根癌农杆菌（共3篇）
根癌农杆菌 篇1
摘要：目的:采用根癌农杆菌介导的转化方法实现丝状真菌里氏木霉的遗传转化,并优化转化条件。方法:构建含潮霉素抗性基因(hph)的双元载体pCAM-hph后,转化根癌农杆菌LBA4404获得转化菌株。将根癌农杆菌的转化菌株和里氏木霉的分生孢子共培养后在含100μg/mL潮霉素的抗性平板上筛选里氏木霉转化子,并采用PCR扩增和序列测定对转化子中的插入片段进行了分析。结果:使用根癌农杆菌介导的转化方法转化里氏木霉,每106个分生孢子可获得25.8个转化子。最佳的转化条件为:农杆菌初始浓度为OD660约为0.8,孢子数为106个,共培养时间为48h,pH为5.0～5.5,培养温度为28℃。结论:建立了根癌农杆菌介导的里氏木霉转化方法,并获得了最佳的转化条件。
关键词：里氏木霉,根癌农杆菌,分生孢子,潮霉素磷酸转移酶,双元载体
0 引言
里氏木霉(Trichoderma reesei)可以大量合成并分泌纤维素酶,在诱导条件下,它分泌到发酵液中蛋白总量可达100g/L[1]。因此,T.reesei也是具有吸引力的基因工程宿主菌。利用T.reesei表达蛋白的前提是通过遗传转化将目的基因转入到其细胞内。对T.reesei进行转化的经典方法为原生质体转化法[2],但原生质体的制备和再生费力费时,而且转化的重复性差、效率较低。根癌农杆菌介导的转化方法(Agrobacterium tumeficiens Mediated Transformation,ATMT)具有操作简便、转化效率高、重复性好等特点,在丝状真菌的转化中日益受到重视。
根癌农杆菌(Agrobacterium tumeficiens)能够在受伤部位侵染植物,将其Ti质粒上的T-DNA (transfer DNA)转入植物细胞并整合进植物的基因组。根据这一特点发展的根癌农杆菌介导植物细胞的转化已成为一种常用方法。除了植物细胞以外,ATMT也能对酵母[3,4]、丝状真菌[5]、动物细胞[6]进行转化。传统的丝状真菌转化方法需制备原生质体,而ATMT对丝状真菌的转化可以孢子、菌丝等直接作为转化受体,操作更为简便。ATMT在丝状真菌的转化中的应用日益广泛,目前已通过ATMT对60余种丝状真菌成功地实现了转化[7]。
作者以农杆菌载体pCAMBIA0380为基础,构建了含潮霉素抗性基因的双元载体pCAM-hph,使用ATMT方法实现了T.reesei的转化,并对转化条件进行了探讨。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
里氏木霉(Trichoderma reesei QM9414)购自美国典型培养物保藏中心(ATCC),大肠杆菌E.coli TOP10F’购自Invitrogen,根癌农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404 由作者实验室郑易之教授惠赠。质粒pCAMBIA0380购自CAMBIA(Australia),pAN7-1为山东大学汪天虹教授惠赠,pMD18-T Simple Vector购自Takara(大连)。
1.1.2 试剂
限制性内切酶、DNA连接酶、Taq DNA聚合酶、DNA片段纯化试剂盒、DNA分子量标记等购自Takara(大连)。利福平Rifampicin 购自北京鼎国生物技术公司;潮霉素(hygromycin B)购自Amresco;卡那霉素(kanamycin)和氨苄青霉素(ampicillin)购自上海生工;乙香丁香酮(AS,acetosyringone)为BBI公司产品;Cefotaxime为医用抗生素(由深圳大学医院提供),其他化学试剂均为国产分析纯。PCR引物合成和DNA序列测定由上海生工完成,所使用的引物列于表1。
1.1.3 培养基
T.reesei的平板及斜面培养基为PDA培养基(土豆浸出汁20%、葡萄糖1%,Agar 2%),用于转化子筛选时加入100μg/mL潮霉素和500μg/mL cefotaxime。T.reesei液体培养基为Mandels培养基[8]。大肠杆菌的培养基为LB培养基,用于筛选转化子时加入终浓度为100μg/mL的氨卞青霉素或50μg/mL的卡那霉素。根癌农杆菌的培养基为YEP培养基(MgSO4 2mmol/L、牛肉膏0.5%、酵母抽提物0.1%、蛋白胨0.5%、蔗糖0.5%、利福平20μg/mL),筛选转化菌株时加入50μg/mL的卡那霉素。根癌农杆菌的诱导培养基为IM培养基(K2HPO4 10mmol/L、KH2PO4 10mmol/L、NaCl 2.5mmol/L、MgSO4 2mmol/L、CaCl2 0.7mmol/L、FeSO4 9μmol/L、(NH4)2SO4 4mmol/L、Glucose 10mmol/L、Glycerol 0.5%、AS 200μmol/L)。
1.2 方法
1.2.1 载体构建
用HindⅢ 和EcoRⅠ酶切质粒pAN7-1,得到分子量约为1 500bp的DNA片段,它含有构巢曲霉色氨酸合成酶基因的终止子(TrpC)和潮霉素磷酸转移酶基因(hph)的一部分。该片段经切胶纯化后与用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切的质粒pCAMBIA0380连接,得到重组质粒pCAMBIA-1.5kb。以P1、P3为引物,以质粒pAN7-1为模板进出PCR扩增,得到分子量约2 600bp的DNA片段,它含有构巢曲霉3-磷酸甘油醛脱氢酶基因gpdA的启动子和hph基因的剩余部分。PCR产物经ApaⅠ、EcoRⅠ分别单酶切纯化后,与经同样处理的pCAMBIA-1.5kb相连接,得到双元表达载体pCAM-hph。
1.2.2 根癌农杆菌的转化
利用改进的冻融法进行转化[9]。
1.2.3 根癌农杆菌介导T.reesei的转化
T.reesei转化受体的准备:用0.85%的生理盐水从PDA平板上洗下培养4d的T.reesei孢子,离心,用IM培养基重悬,并调整至孢子浓度为106个孢子/mL。里氏木霉原生质体的制备按照作者实验室的方法进行[8]。以T.reesei菌丝体为转化受体时取在Mandels培养基中培养48 h的T.reesei湿菌丝0.02g,用1mL IM培养基重悬。
转化用根癌农杆菌的准备:在含抗生素的YEB培养基中培养已转入双元载体pCBAM-hph的根癌农杆菌(抗生素的加量为kanamycin 100μg/mL,rifampicin 20μg/mL),培养温度28℃,转速200r/min,培养时间约24h (使OD660达到0.5-0.7)。取1.5mL上述农杆菌培养液在16 000g下离心10min,弃上清。离心所得的菌体用200μL IM培养基洗涤2次,并用同样体积的IM培养基重悬后接种到5mL IM培养基中培养6h。
转化过程及转化子的鉴定:将100μL的T.reesei孢子悬浮液(或菌丝、原生质体等其它形式的转化受体)与100μL农杆菌的诱导培养物混合后涂布于IM琼脂平板上,IM平板事先用玻璃纸覆盖,涂布时孢子和菌液涂布在玻璃纸的表面。共培养约2d后,将玻璃纸转移至含100μg/mL hygromycin和500μg/mL Cefotaxime的PDA平板上进行选择性培养并筛选转化子。通过PCR扩增hph基因鉴定阳性转化子。
2 结果与分析
2.1 双元重组质粒的构建和鉴定
双元载体pCAM-hph的构建过程如图1所示。由于酶切位点的限制,分两步将质粒pAN7-1中的hph表达盒插入到质粒pCAMBIA0380中的左边界序列和右边界序列之间。首先从pAN7-1中用HindⅢ 和EcoRⅠ双酶切下约1 500bp DNA片段,将它插入到经同样处理的质粒pCAMBIA0380中得到重组质粒pCAMBIA-1.5kb。然后用PCR方法扩增约2 600bp DNA片段,经ApaⅠ和EcoRⅠ 分别单酶切后与同样处理的重组质粒pCAMBIA-1.5kb连接,得到双元载体pCAM-hph。双元载体pCAM-hph构建完成后,使用酶切、PCR扩增和序列分析方法验证载体的正确性。
2.2 根癌农杆菌介导的T.reesei转化
经乙酰丁香酮诱导的根癌农杆菌转化子和里氏木霉的分生孢子在IM平板共培养48h后,将玻璃纸转移至含100μg/mL潮霉素的PDA平板上培养,4d后可见有黄色的菌落产生。通过多次平均计数,得出的转化效率为25.8个转化子每106个分生孢子。从选择PDA平板上任意挑取6个转化子,将其接种到T.reesei液体培养基(含hygromycin)进行培养。采用CTAB法提取基因组DNA,以H1、H2为引物扩增潮霉素磷酸转移酶基因(hph),获得了1 000bp左右的特异性条带(图2)。对该特异性条带进行了DNA序列分析,结果表明,T-DNA已经整合到T.reesei的基因组上。
随机挑取8个转化子接种到含100μg/mL 潮霉素B的PDA平板上进行二次筛选,将所获得的单菌落在不含hygromycin的PDA培养基上传代培养5次。5次传代培养的重组菌株经液体培养后提取总DNA,并进行PCR检测。在所有的5次传代培养物中都检测到hph基因,说明转化子的遗传稳定性较高(数据未列出)。
2.3 转化条件对转化效率的影响
2.3.1 AS浓度对转化效率的影响
使用含不同AS浓度的IM培养基进行农杆菌的诱导和农杆菌与T.reesei的共培养,结果如图3所示。结果表明,在IM培养基中不加AS,不能进行有效的转化,随着AS浓度的提高,转化子数量也增加,在AS浓度达到400μmmol/L时,可获得25.8个转化子。更高浓度的AS会抑制根癌农杆菌的活性,影响转化效率。另外,我们还发现在农杆菌活化时添加适量AS,有利于转化效率的提高。
2.3.2 细菌浓度对转化效率的影响
将使用IM培养基诱导培养的根癌农杆菌细胞离心后用IM培养基重悬,获得不同浓度的农杆菌诱导培养物。分别使用这些诱导培养物与T.reesei孢子进行共培养转化,结果如图4所示。在农杆菌诱导培养物的OD660为0.8时,转化效率最高,过高或过低的细菌浓度对转化效率有一定的影响。
2.3.3 真菌孢子浓度对转化效率的影响
根癌农杆菌活化后,取OD660为0.8的100μL初始菌液与不同浓度的T.reesei分生抱子悬液混合,涂板共培养2d后进行转化子筛选,结果如图5所示。成功的转化需要有一定的孢子浓度,且在孢子浓度106/mL时,转化效率最大。结合图4的结果,推测在根癌农杆菌介导的丝状真菌转化中,细菌浓度和真菌孢子浓度需具有一个合适的比例才能较好地实现。
2.3.4 共培养时间对转化效率的影响
共培养时间在24h内,将玻璃纸转移到筛选平板继续培养时不会出现转化菌落。延长共培养时间,在筛选平板中形成的转化菌落数量明显增加。当在时间过长,转化效率反而有所下降,而且形成的转化菌落会相互重叠,假阳性转化子明显增加,给筛选带来困难(图6)。
2.3.5 pH值对转化效率的影响
根癌农杆菌介导植物细胞转化时,vir区基因的活化除了需要酚类等化学物质的诱导外,还要求较低pH值(5.4~5.6)。使用根癌农杆菌介导T.reesei的转化时,共培养平板的pH值在5.0~5.5时,转化效率超过20个转化子/106个分生孢子(图 7),此结果和用农杆菌介导的方法进行植物的转化比较相似。当共培养的pH为6.5以上,在PDA选择平板上没有T.reesei转化菌落长出。
2.3.6 不同形式的T.reesei转化受体对转化效率的影响
在利用根癌农杆菌介导进行丝状真菌转化时,绝大多数使用真菌孢子作为转化受体[7]。我们分别使用T.reesei的分生孢子、原生质体和菌丝作为转化受体,结果表明采用原生质体为转化受体时转化效率最高(图8),可能的原因是以原生质体为转化受体时T-DNA整合入里氏木霉的过程中受到的限制较少。但由于制备原生质体的过程繁琐,而转化效率提高不足1倍,因此使用ATMT方法进行丝状真菌转化时仍以孢子作为转化受体比较合适。
3 讨论
实验以农杆菌载体pCAMBIA 0380为基础构建了可用于丝状真菌ATMT转化的双元载体,并成功地进行了T.reesei的转化,获得了25.8个转化子/106个孢子的转化效率,远高于使用原生质体进行T.reesei转化的效率(约1个转化子/106个原生质体)[8]。使用ATMT方法进行丝状真菌的转化不仅转化效率高,而且可避免耗时和繁琐的原生质体制备过程,重复性更好。使用ATMT对丝状真菌进行转化日益普遍,包括木霉、曲霉以及食用真菌等的转化都取得了良好的效果[10,11,12]。用于真菌转化的农杆菌菌株的种类较多,如AGL-1、EHA105、LBA1100、LBA1126、LBA4404、A348等[13]。使用的农杆菌品种不同,转化的目标真菌不同,均有可能使转化效率出现差异。Zhong Yaohua等使用农杆菌EHA105转化木霉,转化效率为10~20个转化子/105个孢子[10],郭慧等用EHA105转化日本曲霉的转化效率为80~100个转化子/108个孢子[11],Okamoto Tomomitsu等使用LBA4404菌株转化金针菇时获得5.6个转化子/10mg菌丝体[12]。本工作使用LBA4404菌株转化里氏木霉,获得了25.8个转化子/105个孢子,效率和文献报道基本相当。通过对影响转化效率的各种因素研究,获得了最适的转化条件:IM培养基中AS的浓度为400μmol/L,细菌初始浓度为OD660约为0.8,真菌孢子个数为106个,共培养时间为48 h,共培养的pH为5.0~5.5,共培养温度为28℃,对使用ATMT方法进行丝状真菌转化具有借鉴意义。
根癌农杆菌 篇2
根癌农杆菌感受态细胞的制备以及质粒ProkⅡ对其转化的研究
研究了根癌农杆菌LBA4404和C58C1生长的.培养基类型、菌株生长状态、转化溶液、质粒与感受态细胞共放置时间、质粒加入量、液氮速冻时间及热激条件对质粒ProkⅡ转化的影响.结果表明,以70 mmo/L CaCl2作为转化溶液,YEB培养基制备的、OD600为0.5的LBA4404感受态细胞与10 ng质粒DNA,于0 C共放置30min,液氮速冻5 min,37 C热激5 min时转化率最高,达1.40×105 μg-1;以70 mmo/L CaCl2作为转化溶液,YEB培养基制备的、OD600为0.5～0.6的C58C1感受态细胞与20 ng质粒DNA,于0 C共放置10 min,液氮速冻1 min,37 C热激1 min时转化率最高,达1.33×105 μg-1.
作 者：作者单位：刊 名：西北农林科技大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF NORTHWEST SCI-TECH UNIVERSITY OF AGRICULTURE AND FORESTRY(NATURAL SCIENCE EDITION)年，卷(期)：34(7)分类号：Q813.1+1关键词：根癌农杆菌 感受态细胞 质粒ProkⅡ 转化率
根癌农杆菌 篇3
1 材料与方法
1.1 试验材料
外植体为培矮64S成熟种子,由湖南师范大学生命科学院提供。根癌农杆菌菌株为EHA105,为本实验室保存。质粒为p COs Ac1300-C1,该质粒T-DNA区结构如图1,其中含有C1基因(来源于大肠杆菌)和潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。
1.2 培养基
在培矮64S组织培养和转化过程中使用的培养基如下:
诱导培养基——J0:MS盐分和维生素[5]+谷胺酰氨0.5g/L+蔗糖30.0g/L+琼脂粉8.5g/L,p H 5.8;NB:N6大量盐分[6]+B5微量盐分+N6铁盐+B5维生素+脯氨酸0.5g/L+水解酪蛋白0.3g/L+BA 0.1mg/L+蔗糖33.5g/L+琼脂粉8.5g/L,p H 5.8;
继代培养基——J3:MS大量盐分+10倍B5微量盐分+J3铁盐(Fe SO4·7H2O 41.8mg/L、Na2EDTA 55.9mg/L)+DL维生素(甘氨酸2.0mg/L、盐酸硫胺素1.0mg/L、盐酸吡哆醇1.0mg/L、烟酸1.0mg/L、肌醇100.0mg/L)+谷胺酰氨0.3g/L+脯氨酸0.5g/L+2,4-D 2.5mg/L+麦芽糖30.0g/L+琼脂粉8.5g/L,p H 5.8;NBD2.5:NB+2,4-D2.5mg/L,p H 5.8;
共培养培养基——NBM:N6大量盐分+B5微量盐分+N6铁盐+B5维生素+水解酪蛋白0.8g/L+2,4-D 2.5mg/L+麦芽糖30.0g/L+琼脂粉8.5g/L+乙酰丁香酮0.1mmol/L,p H 5.2;
筛选培养基——J3S:J3+头孢霉素500mg/L+羧苄青霉素400mg/L+潮霉素50mg/L,p H 5.8;
预分化培养基——Y:N6大量+Cu SO43.0mg/L+N6铁盐+B5维生素+谷胺酰氨0.5g/L+脯氨酸0.5g/L+水解酪蛋白0.3g/L+BA 3.0mg/L+NAA 1.0mg/L+蔗糖30.0g/L+山梨醇20.0g/L+琼脂粉8.5g/L+头孢霉素500mg/L+羧苄青霉素400mg/L,p H 5.8;
分化培养基——D:N6大量盐分+10倍B5微量盐分+D铁盐(Fe SO4·7H2O 55.9mg/L、Na2EDTA 74.5mg/L)+DL维生素+谷胺酰氨0.5g/L+脯氨酸0.5g/L+水解酪蛋白0.8g/L+BA 2.0mg/L+IAA 0.2mg/L+NAA 0.2mg/L+KT 2.0mg/L+麦芽糖30.0g/L+琼脂粉8.5g/L+头孢霉素500mg/L+羧苄青霉素400mg/L,p H 5.8;
生根培养基——R:MS盐分和维生素+蔗糖20.0mg/L+IAA 0.5mg/L+NAA 0.5mg/L+琼脂粉8.0g/L,p H 5.8。
1.3 愈伤组织的培养
(1)培矮64S成熟胚愈伤组织的诱导。挑选健壮的培矮64S籽粒剥去颖壳,置37℃培养箱过夜,取出后放入灭菌三角瓶,先用75%的乙醇表面消毒5min,灭菌水冲洗1次,0.1%升汞(Hg Cl2)消毒12min,灭菌水冲洗5次,再放入次氯酸钠(Na Cl O)原液消毒40min,灭菌水冲洗5次,于灭菌滤纸上晾干,然后接种到诱导培养基(J0D3、J0D3N0.5、J0D3N1、J0D3A1、NBD3、NBA1D3、NBA1D2.5、NBN0.5D3、NBN0.5D2.5),每皿30粒,25-26℃暗培养,30d后统计愈伤组织诱导率(愈伤组织诱导率=能分化出愈伤组织的种子数/接入种子总数×100%)。进行三次重复。
(2)培矮64S愈伤组织的继代和分化。30d后将愈伤组织转入继代培养基,每20d继代一次,连续继代四次,观察愈伤组织状态,转入分化培养基,20d后统计分化率(分化率=能分化出植株的愈伤组织数/接入愈伤组织总数×100%)。
(3)农杆菌与愈伤组织的共培养。EHA105(含p COs Ac1300-C1质粒)划LB板(卡那霉素50mg/L和氯霉素34mg/L),28℃培养两天后挑单菌落在LB板(卡那霉素50mg/L和氯霉素34mg/L)划线至全培养皿,28℃过夜培养,用液体共培养培养基洗菌,调OD600=0.5。成熟胚诱导的愈伤组织经过一次或者两次继代培养,从中挑选1-2 mm黄白色表面干爽结构致密的愈伤组织,于灭菌滤纸风干至表面发白。浸入上述准备好的菌液中,浸泡30min,每隔5min摇一次。灭菌水冲洗5次至液体不浑浊,用灭菌滤纸吸干水分,风干至愈伤表面发白,将其转移到固体共培养培养基上,在培养基表面铺一层用液体共培养培养基浸湿的灭菌滤纸,25-26℃下暗培养3d。
(4)抗性愈伤组织的筛选。3d后,将共培养的愈伤组织转入灭菌三角瓶,灭菌水冲洗5次至液体不浑浊,再用加有500mg/L头孢霉素和400mg/L羧苄青霉素的灭菌水浸泡30min,每隔5min摇一次。用灭菌滤纸吸干水分,风干至愈伤表面发白。转移到筛选培养基J3S中,25-26℃暗培养,20d后将抗性愈伤转入新的筛选培养基。
(5)抗性愈伤的分化。两次筛选后,将抗性愈伤转移至预分化培养基Y,置于光照培养箱中培养3d,条件为:25-26℃,14h光照培养。3d后将抗性愈伤转至分化培养基D,置于光照培养箱中,条件同预分化,每20d更换一次培养基。
(6)抗性植株的生根。绿苗高约5-8cm时,转移到生根培养基R,置光照培养箱中,条件同预分化。
(7)抗性植株的驯化移栽。3-4周后,挑选根多而粗壮的抗性植株,打开瓶盖加入蒸馏水于室内炼苗,3d后用自来水将幼苗上的培养基冲洗干净,移栽到装有泥土的瓶子,待幼苗成活移入实验田,常规管理至成熟,单株收取种子。
1.4 再生植株的检测和分析
(1)抗性植株的PCR检测。取抗性植株幼嫩叶片1.0g,按CTAB法[7]提取基因组DNA。PCR引物为:C1-F:5'-GAGATC-CATGGCAAAGATTAAAGGTCAG-3',C1-R:5'-GAACTGCAGC-TAGATAGCTGTTACGTTA AC-3',扩增产物为235bp。PCR扩增体系(20μl):MBI公司Taq DNA聚合酶(5U/μl)0.2μl,10×Buffer(KCl)缓冲液2.0μl,Mg Cl21.6μl,d NTP Mixture(2.5m M)2.0μl,C1-F(20μmol/L)0.4μl,C1-R(20μmol/L)0.4μl,模板1μl,dd H2O 12.4μl。PCR反应程序为:94℃4 min;94℃45sec;58℃1min,72℃1min,30个循环;72℃7min。取PCR产物10μl进行琼脂糖凝胶电泳并照相。
(2)转基因植株的荧光定量实时PCR检测。(1)RNA的提取:取约100mg植物叶片在液氮中研磨成粉末,置于装有1.0ml TRIzol(Invitrogen)的1.5ml离心管中,-80℃保存备用。采用TRIzol试剂提取法:将-80℃保存的样品取出,冰上解冻后,加入200μl氯仿,振荡混匀,离心后小心取出上层水相,转入另一离心管中,加入500μl异丙醇,沉淀、离心分离出RNA,再经75%酒精洗涤,室温微干后,加入适当体积的RNase-free水,充分溶解。所提RNA经DNA酶(Fermentas)处理。(2)荧光定量实时PCR:荧光定量实时PCR引物为:C1-RT-S:5'-AAGGTCAGGTTAAGTGGTTCAACG-3'和C1-RT-A:5'-AGTGTACGAACACATCTTTGCTGC-3'。采用QIAGEN公司的Quanti Tect SYBR Green RT-PCR Kit及Rotor Gene3000荧光定量PCR仪进行检测。内参基因为18s核糖体RNA基因,引物为18s-F:5'-CGTCCCTGCCCTTTGTACAC-3'和18s-R:5'-CGAACACTTCACCGGATCAT T-3'。一步法扩增程序:48℃30min;95℃10min;95℃15sec,58℃40sec,72℃20sec,40个循环。按相对定量法进行定量计算[8],目的基因相对表达量计算公式为:
其中-ΔΔCt=(未知样品ΔCt)-(参比样ΔCt),未知样品ΔCt=(内参基因Ct)-(目的基因Ct),参比样ΔCt=(参比样内参基因Ct)-(参比样目的基因Ct)。在计算相对表达量时,以任意转基因植株表达量为参照,即将其值转换成1,其它样品再与其比较,获得相对表达值。
(3)T1代转基因植株的PCR检测。经PCR检测为阳性的植株,单株收取其种子。挑选20个株系,每个株系挑选20粒种子为一组,种子经0.1%Hg Cl2消毒10min,自来水冲洗3遍,25℃浸种3d,每天换水1次,37℃催芽3d,分批播于中国科学院亚热带农业生态研究所网室盆中。于3叶期,每组混合取幼嫩叶片1.0g,按CTAB法提取基因组DNA,进行PCR检测。
(4)数据分析:采用SPSS11.5软件进行。
2 结果与分析
2.1 诱导培养基对培矮64S成熟胚愈伤组织诱导率的影响
通过几种不同培养基对培矮64S成熟胚愈伤组织诱导率的观测表明:J0培养基诱导率高于NB培养基,J0培养基中加入NAA能显著提高愈伤组织诱导率,ABA和2,4-D的变化对诱导率影响不显著。培矮64S愈伤诱导率最高的培养基为加入1.0mg/L NAA和3.0mg/L 2,4-D的J0培养基,诱导率为56.44%(表1)。通过升汞和次氯酸钠两种方法结合,种子消毒效果较好,污染降低。
注:A为1%水平差异显著性,a为5%水平差异显著性
2.2 继代培养基对培矮64S愈伤组织状态的影响
如图2-A、B所示愈伤组织分别在J3和NB培养基经过四次继代培养,NB培养基中愈伤组织褐化严重,接入分化培养基不能分化;J3培养基愈伤组织变为深黄,有新的球状愈伤生长,接入分化培养基分化率为56.84%。J3培养基中微量盐分为10倍B5微量盐分,糖源为麦芽糖,推测这可能是培矮64S愈伤组织在此培养基中能耐受长时间继代的重要原因。因为培矮64S愈伤组织在J3培养基中经过四次继代仍能保持较高分化率,所以将加50mg/L潮霉素、500mg/L头孢霉素、400mg/L羧苄青霉素的J3培养基确定为培矮64S农杆菌介导转基因的筛选培养基。
2.3 抗性愈伤的分化
在将愈伤接入分化培养基之前增加预分化即山梨醇高渗处理过程,抗性愈伤组织经预分化3d后,转入分化培养基后光下变绿(图2-C),可迅速出苗。分化阶段抗性愈伤分化成植株比率为73.08%。将抗性苗转入壮根培养基上,可迅速生根并长成完整植株(图2-D)。
2.4 抗性植株的P CR检测
经过转化获得133株潮霉素抗性植株,随机选取其中67株提取基因组DNA,进行PCR扩增,结果46株为阳性植株,阳性植株率为68.66%。如图3为13株抗性植株PCR检测结果,235bp大小为目的条带,结果显示抗性植株中8株的扩增片段大小与阳性对照条带一致,而阴性对照(水和非转基因培矮64S植株)没有目的条带,证明C1基因已整合到培矮64S基因组中。
A.J3培养基继代四次的培矮64S愈伤;B.NB培养基继代四次的培矮64S愈伤;C.经过两次筛选后在分化培养基上变绿的抗性愈伤;D.再生植株
1.DL2000;2.无模板阴性对照;3.未转化培矮64S;4.质粒阳性对照;5-17.再生植株
2.5 荧光定量实时P CR检测再生植株
挑选4株经PCR鉴定为阳性的再生植株进行荧光定量实时PCR分析,C1和18S扩增产物的溶解曲线图都为单峰曲线(图4),说明为目的基因的特异扩增,所检测的基因表达量为目的基因表达量;每个样都进行了两个重复,Ct值间的标准差都低于0.4(表2),表明实验重复性较好;从目的基因的相对表达量来看,转基因植株相对表达量高低不同(图5),其中转基因植株D相对表达量是A的2000多倍。结果表明C1基因能在转基因植株中表达,而C1在转基因植株内表达存在差异,这可能和插入的拷贝数和插入的位点有关系。
2.6 T1代植株的PCR检测
如图6为T1代植株PCR检测结果,235bp大小为目的条带,结果显示每组植株的扩增片段大小与阳性对照的条带一致,而阴性对照(水和非转基因培矮64S植株)没有目的条带。本实验DNA为每个株系混合取样,结果反映的是每个株系中20个植株PCR结果,证明C1基因能在T1代植株稳定遗传。
注:以转基因植株A的表达量作为参照,设为1
1.DL2000;2.无模板阴性对照;3.未转化培矮64S植株;4.质粒阳性对照;5-12.T1代植株
3 结论与讨论
3.1 培矮64S愈伤组织的诱导
Vijayaehandra等[9]研究表明,盾片来源的愈伤组织是最容易被农杆菌转化的组织。因季节的限制幼胚取材不方便,而成熟胚取材则可不受季节限制,所以建立成熟胚盾片来源的胚性愈伤组织系统对于水稻的遗传转化是十分必要的。愈伤组织的诱导是组织培养系统中的关键问题,它涉及到外植体的脱分化过程,这个过程主要受内因和外因两方面影响。内因指的是种子生理状态,其中种子存放的时间越长,愈伤组织的诱导频率越低。外因包括诱导培养基成分和条件等,其中培养基的基本组分有无机盐类、有机物质、有机碳源、激素类等,它们的不同组合及含量直接影响到愈伤诱导率。本试验通过对影响愈伤组织诱导的培养基中各因素的探讨,使难诱导愈伤组织的不育系培矮64S的愈伤组织诱导率达到56.44%,为农杆菌介导培矮64S成熟胚遗传转化打下基础。
3.2 培矮64S农杆菌介导转化条件的优化
水稻转基因主要有PEG法[10]、基因枪法[11]和农杆菌介导转化法[12,13]。农杆菌法相对于其它方法,具有转入拷贝数低、大都能稳定遗传、对质粒大小要求不严格、成本较低、操作简单等优点,是目前水稻遗传转化的首选方法。
影响农杆菌转化水稻成功的因素有很多,包括水稻品种、外植体种类、农杆菌菌株和质粒载体、培养基组分、农杆菌对愈伤组织的浸染、农杆菌和愈伤组织共培养的条件和方式等,凡是影响农杆菌Vir区基因活化、愈伤组织生长和再生的因素都可能影响到水稻的成功转化。其中农杆菌对愈伤组织的浸染是关键一环,在液体培养基中培养的农杆菌表面由于残存有抗生素和代谢物,不宜用于转化试验。在固体LB培养基中的农杆菌经NBM培养基悬浮可除去残存物,同时NBM培养基有利于保持愈伤组织状态同时适合农杆菌的生长,因而适于作为浸染液。浸染前将愈伤组织表面风干,有利于农杆菌附着到细胞表面。
农杆菌和愈伤组织共培养的条件和方式对转化与成苗有重要的影响,愈伤组织在农杆菌菌液中的浸染只是将农杆菌附着到细胞壁和细胞膜等细胞的表面结构,而真正实现T-DNA整合到受体细胞基因组则主要是在浸染后的共培养过程中。已有的研究表明,在共培养过程中,除了需要在共培养基中加入乙酰丁香酮等酚类化合物外,低于28℃的温度、较低的p H值(一般为5.2)有利于诱导Vir区基因的表达,促进T-DNA的转移。添加滤纸对愈伤组织转化有促进作用,主要在于保持了愈伤组织的相对干燥,促进愈伤组织的DNA合成与细胞分裂,同时抑制了农杆菌的过度生长,相对延长了可共培养的时间。
抗性愈伤的产生是影响水稻成功转化的重要因素。愈伤组织在J3培养基中继代四次仍能保持较好状态,将其作为筛选培养基的基本成分将有利于抗性愈伤的产生。农杆菌的过度生长会使抗性愈伤不能产生,可以通过抗生素浸泡、风干和在筛选培养基中加入抗生素等方法抑制农杆菌的生长。
抗性愈伤的分化是转化成功的关键。植物组织细胞的分化能力有很强的基因型依赖性,不同的基因型往往要求不同的培养基,很难找出对所有品种都适用的培养条件。抗性愈伤组织经过较长时间筛选培养,愈伤组织的再生能力会下降。抗性愈伤组织在进行分化前先通过山梨醇高渗处理,能促进分化,这可能与愈伤组织的生长状态及愈伤组织内渗透压不同有关。
本研究一方面找到合适的诱导培养基能高效诱导愈伤,为农杆菌介导转基因提供合适的愈伤组织;另一方面从农杆菌对愈伤组织的浸染、农杆菌和愈伤组织共培养的条件和方式、筛选培养基的选择、筛选培养过程中农杆菌的抑制、抗性愈伤的分化等方面来优化农杆菌介导遗传转化过程,取得了较为理想的效果。采用农杆菌法成功转化培矮64S,C1基因能在转基因植株中表达,T1代植株分析C1基因能在后代稳定遗传,为通过转基因研究水稻功能基因和优良品种的培育奠定基础。
摘要：以水稻两用不育系培矮64S成熟胚为外植体,以不同组合培养基为诱导和继代培养基,建立了适合水稻培矮64S转化的高效再生体系,并通过农杆菌EHA105介导,将大肠杆菌C1基因转入培矮64S,获得再生植株。结果表明,J0N1D3为合适的愈伤组织诱导培养基,诱导率达56.44%;通过潮霉素筛选后,获得的抗性愈伤组织分化率为73.08%,经分化,获得133株再生植株;随机挑选67株再生植株经PCR检测,其中46株检测到目的条带,阳性检出率占68.66%;对PCR阳性植株进行荧光定量实时PCR分析,结果表明C1基因能在转基因植株中表达。通过对T1代PCR分析,得到目的条带,表明C1基因能在转基因后代稳定遗传。