部分蔬菜CMV分离物CP基因的克隆及序列分析

部分蔬菜CMV分离物CP基因的克隆及序列分析（共2篇）

部分蔬菜CMV分离物CP基因的克隆及序列分析 篇1

对来自国内不同地区、不同蔬菜作物上的8个黄瓜花叶病毒分离物,采用一步法RT-PCR扩增得到CP基因全长片段,分别克隆到pMD-18T载体并测序.结果表明,本研究8个分离物的CP基因均为657个碱基,可编码218个氨基酸,它们之间的核苷酸序列同源性较高,达92.8%～99.1%;将它们与GenBank中部分CMV CP基因序列比较,显示出与CMV亚组Ⅰ株系的`核苷酸序列同源性达90.7%～98.0%,而与亚组Ⅱ株系的核苷酸序列同源性仅有75.8%～78.1%.因此,这8个分离物应归属于CMV亚组Ⅰ.

作 者：陈伟 罗静 庄木 李艳红 冯兰香 王晓武 谢丙炎 刘玉梅 方智远 Chen Wei Luo Jing Zhuang Mu Li Yanhong Feng Lanxiang Wang Xiaowu Xie Bingyan Liu Yumei Fang Zhiyuan 作者单位：陈伟,罗静,Chen Wei,Luo Jing(首都师范大学生命科学学院,北京,100037;中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京,100081)

庄木,冯兰香,王晓武,谢丙炎,刘玉梅,方智远,Zhuang Mu,Feng Lanxiang,Wang Xiaowu,Xie Bingyan,Liu Yumei,Fang Zhiyuan(中国农业科学院蔬菜花卉研究所,北京,100081)

李艳红,Li Yanhong(首都师范大学生命科学学院,北京,100037)

刊 名：园艺学报 ISTIC PKU英文刊名：ACTA HORTICULTURAE SINICA年，卷(期)：33(5)分类号：S63关键词：黄瓜花叶病毒 CP基因 RT-PCR 序列分析

部分蔬菜CMV分离物CP基因的克隆及序列分析 篇2

PRRSV有2个基因型, 分别为美洲基因型 (VR2332) 和欧洲基因型 (LV) , 目前我国发现的基因型均与美洲基因型的亲缘性接近[4]。PRRSV基因组由8个开放阅读框 (ORF) 组成, 分别为ORFla、OR-Flb、ORF2、ORF3、ORF4、ORF5、ORF6和ORF7, 其中ORF5编码病毒的主要结构蛋白GP5[5,6,7]。GP5蛋白是PRRSV最重要的蛋白, 含有一个与中和病毒有关的重要区域, 含2~4个糖基化位点, 其中2个N糖基化位点在美洲株和欧洲株中最保守区为前导序列, 可能起膜锚定作用。此外, GP5还含有1个美洲型和欧洲型毒株都能识别的抗原表位, 这提示该抗原表位可以作为诊断PRRSV的靶位, 可见ORF5基因可作为PRRSV重组核酸疫苗最重要的候选基因之一[8]。

本研究通过对分离获得的3株PRRSV的ORF5基因进行测序分析, 掌握不同地区PRRSV的变异规律, 从而指导生产, 也为研究新型疫苗提供资料。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

Marc-145细胞系, 由广东大华农动物保健品股份有限公司技术中心农业部动物疫病防控生物技术与制品创制重点实验室馈赠;编号为ZJ-1、ZJ-4的肺脏采自浙江某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征的病猪, 编号为ANH-1的肺脏采自安徽某猪场疑似猪繁殖与呼吸综合征的病猪;DMEM, Invitrogen Corporation公司生产;DL-2 000 Marker、DL-1 000 Marker、低熔点琼脂糖、RT-PCR一步法试剂盒 (Prime ScriptTMOne Step RT-PCR Kit Ver.2) , Ta KaRa公司生产;RNA提取试剂盒 (Axy Prep Body Fluid Viral DNA/RNA Miniprep Kit) 和胶回收试剂盒 (Gel Extraxtion Kit) , AXYGEN公司生产;PRRSV (NSP21594-1680变异株) RT-PCR检测试剂盒, 世纪元亨公司生产;琼脂糖, 广州健阳生物科技有限公司生产;中性红, Sigma公司生产;其他试剂均为国产分析纯。

1.2 病料的处理

取2 g肺脏, 研磨后置于10 m L EP管中, 加入5 m L灭菌生理盐水, 振荡混匀, -20℃反复冻融3次, 12 000 r/min离心10 min;取上清液, 先后经0.45μm、0.22μm过滤器过滤, 收集病毒滤液, -80℃保存, 备用。病毒滤液编号对应病料编号。

1.3 病毒的分离与增殖

取-80℃保存的病毒滤液200μL, 加800μL无血清的DMEM, 接种单层Marc-145细胞, 于37℃、5%CO2培养箱中吸附1 h, 在吸附过程中每隔15 min轻轻摇动1次, 1 h后弃去液体;然后加入含2%胎牛血清 (FBS) 的DMEM, 置37℃、5%CO2培养箱中培养72~96 h, 观察细胞病变 (CPE) 情况。若96 h后没有细胞病变, 则将培养细胞反复冻融3次, 取冻融液1 m L接种单层PK-15细胞, 盲传进行病毒分离和细胞适应, 传至出现较稳定的细胞病变后收毒。细胞毒液和分离毒株编号对应病料编号。

1.4 蚀斑纯化及纯化后接毒

按照参考文献[9]中的方法进行蚀斑纯化及纯化后接毒。

1.5 病毒总RNA的提取

严格按照RNA提取试剂盒说明书提取病料滤液、细胞毒液中的病毒总RNA, -80℃保存或直接进行RT-PCR反应。

1.6 RT-PCR检测

病料滤液和细胞毒液 (包括蚀斑纯化后的细胞毒液) 中PRRSV, 参照PRRSV (NSP21594-1680变异株) RT-PCR检测试剂盒的说明书进行RT-PCR检测;细胞毒液内的猪瘟病毒 (HCV) 、猪细小病毒 (PPV) 、猪伪狂犬病毒 (PRV) 、猪圆环病毒Ⅱ型 (PCV2) , 参照参考文献[10-13]进行RT-PCR检测。

1.7 PRRSV ORF5基因克隆、测序及分析

根据PRRSV JXA1缺失变异株 (EF112445.1) 与美洲标准株VR2332 (EF536003.1) 的ORF5基因序列设计1对引物, P1 5'-ATGTTGGGGAAGTGCTT-GACC-3', P2 5'-CTAGAGACGACCCCATTGTTC-3', 引物大小为603 bp, 由英潍捷基 (上海) 贸易有限公司合成。RT-PCR反应严格参照Prime ScriptTM One Step RT-PCR Kit Ver.2试剂盒说明书。PCR反应体系 (25μL) :模版3μL, P1、P2各0.5μL, 酶1μL, 10×PCR缓冲液12.5μL, 灭菌双蒸水补足至25μL。PCR反应条件:54℃10 min;94℃3 min, 94℃30 s, 55℃30 s, 72℃1 min, 共35个循环;72℃10 min。PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳, 并送北京奥科鼎盛生物科技有限公司测序。

2 结果与分析

2.1 病毒分离与增殖时的细胞病变 (结果见229页彩图1)

由图1可知, 病料接种Marc-145细胞后60小时即出现明显细胞病变, 表现为细胞变圆, 胞浆内形成空泡, 融合缩小, 细胞界限不清晰, 有大片脱落区, 没有脱落的细胞出现拉网现象, 细胞变细长, 胞浆相连。

2.2 病料滤液的RT-PCR检测 (结果见图2)

M.DL-2 000 Marker;1.阳性对照;2.ZJ-1病料滤液RT-PCR产物;3.ZJ-4病料滤液RT-PCR产物;4.ANH-1病料滤液RT-PCR产物。

由图2可知, 目的条带与阳性对照条带一致, 大小均为278 bp, 由此确定这3份病料所含的PRRSV均为NSP2变异株。

2.3 细胞毒液的RT-PCR检测 (结果见图3)

由图3可知, ZJ-1、ZJ-2和ANH-1细胞毒液均不含HCV、PPV、PRV、PCV2, 只含PRRSV, 说明本试验分离到的3株PRRSV纯净。

M.DL-2 000 Marker;1~5.ZJ-1细胞毒液PRRSV、PCV2、PRV、PPV、HCV的RT-PCR产物;6~10.ZJ-4细胞毒液PRRSV、PCV2、PRV、PPV、HCV的RT-PCR产物;11~15.ANH-1细胞毒液PRRSV、PCV2、PRV、PPV、HCV的RT-PCR产物。

2.4 蚀斑纯化后细胞毒液的RT-PCR检测 (结果见图4)

M.DL-2 000 Marker;1.ZJ-1细胞毒液RT-PCR产物;3.ZJ-4细胞毒液RT-PCR产物;4.ANH-1细胞毒液RT-PCR产物。

由图4可知, ZJ-1、ZJ-2和ANH-1这3株PRRSV蚀斑纯化后重新接种Marc-145细胞, 经RT-PCR鉴定, 均表现为单一、纯净的PRRSV条带。

2.5 PRRSV ORF5基因克隆 (结果见图5)

M.DL-1 000 Marker;1.ZJ-1细胞毒液PCR产物;2.ZJ-4细胞毒液PCR产物;3.ANH-1细胞毒液PCR产物。

由图5可知, ZJ-1、ZJ-2和ANH-1这3份病毒液经RT-PCR检测后均获得大小为603 bp的目的条带, 表明目的基因克隆成功。

2.6 PRRSV ORF5基因分析

2.6.1 核苷酸同源性对比分析结果见图6。

由图6可知, ANH-1株与ZJ-1株、ZJ-4株的氨基酸序列一致性分别为99.4%和98.5%, ZJ-1株与ZJ-4株的氨基酸序列一致性为98.7%;ANH-1株与JXA1 (EF112445.1) 株、HUN4 (EU213123.1) 株、TJ (EUB60248.1) 、VR2332 (EF536003.1) 株的氨基酸序列一致性分别为99.8%、99.8%、99.6%和88.5%;ZJ-1株与JXA1 (EF112445.1) 株、HUN4 (EU213123.1) 株、TJ (EUB60248.1) 株、VR2332 (EF536003.1) 株的氨基酸序列一致性分别为99.2%、99.2%、98.9%和88.3%;ZJ-4株与JXA1 (EF112445.1) 株、HUN4 (EU213123.1) 株、TJ (EUB60248.1) 株、VR2332 (EF536003.1) 株的氨基酸序列一致性分别为98.3%、98.3%、98.1%和87.5%。核苷酸同源性对比分析表明, 该3株毒株可能由国内流行毒株进化而来。

2.6.2 氨基酸序列系统进化树分析结果见图7。

由图7可知, 所分离的3株PRRSV均属于美洲群, 与国内其他几株分离毒株亲缘关系较近, 属于同一亚型;与VR2332亲缘关系较远, 说明所分离的毒株可能由国内流行毒株进化而来。

3 讨论