甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析

甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析（共10篇）

甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析 篇1

广西水牛γ干扰素基因的克隆与序列分析

提取经刀豆素(ConA)诱导培养的水牛外周血淋巴细胞的总RNA,采用RT-PCR技术扩增水牛IFN-γ基因,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行测序.序列分析结果表明,获得的IFN-γ基因全长为544个碱基,其开放阅读框(ORF)为501个碱基,编码166个氨基酸.与GenBank上已发表的水牛、乳牛的IFN-γ基因进行同源性比较,其核苷酸同源性均高于97%,氨基酸同源性均高于96%;与其他种类动物的IFN-γ的.同源性相比,随其亲缘关系的远近有所降低.

作 者：熊毅 朱伟 徐贤坤 龙剑明 刘棋 XIONG Yi ZHU Wei XU Xian-kun LONG Jian-ming LIU Qi 作者单位：熊毅,朱伟,徐贤坤,刘棋,XIONG Yi,ZHU Wei,XU Xian-kun,LIU Qi(广西动物疫病预防控制中心,广西南宁,530001)

龙剑明,LONG Jian-ming(广西大学动物科学技术学院,广西南宁,530005)

刊 名：动物医学进展 PKU英文刊名：PROGRESS IN VETERINARY MEDICINE年，卷(期)：200728(9)分类号：Q785关键词：γ干扰素 克隆 序列分析 水牛

甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析 篇2

本研究旨在克隆黑番鸭GH基因组DNA序列,通过对其序列进行分析,了解GH基因特性,为进一步研究该基因的结构和功能,以及探讨该基因的遗传变异规律及其与生产性能的关系提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

采样时,从健康黑番鸭胫静脉采血,EDTA抗凝,-20℃保存。苯酚-氯仿抽提法提取基因组DNA,TE溶解,-20℃保存备用。

1.2 主要试剂

Taq酶、dNTPs和DL2000购自上海生工生物技术有限公司,DNA回收试剂盒购自TaKaRa公司,大肠杆菌DH5α为本实验室保存。

1.3 引物设计

根据GH基因信息(GenBank登录号为:AB158760),在各外显子的两侧DNA序列,采用Primer5.0设计引物。各对引物序列和扩增片段大小如表1所示。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

注:以上引物分别用于分离所对应的半番鸭GH基因组DNA片段。

1.4 PCR扩增

扩增总体系:总体积为20μL,DNA模板约50~100 ng,10×PCR缓冲液2.0μL,Mg2+为1.5 m M,dNTP终浓度为0.5 mmol/L,Taq DNA聚合酶0.4 U,正反向引物各0.5μmol/L,加ddH2O至20μL。

PCR程序:94℃,5 min;34×(94℃,30 s;56~62℃,1 min或30 s;72℃,1 min或30 s);72℃,10 min。因片段大小的不同,每对引物PCR扩增的退火温度和延伸时间不同(各引物对应退火温度见表1)。1%琼脂糖凝胶电泳检测扩增效果,凝胶成像系统拍照并记录。

1.5 克隆及测序

PCR产物经琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化后,与pMD18-T载体16℃连接过夜,转化感受态细胞DH5α,37℃过夜培养。取阳性菌落于含Amp的LB液体培养基中振荡培养,培养结束后进行菌液PCR扩增,并进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。鉴定正确后,取菌液送往上海生工生物工程技术服务有限公司测序。

1.6 序列分析

利用seqman软件进行序列拼接;用ORF finder分析核酸序列的开放读码框;用Blastn软件在GenBank数据库中进行序列搜索;运用Prosite工具进行蛋白基序分析;运用MegAlign多序列比对半番鸭及其他物种基因;用Clustal W构建进化树。

2 结果与分析

2.1 用于GH基因片段分离的各引物扩增结果

经PCR分段扩增黑番鸭GH基因的各片段序列,扩增产物经琼脂糖电泳后4对引物都出现预期大小分别为1 228 bp、1 055 bp、1 157 bp和1 403 bp的片段,如图1所示,1~4泳道分别为引物GH1、GH2、GH3、GH4对应的扩增产物。扩增的各段POU1F1基因产物分别经克隆和菌液PCR后,将菌液PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳检测结果与基因组DNA作为模版的PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果相比较,发现结果一致。

2.2 序列分析

2.2.1 核苷酸序列分析

将4对引物扩增片段进行序列拼接,得到一段长度为4 650 bp的DNA序列。将该段序列与GenBank数据库已有的GH基因进行序列比对(GeneBank收录号:AB158760),同源性达到99%,说明所获得序列为黑番鸭GH基因组序列。对该拼接序列进行分析,发现该段序列包含完整的内含子和外显子序列,由5个外显子和4个内含子组成,其中第1外显子长度为10 bp,第2外显子长度为164 bp,第3外显子长度为114 bp,第4外显子长度为162 bp,第5外显子长度为201 bp;该段序列包含651 bp的开放阅读框(ORF),编码含217个氨基酸的蛋白,推测其分子量为24.89 ku,等电点为7.32。

2.2.2 同源性分析

将克隆的黑番鸭GH基因编码的氨基酸序列与GenBank中其他物种的GH基因氨基酸序列进行同源性分析(图2所示),结果表明:黑番鸭GH基因编码的氨基酸序列与鸡(M35609)、鹅(AY149595)、猪(AY536527)、鹌鹑(FJ458436)、火鸡(M33697)、鸵鸟(AB028191)、和小鼠(NM008117)的同源性分别为92.9%、98.5%、75.9%、91.2%、91.8%、92.8%和74.8%。

基于8种物种GH基因氨基酸部分差异,对其彼此间的距离进行分析,构建了UPGMA系统进化树(见图3)。结果发现,同属雁形目鸭科的黑番鸭、鹅、和鸵鸟亲缘关系较近,聚为一大类;同属鸡形目雉科的家鸡、鹌鹑和火鸡等则聚为一大类;另外,小鼠和猪聚为一类。

3 讨论

分离和克隆基因是研究基因结构、功能及表达的基础。本试验以黑番鸭基因组模板,利用PCR方法扩增黑番鸭GH基因序列,得到长为4 650 bp的DNA序列。序列分析发现,完整的内含子和外显子序列,由5个外显子和4个内含子组成。通过同源性比较,可知黑番鸭GH基因编码的氨基酸序列与鸡、鹅、鹌鹑、火鸡和鸵鸟的同源性较高,都达到了91%以上。聚类分析的结果亦表明同属雁形目鸭科的黑番鸭、鹅、和鸵鸟亲缘关系较近,聚为一大类;同属鸡形目雉科的家鸡、鹌鹑和火鸡等则聚为一大类;另外,小鼠和猪聚为一类。

基因变异可导致群体中存在不同的等位基因,通过寻找与经济性状有正相关的等位基因,对开展畜禽的分子育种工作具有重要意义。不少学者已对GH基因开展了基因突变研究,吉文林等[4]对我国6个地方鸭品种GH基因编码区多态性进行了检测,发现第4外显子存在C3701T的突变;伍革民等[5]应用PCR-SSCP技术分析了5个品种鸭5'和3'调控区及部分外显子和内含子多态位点的检测,共检测到5个多态位点;李慧芳等[6]分析了GH基因对高邮鸭产蛋性能的遗传效应,发现第4外显子C3701T的突变对最长连产天数和双黄率有显著相关;许盛海等[7]对鸭GH基因的编码区及调控区多态性进行检测,发现了3个突变位点,并推测所检测的基因座可能与生产性能相关。而有关黑番鸭GH基因遗传变异的研究还未见报道,本研究对黑番鸭GH基因组DNA序列的成功克隆,将为研究黑番鸭GH基因的遗传变异及其与黑番鸭生产性能的关系提供理论依据。

摘要：根据GenBank中公布的鸭GH基因序列,设计4对引物,以黑番鸭血液基因组DNA为模板,采用PCR方法,扩增出GH基因4650bp的DNA序列,该序列包含了完整的内含子和外显子序列,由5个外显子和4个内含子组成。进一步将克隆的黑番鸭GH基因编码的氨基酸序列与GenBank中其他物种的该基因氨基酸序列进行同源性分析和聚类分析,结果表明:黑番鸭与其他禽类的同源性为91.2%98.5%。同属雁形目鸭科的黑番鸭、鹅、和鸵鸟亲缘关系较近,聚为一大类;同属鸡形目雉科的家鸡、鹌鹑和火鸡等则聚为一大类;另外,小鼠和猪聚为一类。

关键词：黑番鸭,GH基因,克隆,序列分析

参考文献

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纤维素酶系基因的克隆与序列分析 篇3

关键词： 纤维素酶；基因；克隆；序列分析

中图分类号： Q785 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0040-04

纤维素是地球上最丰富的可再生自然资源[1]。全球每年纤维素产量达2 000亿 t[2]，仅我国秸秆产量就达5亿～7亿t，大部分被焚烧、丢弃，不仅浪费资源，而且会对环境造成污染[3]。纤维素是一种无色、无味的白色丝状物，难溶于一般的有机溶剂及水，是植物细胞壁的主要组成部分。植物纤维素结构基本由结晶区域、无定型区域组成，纤维素结晶区域比无定型区域难降解[4]。酶解法是目前降解纤维素最有效的方法[5]。纤维素酶是能够分解纤维素、最终将其降解成葡萄糖的一类酶的总称。根据纤维素酶催化反应功能的不同可将其分为：（1）内切葡聚糖酶，这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键；（2）外切葡聚糖酶，这类酶作用于纤维素线状分子末端，水解β-1，4糖苷键；（3）β-葡萄糖苷酶，这类酶将纤维二糖水解成葡萄糖分子[6]。纤维素酶分子多数由球状的催化结构域（catalytic domains，CD）、连接桥（linker）、纤维素结合结构域（cellulose-binding domains，CBD）3个部分构成[7-9]。纤维素酶分布广泛，目前饲料用纤维素酶主要从微生物中获得。随着分子生物学、基因工程技术的发展，对纤维素酶分子层面研究也随之展开，纤维素酶基因的克隆与表达成了研究焦点。细菌、真菌的纤维素酶系不断被人们发现、分离，大量纤维素酶基因得到克隆、表达，丰富了纤维素酶的研究材料[10]。结构功能完整的纤维素酶基因克隆到高效表达载体上再进行异源表达，能使纤维素酶的产量成倍提高[11]。本试验对纤维素酶系内的3个纤维素酶基因进行克隆和序列分析，旨在为后续高效联合表达纤维素酶系基因进行研究准备。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与质粒 Bacillus subtilis K、Bacillus subtilis L均由实验室筛选并保存，大肠杆菌DH5α购于北京天根生化科技有限公司，pGEM-T Easy Vector System购于Promega公司。

1.1.2 主要试剂 DL 2000 Marker、溴酚蓝、琼脂糖购自北京天根生化科技有限公司；Taq酶、DNTP、各种限制性内切酶购自Promega公司；溴化乙锭（EB）、抗生素（Amp）购于北京索莱宝科技有限公司；RNA酶，蛋白酶K购于北京中科瑞泰生物科技有限公司；琼脂粉、蛋白胨购于Oxid公司。基因组提取试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA胶纯化回收试剂盒均购自于中科瑞泰（北京）生物科技有限公司。

1.1.3 引物 试验中的3对引物序列：

ENF： 5′-ATGAAACGGTCAATCTCTATT-3′；

ENR： 5′-CTAATTTGGTTCTGTTCCCCA-3′；

CENF：5′-ATGAAAAAGATCATGAGTGCAT-3′；

CENR：5′-TTATTCAGGAAACTGAACATGG-3′；

KGF：5′-ATGAGTGAATGGTGGAAAGAAG-3′；

KGR：5′-TCATATACTAATGCCCATCACAG-3′。

1.2 方法

LB培养基的配制：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化钠10 g，蒸馏水1 L，固体LB培养基加入20 g琼脂粉，120 ℃高压灭菌30 min。细菌基因组DNA的提取、质粒DNA的提取、DNA的凝胶回收参照试剂盒提供的说明进行。纤维素酶基因的PCR扩增、纤维素酶基因片段与T载体的连接、重组质粒导入感受态细胞、含纤维素酶基因的重组质粒的酶切鉴定参照《分子克隆试验指南》规定的方法进行。纤维素酶系基因的序列测定由北京擎科新业公司完成。用VectorNT软件和NCBI Blast 2.0在线软件对该纤维素酶基因的序列进行分析。

2 结果与分析

2.1 纤维素酶基因的克隆

根据GenBank公布的纤维素酶系的内切葡聚糖酶基因、外切葡聚糖酶基因、葡萄糖苷酶基因序列设计特异性引物：ENF（R）、CENF（R）、KGF（R），以提取得到的B.subtilis K、B. subtilis L基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增结果如图1所示。扩增得到的DNA片段大小分别为1 500、700、1 700 bp左右。根據来源不同分别将3个基因命名为Ken、Lcen、Kkg。

2.2 纤维素酶基因的鉴定

分别将片段回收，连接于T载体上转化到大肠杆菌培养，挑取单菌落，进行重组质粒PCR鉴定（图2-A），凝胶上有明显的DNA条带，与PCR扩增的结果一样。进行酶切鉴定（图2-B），凝胶上分别出现2条明显的DNA条带，一条大小约为3 kb与T-easy载体的片段大小一致，另一条带大小分别约为1 500、700、1 700 bp，与PCR扩增的结果一致。由此确定PCR扩增产物顺利连接到T-easy载体上，构建了3个基因与T-easy连接的重组质粒，分别命名为LcenT、KenT、KkgT。

2.3 纤维素酶基因的序列分析

将3个纤维素酶基因重组质粒LcenT、KenT、KkgT分别进行测序，并通过VectorNT软件和GenBank数据库对3个基因的序列进行分析。

2.3.1 Lcen基因的序列分析 对LcenT重组质粒进行测序，得到的基因序列如图3所示。

用VectorNT软件对Lcen基因序列进行分析发现，该基因全長699个碱基，组成1个完整的开放阅读框（open read frame，ORF），连续编码232个氨基酸，起始密码ATG，终止密码TAA。

利用NCBI网站上的Blast功能对该基因序列进行比对发现，基因Lcen与已报道的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因GU327817.1、CP003695.1、CP003329.1、AP012496.1、AP012495.1十分相似，相似度为99%。对其编码的氨基酸进行比对分析发现，该基因编码的氨基酸序列与已报道的枯草芽孢杆菌胞外的葡萄糖苷酶基因NP389744.1、YP007427045.1、YP004203797.1、YP006231826.1、ZP06873100.1的氨基酸序列十分相似，相似度达到95%。故可初步确定该基因来源于枯草芽孢杆菌，属于纤维素酶基因。

对基因编码的氨基酸序列进行分析和预测得知，该基因编码的氨基酸结构属于罕见的脂蛋白（RlpA）超家族，基因序列部分与罕见的脂蛋白、假定的EG45-like域包含蛋白1、内切葡聚糖酶c终端域/亚单位和相关蛋白质相似性高。

2.3.2 Ken基因的序列分析 对KenT重组质粒进行测序，得到的基因序列如图4所示。

用VectorNT软件对Ken基因序列分析，KenT的基因全长1 500个碱基，组成1个完整的开放阅读框，连续编码499个氨基酸。起始密码ATG，终止密码TAG。利用NCBI网站上的Blast功能对该基因序列进行比对发现，基因Ken的序列与已报道的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因FJ800366.1、EF070194.1、KC477685.1、CP002468.1、HM543165.1基因序列十分相似，相似度为99%。对其编码的氨基酸进行比对，该基因编码的氨基酸序列与已报道的枯草芽孢杆菌的内切葡萄糖苷酶基因NP389695.2、AFX88666.1、YP007209477.1、ACK38261.1的氨基酸序列十分相似，相似度达到99%。故可确定该基因来源于枯草芽孢杆菌，属于纤维素酶基因。

对该基因编码的氨基酸结构进行分析预测发现，该基因编码的氨基酸属于水解酶超级家族，整体由2个主要部分组成（图5），一部分为纤维素酶区域（cellulase，图5-A），一部分为纤维素酶的绑定区域（CBM-3，图5-B），其中的纤维素酶区域结构符合糖基水解酶家族5的结构特征。

2.3.3 Kkg基因的序列分析 对KkgT重组质粒进行测序，得到的基因序列如图6所示。

用VectorNT软件对Kkg基因序列分析，Kkg基因全长1 686个碱基，组成1个完整的开放阅读框，连续编码561个氨基酸。起始密码ATG，终止密码TGA。

利用NCBI网站上的Blast功能对该基因序列进行比对发现，Kkg的基因序列与已报道的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因cp002468.1、CP003695.1、CP003329.1、AP012496.1、AP012495.1序列十分相似，相似度为99%。对其编码的氨基酸进行比对分析发现，该基因编码的氨基酸序列与枯草芽孢杆菌1，4-6-α-葡糖苷酶基因YP004205293.1、YP007208039.1、YP007428400.1、YP007664110.1、ZP12669813.1的氨基酸序列十分相似，相似度达到99%。故可初步确定该基因来源于枯草芽孢杆菌，属于纤维素酶基因的类别。对该基因编码的氨基酸结构进行分析和预测发现，该基因编码的氨基酸属于 α-淀粉酶的超家族，基因编码的氨基酸序列上包含纤维素酶活性部位、Ca绑定结构域、催化部位（图7）。

3 结论与讨论

纤维素酶的应用非常广泛，然而天然纤维素酶由于酶活较低以及成本高等因素的限制，对于大规模的工业化应用有一定困难。近年来，随着分子生物学和基因工程技术的发展，对纤维素酶分子层面的研究也随之展开，纤维素酶基因的克隆与表达成了研究焦点。 目前常用的基因克隆方法有人工合成法、PCR扩增法以及构建基因文库等[12]。本试验通过GenBank检索枯草芽孢杆菌纤维素酶基因，根据基因的编码序列设计3对引物，从B. subtilis K、B. subtilis L基因组DNA扩增出了3个基因片段，通过测序得到基因序列。枯草芽孢杆菌是目前细菌纤维素酶基因的主要来源，已报道的大部分纤维素酶基因均从枯草芽孢杆菌中获得[13-14]。已报道的枯草芽孢杆菌纤维素酶基因大多数属于内切葡聚糖酶（endo β-1，4 glucanase）基因[14]。在纤维素酶基因克隆上，不论是从何种微生物上进行克隆，大部分报道均是克隆获得1个基因。本试验同时从Bucillus subitilis K基因组DNA中克隆得到2个纤维素酶基因Ken、Kkg，其中Ken大小为 1 500 bp，与已报道的大多数枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因一致，属于纤维素水解酶家族；Kkg基因全长1 686 bp，与已报道的枯草芽孢杆菌1，4-6-α-葡糖苷酶基因一致，在结构分析上，该基因属于α-淀粉酶的超家族。

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甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析 篇4

人溶菌酶基因cDNA的克隆和序列分析

根据GenBank中的人溶菌酶(hLYZ)mRNA序列设计引物,以人胎盘组织总RNA为模板,通过RT-PCR方法扩增出长度为0.85kb的hLYZ cDNA序列,经过序列测定表明所克隆的片段与已发表的`hLYZ cDNA序列的同源性为99%.推导的氨基酸序列经blastp分析与人溶菌酶蛋白质前体的同源性为97%,成熟肽的同源性为99%,为进一步构建人溶菌酶基因乳腺特异性表达载体奠定了基础.

作 者：何晓宁 彭树英 杨瑞锋 刘凤军 郑月茂 张涌 作者单位：西北农林科技大学生物工程研究所,陕西,杨陵,712100刊 名：安徽农业科学 ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF ANHUI AGRICULTURAL SCIENCES年，卷(期)：200634(11)分类号：Q78关键词：人溶菌酶 cDNA 克隆 序列分析

甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析 篇5

2.1 „黄花梨‟CYP707A基因的克隆从„黄花梨‟花芽上克隆得到2个CYP707A基因序列，通过DNAMAN比对，发现两者之间的相似性高达94.27%（图2），氨基酸相似性94.96%。为此，从梨基因组数据库找到2个基因的内含子和外显子基因组序列进行比对，结果显示其相似性为69.95%，说明这2个CYP707A基因为相似性较高的不同基因。将克隆到的„黄花梨‟CYP707A 基因分别定名为PpCYP707A4（Genbank登录号：KP279630）、PpCYP707A5（Genbank登录号：KP279631）。

PpCYP707A4的CDS序列全长为1 431 bp，编码476个氨基酸；其氨基酸序列与苹果（Malus domestica XP_008346457.1）相似性97%，与碧桃（Prunus persica XP_007210577.1）

龙源期刊网 http:// 相似性90%，与梅（Prunus mume XP_008245093.1）相似性87%，与草莓（Fragaria vesca subsp.Vesca XP_004300683.1）相似性83%，与甜橙（Citrus sinensis NP_001275876.1）相似性84%。

安徽农业科学2015年PpCYP707A5的CDS序列全长为1 425 bp，编码474个氨基酸；其氨基酸序列与苹果（Malus domestica XP_008382035.1）相似性 97%，与碧桃（Prunus persica XP_007210577.1）相似性89%，与梅（Prunus mume XP_008245093.1）相似性86%，与草莓（Fragaria vesca subsp.Vesca XP_004300683.1）相似性84%，与甜橙（Citrus sinensis NP_001275876.1）相似性85%。

在线blastp分析，2个PpCYP707As基因均具有1个保守结构域，为PLN02196（图3），属于P450超基因家族。以PpCYP707A4和PpCYP707A5的氨基酸序列作为参考，从NCBI数据库上blast其他物种的CYP707A氨基酸序列，构建系统发育树。仅苹果blast到2个基因（XP_008346457.1、XP_008382035.1），其他物种均只blast到1个基因。系统发育树分析显示（图4），蔷薇科植物的CYP707A基因聚为一大支，PpCYP707A4与苹果XP_008346457.1基因，PpCYP707A5与苹果XP_008382035.1基因单独聚类。

注：a.„黄花梨‟总RNA； b.PpCYP707A4 PCR扩增； c.PpCYP707A5 PCR扩增。

图1电泳图谱图22个PpCYP707As的核苷酸序列比对注：a.PpCYP707A4蛋白的保守结构域； PpCYP707A5蛋白的保守结构域。

图3蛋白保守结构域图42个PpCY707As系统进化树2.2蛋白性质预测采用ExPASy ProtParam、TMpred、SignalP 4.1预测蛋白性质和Prot预测亚细胞定位，结果显示，PpCYP707A4蛋白的理论分子质量为54.4 kDa，理论等电点为9.01，不稳定系数为48.48，属于不稳定蛋白，分子式可写为C2493H3901N645O679S20，原子数7 338，带负电荷（Asp + Glu）氨基酸50，带正电荷（Arg + Lys）氨基酸59，脂溶系数为9239，GRAVY为-0.100，是亲水性蛋白；在6～23位点含有一个由内向外的跨膜螺旋结构，8～26位点有一个由外向内的跨膜螺旋结构；不含信号肽，为非分泌蛋白；并定位在内质网，概率为0.820。PpCYP707A5蛋白的理论分子质量为54.1 kDa，理论等电点为9.03，不稳定系数为47.78，属于不稳定蛋白，分子式可写为C2481H3874N640O673S21，原子数7 689，带负电荷（Asp + Glu）氨基酸49，带正电荷（Arg + Lys）氨基酸59，脂溶系数为91.96，GRAVY为-0.089，是亲水性蛋白。在6～23位点含有一个由内向外的跨膜螺旋结构，8～27位点有一个由外向内的跨膜螺旋结构。与PpCYP707A4蛋白相同，也不含信号肽，为非分泌蛋白；定位在内质网，概率为0.820。

2.3蛋白结构预测采用Npsa-pbil、NetPhos 2.0 Server在线工具预测蛋白质二级结构、磷酸化位点。PpCYP707A4有243个氨基酸残基形成α-螺旋，32个形成β-螺旋，78个形成延伸链和132个形成无规则卷曲；有12个丝氨酸（serine，S）残基、7个苏氨酸残基（threonine，龙源期刊网 http:// T），2个酪氨酸（tyrosine，Y）参与磷酸化过程。PpCYP707A5有226个氨基酸残基形成α-螺旋，27个形成β-螺旋，81个形成延伸链和140个形成无规则卷曲；有13个丝氨酸（serine，S）残基、6个苏氨酸残基（threonine，T），3个酪氨酸（tyrosine，Y）参与磷酸化过程。Swiss-model预测蛋白三级结构，结果显示PpCYP707A4、PpCYP707A5蛋白的QMEAN4值分别为-5.67、-4.79，三级结构存在较大差异（图5）。

注：a.PpCYP707A4蛋白三级结构； b.PpCYP707A5蛋白三级结构。

图5预测的2个PpCYP707A蛋白三级结构3 讨论

休眠的长短决定落叶果树的地理分布，是落叶果树的重要性状之一[7]。我国梨的种质资源大体分为北方品种群和南方品种群，北方品种群的特点为抗寒力较强、休眠期较长，南方品种群表现出早熟、休眠期短等优势[8]。„黄花梨‟在福建省建宁县能够正常开花结果，产量较大，而在纬度较低的福建省上杭县其萌芽不整齐的现象明显，休眠期的长短对于„黄花梨‟的产量和栽培具有重要的制约作用，休眠影响梨品种的选育和梨产业的发展，研究梨的休眠意义重大。对桃[3]、大樱桃[9-10]、欧洲甜樱桃[11]、葡萄[12]、牡丹[13]等的研究表明ABA的含量变化是影响木本植物芽休眠进程的重要因素。从分子水平探讨ABA调控梨花芽休眠进程的分子机制，将有利于构建梨休眠的调控网络，从而有助于梨品种的选育。

该研究从„黄花梨‟上分离到ABA分解途径关键酶基因PpCYP707A4和PpCYP707A5，采用生物信息学方法分析其核苷酸序列、氨基酸序列，构建相关系统发育树并预测蛋白结构。分析结果显示，PpCYP707A4与PpCYP707A5核苷酸序列和氨基酸序列相似度较高，为94.27%和94.96%，两者蛋白理化性质相近，符合家族基因的特点。系统进化树显示，„黄花梨‟的PpCYP707A4和PpCYP707A5与苹果的2个基因（XP_008346457.1、XP_008382035.1）分别单独聚类，而非PpCYP707A4和PpCYP707A5独自聚类。对苹果[14]、大豆[15]、剑兰[16]的研究结果也显示CYP707A家族基因在系统发育树并未单独聚为一类而是分散到几类中。梨基因组数据发表后，Wu等[17]认为蔷薇科的染色体是由祖先7个染色体发展形成的，梨和苹果基因组之间具有高共线性。该研究克隆的2个基因很可能产生于梨和苹果的共同祖先，而后遗传给梨和苹果。CYP707A是一个多基因家族，它们在不同组织中的转录模式不同[2]，以功能交迭的方式参与环境胁迫应答[4，18-19]、休眠解除[20]等不同的生理反应过程，共同调控植物体内源ABA的分解。因而，需进一步研究该基因家族各基因的特性，研究它们的生物学功能，为开展„黄花梨‟花芽休眠的研究提供信息，为短低温梨品种的选育奠定基础。

参考文献

[1] 廖光升.黄花梨低温需冷量研究[J].落叶果树，2010（1）： 4.[2] 许智宏，薛红卫.植物激素作用的分子机理[M].上海： 上海科学技术出版社，2012： 67-69.龙源期刊网 http:// [3] 王海波，高东升，王孝娣，等.赤霉素和脱落酸与桃芽自然休眠诱导[J].果树学报，2006，23（4）： 599-601.[4] SAITO S，HIRAI N，MATSUMOTO C，et al.Arabidopsis CYP707As encode（+）-abscisic acid 8′-hydroxylase，a key enzyme in the oxidative catabolism of abscisic acid[J].Plant Physiology，2004，134（4）： 1439-1449.[5] NAMBARA E，MARION-POLL A.Abscisic acid biosynthesis and catabolism[J].Annu Rev Plant Biol，2005，56： 165-185.[6] KUSHIRO T，OKAMOTO M，NAKABAYASHI K，et al.The Arabidopsis cytochrome P450 CYP707A encodes ABA 8′‐hydroxylases： key enzymes in ABA catabolism[J].The EMBO Journal，2004，23（7）： 1647-1656.[7] 王海波，高东升，王孝娣，等.落叶果树芽自然休眠诱导的研究进展[J].果树学报，2006，23（1）： 91-95.龙源期刊网 http://

龙源期刊网 http://

甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析 篇6

真核生物的翻译起始因子5A (eIF5A)是调控生物生长发育、衰老及环境适应等的重要因子.利用设计的小麦蛋白翻译起始因子5A基因的引物对小麦“中国春”基因组DNA和cDNA进行PCR扩增,并将扩增的特异片段回收、克隆和测序,从基因组DNA中得到长度分别为1 679 bp、1 910 bp两条带,从cDNA扩增得到1条636 bp带,分别命名为eIF5a1(基因登录号:DQ167202)、eIF5a2(基因登录号:DQ167201)和eIF5a3.利用GeneRace方法得到eIF5a3(基因登录号:DQ167203)的.全长为768 bp.序列分析表明,eIF5a1、eIF5a2具82.3%相似性,都形成636 bp的转录产物,转录产物仅6个核苷酸差异.将eIF5a1、eIF5a2和 eIF5a3这3个序列的预测氨基酸序列进行比对,发现仅有1～2个氨基酸的差异,证实它们为eIF5A基因家族的成员.进化分析表明它们与报道的玉米、水稻、西红柿、烟草的eIF5A基因序列的遗传关系最近.进一步研究表明eIF5a2位于2B染色体上,并用半定量RT-PCR 研究了小麦eIF5A基因的表达情况.

作 者：周建平杨足君 冯娟 迟世华 刘成 任正隆 ZHOU Jian-Ping YANG Zu-Jun FENG Juan CHI Shi-Hua LIU Cheng REN Zheng-Long 作者单位：电子科技大学生命与技术学院,成都,610054刊 名：遗传 ISTIC PKU英文刊名：HEREDITAS(BEIJING)年，卷(期)：28(5)分类号：Q94关键词：eIF5A 小麦 半定量RT-PCR 进化

甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析 篇7

1 材料与方法

1.1 毒株

病毒株Go/CH/FJ/1/06 (F1) 、Mallard/CH/HLJ001/06 (JL01) 、CK/CH/HLJ/1/06 (ZY) 由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室分离、鉴定并保存。F基因序列分析表明, Go/CH/FJ/1/06 (F1) 为基因Ⅱ型, Mallard/CH/HLJ/1/06 (JL01) 和CK/CH/HLJ/1/06 (ZY) 为基因Ⅶ型[1]。病毒株QY97由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所禽传染病研究室保存, 为基因Ⅶ型。

1.2 引物的设计与合成

根据已发表的NDV NP基因序列设计并合成引物, 序列为P1 5′- ACGGGTAGAAGGTGTGAA- 3′, P2 5′- GGCTGGGTGTTGTCGAT- 3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成, 其扩增片段长度约为1.5 kb。

1.3 RT - PCR扩增NP基因

按照Invitrogen公司的Trizol试剂说明书提取NDV RNA。将提取的病毒RNA溶于9.5 μL DEPC处理的水中, 与1 μL上游引物P1混匀, 70 ℃温育5 min, 冰浴5 min以消除RNA的二级结构;然后加入5×反应缓冲液4 μL, dNTP 混合物4 μL, 反转录酶1 μL, 混匀, 37 ℃反转录90 min;然后95 ℃作用5 min, 冰浴5 min灭活反转录酶活性后进行PCR。PCR 反应条件为94 ℃ 40 s, 58 ℃ 40 s, 72 ℃ 90 s, 共35个循环;最后72 ℃延伸10 min。扩增产物通过0.8%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.4 目的基因的克隆与鉴定

将扩增的PCR产物经胶回收试剂盒纯化后, 与pMD18-T载体连接, 转化至DH5α感受态菌中, 挑取单个菌落, 按碱裂解法提取质粒, 经质粒PCR和质粒酶切初步鉴定为阳性后, 送北京华大基因工程公司进行序列测定。

1.5 序列分析

采用DNASIS软件对获得的4株病毒的NP基因与其他序列比较, 文中所用参考毒株见表1。

2 结果

2.1 NP基因的RT-PCR扩增结果

应用所设计的引物进行RT-PCR扩增, 结果扩增出了1条长度约为1.5 kb的目的条带, 与设计结果大小相符, 见图1。

1.QY97; 2.F1; 3.JL01; 4.ZY; 5.空白对照; 6.DL-2 000 Marker。

2.2 重组质粒的PCR及酶切鉴定结果

应用设计的引物可从重组质粒中扩增出与设计结果大小一致的1.5 kb左右的特异性片段。挑选的阳性重组质粒经EcoR Ⅰ + Pst Ⅰ双酶切后, 切出长约2. 69 kb的载体片段和1.5 kb左右的目的基因 (见图2) , 证明重组质粒为阳性。

1～4.质粒PCR结果;5.对照;6. λ-EcoT14 digest;7～10.质粒酶切结果。

2.3 序列分析

获得的NP基因全长1 470 bp, 编码483个氨基酸, 通过序列比较发现:NP基因的5′端高度保守, 而其3′端400～489位氨基酸之间存在一定的差异。全长基因的同源性为89%～100%, 而3′端400～489位氨基酸强弱毒之间的同源性为67.5%～100%;弱毒株之间比较保守, 同源性为95.3%～100%;强毒株中同一基因型之间的同源性为84.4%～100%。NP蛋白400～490位氨基酸之间差异较明显, 见图3。

3 讨论

NP蛋白在新城疫病毒结构蛋白中相对保守, 主要与病毒的复制作用相关。在病毒的组装过程中, NP蛋白可能和M蛋白结合, M蛋白与NP蛋白的结合可以介导核衣壳与病毒囊膜相互反应, 从而引起病毒粒子的出芽和子代病毒从细胞质膜的释放。本研究扩增的4株新城疫的NP全长基因共1 470 bp, 编码489个氨基酸。研究表明, 缺失443～460位氨基酸, 不影响NDV的复制。对蛋白的二级结构进行分析, 444～459位氨基酸形成一个α螺旋, 缺失444～455位氨基酸和442～489位氨基酸后, 不能获得具有感染性的病毒, 分析442～489位可能是NP蛋白的重要功能区[2]。R Ahmad-Raus以纯化的重组NDV NP蛋白免疫获得了6株针对NP蛋白线性表位的单克隆抗体, 并对其中3个单克隆抗体对应的位点进行了定位 (分别位于NP蛋白的441～489位, 22～121位, 122～375位氨基酸之间) , 并由此说明NP蛋白的N端和C端能够引起免疫反应, 暴露于蛋白的外部[3]。

NP基因在NDV的结构蛋白中属于比较保守的一个, Jacqueline A K等[4]对1998—2002年间分离病毒的NP基因序列进行比较, 同源性达99%。本试验扩增了4株新城疫病毒的NP基因, 序列比较结果表明, 全长基因的同源性在89%～100%之间, NP基因的5′端序列高度保守, 而3′端400～489位氨基酸在不同毒株之间存在一定的变异。弱毒株之间序列高度保守, 而强毒株在同一基因型内部序列相对保守, 同源性均在84.4%以上;不同基因型之间毒株的同源性最低可达67.5%。这说明NP基因在病毒的进化过程中呈现一定的变异规律。Teshome M等的研究表明, 442～489位氨基酸可能是NP蛋白的重要功能区, 新城疫病毒毒力相关的因素是由多种原因造成的, 置换毒株的F基因并没有改变其致病性。NP蛋白具有天然的高度免疫原性, 但是不具有免疫保护性, 以NP蛋白免疫, 强毒攻击后会引起高度致死性, 那么NP基因在3′端的不同是否也会对病毒的毒力发挥作用, 还是仅仅与病毒的复制相关[5]?由于NP基因序列的高度保守而常常被用于病原的检测, 那么NP基因3′端在强弱毒株上的差异提示可以根据该序列的差异研制适合的诊断方法, 以作为区分疫苗免疫和强毒株感染的标志, 这还有待于进一步的研究。

参考文献

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甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析 篇8

关键词：DAZL基因；序列；克隆；表达载体

中图分类号： S823.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0034-03

收稿日期：2014-03-21

基金项目：黑龙江省普通高等学校动物遗传育种与繁殖重点实验室开放课题（编号：GXZDSYS-2012-07）；东北农业大学博士启动基金（编号：2012RCB27）。

作者简介：郑鹏（1979—），男，黑龙江兰西人，博士，讲师，主要从事动物繁殖生理与繁殖技术研究。E-mail：zh-96128@163.com。

通信作者：张贵学，博士，教授，博士生导师，主要从事动物繁殖生理与繁殖技术研究。E-mail： gxzhang@neau.edu.cn。Deleted in azoospermia like （DAZL）基因是DAZ基因家族中的一员，最早克隆于蝇类的睾丸组织，是一个在进化上高度保守的基因，在脊椎动物的生殖细胞中特异表达，是生殖细胞形成所必须的调控因子。DAZL通过RNA识别基序与mRNA结合，并以多聚体的方式在翻译水平发挥作用[1]。DAZL基因是BOULE基因通过基因修饰、倍增而来，广泛分布于人类、鼠、爪蟾、蝾螈、斑马鱼、青鱼等物种中[2]。许多物种的DAZL同系物对生殖细胞的分化都是非常重要的。DAZL基因的突变、微缺失以及表达下调均可引起生精障碍，导致雄性不育[3]。Ruggiu等发现，与正常鼠相比，杂合DAZL基因缺陷鼠的畸形精子率增高，但仍有正常生育力，而纯合鼠表现为严重的生殖细胞减少，成熟阻滞，睾丸体积减小，不能生育[4]。此外，Schrans-Stassen等研究证实，DAZL基因敲除鼠表现出双睾丸干细胞数目减少、以及减数分裂早期精原细胞分化失败，从而导致不育[5]。因此，研究DAZL基因及其编码蛋白对探索配子发生和成体生殖缺陷及修复具有重要意义。本试验主要对DAZL基因进行克隆和开展生物信息学分析，并构建牛DAZL基因真核表达载体pEGFP-N3-DAZL，以期为探索DAZL基因的功能和在精子发生过程中的作用提供前期基础和试验依据。

1材料与方法

1.1试验材料

成年牛（约40月龄）睾丸组织，取自哈尔滨成高子屠宰场；Trizol Reagent和lipofectamine2000购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自ABI公司，pEASY-T1 Simple Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司，T4 DNA连接酶购自NEB公司 DMEM/F12、胎牛血清购自Gibco公司，PrimeSTAR HS DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及其他常规试剂均购自大连宝生物公司。

1.2试验方法

1.2.1牛DAZL基因的生物信息学分析利用DNAStra软件分析DAZL的一级结构；采用Clustal X进行DAZL基因同源性多重比对；采用MEGA4程序构建分子进化树。

1.2.2牛DAZL基因真核表达载体的构建参照GenBank牛DAZL基因序列（NM_001081725）设计其编码区特异性克隆引物F：CGGAATTCTATGTCTGCTGCAAATCCTGAGACTC和R：CGGATCCAACAGACTTAAGCACTGCCCGACTT（上、下游分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点），引物由华大基因公司合成。利用Trizol法提取成牛睾丸组织总RNA，并反转录成cDNA，以其为模板，利用高保真Prime-STAR HS DNA聚合酶对牛DAZL基因全长编码区进行RT-PCR扩增，目的片段经凝胶回收加A后连接到pEASY-T1 simple载体上，进一步亚克隆到pEGFP-N3载体上。构建好的质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定后，送往北京华大公司测序。

2结果

2.1DAZL基因的生物信息学分析

2.1.1DAZL基因一级结构分析牛DAZL基因的CDS全长为888 bp，由264个腺嘌呤（A）、194个胞嘧啶（C）、187个鸟嘌呤（G）和243个胸腺嘧啶（T）组成，4种碱基的含量依次为29.73%、21.85%、21.06%、27.36%。该基因ORF位于 1 888 bp，编码295个氨基酸，含29个强碱性氨基酸残基（K，R），24个强酸性氨基酸（D，E），82个疏水性氨基酸残基（A、I、L、F、W、V），103个极性氨基酸残基（N、C、Q、S、T、Y），分子量为33.02 Ku，等电点为8.78，脯氨酸、丝氨酸、缬氨酸所占比例较高。

2.1.2DAZL基因同源性分析从NCBI的GenBank数据库中选取人（Homo sapiens）、大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠（Mus musculus）、牛（Bos taurus）、中国牦牛（domestic yak）、猪（Sus scrofa）、狨猴（Callithrix jacchus）、松鼠猴（Saimiri sciureus）、小黑猩猩（Pan paniscus）、獠狨（Saguinus oedipus）、原鸡（Gallus gallus）共11个物种的DAZL基因，采用Clustal X进行多重比对，结果显示牛与中国牦牛的同源性最高，为99%，与小鼠、人、狨猴、小黑猩猩、猪、獠狨、松鼠猴、大鼠、原鸡的同源性分别为98%、97%、97%、97%、97%、96%、96%、92%、80%（图1）。

nlc202309012308

2.1.3分子进化树构建使用MEGA4程序，采用 Neighbor-Joining 算法，Bootstrap设为1 000，构建分子进化树，从树的拓扑结构上来看，牛的DAZL基因与中国牦牛的关系最近，与大鼠和小鼠一同构成了一个小群，同人、獠狨、猪共同构成一个亚类群（图2）。

2.2DAZL基因编码区的克隆

提取的RNA进行反转录合成cDNA，检测内参基因和DAZL基因的表达情况，结果发现成年牛睾丸中有DAZL基因的表达。

以成年牛睾丸组织cDNA为模板进行PCR扩增，扩增出1条与预期长度相符的片段，得到了DAZL基因的全部编码区（图3-A）。将扩增出与预期长度相符的片段进行胶回收，与PMD18-T载体连接、转化，对构建的载体进行PCR鉴定和EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定，结果显示在902 bp处出现特异条带（图3-B、图3-C），与预期的插入片段大小相符。

2.3表达载体的制备与鉴定

将DAZL-PMD18-T和PEGFP-N3进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切、胶回收，然后按摩尔比1 ∶1的量，用T4 DNA连接酶进行连接，得到构建的载体，然后将构建好的DAZL表达载体进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切及PCR鉴定，琼脂糖凝胶检测为所要片段大小（图4）。转化，挑菌阳性克隆进行序列测定，测序正确的质粒用于下一步的试验。

3讨论

不同物种DAZL基因具有高度的同源相似性，参与调控生殖细胞的发育和分化。有研究表明，DAZL基因的缺失或突变会引起精子发生过程中减数分裂阻滞，导致精子缺乏和男性不育[3]。小鼠DAZL基因突变可影响两性生殖细胞的功能，DAZL基因敲除鼠表现出不育[5]。DAZL和BOULE都是DAZ家族的重要成员，二者都具有典型的RNA识别基序（RNA recognition motifs，RRM）和DAZ重复序列[6]，能够与一系列影响精子发生基因的mRNA结合，如CDC25A、TPX1、DDX4和TSSK3等[7]，并以多聚体的方式在翻译水平发挥作用。

将目的基因超表达是研究基因功能的主要手段之一[8-9]，即将目标基因与合适的载体相连接，使其在体外或体内过量表达，观察该基因超量表达后细胞或组织或机体所发生的表型变化，从而对该基因的功能作出评价。Yu等利用DAZL基因的超表达技术，将胚胎干细胞诱导分化成精子样细胞[10-11]，可见DAZL基因是精子发生的一个主要基因。本试验扩增牛DAZL基因的编码区，构建了PEGFP-N3-DAZL表达载体，为进一步探讨DAZL基因超表达的体细胞能否向精细胞方向分化、DAZL基因超表达的生殖干细胞能否加速分化形成精子奠定基础。

4结论

本试验成功构建了牛DAZL基因的带绿色荧光蛋白的真核表达质粒pEGFP-N3-DAZL，为阐明DAZL基因调控精子发生的机制奠定基础。

参考文献：

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甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析 篇9

采用荧光差显(fluorescent differential display,FDD)技术,比较分析了干旱处理与未处理水稻叶片及根中的mRNA表达,并利用H.A.Yellow-PAGE(含0.1% H.A.Yellow)再分离与大矩阵(macroarray)筛选相结合的方法,发现1个与拟南芥NADPH氧化还原酶高度相似(96%)的差异片段.该基因的.cDNA全长为1423 bp,编码一个具有345个氨基酸残基的多肽.在正常情况下该基因表达量很低,而在干旱处理中高表达.讨论了干旱胁迫下NADPH氧化还原酶基因的可能功能.

作 者：陈静 姜华 万佳 高晓玲 王平荣 席江 徐正君 CHEN Jing JIANG Hua WAN Jia GAO Xiao-ling WANG Ping-rong XI Jiang XU Zheng-jun 作者单位：陈静,万佳,高晓玲,王平荣,席江,CHEN Jing,WAN Jia,GAO Xiao-ling,WANG Ping-rong,XI Jiang(四川农业大学,水稻研究所,四川,温江,611130)

姜华,徐正君,JIANG Hua,XU Zheng-jun(四川农业大学,水稻研究所,四川,温江,611130;四川农业大学,作物基因资源与遗传改良教育部重点实验室,四川,雅安,625014)

甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析 篇10

白菜型油菜PABP5基因启动子的克隆及表达特性分析

本研究中利用基因组步移法从白菜型油菜中克隆到Poly(A)结合蛋白基因PABP5起始密码子上游长588 bp的一段序列,经软件分析预测表明,该序列具有典型的启动子结构,并且具有多个与花药特异性表达相关的顺式作用元件,如TATA box,CAAT box,AGAAA motif,AGGTCA motif,AAACCCTAA motif,GTGA motif等.为了研究该片段的表达特性,本文将克隆到的序列置换pPBI121中的CaMV35S启动子,驱动其下游的.GUS基因,构建了植物表达载体,转化拟南芥,获得了转基因植株.组织化学染色表明,在PABP5启动子Ppabp5的驱动下,报告基因GUS在拟南芥的根尖、第一片真叶叶原基以及花药中特异表达.本研究为PABP5基因的进一步功能研究奠定了基础.

作 者：石磊 董彩华 白泽涛 郭学兰 柴国华 黄军艳 刘胜毅 Shi Lei Dong Caihua Bai Zetao Guo Xuelan Chai Guohua Huang Junyan Liu Shengyi  作者单位：中国农业科学院油料作物研究所,农业部油料作物生物学重点开放实验室,武汉,430062 刊 名：分子植物育种 英文刊名：MOLECULAR PLANT BREEDING 年，卷(期)：2009 7(2) 分类号：S6 关键词：白菜型油菜   PABP5   启动子   拟南芥   花药特异性表达