全基因序列

全基因序列（共12篇）

全基因序列 篇1

在国家“863”计划、“973”计划和国家自然科学基金、公益性行业科研专项等资助下,中国水产科学研究院联合中国科学院、哈佛大学、奥本大学等单位组建的国际合作团队完成了鲤鱼全基因组序列图谱绘制,并揭示其独特的全基因组复制事件,这是国际上首个完成全面解析的异源四倍体硬骨鱼类基因组图谱。该研究成果以Article形式于2014年9月21日在《自然-遗传》(Nature Genetics)杂志在线发表(DOI 10.1038/ng.3098)。

鲤鱼是全球分布和养殖范围最广泛的经济鱼类之一,同时是我国最具代表性的淡水养殖鱼类之一,也是我国最有条件利用基因组资源进行品种改良的水产养殖物种之一。鲤鱼基因组由100条染色体组成,是迄今完成全基因组测序的脊椎动物中染色体数目最多的,其基因组经历了四轮复制,也是迄今为止最为复杂的四倍化脊椎动物基因组之一。

鲤鱼全基因组序列图谱的完成,标志着鲤科鱼类重要经济性状的遗传解析和遗传选育研究全面进入基因组时代,对解析鲤科鱼类生长、品质、抗病、抗逆等重要经济性状的分子机制具有重要意义,同时为研究脊椎动物基因组进化和基因衍化机制提供了宝贵的数据和模型,为开展全基因组选择育种、培育品质优良的鲤鱼新品种奠定了坚实基础,具有重要的理论意义和应用价值。

全基因序列 篇2

人类P53下游基因一致性序列研究

人类P53蛋白是一种通用转录因子,通过调控一系列下游基因的转录来影响许多细胞功能.p53下游基因含有P53蛋白结合序列,收集已报道的63条人类P53蛋白结合序列并与El-Deiry等定义的.一致性序列进行比较,发现这些P53蛋白结合序列与一致性序列特征并不严格一致,对这些偏差规律的分析有利于建立p53下游基因预测模型,进而利用计算机方法预测p53下游基因,研究其基因互作网络.

作 者：白明泽 谭军 舒坤贤 BAI Ming-ze TAN Jun SHU Kun-xian  作者单位：白明泽,谭军,BAI Ming-ze,TAN Jun(重庆邮电大学,生物信息学院,重庆,400065)

舒坤贤,SHU Kun-xian(重庆邮电大学,生物信息学院,重庆,400065;中南大学,湘雅医学院,湖南,长沙,410065)

刊 名：重庆邮电学院学报(自然科学版)  ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF CHONGQING UNIVERSITY OF POSTS AND TELECOMMUNICATIONS(NATURAL SCIENCE) 年，卷(期)： 18(4) 分类号：Q78 关键词：p53基因   p53下游基因   一致性序列  

全基因序列 篇3

关键词：DAZL基因；序列；克隆；表达载体

中图分类号： S823.3文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）01-0034-03

收稿日期：2014-03-21

基金项目：黑龙江省普通高等学校动物遗传育种与繁殖重点实验室开放课题（编号：GXZDSYS-2012-07）；东北农业大学博士启动基金（编号：2012RCB27）。

作者简介：郑鹏（1979—），男，黑龙江兰西人，博士，讲师，主要从事动物繁殖生理与繁殖技术研究。E-mail：zh-96128@163.com。

通信作者：张贵学，博士，教授，博士生导师，主要从事动物繁殖生理与繁殖技术研究。E-mail： gxzhang@neau.edu.cn。Deleted in azoospermia like （DAZL）基因是DAZ基因家族中的一员，最早克隆于蝇类的睾丸组织，是一个在进化上高度保守的基因，在脊椎动物的生殖细胞中特异表达，是生殖细胞形成所必须的调控因子。DAZL通过RNA识别基序与mRNA结合，并以多聚体的方式在翻译水平发挥作用[1]。DAZL基因是BOULE基因通过基因修饰、倍增而来，广泛分布于人类、鼠、爪蟾、蝾螈、斑马鱼、青鱼等物种中[2]。许多物种的DAZL同系物对生殖细胞的分化都是非常重要的。DAZL基因的突变、微缺失以及表达下调均可引起生精障碍，导致雄性不育[3]。Ruggiu等发现，与正常鼠相比，杂合DAZL基因缺陷鼠的畸形精子率增高，但仍有正常生育力，而纯合鼠表现为严重的生殖细胞减少，成熟阻滞，睾丸体积减小，不能生育[4]。此外，Schrans-Stassen等研究证实，DAZL基因敲除鼠表现出双睾丸干细胞数目减少、以及减数分裂早期精原细胞分化失败，从而导致不育[5]。因此，研究DAZL基因及其编码蛋白对探索配子发生和成体生殖缺陷及修复具有重要意义。本试验主要对DAZL基因进行克隆和开展生物信息学分析，并构建牛DAZL基因真核表达载体pEGFP-N3-DAZL，以期为探索DAZL基因的功能和在精子发生过程中的作用提供前期基础和试验依据。

1材料与方法

1.1试验材料

成年牛（约40月龄）睾丸组织，取自哈尔滨成高子屠宰场；Trizol Reagent和lipofectamine2000购自Invitrogen公司，反转录试剂盒购自ABI公司，pEASY-T1 Simple Cloning Kit购自北京全式金生物技术有限公司，T4 DNA连接酶购自NEB公司 DMEM/F12、胎牛血清购自Gibco公司，PrimeSTAR HS DNA聚合酶、限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及其他常规试剂均购自大连宝生物公司。

1.2试验方法

1.2.1牛DAZL基因的生物信息学分析利用DNAStra软件分析DAZL的一级结构；采用Clustal X进行DAZL基因同源性多重比对；采用MEGA4程序构建分子进化树。

1.2.2牛DAZL基因真核表达载体的构建参照GenBank牛DAZL基因序列（NM_001081725）设计其编码区特异性克隆引物F：CGGAATTCTATGTCTGCTGCAAATCCTGAGACTC和R：CGGATCCAACAGACTTAAGCACTGCCCGACTT（上、下游分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点），引物由华大基因公司合成。利用Trizol法提取成牛睾丸组织总RNA，并反转录成cDNA，以其为模板，利用高保真Prime-STAR HS DNA聚合酶对牛DAZL基因全长编码区进行RT-PCR扩增，目的片段经凝胶回收加A后连接到pEASY-T1 simple载体上，进一步亚克隆到pEGFP-N3载体上。构建好的质粒经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切鉴定后，送往北京华大公司测序。

2结果

2.1DAZL基因的生物信息学分析

2.1.1DAZL基因一级结构分析牛DAZL基因的CDS全长为888 bp，由264个腺嘌呤（A）、194个胞嘧啶（C）、187个鸟嘌呤（G）和243个胸腺嘧啶（T）组成，4种碱基的含量依次为29.73%、21.85%、21.06%、27.36%。该基因ORF位于 1 888 bp，编码295个氨基酸，含29个强碱性氨基酸残基（K，R），24个强酸性氨基酸（D，E），82个疏水性氨基酸残基（A、I、L、F、W、V），103个极性氨基酸残基（N、C、Q、S、T、Y），分子量为33.02 Ku，等电点为8.78，脯氨酸、丝氨酸、缬氨酸所占比例较高。

2.1.2DAZL基因同源性分析从NCBI的GenBank数据库中选取人（Homo sapiens）、大鼠（Rattus norvegicus）、小鼠（Mus musculus）、牛（Bos taurus）、中国牦牛（domestic yak）、猪（Sus scrofa）、狨猴（Callithrix jacchus）、松鼠猴（Saimiri sciureus）、小黑猩猩（Pan paniscus）、獠狨（Saguinus oedipus）、原鸡（Gallus gallus）共11个物种的DAZL基因，采用Clustal X进行多重比对，结果显示牛与中国牦牛的同源性最高，为99%，与小鼠、人、狨猴、小黑猩猩、猪、獠狨、松鼠猴、大鼠、原鸡的同源性分别为98%、97%、97%、97%、97%、96%、96%、92%、80%（图1）。

nlc202309012308

2.1.3分子进化树构建使用MEGA4程序，采用 Neighbor-Joining 算法，Bootstrap设为1 000，构建分子进化树，从树的拓扑结构上来看，牛的DAZL基因与中国牦牛的关系最近，与大鼠和小鼠一同构成了一个小群，同人、獠狨、猪共同构成一个亚类群（图2）。

2.2DAZL基因编码区的克隆

提取的RNA进行反转录合成cDNA，检测内参基因和DAZL基因的表达情况，结果发现成年牛睾丸中有DAZL基因的表达。

以成年牛睾丸组织cDNA为模板进行PCR扩增，扩增出1条与预期长度相符的片段，得到了DAZL基因的全部编码区（图3-A）。将扩增出与预期长度相符的片段进行胶回收，与PMD18-T载体连接、转化，对构建的载体进行PCR鉴定和EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切鉴定，结果显示在902 bp处出现特异条带（图3-B、图3-C），与预期的插入片段大小相符。

2.3表达载体的制备与鉴定

将DAZL-PMD18-T和PEGFP-N3进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切、胶回收，然后按摩尔比1 ∶1的量，用T4 DNA连接酶进行连接，得到构建的载体，然后将构建好的DAZL表达载体进行EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切及PCR鉴定，琼脂糖凝胶检测为所要片段大小（图4）。转化，挑菌阳性克隆进行序列测定，测序正确的质粒用于下一步的试验。

3讨论

不同物种DAZL基因具有高度的同源相似性，参与调控生殖细胞的发育和分化。有研究表明，DAZL基因的缺失或突变会引起精子发生过程中减数分裂阻滞，导致精子缺乏和男性不育[3]。小鼠DAZL基因突变可影响两性生殖细胞的功能，DAZL基因敲除鼠表现出不育[5]。DAZL和BOULE都是DAZ家族的重要成员，二者都具有典型的RNA识别基序（RNA recognition motifs，RRM）和DAZ重复序列[6]，能够与一系列影响精子发生基因的mRNA结合，如CDC25A、TPX1、DDX4和TSSK3等[7]，并以多聚体的方式在翻译水平发挥作用。

将目的基因超表达是研究基因功能的主要手段之一[8-9]，即将目标基因与合适的载体相连接，使其在体外或体内过量表达，观察该基因超量表达后细胞或组织或机体所发生的表型变化，从而对该基因的功能作出评价。Yu等利用DAZL基因的超表达技术，将胚胎干细胞诱导分化成精子样细胞[10-11]，可见DAZL基因是精子发生的一个主要基因。本试验扩增牛DAZL基因的编码区，构建了PEGFP-N3-DAZL表达载体，为进一步探讨DAZL基因超表达的体细胞能否向精细胞方向分化、DAZL基因超表达的生殖干细胞能否加速分化形成精子奠定基础。

4结论

本试验成功构建了牛DAZL基因的带绿色荧光蛋白的真核表达质粒pEGFP-N3-DAZL，为阐明DAZL基因调控精子发生的机制奠定基础。

参考文献：

[1]Moore F L，Jaruzelska J，Dorfman D M，et al. Identification of a novel gene，DZIP （DAZ-interacting protein），that encodes a protein that interacts with DAZ （deleted in azoospermia） and is expressed in embryonic stem cells and germ cells[J]. Genomics，2004，83（5）： 834-843.

[2]Saxena R，Brown L G，Hawkins T，et al. The DAZ gene cluster on the human Y chromosome arose from an autosomal gene that was transposed，repeatedly amplified and pruned[J]. Nature Genetics，1996，14（3）：292-299.

[3]Reynolds N，Cooke H J. Role of the DAZ genes in male fertility[J]. Reproductive BioMedicine Online，2005，10（1）：72-80.

[4]Ruggiu M，Saunders P T，Cooke H J. Dynamic subcellular distribution of the DAZL protein is confined to primate male germ cells[J]. Journal of Andrology，2000，21（3）：470-477.

[5]Schrans-Stassen B H，Saunders P T，Cooke H J，et al. Nature of the spermatogenic arrest in Dazl—/- mice[J]. Biology of Reproduction，2001，65（3）：771-776.

[6]Eberhart C G，Maines J Z，Wasserman S A. Meiotic cell cycle requirement for a fly homologue of human deleted in azoospermia[J]. Nature，1996，381（6585）：783-785.

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全基因序列 篇4

据最新报道, 在省农科院和中国农业大学的科研团队共同努力下, 黑龙江省独有的地方猪品种, 民猪的首部全基因组序列图谱绘制最近完成, 这是我国民猪全基因组测序和序列图谱绘制工作的一个重大突破。

据国家生猪产业技术体系岗位科学家、农业部地方猪资源研究与开发利用团队带头人、黑龙江省重点学科带头人刘娣教授介绍, 民猪是在世界综合排名第四的优良稀缺猪种, 是列入国家品种资源保护名录的猪品种, 具有繁殖力高、肉质优良、抗病、耐粗饲、能在我省冬季寒冷条件下生存的特点, 其在世界猪品种改良、性能提升中贡献巨大, 对其进行综合性的系统研究与保护利用, 对保证我国猪品种多样性意义重大;对民猪的基因测序和序列图谱绘制就是对其系统研究和科学保护利用的一个重要基础。

由刘娣教授带领的科研团队使用近300G的双端测序数据, 构建出民猪全基因组序列图谱, 得到的基因组大小约为2.64Gb, 同时在民猪基因组中检测出1200万个单核苷酸突变位点和180万个插入/缺失突变。并成功绘制了民猪的首部全基因组序列图谱。同时, 还通过对民猪种质性能、杂交利用等诸多方面的研究, 进一步对民猪遗传本质进行了揭示。

全基因序列 篇5

中国水仙MADS-box基因克隆及其序列分析

采用同源克隆方法首次克隆了一条中国水仙MADS-box基因,命名为NtMADS.该基因长599bp,编码199AA,具有植物MADS-box基因特有的典型结构MADS-box和K-box.

作 者：鞠玉栋 郑回勇 吴维坚 陈永快 何炎森 吴松海 作者单位：福建省农业科学院甘蔗研究所,福建漳州,363005刊 名：安徽农学通报英文刊名：AUHUI AGRICULTURAL SCIENCE BULLETIN年，卷(期)：14(21)分类号：Q331.8关键词：中国水仙 花发育 基因克隆 序列分析

全基因序列 篇6

关键词:洋葱;花青素合成酶基因;基因克隆;序列分析

中图分类号:Q785文献标识号:A文章编号:1001-4942(2010)01-0001-05

Cloning and Sequence Analysis of Anthocyanidin Synthase Gene in Onion

MIAO Jun, LIU Bing-jiang, YANG Yan-yan, HUO Yu-meng,ZHANG Yi-hui,HUO Feng-mei,XIU Jing-run,WU Xiong*

(Institute of Vegetables, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China)

Abstract Bulb color is an important economic trait in onion (Allium cepa). The anthocyanidin synthase gene AcANS in onion was cloned by PCR, and its sequence alignment and bioinformatics analysis were carried out. The open reading frame(ORF) of AcANS gene was 1 059 bp, and it encoded a protein with 352 amino acids. An AT-rich intron of 107 bp, obeying the GT-AG rule, was in the DNA sequence. The 2OG-Fe (II) domain of oxygenase family gene was in the peptide from 210 to 309.

Key words Onion;Anthocyanidin synthase gene; Gene clone; Sequence analysis

洋葱(Allium cepa L.)以肥大的肉质鳞茎为食用器官,根据其鳞茎的皮色可分为红皮、黄皮和白皮等品种。皮色是洋葱的重要经济性状之一,具有其自身的遗传规律[1,2]。器官的颜色是植物最重要、最直观的表型之一,对其遗传规律的研究起始于孟德尔对豌豆花色的研究,当时的研究是将基因位点与易于观察的色彩变异联系起来。如今有关花[3～5]、玉米籽粒[6～8]和拟南芥种皮[9,10]的颜色等,在遗传学、生物化学和分子生物学等方面的研究已取得重要进展。

花青素是决定花、叶片、果实和种子等颜色的重要因素之一,属类黄酮(flavonoids)物质。类黄酮化合物是植物的次生代谢产物,其基本碳骨架结构为C6-C3-C6,C3部分与O形成吡喃杂环。类黄酮化合物因其结构差异可被分为6 种主要类型,包括查耳酮(chalcones)、黄酮(flavones)、黄酮醇(flavonols)、黄烷双醇(flavandiols)、花色素苷(anthocyanins)和缩合单宁(condensed tannins 或proanthocyanidins)[11～13]。类黄酮广泛分布于植物界且在植物体内具有重要生理学意义,现已知它们控制着生长素的运输、根系的发育分支和向重性、种子萌发、紫外保护和抵御等[9,10,14]。

花青素由一系列酶催化合成,经由苯基丙酸类合成路径(phenylpropanoid pathway)和类黄酮生物合成途径(flavonoids biosynthetic pathway)生成[11～13]。生物合成前体为丙二酰CoA 和对香豆酰CoA,由苯基乙烯酮合成酶(CHS)催化二者形成苯基乙烯酮。黄色苯基乙烯酮异构化形成无色的黄烷酮。在黄烷酮羟基化酶(F3H)催化下形成无色的二羟基黄酮醇,由二羟基黄酮醇还原酶(DFR)催化还原形成无色花色素,无色花色素在花青素合成酶(ANS)作用下转变成有色花色素。然后由UF3GT(UDP-葡萄糖类黄酮-3-氧-葡萄糖转移酶)催化,糖基化形成比较稳定的花青素。本文克隆了洋葱的花青素合成酶基因,并对其进行序列比对和生物信息学分析,以期为进一步探索洋葱不同皮色的形成原因和分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料及DNA、RNA提取

以洋葱(Allium cepa L.)的新鲜叶片和花为材料,采自山东省农业科学院蔬菜研究所试验基地,取样后迅速放入液氮中冷冻,于-80℃保存备用。基因组总DNA用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen,北京)提取,用pH 8.0 的TE 稀释成50 ng/μl。总RNA用RNAsimple总RNA提取试剂盒(Tiangen,北京)提取,cDNA 第一链的合成用TIANScript RT Kit(Tiangen,北京)完成。

1.2 PCR反应及目的片段的克隆

本研究所用的上游引物P1:CGGGACAACATAACTCAGAACAATT和下游引物P2: CATAATCAAACATCAGAGTCATCC由博尚生物技术有限公司合成。

PCR反应总体积为25 μl,其中模板(基因组总DNA或cDNA)1 μl,2.5 mmol/L dNTPs 2 μl,引物各0.5 μl,10×Ex-Taq buffer 2.5 μl,Ex-Taq DNA polymerase(Takara,大连)0.13 μl,用灭菌蒸馏水补充至25 μl。

扩增程序:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,58℃退火 1 min,72℃延伸1 min,35个循环;最后72℃保温7 min。

扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离,然后在Fluor ChemTM5500凝胶成像系统(Alpha Innotech, USA)上检测并照相记录,分子量Marker DL2000从大到小依次为:2000、1000、750、500、250和100 bp。

PCR 扩增产物用凝胶回收试剂盒(Tiangen,北京)进行回收,与克隆载体pMD18-T(Takara,大连)连接,转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,将阳性克隆送到博尚生物技术有限公司进行测序。

1.3 序列分析

利用Blast进行序列比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi),主要采用DNAMAN 软件及http://www.expasy.org和http://www.softberry.com等网上软件进行生物信息学分析。

2 结果与分析

2.1 洋葱AcANS基因的克隆

洋葱总DNA扩增的PCR 产物和RT-PCR 产物经电泳分离(图1),再通过回收、连接、转化后,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,将阳性克隆进行序列测定。测序结果显示总DNA扩增片段1 215 bp,RT-PCR 产物1 108 bp,将其序列进行ORF分析,发现有完整的开放读码框。其ORF序列1 059 bp,预测的蛋白质由352个氨基酸残基组成,将其命名为AcANS基因。

1.gDNA为模板 2.cDNA为模板 M.Marker DL2000

图1 洋葱AcANS基因扩增产物电泳图

2.2 洋葱AcANS基因的序列特征

将AcANS基因的基因组序列和cDNA序列进行比对,发现其编码区有一个107 bp的内含子(图2)。这一内含子符合GT-AG规则,即其5′端为GT核苷酸残基,而3′端为AG核苷酸残基。并且内含子区富含AT,其中A和T共 85个,G和C共 22个,AT含量高达79.4%;而外显子区的AT含量为53.1%。

AcANS的Blast P 分析结果表明,此蛋白第210～309肽段含有2OG-Fe(Ⅱ) 加氧酶家族基因的结构域(图3)。ProtParam 程序预测,AcANS的氨基酸组成中Leu占最大比例,高达12.2%;

黑体部分显示内含子序列(符合GT-AG规则)

图2 洋葱AcANS基因编码区的DNA序列

图3 洋葱AcANS的2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶家族基因的结构域

Glu第二,占到8.0%。Signal P 3.0 Server 检测结果显示AcANS不含信号肽序列,为非分泌蛋白。

洋葱的AcANS与水稻的OsANS和拟南芥的AtANS蛋白序列比较(图4),显示它们具有一些保守的区段,其中第210～309肽段很保守,与Blast P 分析结果一致,含有2OG-Fe(Ⅱ) 加氧酶家族基因的结构域。

2.3 洋葱AcANS进化分析

将洋葱的AcANS与水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、红掌(Anthurium andraeanum)、荷兰鸢尾(Iris hollandica)、芥菜(Brassica juncea)、甘蓝(Brassica oleracea var.

图4 洋葱的AcANS与水稻的OsANS和拟南芥的AtANS蛋白序列比较

capitata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago truncatula)和牵牛(Ipomoea nil)等的花青素合成酶进行聚类分析,结果(图5)单子叶植物和双子叶植物各聚成一类。十字花科的甘蓝、芥菜和拟南芥聚在一起;豆科的大豆和苜蓿聚在一起;洋葱和鸢尾有较近的亲缘关系,并且与禾本科的水稻、小麦和玉米聚在一起。这就提示我们在今后洋葱的研究中,可以优先借鉴其它单子叶植物的信息,同时参考双子叶植物的相关信息。

图5 植物ANS的系统进化

3 讨论与结论

本研究从洋葱基因组DNA和cDNA分别扩增了花青素合成酶基因(AcANS),通过两者的序列比较发现其含有一个内含子,这一内含子符合GT-AG规则。AcANS的开放阅读框为1 059 bp,编码352个氨基酸残基,其蛋白质第210～309肽段含有2OG-Fe(Ⅱ) 加氧酶家族基因的结构域。花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是花青素合成后期的酶,也有人称其为无色花青素双加氧酶(leucoanthocyanidin dioxygenase,LDOX),是一种2-酮戊二酸铁依赖型双加氧酶,催化从无色花青素到有色花青素的转变,即催化无色翠雀素、无色矢车菊色素和无色天竺葵色素生成翠雀素、矢车菊色素和花葵素[15～17]。

花青素合成酶基因是决定植物器官颜色的关键因素之一。Rosati 等(1999)[4]从美国金钟连翘(Forsythia intermedia)中克隆得到了ANS基因和其启动子,并证明在花瓣中无花色素苷是由于缺少ANS基因的表达所至。Nakatsuka等(2005)[5]发现,ANS基因的突变是导致龙胆花变为白色的重要原因。

花青素合成酶只是类黄酮生物合成途径中的一个环节,整个途径由一系列酶催化完成;同时编码这一系列酶的结构基因又受调节基因的控制,调控其表达的强度和模式。随着洋葱类黄酮生物合成途径的相关基因逐步被揭示,我们将从这些基因的等位变异中开发与皮色相关的分子标记,并把这些标记应用于洋葱的杂交育种实践中,建立具有自主知识产权的洋葱杂交育种体系。

参 考 文 献:

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全基因序列 篇7

DHV可分为3个血清型,DHV-1属于小RNA病毒科成员,呈世界性分布且致病性最强,DHV-2和DHV-3属于鸭星状病毒(DAsV),均呈偶发性,而且致死率低[2,3,4]。2007年,C.H.Tseng等[5]和M.C.Kim等[6]在我国台湾地区和韩国发现了血清学和基因水平相差较远的鸭肝炎病毒新血清型(DHV new serotype,DHV-N),命名为DHV-1B(中国台湾株)和DHV-1C(韩国株)。近年来,我国学者也不断从发病鸭中分离到与DHV-1和DHV-3无血清学相关性的DHV-N[7,8]。

研究对2010年从广东省某鸭场分离到的DHV-1 GD 株全基因组序列进行测定,将其与国内外其他DHV参考毒株基因进行序列比对及遗传进化分析,旨在揭示DHV的变异情况和不同毒株之间的进化关系,以期为今后在分子水平上研究鸭病毒性肝炎致病机理提供依据。

1 材料与方法

1.1 毒株、菌株和载体

DHV-1 GD株和大肠杆菌DH5α,均由华南农业大学兽医学院禽病教研室保存;克隆载体pMD18-T,购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 主要试剂

TRIzol® Reagent,Invitrogen公司生产;M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、DNA聚合酶TaKaRa ExTaqTM、dNTP Mixture(各2.5 mmol)、DL-10 000 Marker,均为宝生物工程(大连)有限公司产品;DNA纯化试剂盒(E.Z.N.A.TM Gel Extraction Kit),Omega公司产品。

1.3 引物的设计与合成

根据GenBank中公布DHV-1的全基因组序列,用Premier Primer 5.0软件设计覆盖整个基因组[不包括Poly(A)]序列的5对引物。引物由上海英潍捷基生物技术有限公司合成,序列见表1。

1.4 病毒总RNA的提取

取经GD株接种鸭胚进行病毒的增殖,收取尿囊液,参照Invitrogen公司生产的TRIzol® Reagent RNA提取试剂的使用说明书提取病毒总RNA[9]。

1.5 RT-PCR

以提取的RNA为模板,按M-MLV反转录试剂盒说明书合成cDNA的第一链,再以此链为模板,用5对引物分别进行PCR反应,分段扩增GD株全基因组的各片段。PCR反应条件根据具体引物而有所不同,然后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。

1.6 克隆和测序

用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物,以T4 DNA连接酶与克隆载体pMD18-T连接后,转化大肠杆菌DH5α,于37 ℃在LB固体培养基(含100 mg/L氨苄西林)中倒置过夜培养,挑取单个菌落,筛选重组质粒。重组质粒经PCR扩增法鉴定为阳性后,送上海英潍捷基生物技术有限公司完成测序。

1.7 基因序列的拼接与分析

采用DNAStar的Seqman程序对序列测定结果进行拼接,获得GD株基因组全长序列,将该序列与GenBank中DHV参考毒株进行核苷酸序列和氨基酸序列的同源性比较。本研究参考的25株DHV-1分离株和变异株的名称及其在GenBank的登录号如下:04G(EF067923)、GFS99(FJ496344)、GQY07(FJ496342)、GS(FJ157175)、HB(FJ157180)、HS(DQ812094)、HSS(DQ812092)、JX(EU371557)、NA(GQ130377)、R(EF585200)、S(EF417871)、X(FJ496343)、YZ(EF724900)、90D(EF067924)、A66(DQ886445)、AP-03337(DQ256132)、AP-04009(DQ256133)、AP-04114(DQ812093)、AP-04203(DQ256134)、C-LGJ(GU066819)、C-QYD(GU066825)、DRL-62(DQ219396)、E53(EF151313)、F(EU264072)、GFS06(FJ496341)。

2 结果

2.1 目的基因的扩增结果

以病毒RNA为模板,用设计的5对特异性引物进行RT-PCR,分别扩增出各目的片段,取10 μL产物经1%琼脂糖凝胶电泳,电泳结果与预期片段大小一致,结果见图1。

M.DL-10 000 Marker;1.A片段; 2.B片段; 3.C片段; 4.D片段; 5.E片段。

2.2 序列测定与拼接结果

将5个目的片段的测序结果用DNAStar软件处理,得到GD株的全基因组核苷酸序列。结果显示GD株全基因组长为7 690 nt[3′端Poly(A)尾除外],基因组结构为5′UTR-VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2B-2C-3A-3B-3C-3D-3′UTR,5′UTR为626 nt,3′UTR为314 nt,结构基因和非结构基因位于中间的单一开放阅读框架(ORF),由6 750个核苷酸组成,编码含2 249个氨基酸的多聚蛋白(polyprotein),具有与小RNA病毒科其他成员相似的切割位点,且被切割成12个终蛋白产物,其中P1被降解成VP0、VP3和VP1,P2被降解成2A1、2A2、2A3、2B和2C,P3被降解成3A、3B、3C和3D。GD株全基因组的组成见表2。

2.3 基因组序列分析结果

通过DNAStar软件对GD株全基因组序列与其他25株参考毒株进行比较分析发现:GD株与其他传统DHV-1毒株的全基因组核苷酸序列同源性为94.8%～99.7%,多聚蛋白的氨基酸序列同源性为97.7%～99.6%;GD株与中国台湾和韩国变异株的核苷酸序列同源性为72.7%～73.2%,氨基酸序列同源性为81.8%～83.4%,见表3、表4。

将本研究所获得的GD株全基因组核苷酸序列、多聚蛋白氨基酸序列分别与GenBank中另外25株DHV的相应序列进行进化树分析,结果表明,在各种进化树中,GD株DHV-1均与其他传统DHV-1毒株在同一进化分支上,而与韩国变异株及中国台湾变异株的进化分支距离较远,见图2、图3。

3 讨论

试验采用分段克隆法获得了DHV-1 GD株全基因组克隆,测定其全长cDNA序列,序列分析结果表明,DHV-1 GD株是全基因组长为7 690 nt[不包括Poly(A)]的单股正链RNA。DHV-1 GD株基因组具有典型的小RNA病毒基因组特点,含有1个大的开放阅读框架(第627～7 376 nt),约占整个基因组的88%,编码含2 249个氨基酸的多聚蛋白,且被裂解产生12个蛋白终产物:VP0-VP3-VP1-2A1-2A2-2A3-2B-2C-3A-3B-3C-3D,符合小核糖核酸病毒科基因组的基本结构[10,11]。

对进化树的分析结果表明,GD株与中国传统分离株GFS99、X、E53、C-QYD等毒株亲缘关系较近,

处于同一较小的分支上,同源性高达为99.7%,而与韩国变异株AP-03337、AP-04009、AP-04114、AP-04203及中国台湾变异株90D、04G的亲缘关较远。说明GD株属于DHV-1型分支,与韩国和中国台湾新型DHV处于明显不同的分支。

自20世纪50年代DHV首次被发现后,鸭病毒性肝炎呈世界性分布。有研究表明,Ⅰ型鸭肝炎发病率呈上升趋势,并且变异株不断出现,养鸭业遭受到巨大的经济损失。试验从分子水平对从广东省分离的DHV-1 GD毒株全基因组序列进行测定与分析,为进一步认识DHV-1毒株的分子遗传特性提供了良好的分子生物学平台,进一步丰富了DHV基因信息学资料,也为以后通过反向遗传手段在分子水平上研究鸭肝炎病毒致病基因奠定了基础。

摘要：为了给在分子水平上研究鸭肝炎病毒(DHV)的致病机理奠定基础,进一步丰富DHV的遗传变异和进化信息,试验采用RT-PCR方法分段克隆获得DHV-1 GD株的全基因组序列并进行序列分析。结果表明:GD株的基因组全长7 690 nt[不含Poly(A)尾],5'端和3'端非编码区长度分别为626 nt和314 nt,单一开放阅读框架(ORF)为627～7 376 nt,编码2 249个氨基酸;GD株与DHV-1参考株比较,其核苷酸和氨基酸同源性分别为94.8%～99.7%和97.7%～99.6%;与中国台湾和韩国新型DHV(DHV-N)相比同源性分别为72.7%～73.2%和81.8%～83.4%;GD株与DHV-1参考株遗传进化关系较密切,处于同一分支,而与DHV-N遗传关系较远,处于不同分支。

关键词：鸭肝炎病毒(DHV),基因组,序列分析

参考文献

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[6]KIM M C,KWON Y K,JOH S J,et al.Recent Korean isolates ofDuck hepatitis virus reveal the presence of a new geno-and serotypewhen compared to Duck hepatitis virus type 1 strains[J].Arch Vir-ol,2007,152(11):2059-2072.

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[8]范书才,李虹,袁率珍,等.新型鸭肝炎病毒的分离鉴定[J].中国预防兽医学报,2009(10):309-315.

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全基因序列 篇8

在前期的工作中,笔者对十余种弧菌科致病菌株进行了质粒有无的筛检,仅在鳗弧菌中检测并提取到了天然质粒。对Gen Bank进行检索发现,鳗弧菌质粒的测序工作尚未见报道;因此,本研究拟以鳗弧菌质粒为对象进行测序及复制元件(Ori)的研究。由于鳗弧菌与维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)同样隶属于弧菌科,因此将预测好的复制元件克隆到质粒中,以维氏气单胞菌作为试验菌株,检测复制元件在维氏气单胞菌中能否起到复制作用。

1 材料

1.1 细菌菌株和质粒

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)13YK-003株(NPC-CAA,No.BYK00813),购自国家水生动物病原库;质粒p JV,从鳗弧菌13YK-003中提取;维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)CL0901株,水产动物营养与病害研究室保存;p EASYTM-Blunt Zero Cloning Vector,购于北京全式金生物技术有限公司。

1.2 引物

本研究中所用引物列于表1。

1.3 酶和试剂

Pfu酶和卡那霉素(Kan)、氨苄西林(Amp),购自北京全式金生物技术有限公司;T4 DNA连接酶,购自Thermo Fisher公司;PCR产物纯化试剂盒,购自普洛麦格(北京)生物技术有限公司;质粒小提试剂盒,购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.4 培养基

LB培养基:蛋白胨1%,酵母提取物0.5%,氯化钠1%,p H值为7.2~7.4;固体培养基需另加琼脂粉1.5%;121℃灭菌20 min。

Kan抗性的LB培养基:向LB培养基中加工作浓度为50μg/m L的Kan。

Amp抗性的LB培养基:向LB培养基中加工作浓度为100μg/m L的Amp。

1.5 主要仪器和设备

PCR仪(型号为My CyclerTM)、核酸蛋白测量仪、电泳仪(型号为Power Pac BasicTM),均由Bio-Rad公司生产;离心机(型号为1-14),Sigma公司生产;LRH系列生化培养箱,购自上海一恒科技有限公司;振荡培养箱(THZ-D台式恒温振荡器),购自太仓市实验设备厂;电击仪(型号为BTX ECM630),购自东胜创新生物科技有限公司。

2 方法

2.1 质粒的提取和测序引物的设计

将鳗弧菌(V.anguillarum)13YK-003株培养至平台期,用质粒小提试剂盒(离心柱型)对已培养好的菌液进行质粒提取。

用HindⅢ和XbaⅠ酶将上述质粒双酶切,并用相同的酶对质粒p EASYTM-T1双酶切,产物经纯化后,用T4 DNA连接酶连接,转化大肠杆菌感受态细胞,在Amp抗性的LB培养基上筛选。选取单克隆测序,并以此段已知序列为基础,设计扩增该质粒全序列的引物。

2.2 质粒全序列测定和编码序列的预测

按照设计的向上引物(Primer 1)和向下引物(Primer R),由测序公司双向测通该质粒,所用引物列于表1。将测序结果拼接,得到质粒p JV的全序列。利用Glimmer3基因预测软件预测该质粒可能包含的基因模型,得到基因的位置和方向等信息,并为预测到的基因做相应的基因注释。

2.3 复制区域的预测

通过在线工具http://tubic.tju.edu.cn/OriFinder预测分析该质粒的复制区域[4]。

2.4 复制区域的试验验证

2.4.1 引物

设计引物Ori-F和Ori-R(序列见表1),由华大基因合成。

2.4.2 目的片段Ori的PCR扩增

扩增目的片段,反应体系(50μL):Ori-F、Ori-R各2μL,2×Easy Pfu PCR Super Mix 25μL,p JV 1μL,用dd H2O补足50μL。反应参数为:95℃预变性5 min;94℃热变性30 s,48℃扩增30 s,72℃延伸1 min,共30个循环;72℃延伸10 min。

PCR反应结束后,用PCR产物纯化试剂盒对产物进行纯化,为下一步试验做准备。

2.4.3 目的片段的克隆

将上述反应产物连接到常规大肠载体中。根据连接试剂说明书,加入PCR产物、载体和水,轻轻旋转混匀,室温反应5 min;待反应结束后,在冰上将反应物加入大肠杆菌Trans-T1感受态细胞中,加入250μL室温LB液体培养基,37℃、200 r/min振荡培养孵育1 h;取培养液涂于Kan抗性的LB培养基上,37℃培养12~24 h,监测转化子的生长情况。

2.4.4 PCR鉴定含重组质粒的转化子

先将Taq Mix与鉴定引物Ori-F和Ori-R按比例混合,做为PCR体系备用;然后取5支装有11.5μL无菌水的PCR小管,分别向里面加入少量随机挑取的5个单克隆菌落,在PCR仪中99℃热变性菌体5 min;再向各管中分别加入13.5μL除模板之外的PCR反应体系。PCR反应条件:94℃热变性30 s,48℃退火30 s,72℃延伸1 min,共30个循环。

2.4.5 维氏气单胞菌(A.veronii)CL0901感受态细胞的制备

将培养好的A.veronii CL0901菌液按1∶100转接到新的无抗LB液体培养基中,30℃、240 r/min培养;当OD600值达到0.4时停止培养,将菌液在冰上放置15 min;然后分别取1 m L放入1.5 m L Eppendorff管中,4℃、12 000×g离心1 min;弃上清液,加500μL的灭菌去离子水洗1遍,4℃、12 000×g离心1 min;弃上清液,加10%的甘油1 m L洗2遍,4℃、12 000×g离心1 min;弃上清液,加80μL 10%的甘油重悬菌体,配成80μL/管的感受态细胞。

2.4.6 将质粒电击转化到A.veronii CL0901感受态细胞中

取49μL的A.veronii CL0901感受态细胞加入到一支新的1.5 m L的离心管中,再向里面加入1μL的新构建质粒,轻轻吹吸混匀,将其加入到预冷的电极杯中,冰上放置5 min;另取一个电极杯,加入1μL的普通T载体和49μL的A.veronii CL0901感受态细胞作为对照组;将电转仪设置电击参数为1.8 k V、2.5μF、200Ω,电击;取出电极杯,迅速加入1 m L的LB液体培养基,反复吹吸混匀;将混合有培养基的电击液转入新的无菌的1.5 m L离心管中,30℃、150 r/min震荡培养1 h;涂布Kan抗性的LB培养基,30℃倒置培养过夜。

3 结果

3.1 弧菌质粒全序列的测定结果

将从鳗弧菌(V.anguillarum)13YK-003株提取的天然质粒命名为p JV。经9条引物(包括Primer 1、Primer 1-1、Primer 1-2、Primer R、Primer R-1、Primer R-2、Primer R-3、Primer R-4、Primer R-5)测序,将10段序列拼接,得到质粒p JV全长5 982 bp的核苷酸序列,登录Gen Bank,登录号为JQ782192。

3.2 弧菌质粒编码序列的预测结果

用基因预测软件预测出的质粒p JV包含6个编码序列,分别命名为UQY-1、UQY-2、UQY-3、UQY-4、UQY-5、UQY-6,位于质粒的331~447 bp、513~1 535 bp、2 020~2 562 bp、2 876~3 766 bp、4 234~4 416 bp、4 640~5 272 bp。其中4个基因(UQY-2、UQY-3、UQY-4、UQY-6)预测到核糖体结合位点(RBS):UQY-2被认为编码DNA复制蛋白;UQY-3则可能编码MerR超家族蛋白,其作用也是个同DNA结合的蛋白编码基因;UQY-4是一个功能未知、但在许多细菌中均有检出的基因。另外两个编码基因(UQY-1和UQY-5)可能不表达,因为这两个基因序列较短,且RBS不确切。

3.3 弧菌质粒复制元件的预测结果

通过在线工具http://tubic.tju.edu.cn/OriFinder预测,结果(见296页彩图1A)表明,p JV的复制元件Ori是一段长为313 bp的序列,位于448~760 bp,包含Dna A boxes位置,见296页彩图1B。

3.4 目的片段Ori C的PCR扩增结果

以Ori-F和Ori-R为引物、以质粒p JV为模板进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳分析,PCR扩增产物(见图2)与目的片段大小一致,与预期的313 bp相符。

1.MarkerⅢ;2.Ori C的扩增结果。

3.5 Ori C片段的p EASYTM-Blunt Zero Cloning Vec-tor克隆

将PCR扩增得到的目的片段Ori C克隆至p EA-SYTM-Blunt Zero Cloning Vector,得到转化子Trans T1/p T-Ori,经PCR鉴定(结果见图3),5个转化子均能扩增出约300 bp的条带,与预期相符。选择鉴定正确的转化子送到华大基因测序,测序结果经DNAStar软件分析比对,与Gen Bank(JQ782192)的序列完全一致。

M.DL-10 000 Marker;1~5.筛选的转化子PCR鉴定结果。

3.6 Ori C片段在A.veronii CL0901感受态细胞中复制功能的验证

将质粒p T-Ori电转入A.veronii CL0901感受态细胞后,在Kan抗性的LB培养基上出现转化子,命名为CL0901/p T-Ori;而用普通T载体电转化A.veronii CL0901感受态细胞的培养基上并未出现阳性转化子。从CL0901/p T-Ori转化子中提取质粒,结果表明与大肠杆菌Trans T1/p T-Ori转化子中所提质粒大小相同(见图4)。说明Ori C片段使普通大肠杆菌质粒p EASYTM-Blunt Zero Cloning Vector具有了在维氏气单胞菌A.veronii中复制的能力,即可证明Ori C为鳗弧菌质粒p JV的复制区。

M.DL-15 000 Marker;1.Trans T1/p T-Ori;2.CL0901/p T-Ori。

4 结论

4.1 鳗弧菌质粒的全序列测定

鳗弧菌13YK-003株经检测含有天然质粒,命名为p JV。双向测通该质粒,将10段序列拼接,得到质粒p JV全长5 982 bp的核苷酸序列,登录GenBank,登录号为JQ782192。

4.2 编码序列以及复制区的预测

通过基因预测软件,预测到质粒p JV包含6个编码基因,其中4个(UQY-2、UQY-3、UQY-4、UQY-6)含有RBS。通过在线工具http://tubic.tju.edu.cn/Ori-Finder预测出复制区Ori C位于质粒p JV的448~760 bp之间,长313 bp,是包含Dna A boxes的一段序列。

4.3 试验验证得到复制区的功能

将上述预测复制区克隆到一个普通大肠杆菌T载体中,再电转入维氏气单胞菌CL0901株中,此携带弧菌质粒复制区的大肠杆菌质粒能够在维氏气单胞菌中存活并复制,且两菌株中所含质粒通过电泳鉴定大小相等,证实预测的质粒p JV复制区(Ori C)在A.veronin CL0901感受态细胞中具有复制功能。

5 结论

本研究对鳗弧菌13YK-003株进行了质粒提取,该质粒命名为p JV,对其进行测序和分析,预测出Ori,并对该复制元件进行试验验证,为构建新的弧菌科载体奠定了基础。

参考文献

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全基因序列 篇9

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒,分离鉴定,序列分析

猪繁殖与呼吸综合征 (PRRS) 是一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为主要特征的传染病, 简称“蓝耳病”, 其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) [1]。PRRSV属于动脉炎病毒, 基因组结构为单股正链RNA。笔者在2008年采集广东省某猪场疑似猪高热症病料1份, 通过RT-PCR检测、Marc-145细胞传代证实分离到1株PRRSV, 对其进行了鉴定和全基因序列分析, 现报道如下。

1 材料

从具有典型猪无名高热症状的广东省某猪场无菌采集病猪血液、肺脏、脾脏、淋巴结等, -70 ℃保存。阳性对照毒株PRRSV为美洲型中国分离株Ch-1a、 Marc-145细胞, 均由华南农业大学兽医学院传染病教研室保存;总RNA提取试剂Trizol® Reagent RNA提取试剂盒、胎牛血清, Invitrogen公司产品;PCR试剂, 均购自TaKaRa公司;DMEM培养基 (高糖) 、EDTA胰蛋白酶, 均为Gibco公司产品。

2 方法

2.1 病毒的分离与传代

无菌采集血液, 待凝固后3 000 r/min离心10 min, 收集血清, 编号, 4 ℃保存, 备检;实质脏器 (肺脏和淋巴结) 按常规方法处理, 接种Marc-145细胞, -70 ℃保存, 备用。

2.2 引物的设计与合成

根据GenBank中发表的PRRSV NSP2基因组序列, 以美洲型标准株VR-2332为模板设计1对特异性引物, 序列为上游引物5′-AACCAGACCAGAGGCA-3′, 下游引物5′-ATGCTGACGGTGATGC-3′, 目的片段长度为271 bp。参考GenBank上注册的PRRSV基因组序列设计覆盖整个基因组的多对特异性引物 (见表1) 。同时设计、合成口蹄疫病毒 (FMDV 5′-GATGGAGAGACAGAAACC-3′, 5′-CATGTCCTGTCCTTTCACT-3′, 目的片段长度为370 bp) 、猪瘟病毒 (CSFV 5′-TATCATCAACAGACCTCAG-3′, 5′-AACTCTTTTGCCTCCCAC-3′, 目的片段长度为594 bp) 、猪流感病毒 (SIV 5′-TTCTAACCGAGGTCGAAAC-3′, 5′-AAGCGTCTACGCTGCAGTCC-3′, 目的片段长度为229 bp) 引物, 以备检测。上述引物均由上海英潍捷基生物技术有限公司合成。

2.3 病毒RNA的提取和cDNA的合成

按Trizol® Reagent RNA提取试剂盒的使用说明提取病毒RNA, 反转录得到cDNA, -20 ℃保存, 备用。

2.4 病毒特异性检测

将上海英潍捷基生物技术有限公司合成的特异性引物进行PCR扩增, 电泳检测。反应在Biometra PCR循环仪器上进行。PCR扩增体系 (25 μL) :TaKaRa TaqTM DNA 聚合酶0.2 μL, 10×PCR Buffer (Mg2+ Plus) 2.5 μL, 2.5 mmol/L dNTPs 1 μL, 20 pmol/μL 上、下游引物各0.5 μL, cDNA 0.5 μL, 灭菌双蒸水19.8 μL。

反应程序:94 ℃ 4 min;94 ℃ 1 min, 55 ℃ 50 s, 72 ℃ 30 s, 共30个循环;72 ℃延伸7 min。PCR产物用1%琼脂糖凝胶 (含0.5 μg/mL EB) 电泳检测。

2.5 病毒Nsp2基因及全基因组PCR扩增

以上述合成的cDNA为模板, 分别用各自的上、下游引物经PCR扩增Nsp2基因及全基因组, 扩增产物用2%琼脂糖凝胶电泳检测。

2.6 基因的克隆、序列测定与分析

将PCR产物回收纯化后分别克隆入pMD18-T载体, 选取阳性重组质粒送上海英俊生物技术有限公司进行序列测定。基因组各片段的测序结果按顺序拼接后, 通过互联网提交NCBI BLAST SERVER进行验证。从GenBank中选择具有代表性的PRRSV毒株 (见表2) 基因组的核苷酸序列, 运用软件DNAStar (Version 7.0) 和MEGA 4.0进行核苷酸序列相似性分析和遗传进化树分析。

注:1～19号为北美型毒株;20号为欧洲型毒株。

3 结果

3.1 病料的RT-PCR检测结果

结果表明, 扩增出了长为271 bp的PRRSV目的条带, CSFV、FMDV、SIV PCR检测结果均为阴性。

3.2 细胞传代病毒的分离结果

将经无菌过滤的组织病料处理液接种于长满单层Marc-145细胞的6孔细胞培养板, 置37 ℃的CO2培养箱中培养2～3 d即出现细胞变圆现象, 部分变圆细胞脱落、黏附在单层上, 随后大量细胞变圆、脱落, 继续盲传3代均出现稳定细胞病变。笔者将分离株命名为PRRSV-GZ株。

3.3 基因组各片段cDNA的RT-PCR扩增结果

以抽提得到的病毒总RNA进行反转录后作为模板, 分别用各片段的上游引物F和下游引物R进行PCR扩增, 各扩增产物分别标记为P1～P10。经1%琼脂糖凝胶电泳, 可见相应的目的条带, P1～P10分别为439, 1 967, 2 174, 1 110, 2 401, 2 244, 2 247, 2 250, 2 606, 490 bp, 各片段长度与理论长度一致。PRRSV-GZ株基因组各片段RT-PCR扩增结果见图1。

M1. DL-2 000 Marker; 1～10.分别为PRRSV-GZ株 P1～P10扩增片段;11.阴性对照;M2.DL-15 000 Marker。

3.4 Nsp2部分核苷酸序列测序结果

测序结果通过DNAStar和MEGA 4.0软件进行遗传进化树分析, 结果见图2。核苷酸序列相似性分析图3。

结果表明, PRRSV-GZ株与我国近期从高热症猪群中分离的毒株核苷酸序列有着较高的同源性, 其核苷酸相似性均在93%以上。PRRSV-GZ株核苷酸序列与欧洲型代表株LV株间的同源性相对较远, 处于完全不同的两大分支上, 核苷酸序列相似性仅为57.2%。

3.5 PRRSV-GZ株全基因组序列测定与分析

利用通用引物pMD18-T以及特异性引物对PRRSV XH-GD株基因组分段扩增片段进行序列测定。将各扩增片段测序结果用Seqman软件拼接, 最终获得PRRSV-GZ株全基因序列, 全长为15 352 bp。测序结果通过DNAStar和MEGA 4.0软件进行遗传进化树分析, 结果见图4。核苷酸序列相似性分析结果见图5。

结果表明, 全基因组序列分析结果与Nsp2部分核苷酸序列分析结果相似, PRRSV-GZ株属于美洲型毒株, 而且与我国近期从高热症猪群中分离的毒株核苷酸序列有着较高的同源性, 其核苷酸相似性均在99%以上。PRRSV-GZ株核苷酸序列与欧洲型代表株LV株间的同源性相对较远, 处于完全不同的两大分支上, 核苷酸序列相似性仅为58.4%。

4 讨论

从广东省某猪场具有典型猪无名高热症症状的猪体上无菌采集病料, 经常规处理后, 成功地分离得到美洲型PRRSV, 并命名为PRRSV-GZ株。通常情况下, 猪肺泡巨噬细胞 (PAM) 、Marc-145等细胞均可用于PRRSV分离[2], 而PAM更有利于PRRSV的分离与培养。但是PAM来源相对较少, 分离培养较为麻烦, 生长缓慢且易于污染, 因此试验采取Marc-145细胞进行PRRSV的分离。

PRRSV的变异是造成该病难以控制的重要原因之一。高致病性蓝耳病可导致高病死率、高传播率, 易同猪瘟病毒、猪圆环病毒及副猪嗜血杆菌等混合感染, 并且可致饲料利用率降低, 生产成本上升, 产出降低, 给养殖业带来严重的损失。智利已于2007年成功净化蓝耳病。我国猪病情况比较复杂, 且蓝耳病净化成本较高, 目前国内主要流行的为美洲型毒株, 对蓝耳病防控仍以加强生物性安全措施及疫苗保护为主, 因此研究蓝耳病疫苗对预防该病显得至关重要。研究利用Marc-145细胞成功地从高热症病料中分离得到1株美洲缺失型PRRSV, 为研制基因工程疫苗选取毒株奠定了基础。

参考文献

[1]希尼尼根, 程安春, 汪铭书.猪繁殖与呼吸综合征研究进展[J].养猪, 2004 (4) :36-38.

全基因序列 篇10

目前,植物分子生物学研究的热点之一是发掘野生植物资源中的优异基因并深入研究其生物学功能。其中,研究基因生物学功能的一个重要方面就是研究基因的时空表达模式,目前通常采用real time RT-PCR的方法进行检测,而这一研究手段通常需要首先确定一个稳定表达的持家基因(housekeeping gene)作为参考,即内参基因。Actin基因编码肌动蛋白,在真核细胞中普遍存在,在不同组织和细胞中恒定表达,是植物基因表达研究常用的内参基因。肌动蛋白是高等植物细胞骨架中微丝的主要组分,执行重要的生理功能,如细胞分裂、细胞内物质运输、细胞内信号传导等[1,2]。研究表明,高等植物中Actin基因的核苷酸序列高度保守,可通过设计简并性引物来扩增不同植物物种的Actin基因片段。到目前为止,已在许多种高等植物如木薯(Manihot esculenta Crantz)[3]、花生(Arachis hypogaea L)[4]、豌豆(Pisum sativum)[5]、向日葵(Helianthus annuus)[6]、火龙果(Hylocereus undatus)[7]、多浆植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)[8]、盐生植物碱蓬(Suaeda glauca)[9]中克隆获得了Actin基因片段。

厚藤(Ipomoea pes-caprae L)也称马鞍藤、沙藤、二叶红薯、马蹄草等,为旋花科(Convolvulaceae)多年生草质藤本;茎极长而匍匐地面;叶互生,形如马鞍;花期全年,以夏季最盛;聚伞花序,花冠漏斗状,辐射对称,粉红色至浅紫红色[10]。厚藤性喜高温、干燥和阳光充足的环境,耐盐、抗风和耐旱性极佳;多生长于热带亚热带地区的海滨沙滩及路边向阳处;在我国分布于浙江、福建、台湾、广东、广西和海南等地[11]。厚藤具有重要的药用价值,其组织中含有多种药用成分,具有祛湿消肿的功能,是一种常用民间草药[12]。厚藤是典型的海滩植物,同时也是沙砾不毛之地防风固沙的第一线植物,具有绿化、美化环境和防风固沙的作用[13,14]。因此,厚藤是一种优异的野生植物资源,在海岛和海岸带(特别是珊瑚砂环境)植被恢复及防风固沙方面有非常重要的应用价值。此外,由于厚藤的抗逆性极强,通过分子生物学的手段研究厚藤的抗逆分子机制具有重要的科学意义。针对植物功能基因特别是抗逆基因的研究不仅可以了解这些基因的功能,而且有助于更好地利用这些研究结果定向地改造植物性状,使其更好地服务于人类社会。目前,有关厚藤的功能基因研究方面未见报道。本文通过克隆厚藤的Actin基因并分析其序列,为后续克隆厚藤的功能基因,并研究功能基因的表达模式提供内参基因。

1 材料与方法

1.1 实验材料选取

厚藤于2015年10月引种自广东省汕尾市鲘门镇的海滩,并栽培于本实验室。取成熟叶片样品,用RNase-free的水清洗后,采用锡箔纸包裹,立即冻存于液氮中,之后置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 试剂和主要仪器

大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存。RNA的提取采用Magen公司HiPure Plant RNA Kits(R4151)。cDNA链的合成依照全式金公司TransS-cript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的说明书进行。DNA回收采用Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits。高保真Taq酶采用TakaRa公司的ProbestTMDNA Polymerase。本论文所用的pMD-18T载体从TaKaRa公司购买,其他常规生化试剂均购自中国科学院喀斯玛科苑商城。

本研究所使用的主要仪器包括紫外/可见分光光度计(NanoDrop ND 1000,赛默飞世尔科技有限公司)、PCR仪(A300Fast Thermal Cycler,杭州朗基科学仪器有限公司)、琼脂糖凝胶电泳系统(JY300C,北京君意东方电泳设备有限公司)、凝胶成像分析系统(JS-680B,上海培清科技有限公司)等。其他常规仪器如移液器、培养箱、摇床、冰箱等均为本实验室自备。

1.3 方法

1.3.1 引物合成

通过查询NCBI网站上(http://www.dtd.nlm.nih.gov/)上公布的多种植物的Actin基因序列,经序列同源性比对后,设计简并性引物ActinP1和ActinP2,引物序列见表1。采用该简并引物扩增厚藤Actin基因的cDNA片段。推测该目的Actin基因的cDNA片段长度为600bp左右。所需引物由广州英潍捷基公司合成。

1.3.2 总RNA提取

取厚藤的成熟叶片提取总RNA,按照Magen公司HiPure Plant RNA Kits(R4151)的操作说明书提取。对提取的总RNA进行NanoDrop ND 1 000紫外可见分光光度计浓度检测和琼脂糖凝胶电泳。

1.3.3 cDNA单链的合成及Actin片段的扩增

采用两步法以总RNA为模板进行逆转录反应获取cDNA第一链。cDNA单链的合成依照全式金公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的说明书进行。

以厚藤叶片的cDNA单链为模板,采用高保真DNA聚合酶ProbestTMDNA Polymerase扩增厚藤Actin基因。所采用的引物为ActinP1和ActinP2,PCR反应体积为50μL。PCR扩增反应体系为:10x PCR Buffer 5μL,10mmol·L-1dNTP Mixture4μL,10μmol·L-1ActinP1 1μL,10μmol·L-1ActinP2 1μL,ProbestTMDNA Polymerase 0.5μL,cDNA模板2μL,ddH2O236.5μL。各种成分混匀后置于PCR仪上进行反应。采用的PCR反应程序为:(1)94℃预变性5min;(2)94℃变性30sec、56℃退火45sec、72℃延伸45sec,30个循环;(3)72℃延伸10min。

采用1%的琼脂糖凝胶电泳对获得的PCR产物进行电泳检测,并获得单一的DNA条带,即为PCR扩增得到的Actin基因片段。Actin片段依照Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits说明书进行琼脂糖凝胶电泳回收。DNA片段回收后用普通Taq酶进行3′末端加A处理。

1.3.4 阳性克隆的筛选与鉴定

将回收的DNA片段连接于pMD-18T载体,转化大肠杆菌感受态DH5α菌株,连接及转化方法均参照TaKaRa公司的说明书。将转化后的菌液涂布在LB固体培养基(含Ampicillin/IPTG/X-Gal)上,进行蓝白斑筛选,白色菌落可初步确定为阳性克隆。随机挑取白色菌落进行菌落PCR鉴定,提取质粒,送至广州英潍捷基公司测序。

1.3.5 序列的生物信息学分析

序列的比较、翻译等在OMIGA生物软件上进行,序列同源性分析采用BLAST程序,在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站上进行。

2 结果与分析

2.1 总RNA检测结果

以厚藤的成熟叶片为材料提取总RNA,经检测OD260nm/OD280nm平均比值为2.17,表明所提取的总RNA具有较高的纯度;电泳检测表明,28S rRNA、18SrRNA条带清楚(图1),表明总RNA未发生降解,可进行下一步的逆转录反应;总RNA浓度为75ng·μL-1。获得的总RNA可以用于下一步RT-PCR扩增实验,获得cDNA。

2.2 RT-PCR扩增

以逆转录反应获得的cDNA第一链做为PCR反应的模板,采用简并性引物ActinP1和ActinP2进行常规PCR扩增。获得的PCR产物经电泳检测显示,在600bp左右有一条特异性的条带(图2),推测有可能是我们所需要的厚藤Actin基因的cDNA片段,可进行下一步的DNA片段回收。

2.3 阳性克隆的鉴定与测序

特异性DNA片段经切胶回收后,连接于pMD-18T载体上,并将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α菌株。将转化菌液涂布于LB固体(含Ampicillin/IPTG/X-Gal)培养基平板上进行蓝白斑筛选,白色菌落可初步确定为阳性克隆。随机挑取白色单菌落,用引物ActinP1和ActinP2进行菌落PCR检测(反应体系中未加菌落为阴性对照),得到的扩增片段大小约为600bp(图3),与RT-PCR结果一致,表明这些克隆为阳性克隆,可以提取质粒,进行测序。

注:M:DNA Marker;C:未加菌落的阴性对照;1-3:三个阳性单菌落Note:M:DNA marker;C:negative control;1-3:positive clones

2.4 序列分析

随机挑取3个阳性克隆,扩增培养后提取质粒,将重组质粒进行测序,结果表明,3个阳性克隆均插入相同的cDNA序列,大小均为598bp,表明我们所获得的Actin基因在厚藤叶片中表达量最高,因此才最容易被扩增出来。去掉两端的简并性引物序列之后,获得的cDNA片段大小为554bp,该片段编码184个氨基酸(图4)。将该基因命名为IpActin1。并将该序列登录在GenBank上,序列号为KU564627。

将该cDNA片段在NCBI数据库中进行BLAST分析,发现该序列与烟草的Actin基因(XM_009789260.1)同源性最高,相对应区域的核苷酸序列一致性达到了87%,与其他植物的核苷酸序列一致性也均在80%以上。氨基酸序列分析表明,该Actin片段(184个氨基酸)与芝麻的Actin蛋白(AHY35167.1)的对应区域仅有一个氨基酸的差别,氨基酸序列一致性达到98%,与其他植物Actin的氨基酸序列一致性也均在90%以上。结果表明,所获得的厚藤IpActin1的cDNA片段确实为植物中高度保守的Actin基因片段,可用于下一步的研究工作中。

3 讨论与分析

植物肌动蛋白(Actin)是组成细胞骨架微丝的基本成分,通常在不同组织和细胞中普遍存在并稳定表达。正是由于Actin基因具有这种稳定表达特征,通常被认定为持家基因。在功能基因表达模式的研究中,通常需要选择一个稳定表达的持家基因作为分子内标,用来消除不同RNA样品在操作过程中可能存在的差别,从而对基因表达的定量分析进行归一化[15,16]。目前,在多个植物物种中,已采用Actin基因作为稳定表达的内参基因,对其功能基因的表达进行定量分析。

在本研究中,已成功地克隆了厚藤的Actin基因IpActin1。序列分析表明,在核苷酸序列同源性比较方面,IpActin1片段与其他植物Actin基因的同源性均在80%以上;在编码的氨基酸序列同源性比较方面,其同源性也达到了90%以上。由序列分析结果结合以往的研究,我们可以推测出,本研究所获得的IpActin1基因可能也是一个高度保守的持家基因。本实验采用厚藤的成熟叶片为材料,提取RNA,通过逆转录扩增Actin基因片段,随机挑取的3个重组克隆经测序均编码同一个Actin基因片段,由于植物体内的Actin基因通常由多基因编码,表明所获得的Actin基因可能是厚藤植株内表达最丰富的Actin基因,进一步确定了该基因可用作内参基因,可以用于后续厚藤功能基因表达模式的研究。

全基因序列 篇11

摘 要 牛疱疹病毒Ⅰ型（ bovine herpesvirus-1，BHV-1）是牛的一种重要病原，可引起牛严重的呼吸道感染、结膜炎、脑炎、产奶量下降、子宫炎、肠炎、传染性脓疱性外阴阴道炎和流产等。以GenBank中编号为U06934.1的BHV-1 gE基因为材料分析其生物信息学，以预测其蛋白主要抗原表位，有助于建立相应的实验模型。

关键词 BHV-1 gE基因；生物信息学分析；抗原表位

中图分类号：Q517 文献标志码：A 文章编号：1673-890X（2014）21--02

1 材料与方法

1.1 BHV-1 gE编码蛋白氨基酸序列

以GenBank中编号为U06934.1的Bovine Herpesvirus 1 （type 1.1） FM glycoprotein gE，complete cds基因为材料。

1.2 gE的跨膜区预测

采用DAS服务器（Cserzo M. et al，1997）（http：//www.sbc.su.se/miklos/DAS/），将氨基酸序列输入工作区预测跨膜区。

1.3 gE蛋白二级结构预测

用SOPMA服务器（Geourjon，C. et al，1995）（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）预测gE蛋白的二级结构。

1.4 gE蛋白亲水性、可及性、极性及柔韧性参数预测

采用Hopp&Woods亲水性参数（Hopp TP et al，1981）、Janin可及性参数（Jaint，1979）、Zimmerman极性参数（Zimmerman JM et al，1968）及柔韧性参数预测（http：//www.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）。

1.5 gE蛋白抗原位点的预测

采用Antigenic Propensity服务器（Kolaskar AS et al.，FEBS，276，172 1990）（http：//www.imtech.res.in/raghava/bcepred/bcepred_submission.htm（l）预测其抗原位点。

2 结果

2.1 gE蛋白的跨膜区预测

采用DAS服务器gE分析，gE蛋白跨膜域位置跨膜区位于14-23、360-363、423-444残基位置之间。

2.2 gE蛋白二级结构预测

二级结构上α-螺旋 （Hh） 106 个占18.43%、伸张结构（β-片层）（Ee）119个占20.70%、β-转角（Tt） 16 个占2.78%、无规卷曲 （Cc） 334个占58.09%，β-转角趋向于突出到蛋白表面，在多肽及蛋白中易作识别位点。

2.3 gE蛋白亲水性、可及性、极性及柔韧性参数预测

采用Janin可及性参数、Zimmerman极性参数、Hopp&Woods亲水性参数对gE蛋白预测，gE蛋白 Janin可及性参数在第427-440个残基达到最大值，gE蛋白 Hopp&Woods亲水性参数422～430个残基达到最大值

2.4 gE蛋白抗原位点的预测

采用Antigenic Propensity服务器预测gE蛋白抗原位点结果如下（下划线区域都是该蛋白质的潜在抗原表位）。

1MQPTAPPRRRLLPLLLPQLLLFGLMAEAKPATETPGSASVDTVFTARAGAPVFLPGPAARPDVRAVRGWSVLAGACSPPVPEPVCLDDRECFTDVALDAACLRTARVAPLAIAELAERPDSTGDKEFVLADPHVSAQLGRNATGVLIAAAAEEDGGVYFLYDRLIGDAGDEETQLALTLQVATAGAQGAARDEEREPATGPTPGPPPHRTTTRAPPRRHGARFRVLPYHSHVYTPGDSFLLSVRLQSEFFDEAPFSASIDWYFLRTAGDCALIRIYETCIFHPEAPACLHPADAQCSFASPYRSETVYSRLYEQCRPDPAGRWPHECEGAAYAAPVAHLRPANNSVDLVFDDAPAAASGLYVFVLQYNGHVEAWDYSLVVTSDRLVRAVTDHTRPEAAAADAPEPGPPLTSEPAGAPTGPAPWLVVLVGALGLAGLVGIAALAVRVCARRASQKRTYDILNPFGPVYTSLPTNEPLDVVVPVSDDEFSLDEDSFVDDDSDDDGPASNPPADAYDLAGAPEPTSGFARAPANGTRSSRSGFKVWFRDPLEDDAAPARTPAAPDYTVVAARLKSILR575

2.5 综合分析

将各种参数和方法预测的可能有抗原表位的肽段综合分析，从表中可以发现，应用不同的预测方法，其预测的抗原表位的个数和抗原表位可能出现的肽段有所不同，其中在第427个氨基酸序列片段达到最大值，但氨基酸序列片段420至480则显示多种预测方法基本一致，具有较好的亲水性、可及性、极性及柔韧性，gE基因分子以β-转角（2.78%）出现的区域较少，α-螺旋（18.43%）较多蛋白结构比较稳定。因此，B细胞表位可能在此两片段或它们附近。

3 结语

牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是由牛传染性鼻气管炎病毒（ IBRV） 引起牛的一种急性、热性、接触性传染病，以高热、呼吸困难、鼻炎、鼻窦炎和上呼吸道炎症为主要特征。又称牛疱疹病毒Ⅰ型（ bovine herpesvirus-1，BHV-1），IBRV属于疱疹病毒科（Herpesviridae）、疱疹病毒甲亚科（Alphaherpesvirinae），水痘病毒属（Varicellovirus），是牛的一种重要病原。

在机体内，疏水性残基一般埋在蛋白内部，而亲水性残基位于表面，因此蛋白的亲水部位与蛋白的抗原位点有密切的联系，最高亲水性区域常位于抗原决定簇内部或其附近。根据亲水性参数、可及性参数、柔韧性参数以及二级结构预测等综合考虑，BHV-1病毒的抗原表位大部分位于氨基酸残基420-480等区域内或其附近。

本实验通过对BHV-1 gE基因的氨基酸序列生物学分析，为下一步实验的开展奠定了良好的基础。

全基因序列 篇12

本文对2009～2010年上半年辽宁省335个兽医门诊送检的具有典型PMWS症状病猪的病料样品进行PCV2荧光PCR检测, 从中选取6份阳性病料进行病毒DNA的分离、鉴定、测序, 分析6株PCV2辽宁省分离毒株的基因序列, 比较分离毒株互相之间的同源性, 再与Genbank中2004～2010年之间国内外不同地域发表的13个参考毒株的ORF1、ORF2基因序列之间进行比对, 进而分析国内外流行毒株之间的内在联系, 各毒株分子流行病学特点, 比较各毒株间的同源性和差异性, 为辽宁省防控PCV2相关疾病提供可靠的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验材料

PK-15细胞由中国动物卫生与流行病学研究中心惠赠。病料为辽宁省各地区335个兽医门诊采集具有典型PMWS临床症状和剖检病变的病死猪的淋巴结、肝脏、脾脏、肺脏和扁桃体等组织器官。

1.1.2 主要试剂

DNA凝胶快速回收试剂盒购自广州东盛科技有限公司;Taq DNA聚合酶、25 mmol/L MgCl2、1 dNTPs、10×Buffer E、T4DNA连接酶和限制性内切酶EcoRI均购自上海华美生物工程有限公司;Proteinase K、pGEM-T Easy载体均购自Promega公司;大肠杆菌DH5α由中国动物卫生与流行病学研究中心惠赠;DNAMarker DL 2 000+DL 15 000、X-gal和IPTG均购自大连Takara公司。

1.1.3 主要仪器

台式高速冷冻离心机 (Z323K型) , 德国赫默公司;PCR仪 (T1型) , 德国Biomepra公司;凝脂成像分析仪 (UV-WHIPE型) , 美国Upv公司;电泳仪 (3000X1型) , 美国BIO-RAD公司;紫外分析仪 (UV-3000型) , 上海天能科技电子有限公司;恒温金属浴 (CHB-100型) , 杭州大和热磁电子有限公司

1.2 方法

1.2.1 PCV2的分离与鉴定

(1) 分离。将PCV2荧光PCR检测结果为阳性的病料中随机选取6份用研磨器研磨后, 反复冻融4次, 提取上清液, 用0.22μm的细菌滤器过滤除菌。培养过程中同时设立不接毒的细胞培养物作为阴性对照。将上述病毒滤液与PK-15细胞悬液按体积比1:9的比例充分混合, 37℃培养48 h。弃去生长液, 用200 mmol/L D-氨基葡萄糖37℃处理25 min。倒去D-氨基葡萄糖, 用Hank′s液洗涤细胞3次。再加入细胞生长液继续培养72 h, 将细胞反复冻融3次, 收集病毒液。 (2) 将接种PCV2病毒的PK-15细胞, 反复冻融3次以裂解细胞, 取待测样本各100μl, 分别加到0.5 ml离心管中;加入100μl试剂盒的DNA提取液1, 振荡混匀, 13 000 r/min离心10 min;吸弃上清;再加入25μl试剂盒的DNA提取液2, 振荡混匀, 2 000 r/min离心10 s;100℃干浴10 min;13 000 r/min离心10 min, 保留上清于-20℃备用。

1.2.2 PCV2基因测序与分析

1.2.2. 1 PCV2全基因引物设计及合成

参考GenBank中已发表的PCV2序列, 应用primer 5.0软件, 设计出一对PCV2全基因扩增引物 (P1/P2) 。

引物由大连宝生物工程公司合成。

1.2.2. 2 PCV2基因的PCR扩增

各自以病料组织和细胞抽提物获得的DNA为模板, 进行PCR扩增。

PCR反应体系 (20μl) 包括:10×PCR缓冲液2μl、模板DNA 1μl、P1 (20 pmol/μl) 0.4μl、P2 (20 pmol/μl) 0.4μl、ExTaq酶0.2μl、dNTP (2.5 mmol/ml) 1.5μl、灭菌ddH2O 14.5μl。将各成分瞬时离心混合。

反应条件:94℃5 min;93℃55 s;59℃1 min;72℃1.5 min, 进行30个循环;最后72℃10 min, 用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。

1.2.2. 3 PCV2基因片段的回收

利用DNA凝胶快速回收试剂盒, 按照试剂盒说明书对PCR扩增产物进行基因片段的回收。

1.2.2. 4 连接反应

取新的经灭菌处理的0.5 ml eppendorf管, 编号。将pGEM-T easy 0.1μg载体DNA转移到无菌离心管中, 加等量 (可稍多) 的PCR产物。加蒸馏水至体积为8μl, 于45℃保温5 min, 以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。加入10×T4 DNA ligase buffer1μl、T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底, 于16℃保温8～24 h。

1.2.2. 5 重组质粒转化

用CaCl2法制备感受态大肠杆菌DH5α, 冰浴3 h后供转化试验用。

1.2.2. 6 质粒DNA的少量制备

按照质粒提取试剂盒说明书操作, 并于-20℃保存。

1.2.2. 7 酶切鉴定

在10μl重组质粒中加入2μl 10×buffer E、0.5μl EcoRⅠ, 添加超纯水至20μl, 37℃温育1 h, 用1.5%的琼脂糖电泳。根据出现目的片段大小, 确定目的基因是否已插入到pGEM-T easy载体。

1.2.2. 8 PCV2基因的序列测定与分析

通过以上病毒分离培养的方法获得6个克隆菌株, 送交中国动物卫生流行病学研究中心完成PCV2基因序列测定。利用DNAstar软件, 结合相关的文献资料, 分析PCV2基因的序列及所编码的氨基酸, 与已发表的基因序列比较分析同源性。

2 结果与分析

2.1 PCV2全长基因鉴定结果

2.1.1 病毒分离培养PCR鉴定结果

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳, 紫外光下观察可见, 6个PCR扩增产物都出现了与预期结果相符的位于1 767 bp附近的特异条带, 见图1。

1-6.6个PCV2分离株全长基因PCR扩增产物)

2.1.2 重组质粒酶切鉴定结果

共获得6个含不同PCV2毒株全基因组扩增片段的阳性重组质粒, 分别命名为PCV-LN33-08、PCV-LN73-10、PCV-LN02-10、PCV-LN07-10、PCV-LN101-10、PCV-LN19-09, 见图2。

(1-6.六个重组质粒T-pcv的双酶切产物)

2.2 序列分析结果

2.2.1 全基因组序列分析结果

本试验获得的6个PCV2辽宁分离株基因组全长均为1 767 bp, 与有关报道的一致。将这6个分离株与Genbank中2004～2010年以来分离的8株国内代表株以及5个国外代表株进行比较。应用DNAStar分析软件对这些序列进行全基因组序列同源性分析发现, 本试验6毒株与所选的其他参考毒株全基因核苷酸序列同源性介于94.6%～100%之间, 见图3。

2.2.2 ORF1序列分析结果

本试验6个PCV2分离株ORF1均为945 bp, 编码314氨基酸的蛋白质。通过对PCV2分离毒株ORF1核苷酸及推导的氨基酸序列同源性比较发现, 本试验6个分离毒株内部ORF1核苷酸同源性为96.8%～100%, 推导的氨基酸序列同源性为98.4%～100%, 见图4。

本研究用PCV2毒株 (包括试验株与参考毒株) 的ORF1核苷酸序列同源性为96.8%～100%, 推导的氨基酸序列同源性为97.5%～100%, 见图5。

2.2.3 ORF2序列分析结果

大部分PCV2病毒的ORF2有702个核苷酸组成, 推导氨基酸数目为233 aa。本试验的6个毒株内部ORF2核苷酸和氨基酸序列同源性分别为91.3%～100%和85.5%～100%, 见图6。

通过对PCV分离毒株ORF2核苷酸及推导的氨基酸序列同源性比较发现, 与ORF1相比, 不同PCV2毒株ORF2之间差异明显, 核苷酸和氨基酸序列同源性分别为90.6%～100%和80.4%～100%, 见图7。

2.2.4 PCV毒株的遗传学关系分析

从系统发生进化树可以看出 (见图8) , 所有PCV毒株大致可分为2个大分支, 试验株PCV-LN19-09单独位于其中的一个大分支内, 其他5株试验株共同位于另一大分支。每个大分支又明显分支为2个小亚群, 并在此基础上进一步分成细小的分支。

其中, 试验株PCV-LN19-09与2005年辽宁分离株LN05-EF524526以及2006年广西、河北、河南等地分离株同在一个小亚群内, 提示亲缘关系较近。试验株PCV-LN02-10、PCV-LN07-10与2005年上海分离株和2006年甘肃分离株同在一个小亚群, 亲缘关系较近。

试验株PCV-LN33-08、PCV-LN73-10、PCV-LN101-10与国外的2004年英国分离株、2010年西班牙分离株、2006年斯洛文尼亚分离株以及国内的2008年山东分离株、2004年浙江、江西分离株同在一个小亚群, 有较近的亲缘关系。2000年美国分离株和2000年加拿大分离株共同位于一个单独的小亚群, 且与试验株亲缘关系均较远。

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