炭疽杆菌（精选3篇）
炭疽杆菌 篇1
摘要：炭疽病是引起一种人、畜共患急性传染病, 其病原菌是炭疽杆菌。近年来炭疽杆菌更是被恐怖分子用来作为武器使用, 严重危害到人们的生活和安全, 同时提醒人们应该努力研究开发新的有效治疗和预防该病措施。该文终述了炭疽杆菌的生物学性状、抗原特性、炭疽毒素及毒性机理和分子生物学的研究进展, 尤其是对保护性抗原的研究。
关键词：炭疽杆菌,生物学性状,抗原特性,炭疽毒素,分子生物学,保
炭疽芽孢杆菌 (Bacillus anthracis简称炭疽杆菌, 是引起人、畜共患急性传染病———炭疽 (Anthrax) 的病原菌。该菌主要引起皮肤炭疽、肺炭疽或肠炭疽, 且均可并发败血症。炭疽杆菌于1849年由德国兽医师Pollender首先发现, 1876年德国学者Koch获得了炭疽杆菌的纯培养, 2年后又发现了它的芽孢。l881年巴斯德 (L.Pasteur) 及其学生成功地制备了炭疽菌苗。虽然人类炭疽病十分少见, 发病率仅为十万分之一, 但炭疽可作为潜在的武器而用于生物战[1]。
草食家畜是主要易感动物, 家畜食用或吸入炭疽芽孢污染的水、草和饲料后, 芽孢可在家畜体内迅速发芽、繁殖而发病。表现为急性败血症, 常突然死亡, 并伴有自然孔出血, 血液不凝固, 含有大量细菌, 细菌遇到空气便形成芽孢, 从而造成新的环境污染。
1 生物学性状
1.1 形态特征
炭疽杆菌 (Bacillus anthracis) 是人类历史上第一个被发现的病原菌, 是致病菌中最大的杆菌之一。炭疽杆菌为革兰氏阳性粗大杆菌, 长5~10μm, 宽1~3μm, 两端平切, 无鞭毛, 不能运动, 在宿主标本涂片中呈单个或短链, 培养后常形成竹节状长链[2]。
炭疽杆菌在体外能形成芽孢, 是需氧芽孢杆菌属中最重要的致病菌。在动物体内和未解剖的尸体中不能形成芽孢, 只有在脱离尸体后与外界空气接触, 遇到游离氧和在一定温度 (25~30℃) 、湿度条件下才能形成芽孢, 芽孢位于菌体中央, 直径不超过菌体宽度, 呈椭圆形或圆形, 囊孢不膨大。
炭疽杆菌在人及动物体内能形成荚膜, 而形成荚膜是毒性特征, 且荚膜在体内有抗吞噬作用, 有利于细菌的繁殖扩散;在体外, 荚膜能掩盖嗜菌体受体, 阻止嗜菌体裂解菌体。而且荚膜对腐败作用的抵抗力较菌体强。
1.2 生长条件及抵抗力
炭疽杆菌的营养要求不高, 生长条件不严格, pH 6.0~8.5 (最适pH 7.0~7.4) 、温度14~44℃ (最适温度37℃) 均可生长。炭疽杆菌的繁殖体抵抗力不强, 容易被一般的消毒剂给杀死, 但所形成的芽孢抵抗力很强, 在干燥土壤或皮毛中常温下可存活数十年 (有报道80年) [4], 煮沸10 min可将芽孢杀死, 干热140℃3 h才能杀灭。炭疽芽孢对碘特别敏感, 对青霉素、链霉素等抗生素也相当敏感。
2 炭疽杆菌的抗原结构
炭疽杆菌的抗原可分为2部分:一是细菌性抗原, 包括荚膜多肽抗原、菌体多糖抗原和芽孢抗原;二是外毒素复合物[3]。
2.1 细菌性抗原
2.1.1 荚膜多肽抗原:
该抗原仅见于有毒菌株, 与毒力有关, 可保护该菌不被吞噬细胞所吞噬。由D-谷氨酸γ多肽组成, 抗原性单一, 是一种半抗原, 但可因腐败而被破坏并失去抗原性。此抗原的抗体无保护作用, 但其反应性较特异, 若以高效价抗荚膜血清与具有荚膜的炭疽杆菌作用, 在其周边外发生抗体的特异性沉淀反应, 显微镜下可见荚膜肿胀。
2.1.2 菌体多糖抗原:
菌体多糖抗原是存在于本菌细胞壁及菌体内的半抗原, 由等分子量的乙酰基葡萄糖胺和D-半乳糖及乙酸组成, 与细菌毒力无关。能耐热, 性质稳定, 即使在腐败的尸体中经过较长时间或经加热煮沸甚至高压蒸气处理, 抗原性也不被破坏。这种抗原没有特异性, 能与其他需氧芽孢杆菌发生交叉反应。
2.1.3 芽孢抗原:
芽孢抗原是芽孢的外膜层含有的抗原决定簇 (AD) , 它与皮质一起组成炭疽芽孢的特异性抗原, 具有免役原性和血清学诊断价值。
2.2 外毒素复合物
有毒炭疽菌在生长过程中合成毒素, 毒素是由保护性抗原 (protective antigen, PA) 、致死因子 (1ethal factor, LF) 和水肿因子 (edema factor, EF) [5]3种蛋白质形成的复合物, 为外毒素复合物。EF是分子量89 000的未活化的腺苷酸环化酶, 使体内ATP转化成cAMP;LF是分子量为90 000的蛋白质, 裂介MAPKK、阻断MAPKK信号传导途径和使细胞溶解;PA是一种膜结合蛋白, 具有免疫原性, 能使机体产生抗本菌感染的保护力, 与宿主吞噬细胞表面受体结合后寡聚化形成离子通道, 使EF、LF组分得以进入胞质溶胶而发挥毒性作用。
3 保护性抗原研究
1983年Vodkin等首先在大肠杆菌上克隆并表达了PA, 利用DNA重组技术, 将含有PA基因的质粒pXO1用BamHI酶切后, 再将6 kb DNA片段经质粒pBR322传递至大肠菌株的染色体上克隆出2个组体:pSE24和pSE36。
1986年Ivtns等又将含有插入6 kb pXO1DNA的pSE36亚克隆到质粒载体pUB110, 并DNA重组转化至枯草杆菌IS53株, 克隆出2个重组体PA1 (pPA101) 和PA2 (pPA102) 。用重组活菌苗免疫豚鼠后, 可抵抗炭疽芽孢杆菌的致死性攻击。将PAl转化至枯草杆菌DB104株, 分离得到PA7, 其所产生的PA在生物学、血清学特性上与桔草杆菌PA1相同。目PA1和PA2不产生LF和EF, 初步证实在缺少EF和LF仅有PA免疫的情况下, 可抵抗炭疽毒素和芽孢的致死性攻击, 进一步尚需在动物中进行重组枯草杆菌PA1和PA2株与炭疽杆菌Sterne株和人用PA菌苗在安全及效果方面的比较研究。
1988年Wellkos等对PA进行了全序列分析, 首次报告了其核酸序列。PA分子量为85 KD, 其开放阅读框 (ORF) 为2 319 bp, 其中2 205 bp编码了分泌蛋白的735个氨基酸, 分子量为82.684KD, 在这编码区最后氨基酸后有一TAA终止密码子。在分泌蛋白编码区之前有29个密码子为信号肽。PA基因密码子有较多的A+T含量, A=39%, T=30%, G=17%, C=14%。PA基因无半胱氨酸密码子, PA基因密码子与其他G+和G-杆菌所产生的毒素和蛋白基因不同 (除苏云金杆菌) 。PA基困完整的核酸序列有几个用途:PA启动子序列可有点特异性突变, 因此, 增加在桔草杆菌和大肠杆菌宿主中克隆PA产量将成为可能;PA编码区特异性突变位点可使在菌苗研究中产生具有免疫原性又与经生物灭活后有交叉反应的蛋白;检测PA靶细胞结合与炭疽毒素EF和LF结合的不同基因区的作用;PA核酸片段将用作探针以检测炭疽杆菌变异株PA的基因组成。
1989年Bartkus报告PA基因的转录调控。基于炭疽杆菌主要致病因子 (毒素和荚膜) 的产生需碳酸氢盐这一点, 并以此作为刺激PA产生的基础, 为进一步表明pag转录调控所需因素特性, 将pag启动子基因区与载体p PL703的氯霉素乙酰基转移酶基因 (cat-86) 熔合一起, 并转化至炭疽杆菌UM23-l (pXO1TOX+) 和UM23C1-1 (pXO1TOX-) 株。这是由于pag-cat-86编码了易于测定的酶, 即氯霉素乙酰转移酶 (CAT) 。因此用分子杂交法可进行pag-cat-86的分析和结果判定[6]。
1990年lacono-Connors等报告将pag于杆状病毒和痘苗病毒中重组并获表达。将pag插入痘苗病毒, 提供了一个可在体内表达pag的真核重组载体, 而杆状病毒PA基因重组体可在细胞培养中高效产生PA。基于此, 将PA以点突变修饰并亚克隆至杆状病毒和痘苗病毒质粒传递载体, 分别为pACYM1和pSC-11, 然后经同源性重组, 将PA基因插入杆状病毒和痘苗病毒, 再将重组的两病毒分别转染至SF-9细胞和Vero细胞, 其每细胞PA产量分别为6 pg/细胞和0.2 pg/细胞。分别用两病毒重组体免疫鼠, 可刺激其产生高滴度的抗PA抗体反应。炭疽毒毒符合毒素的AB结构式, 其有两个特点: (1) B和A成分是独立的蛋白分子; (2) 两A成分 (IF和EF) 共用B成分, 即PA。
4 炭疽毒素的研究近况
现已明确炭疽杆菌产生3种蛋白:保护性抗原 (protective antigen, PA, 735个氨基酸) 、致死因子 (1ethal factor, LF, 776个氨基酸) 和水肿因子 (edema factor, EF, 767个氨基酸) , 这3种因子单独均无毒性作用, 而它们共同构成的复合物成为毒素, 致死因子LF与保护抗原PA结合构成致死外毒素LeTx, 被认为是感染导致死亡的最初反应;水肿因子EF与保护抗原PA结合构成水肿毒素ET。
4.1 致病因子
炭疽杆菌的毒力因子由体内孢子发芽产生的繁殖体表达, 内孢子进入体内后, 被巨噬细胞吞噬, 而携带入局部淋巴结, 内孢子在巨噬细胞内发芽, 成为繁殖体, 然后从巨噬细胞内释放, 在淋巴结内增殖, 进入血液循环, 引起败血症。繁殖体表达的毒力因子, 包括毒素和荚膜, 其所致的毒血症具有全身作用, 导致宿主死亡。炭疽杆的主要毒力因子在两个毒力质粒上编码, pX01和pX02, 毒素和荚膜基因表达的调节由转录因子AtxA介导, 其活性受环境条件影响, 荚膜基因的表达也由其本身的转录调节因子AcpA控制。两个质粒对于毒力因子的表达是必需的, 失去任何一个都可致使毒力减弱。
4.2 毒素研究
炭疽杆菌分泌的两个外毒素为两个亚单位毒素, 两个A蛋白, 即LF和EF, 一个B蛋白PA。水肿因子EF (89kDa) 、致死因子LF (83kDa) 和保护抗原PA (85kDa) , 极不耐热。PA、LF和EF由位于pX01上的独立基因Pag、Lef和Cya编码, 非连续性地位于pX01质粒上的30 kb区内;Pag由PagA和PagR组成, PagA为PA的结构基因, PagR可能在PagA促进子区域或某些影响PagA表达的其它基因促进子区域内, 在适宜PA合成的培养条件下, PagR可抑制PagA表达[7]。
研究发现PA是一单链蛋白质, 特异地结合LF或EF的复合物 (PA63) , 通过受体介导的内胞作用进入细胞, 形成酸性胞内物。酸性环境使七聚体组份发生形态变异, 转变成螺旋状膜蛋白核心, 核心的形成激发LF和 (或) EF通过胞膜进入胞浆。PA的结晶样结构表现为一长扁形分子, 大多由β结构构成, 形成四个结构域。结构域1包括furin蛋白酶的作用位点和EF/IF的结合位点;结构域2与PA跨膜孔道的形成有关;结构域3与PA在细胞膜上形成七聚体有关;结构域4则被认为是PA与其受体的结合部位。国外早期研究认为PA结构域4含有蛋白的主要中和表位, 现在研究发现, 结构域2和4都包含PA的主要中和表位。
LF是一种仅对单核细胞和巨噬细胞有胞毒作用的金属蛋白酶-Zn2+内肽酶, 能裂解促有丝分裂原活化蛋白激酶激酶 (mitigen-activated protein kinase kinase, MAPKK) 。Pannier等[14]指出LF由4个区组成:1区结合炭疽毒素, 保护性抗原 (PA) 的膜易位成分。2区类似于得自蜡状芽孢杆菌的ADP-糖基化毒素, 但活性位置已突变并得到补充以扩大基质识别。3区被插入2区, 似乎由2区的结构成分反复复制而组成。4区与远距离的锌金属蛋白酶家族相联接, 并含有催化中心, 它也与1区相似。而且, LF可切割Pag和Lef基因, LF基因N末端7个氨基酸残基切割后, 使LeTx活性下降, LF切割了N末端必须氨基酸残基后, 使一个稳定的蛋白质变得高度不稳定, 这个新N末端不稳定氨基酸残基成为蛋白酶降介的靶蛋白。LeTx刺激巨噬细胞释放肿瘤坏死因子α和白细胞介素-1β, 部分地反应于全身性炭疽的突然死亡。
EF是通过包括抑制吞噬作用来操作损伤宿主防御机能的腺苷酸环化酶。Bradley等[8]认为:PA与细胞受体结合并对酶成分到细胞溶胶的传递起作用。他们并通过基因互补处置克隆出人体PA受体, 这种受体, 是具有来自细胞外直接与PA结合的Willebrand A因子片段的1型膜蛋白。
近年来的研究人们还发现了一些意想不到的情况, 如:Duesbery发现LF能极大地减少肿瘤内新血管的形成, 证实LF强有力地抑制ras介导的肿瘤生长, 并是一种可能的抗肿瘤治疗措施。Friedlander[9]则明确指出对炭疽毒素结构的研究将有利于进一步开发更有效的抗毒素治疗药物。
5 分子生物学研究近况
炭疽杆菌是细菌学历史中发现和研究得最早的致病菌之一, 但近年来, 其分子水平研究却远远落后于其它菌株。这与该菌胞壁厚实难破, 且质粒属严谨型, 拷贝数低, 同时质粒巨大, 制备过程中易降解, 获取质粒难度大有关。目前, 国外已开展了炭疽杆菌分子水平的研究, 但有关报道不详。我们成功地构建了pXO1质粒基因文库和建立了DNA探针检测方法, 有助于国内深入开展炭疽杆菌分子生物学研究[10]。
国外仅于1989年报道1.9 kb保护性抗原基因探针用来检测野生菌株, 但该探针与pBR322质粒存在弱交叉反应[11], 特异性欠佳。而我们所构建的6.0 kb保护性抗原基因探针仅与含有pXO1质粒的炭疽杆菌的保护性抗原基因重组子杂交, 其特异性强, 重复性好, 且革兰氏阳性菌原位杂交膜处理法同样可适合于制备包括革兰氏阴性在内的各类菌株原位杂交膜。已知钱氏、巴斯德疫苗株I在培养液中不产生毒性因子, 其它炭疽杆菌均产生不同程度的毒性, 6.O kb保护性抗原基因探针与1~7号炭疽杆菌、A16R株、巴斯德疫苗株I、CTN-1疫苗株杂交阳性, 与钱氏、巴斯德疫苗株I杂交阴性, 符合这些菌株生理特性。同时, 传统减毒疫苗株筛选是经繁琐动物试验进行, 而探针则提供了一条快速筛选的新途径。
总之, 炭疽杆菌对人畜的危害非常大, 严重地威胁着人类社会的发展。近年来, 在美国发生的生物恐怖相关性炭疽事件, 一方面使人们看到了恐怖主义对人类社会的危害, 同时又促使人们提高警惕并努力开发新的有效治疗和预防炭疽杆菌的措施, 对加强疫病的控制提出了更高的要求。
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炭疽杆菌病的预防措施 篇2
1 病 原
炭疽杆菌是革兰氏阳性大杆菌, 在暴露于氧气和适当温度下可形成芽胞。菌体对外界理化因素抵抗力不强, 但芽胞有坚强的抵抗力, 在干燥条件下可存活32～50年, 150 ℃ 60 min才可杀死。本病主要通过采食污染的饲料、饲草和饮水经消化道感染, 但经呼吸道和吸血昆虫感染的可能性也存在。本病常呈地方性流行, 干旱或多雨、洪水涝积、吸血昆虫都是促进炭疽多发的因素。
2 症 状
本病潜伏期一般1～5 d, 最长可达14 d, 最急性常无任何症状突然死亡, 天然孔出血, 尸僵不良。急性病例表现呼吸极度困难, 体温升高至42 ℃, 表现兴奋不安, 淋巴结肿大, 腹泻带血, 肠系膜及肺脏有病变。
3 预防措施
(1) 在常发地区, 每年对易感动物进行预防注射。另外, 加强检疫和大力宣传本病的危害和防治。
(2) 发生本病时, 应尽快上报疫情, 划定疫点、疫区, 采取隔离封锁等措施, 对病畜采取隔离治疗措施, 圈舍彻底消毒, 同群畜观察至2周, 必要时作紧急预防注射, 加强疫情监测。
(3) 加强牲畜间疫情监测, 调整监测范围, 扩大到所有牲畜和土样检测。
(4) 加强牲畜棚圈消毒, 向全县农牧民广泛宣传环境卫生对本病预防的重要性, 加强牲畜棚圈消毒。
(5) 将炭疽病预防纳入计划免疫范围, 开展预防注射工作。
炭疽杆菌 篇3
1 材料准备
1.1 样品
海关仓库随机分批采取, 采样量为每批次的1%。2004年6月5日—2005年12月8日, 共采集180批, 为同期进口总批次的34.75%, 其中牛皮2 140份, 羊皮2 170份, 羊毛2 173份。
1.2 培养基
普通肉汤, 普通营养琼脂平板, 鲜血琼脂平板, 半固体培养基, 指示性选择培养基。
1.3 其他
炭疽噬菌体 (兰州生物制品研究所) , 青霉素纸片 (杭州微生物制剂厂生产10 U/片) , 健康成年的小白鼠。
2 方法
2.1 培养方法
2.1.1 样品处理
称取1 g样品, 剪碎, 装入大试管中, 加入10~15 m L的0.5%洗洁精 (上海白猫有限公司) 配制的洗涤液, 振荡10~15 min, 洗脱芽孢, 静置5~10 min, 吸出上清液, 60~65℃水浴30 min。
2.1.2 接种
取每份上述处理过的上清液0.1 m L接种于指示性选择培养基上, 以L型玻棒涂匀, 37℃孵育48 h。
2.1.3 挑取可疑菌落
从指示性选择培养基上挑取光滑、兰色小菌落接种到普通肉汤中, 37℃孵育24 h, 观察肉汤生长情况, 选取上液澄清, 无菌膜, 振荡后有絮状沉淀者留作鉴定。
2.2 鉴定
2.2.1 噬菌体裂解试验
取24 h肉汤培养物0.3 m L接种于普通营养琼脂平板上, 以L型玻棒涂匀, 滴一滴炭疽诊断用噬菌体, 37℃孵育8~18 h, 观察噬菌斑。2.2.2青霉素串珠试验和青霉素抑制试验取24 h肉汤培养物0.2 m L接种于普通营养琼脂平板上, 以L型玻棒涂匀, 平板中央置一10 U/片的青霉素纸片, 37℃孵育1~3 h, 观察串珠形成情况, 然后放回, 37℃孵育18~24 h, 测抑菌圈大小。
2.3 致病性试验
将最终鉴定的炭疽杆菌经37℃18~24 h营养肉汤培养后, 以0.1 m L皮下注射小白鼠2只。
3 结果
(1) 6 483份样品中有2张羊皮, 1份羊毛呈炭疽阳性。
(2) 经培养后从2张羊皮、1份羊毛样品中分离出3株菌符合下列条件:即革兰阳性、粗大、成链、无动力;肉汤37℃24 h培养后, 上液澄清、振摇后管底有絮状沉淀徐徐上升;鲜血琼脂平板37℃18~24 h培养后, 菌落粗糙、不溶血;炭疽噬菌体裂解试验阳性, 有明显的噬菌斑;青霉素串珠试验阳性, 有典型的串珠;青霉素抑制试验阳性, 有20 mm左右抑菌圈;24 h后有两组小白鼠死亡, 解剖采取其血、心脏、脾脏、肝脏涂片, 美兰染色, 镜检为炭疽杆菌。
4 讨论
(1) 从6 483份样品中只检出3份样品有炭疽杆菌, 其中2份有致病性, 说明在某国进口的皮革中存在炭疽病, 有可能是炭疽疫区。