rps16序列（精选3篇）
rps16序列 篇1
兔巴氏杆菌病是由多杀性巴氏杆菌 (Pm) 引起的一种急性、传染性疾病, 以败血症和出血性炎症为主要特征, 因此又被称为“兔出血性败血症” [1]。该病的病原为多杀性巴氏杆菌, 为革兰阴性、两端钝圆、细小、卵圆形的短杆菌, 大小为 (1～1.5) μm× (0.25～0.5) μm, 用美蓝染色可见呈两极染色、无芽孢及鞭毛的菌体。该菌在鲜血和血清培养基上生长良好, 但在普通培养基上不能生长。由于巴氏杆菌毒力强弱不同, 呈3种菌落形态。本菌以其荚膜抗原和菌体抗原区分血清型, 我国分离的家兔多杀性巴氏杆菌以7:A为主[2]。
传统的微生物系统分类是根据菌落的形态特征和生理生化特性进行分离、纯培养, 然后从形态学、生理生化反应特征以及免疫学特性加以鉴定。传统鉴定法具有丢失大量微生物资源, 不能正确地反映微生态, 分类不够准确和科学的缺点。而以16S rDNA为基础的现代分子生物学技术克服了传统分类法的局限性, 而且提高了解析的灵敏度, 在基因水平上扩大了物种多样性的视野, 可以快速、微量、准确、简便地对微生物进行分类鉴定[3]。
研究对1株从名山兔场分离的疑似兔巴氏杆菌进行了纯化培养、形态学鉴定、生化鉴定、动物试验、药敏试验以及16S rDNA的克隆和序列分析, 以期为开展兔巴氏杆菌病诊断及防治奠定一定的理论基础。
1 材料
于四川省雅安市名山县某兔场无菌采集病兔肝脏、肺脏、脾脏、肾脏及心血作为病料, 送至实验室进行检测。
血清平板 (含5%新生牛血清) 、血平板 (含8%绵羊血) 、麦康凯琼脂平板、Amp平板 (含0.1 mg/mL氨苄西林) 、LB液体培养基、PBS溶液、革兰染液, 均为四川农业大学分子生物学四川省重点实验室自制;2×Taq PCR Master Mix、ddH2O、质粒抽提试剂盒, 购自天根生物有限公司; DL-2 000 Marker、pMD19-T 载体, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司;T4 DNA 连接酶、10×Buffer T4 DNA连接酶、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒, 购自博迈德生物有限公司;DH5α菌种, 四川农业大学动物生物技术中心保存;药敏纸片、微量生化反应管, 购自杭州微生物试剂有限公司;实验用体重为20 g小白鼠10只, 购自四川华西医科大学;未免疫体重为2 kg健康家兔6只, 由四川农业大学实验动物场提供。
2 方法
2.1 病原菌的分离
将无菌采集的家兔肝脏、肺脏划线接种于鲜血琼脂平板, 37 ℃需氧培养16～18 h后观察, 挑取直径为1 mm左右、表面光滑、湿润、呈露珠状、无溶血活性的菌落进行革兰染色, 镜检, 单个存在的革兰阴性球杆菌的菌落为可疑菌, 对该菌进行传代纯化。
2.2 生化鉴定
对分离病原菌进行糖发酵、硝酸盐还原、H2S等生化试验。
2.3 动物试验
2.3.1 小鼠致死性试验
挑取纯化单个菌落接种于含5%新生犊牛血清的LB液体培养基, 37 ℃摇床培养8～10 h;取10 mL培养液于无菌试管内4 000 r/min离心5 min;用无菌PBS溶液重悬, 倍比稀释菌悬液, 采用涂布法进行活菌计数, 并用PBS稀释为5×108 CFU/mL;腹腔注射小鼠5只 (0.2 mL/只) , 对照组5只小鼠腹腔注射无菌PBS溶液 (0.5 mL/只) 。隔离饲养, 定时观察小鼠发病情况, 死亡小鼠立即解剖, 观察病变并采集小鼠肝脏进行病原菌的分离鉴定。
2.3.2 家兔回归试验
将健康家兔适应性饲养1周后分为试验组与对照组, 选取2.3.1配制的病原菌菌悬液腹腔注射3只健康家兔[1.0 mL/只 (试验组) ], 另外3只家兔静脉注射PBS溶液[1.0 mL/只 (对照组) ]。将两组家兔分群隔离饲养, 定期观察家兔的发病情况, 有病死家兔立即解剖, 观察病理变化并采集肝脏与肠内容物进行病原菌的分离、鉴定。
2.4 药敏试验
选择环丙沙星、菌必治、强力霉素、丁胺卡那霉素、左氟沙星、氨苄西林、庆大霉素等15种临床常用药物, 采用标准纸片琼脂扩散法进行病原菌的药敏试验。
2.5 多杀性巴氏杆菌的PCR鉴定
2.5.1 PCR模板的制备
挑取该分离株致病菌纯培养个单菌落, 用200 μL ddH2O漩涡振荡重悬, 煮沸变性10 min, 12 000 r/min离心2 min, 取上清液保存, 备用。
2.5.2 PCR鉴定
根据多杀性巴氏杆菌的KMT基因设计1对特异性检测引物[由宝生物工程 (大连) 有限公司合成], 序列为P1 5′-ATCCGCTATTTACCCAGTGG-3′;P2 5′-GCTGTAAACGAACTCGCCAC-3′, 预期扩增片段为457 bp。
PCR 扩增反应体系 (20 μL) :2×Taq PCR Master Mix 10 μL, ddH2O 8 μL, 上、下游引物各0.5 μL, 模板1 μL。反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s, 56 ℃退火30 s, 72 ℃延伸1 min, 共30个循环;最后72 ℃延伸7 min。经1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
2.6 16S rDNA序列分析
2.6.1 16S rDNA PCR扩增
细菌16S rDNA通用引物[2] [由宝生物工程 (大连) 有限公司合成]序列如下:P1 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ (对应于E.coli 16S rDNA的第8～27个碱基) , P2 5′-AAGGAGGTGATCCAACCGCA-3′ (对应于E.coli 16S rDNA的第1 492～1 510个碱基) , 预期扩增片段大小为1 500 bp左右[3]。使用2.5.1制备模板进行PCR扩增, 反应体系与2.5.2相同, 反应程序为94 ℃预变性5 min, 94 ℃变性40 s, 55 ℃退火50 s, 72 ℃延伸90 s, 共30个循环;72 ℃延伸7 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳观察结果。
2.6.2 PCR产物克隆、测序及序列分析
参照凝胶DNA回收试剂盒说明书回收特异性目的片段, 回收产物连接pMD19-T 载体转化自制的DH5α感受态细胞, 涂布Amp平板37 ℃培养12～14 h, 挑取阳性菌落接种含Amp的LB液体培养基扩大培养, 参照质粒提取试剂盒说明书抽提质粒进行PCR快速鉴定, 取阳性克隆质粒送至上海英俊生物技术有限公司测序。将测序结果在GenBank中进行Blast比对, 利用DNAStar软件进行同源性分析并绘制系统发育树。
3 结果与分析
3.1 细菌分离培养
3.1.1 培养特性
在鲜血琼脂培养基上分离株均生长良好, 形成灰白色、圆形、湿润、露珠样、针尖大小的菌落, 但在普通琼脂培养基上不能生长。
3.1.2 镜检观察
挑取纯培养物革兰染色、镜检, 可见革兰阴性小杆菌, 单个存在, 形态一致, 菌体近圆形, 无鞭毛, 不形成芽孢, 两极着色不明显。
3.2 生化试验结果 (见表1)
注:“+”表示阳性反应; “-”表示阴性反应。
3.3 致病性试验
3.3.1 小白鼠感染试验
试验组小白鼠18 h内全部死亡, 在接种部位的皮下组织出现炎性水肿。取肝脏、脾脏组织涂片, 瑞氏染色、镜检可见两极浓染的球杆菌, 革兰染色、镜检可见两极浓染的阴性球杆菌。无菌采集肝脏接种血清平板, 培养24 h后能分离到大量多杀性巴氏杆菌。对照组5只小鼠健康存活。
3.3.2 家兔回归试验
试验组家兔接种后12小时出现精神萎靡, 食欲减退, 体温升高等症状;18小时时1只家兔死亡, 另外2只在24 h内死亡。剖检死亡家兔, 肺脏有明显出血, 肝脏有部分坏死, 其他器官无明显病变;从死亡家兔的肺脏、肝脏分离到大量感染菌。对照组家兔仍然存活, 无临床症状。
3.4 药敏试验 (结果见表 2)
mm
3.5 多杀性巴氏杆菌PCR鉴定结果
使用分离菌制备模板, 通过多杀性巴氏杆菌特异性鉴定引物扩增出457 bp左右的片段 (见图1) , 与预扩增片段大小一致, 结合染色、镜检等特性可以初步判定为兔多杀性巴氏杆菌感染。
M.DL-2 000 Marker;1.PCR产物;2.阴性对照。
3.6 16S rDNA克隆和序列分析
3.6.1 16S rDNA克隆
提取分离纯化后的菌株DNA作为PCR反应的模板, 用引物P1/P2扩增目的基因, 获得了与预期大小相符的目的条带 (见图2) 。
M.DL-2 000 Marker;1.PCR产物;2.阴性对照。
3.6.2 序列同源性分析与系统发育分析
测序结果表明, 该分离株的16S rDNA片段长1 532 bp, 将该序列通过NCBI上的Blast功能发现, 该菌株的16S rDNA序列与多杀性巴氏杆菌序列的同源性较高, 进一步通过DNAStar软件将此序列与已公布在GenBank中的4株多杀性巴氏杆菌以及多株革兰阴性菌的16S基因进行同源性分析发现, 分离株与多杀性巴氏杆菌同源性高达99.9%, 与其他细菌同源性较低。通过系统发育分析发现, 分离株与多杀性巴氏杆菌聚在同一支上 (见图3) 。
4 讨论
兔巴氏杆菌的检测、鉴定和分型依赖于实验室分离培养, 细菌纯化后, 通过诸如形态学、糖类发酵模式和血清学特征等表型来分类, 然而培养条件能够影响这些特征的表达, 从而影响菌株表型鉴定方法的稳定性和可靠性。近年来, 随着分子生物学的发展, 细菌鉴定已从表型特征描述发展到分子生物学的鉴定, 研究人员根据细菌的遗传特征建立多种基因检测、鉴定和分型的方法。本研究所采用的PCR方法是设计1个针对基因组某保守基因的引物, 然后进行体外核酸扩增, 再用琼脂糖凝胶电泳的方法来分离该扩增片段, 并进行大小和序列分析。
16S rDNA序列含有进化速率不同的区域——可变区与恒定区, 以及多个重复的核苷酸三联体序列, 不同种属的细菌, 其16S rDNA序列有差异。根据这些特点, 16S rDNA常被用于细菌种属的鉴定和分类。Dey S等[4]对来自牛、水牛、猪、绵羊和山羊等宿主Pm B:2血清型分离株的16S rDNA序列进行比较分析, 结果表明, 来自不同宿主Pm分离株间16S rDNA序列同源性高达99.9%, 而且引起不同动物败血症B:2血清型分离株种系发生关系很近。国内亓英芳等[5]分别对禽、猪等Pm分离株的16S rDNA序列进行了分析, 并证实以16S rDNA为靶基因设计的PCR方法可以快速、准确地鉴定Pm。
由药敏试验结果可知, 分离菌对阿莫西林、先锋Ⅵ、先锋Ⅴ、丁胺卡那霉素具有较强的耐药性, 而对罗美沙星、左氟沙星、环丙沙星、氟哌酸敏感性较高, 建议兔场发病时要交替使用这几种药物, 治疗效果较好, 临床发病时不要滥用抗生素, 应根据药敏试验结果选用敏感性药物。
兔巴氏杆菌病应以预防为主, 兔场应自繁自养, 必须引种时要做好隔离观察与消毒, 加强日常管理与卫生消毒, 定期进行巴氏杆菌灭活苗接种[6]。
参考文献
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[3]雷正瑜.16S rDNA序列分析技术在微生物分类鉴定中的应用[J].湖北生态工程职业技术学院学报, 2006, 4 (1) :4-7.
[4]DEY S, SINGH V P, KUMAR A A, et al.Comparative sequenceanalysis of 16S rDNA gene of Pasteurella multocida serogroup B iso-lates from different animal species[J].Res Vet Sci, 2007, 83:1-4.
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[6]林艳, 田明星, 李敏, 等.藏鸡副鸡嗜血杆菌的分离及16S rDNA序列分析[J].中国家禽, 2010, 32:4.
rps16序列 篇2
舟山位于我国东南沿海,中国大陆海岸线的中心,地理坐标为东经121°30′～123°25′,北纬29°32′～31°04′,是长江、钱塘江和甬江的出海口,海洋资源相当丰富,是进行嗜盐菌研究的菌株理想来源地。我们从舟山深海取得海泥样品,获得一株只能在8%～20%NaCl培养基中生长的嗜盐菌,并对该菌的16SrRNA基因测序。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 供试菌株
菌株来源于舟山深海海泥,经无菌双蒸水稀释后,再过滤获得。
1.1.2 仪器和试剂
用于本试验的设备主要为低温冷冻离心机(HITACHI CR21R)、PCR扩增仪(Biometra PCR仪)。试验所用ExTaq DNA酶、pMD-18T载体购于TAKARA公司,DNA凝胶回收试剂盒购于上海博亚生物技术有限公司,其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 菌株的筛选
筛选LB培养基:蛋白胨10g/L,酵母粉5g/L,盐浓度按照0.5%、0.9%、2.5%、3.5%、5%、8%、10%、20%、30%设置。用200μl土壤过滤液涂平皿,37℃摇床培养,挑取单菌落反复划线纯化,得到10%NaCl培养基中生长的5个单菌落。纯化好的菌株以甘油管用冻存管在-80℃保存,以便后面研究使用。
1.2.2 菌株基因组DNA的提取
将液体培养基中生长好的菌液,12 000r/min离心2min后倒去上清收集菌体,用无菌水清洗菌体,溶菌酶破壁,蛋白酶K处理,酚/氯仿/异戌醇按体积比25/24/1进行抽提,冷无水乙醇沉淀,70%冷乙醇洗净沉淀后减压干燥风干,最后溶于TE缓冲液中并放置在-20℃条件下保存。
1.2.3 菌株的抗性实验
用不同盐浓度的LB培养基在37℃摇床中摇菌,对菌株嗜盐性进行筛选,结果表明该菌株生长最适NaCl浓度为8%～20%,培养基低于8%和高于20%NaCl浓度该菌均不生长。
1.2.4 16SrRNA的PCR扩增及克隆
以提取的基因组DNA为模板,通过PCR反应扩增菌株的16S rRNA基因序列。PCR扩增采用一对引物,其正向引物为F(8-27):5'-AGA,GTT,TGA,TCA,TGG,CTC,AG-3'。反向引物为R(1525-1541):5'-T,AAG,GAG,GTG,ATC,CAA,C-3'。引物分别对应National center for Biotechnology Information(NCBI)J01859号Escherichia coli 16S rDNA核苷酸保守序列上的8-27位和1525-1541位。
PCR反应体系为50μl:其中10×PCR buffer(含有MgCl2 20mmol/L)5μl,2.5mmol/L dNTP 1μl,基因组DNA模板0.2μl,20μmol/L的引物分别2μl,Taq DNA聚合酶0.5μl,去离子水39.3μl。
PCR扩增条件为:94℃ 5min;94℃ 1min,55℃ 45s,72℃ 1.5min,一共运行30个循环;72℃ 10min。
扩增的PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离后,采用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化,将纯化的PCR产物与载体pMD-18T连接后转化DH5α进行克隆。
1.2.5 阳性克隆的筛选
将转化后的菌落接种于含氨苄青霉素(100mg/L)、X-gal(40mg/L)和IPTG(24mg/L)的LB平板中。挑取白色菌落,将其扩大培养后用碱裂解法小量快速提取质粒DNA。将提取的质粒DNA为模板进行PCR扩增,1%琼脂糖凝胶电泳检测重组阳性质粒。同时将质粒DNA以BamHⅠ、HindⅢ酶切,进一步验证克隆结果。
1.2.6 16S rRNA的全序列测定
纯化后得到重组质粒DNA,由北京三博公司进行全序列测定。
2 结果与分析
2.1 经过多次传代驯化、反复平板涂布,分离纯化的嗜盐菌在固体培养基上呈圆形,菌落较大、边缘整齐,表面光滑,菌体呈白色,极易挑起。菌株细胞为杆状,无鞭毛,大小为(0.6～0.7)μm ×(1.7～2.4)μm。其生长特点是低于8%NaCl和高于20%盐浓度的培养基中不能生长,适合在8%～20%的 NaCl盐浓度的培养基中生长。
2.2 菌株基因组DNA提取
菌株的基因组DNA通过溶菌酶、蛋白酶K以及酚/氯仿/异戌醇抽提,而后用乙醇沉淀,得到了基因组DNA,如图1所示。
2.3 菌株16SrRNA 基因序列的PCR扩增
以提取的基因组DNA为模板,通过PCR反应扩增菌株的16S rRNA基因序列。扩增的PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离后,其电泳结果见图2,菌株16S rDNA基因序列经过PCR扩增后,有一条大约1 500bp左右的核苷酸片断被扩增出。
2.4 菌株的16SrRNA基因全序列测定
将扩增的PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离后,采用DNA凝胶回收试剂盒进行回收纯化,将纯化的PCR产物与载体pMD-18T连接后转化进行克隆,经过筛选后将有16S rRNA基因序列插入的质粒提取测序。Bankit1052782的16S rRNA的基因序列被测定后,将该数据提交给了国际核酸数据库GenBank,经确认,在国际核酸数据库GenBank中的注册号为EB382220.National center for Biotechnology Information于2008年02月05日将该数据公布。将测得的序列用BLAST软件在Gene bank数据库进行同源性检索。
该株嗜盐菌16SrRNA基因序列测序结果如图3所示。
2.5 构建进化树
构建的系统发育树如图4所示,获得19条相似16S rRNA基因序列,加上目标基因,一共20条序列,保存为16SrRNA.txt。用CLUSTAL X软件进行多序列比对,得到16SrRNA.aln。用MEGA4软件对多序列比对结果进行进化分析,用N-J法(连接近邻法)构建进化树。由图4可见, 系统树整体由2个分支构成,EU382220处于Chromohalobacter-salexigens属部分菌株的系统发育树的一个分支中,根据16S rRNA的系统发育树分析,EU382220菌属于Chromohalobacter-salexigens属。
3 讨论
我们从舟山深海海泥中筛选得到一株嗜盐菌,经形态特征、16SrRNA序列分析,将所得序列与已知的16S rRNA序列进行同源性比较,该菌与色盐杆菌属红海菌DSM 3043(NC 007963.1)有94%的相似性。通常情况下,16S rRNA序列同源性小于97%,可以认为属于不同种,同源性小于93%,认为属于不同属。因此,该菌株可归属为色盐杆菌属。有报道新疆中部地区伊吾湖嗜盐微生物和细菌视蛋白基因资源[3]被研究。该嗜盐菌只能在8%～20%盐浓度的培养基中生长,这与普通的嗜盐菌有很大不同,这对于丰富嗜盐微生物的基因库具有重大意义。周钰钢等人从北京科技大学校园的草坪中分离到一株芽孢杆菌[4],其也能在20%NaCl盐浓度的培养基中生长。但我们鉴定的一株色盐杆菌具有嗜盐性,在低于8% NaCl盐浓度的培养基中不能生长。
嗜盐微生物是极其宝贵的基因资源,同时也是研究生物进化和生物多样性的重要材料。海洋是世界上盐份储藏最高的地方,同时那里的高盐、低温、无光照的特殊环境造就了海洋生物的多样性远远大于陆地生物。适应海洋环境的生物,其机体组分和代谢产物也与陆生生物大不相同,其细胞内形成了多种具有特殊功能的酶,同时蕴含着大量的新型化合物,对人类的生产和生活都是十分有用的。例如,嗜盐古菌的紫膜(Purple membrane)能够通过构型的改变存储信息,并具有广泛的pH值和温度耐受范围,是未来制造生物计算机芯片的理想材料[5]。另外,中度嗜盐菌产生的酶可以在高盐、高pH值情况下发挥作用,因而可使一些特殊环境下的生物降解得以实现,一种纤维素磷酸合酶已经成功从生长在耐盐的水稻中分离[6]。
总之,这项研究丰富我国微生物资源库和基因库,促进我国微生物学的学科发展,我们下一步的实验目的是用抑制差减杂交从这株嗜盐菌中筛选到耐盐基因,并转到植物中,增加其耐盐抗性,提高作物产量。这株嗜盐菌的发现具有很好的理论意义和潜在的应用价值,并值得做进一步的研究工作。
参考文献
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[5]FrankJ,Chiu W,Henderson R.Flopping polypeptide chains and Suleika’s subtle imperfections:analysis of variationsinthe electron micrographof a pur-ple membrane crystal[J].Ultramicroscopy,1993,49:387-396.
rps16序列 篇3
近年来分子系统学及DNA分子技术的快速发展,使得从分子水平研究物种间的亲缘关系及进行物种鉴定成为可能。动物线粒体基因组是一个小分子量环状分子(约为15.7～19.5 kb),一般认为它具有比核DNA高几倍的进化率[4]。在绝大多数动物中线粒体是单(母)系遗传,因此没有像核基因存在的重组现象[5]。线粒体DNA(mtDNA)作为遗传标记被广泛用于群体遗传和系统进化的研究。李刚等[6]运用同工酶谱对合浦珠母贝、长耳珠母贝和大珠母贝种间人工杂交进行了研究,证实这3个种的同工酶谱具有种的特异性,可作为鉴定种的一种分子手段。阎冰等[7]对马氏珠母贝和长耳珠母贝进行了RAPD分析,发现两者扩增带谱不同,具有各自的群体特征带。王小玉等[8]利用RAPD标记可将7种珍珠贝区分开来,而喻达辉等[9]对珠母贝6个种的ITS2序列进行了分析,发现不同种间序列差异较大,但种内差异非常小,认为ITS2序列可以作为种间鉴别标记。
文章拟通过分析合浦珠母贝、长耳珠母贝和企鹅珍珠贝的16S rRNA基因的核苷酸序列变异,并利用GenBank数据库其他珍珠贝种类的16S rRNA序列资料,探讨珍珠贝类的遗传变异与亲缘关系,为其遗传资源保护与利用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
样品的种类和采集地点见表1。合浦珠母贝取3个个体,而长耳珠母贝和企鹅珍珠贝各取2个个体,分别取少许闭壳肌保存于95%的酒精中待用。
1.2 方法
1.2.1 基因组DNA的提取
DNA的提取参照郭奕惠等[10]的方法并略作改进。取约20 mg珍珠贝肌肉组织,用纯水洗涤2次后,放入1.5 mL离心管内,先加入100 μL TEN9细胞裂解缓冲液,剪碎,再加入TEN9至600 L,加入SDS至终浓度为2%,混匀,56 ℃温浴15 min,加入蛋白酶K(20 mg·mL-1)10 μL,于56 ℃消化至溶液澄清。加入15 μL RNaseA,37 ℃反应约15 min,冷却后分别用等体积的饱和酚;酚:氯仿:异戊醇(25:24:1);氯仿:异戊醇(24:1)各抽提1次,加入2倍体积无水乙醇和1/10体积NaAc(3 mol·L-1,pH 5.2),于-20 ℃沉淀2 h以上,离心,75%乙醇洗涤2次,干燥后加入200 L去离子超纯水溶解,4 ℃存放。提取的基因组样品用1%琼脂糖凝胶电泳,EB染色检测,紫外分光光度计测定OD260和OD280 nm,检测抽提的DNA质量和计算DNA浓度,然后配成浓度为20 ng·μL-1备用。
1.2.2 引物设计与PCR扩增
根据已知双壳贝类16S rRNA基因序列设计合成一对引物,16S-F:5′-CGCCTGGTTGATTAAAAACATTGCTGC-3′,16S-R:5′-CCGGTTTGAACTCAGATCACGTA-3′。PCR反应体积为20 μL,包含1×PCR缓冲液[10 mmol·L-1 Tris-HCl(pH 9.0,25 ℃),50 mmol·L-1 KCl,0.1% Triton X-100],3 mmol·L-1 MgCl2,0.1 mmol·L-1 dNTP,0.15 μmol·L-1引物,1 U TaqDNA聚合酶(上海申能博彩),DNA模板30～50 ng。反应开始为93 ℃变性4 min,之后35个循环:93 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,最后为72 ℃ 5 min。扩增产物全部上样到1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳分离,然后割胶,用试剂盒(V-gene)进行PCR产物纯化和回收。PCR产物经纯化回收后送往上海英骏公司测序。
1.2.3 数据分析
所测序列经手工校正后,用Clustal 1.81[11]软件与其他已知序列进行比对。利用MEGA3.1软件,依KIMURA[12]双参数法(two-parameter method)对核苷酸位点的替换数进行统计,Gap处理为缺失,用最大简约法(maximum parsimony method,MP)进行聚类分析构建进化树,并用Bootstrap重复1 000次计算各分支的置信度。
2 结果
2.1 16S rRNA基因的碱基组成与同源比对分析
从所有个体的总DNA中均成功扩增出了大约500 bp的16S rRNA基因片段,直接把PCR产物送往上海英骏有限公司进行测序,将所测的3种核苷酸序列经手工校正后用Clustal 1.81软件对齐,删去引物及部分端部序列后,得到439 bp可供分析的核苷酸片段。同源比对结果显示,合浦珠母贝(3个个体)种内个体间序列完全相同,与网上已注册的合浦珠母贝序列(注册号:AB214441、AB214448和AB214449)完全一致;长耳珠母贝(2个个体)种内个体间有2个颠换(Transversion)突变位点,与其他珠母贝属的珍珠贝同源性都比较高;而企鹅珍珠贝(2个个体)种内个体间有1个转换(Transision)突变位点和5个颠换(Transversion)突变位点,与珍珠贝属的珍珠贝同源性较高,与其他珠母贝属的珍珠贝同源性较低。与其他珍珠贝一样,3种贝的16S rRNA基因中碱基A和T比G和C含量丰富(表2)。同Genbank中其他9种珍珠贝的序列进行比较,得到464个同源比对位点,包括51个插入/缺失位点和231个变异位点(173个简约信息位点,53个单突变子,图1)。合浦珠母贝与长耳珠母贝的同源性为83.2%,合浦珠母贝、长耳珠母贝与企鹅珍珠贝的同源性分别为55.4%和59.0%。表明同属珍珠贝同源性较高,不同属珍珠贝同源性较低。
2.2 遗传距离分析
根据Kimura双参数模型,得到12种珍珠贝类的遗传距离为0～0.490。珠母贝属的9种珍珠贝遗传距离为0～0.288,珍珠贝属的2种珍珠贝(P.penguin和P.hirundo)遗传距离为0.163(表3)。同属珍珠贝之间的遗传距离较小,不同属珍珠贝之间的遗传距离较大。合浦珠母贝(P.fucata)与长耳珠母贝(P.chemnitz)的遗传距离为0.168,合浦珠母贝(P.fucata)与企鹅珍珠贝(P.penguin)的遗传距离为0.446,长耳珠母贝(P.chemnitz)与企鹅珍珠贝(P.penguin)的遗传距离为0.410。合浦珠母贝(P.martensi)与(P.fucata)的遗传距离为0,白珠母贝(P.albina)与黑珠母贝(P.nigra)的遗传距离也为0。
2.3 聚类分析
根据12种双壳贝类的16S rRNA基因序列用MEGA 3.1软件构建了它们的NJ系统树(图2)。结果显示,系统进化树可分为2支,一支由珠母贝属的种类组成,包括合浦珠母贝、射肋珠母贝、斑珠母贝、黑珠母贝、白珠母贝、长耳珠母贝、大珠母贝和珠母贝等;另一支由珍珠贝属的种类组成,包括企鹅珍珠贝和燕子莺蛤(P.hirundo)。
3 讨论
线粒体16S rRNA结构既具有保守性,又具有高变性。保守性能够反映生物物种的亲缘关系,为系统发育提供重要线索;高变性则能揭示出生物物种的特征核苷酸序列,是属种鉴定的分子基础,因此,一般认为16S rRNA适用于种以上水平的变异分析[13]。目前未见国内有关珍珠贝16S rRNA序列的报道,文章初步分析了合浦珠母贝、长耳珠母贝和企鹅珍珠贝的线粒体DNA 16S rRNA基因部分序列及其与珍珠贝科其他种类的亲缘关系。合浦珠母贝、长耳珠母贝和企鹅珍珠贝的16S rRNA基因部分序列的G、C含量分别为46.9%、43.0%和41.9%,和其他珍珠贝一样,碱基A、T含量比G、C丰富。
根据16S rRNA基因序列得到的遗传距离,合浦珠母贝与长耳珠母贝的遗传距离为0.168,合浦珠母贝、长耳珠母贝与企鹅珍珠贝的遗传距离分别为0.446和0.410,说明合浦珠母贝和长耳珠母贝亲缘关系较近,而与企鹅珍珠贝的亲缘关系较远。珠母贝属的9种珍珠贝遗传距离为0～0.288,珍珠贝属的2种珍珠贝(企鹅珍珠贝和燕子莺蛤)遗传距离为0.163。珠母贝属与珍珠贝属之间的遗传距离为0.410～0.490,表明珍珠贝科珠母贝属与珍珠贝属在遗传上存在较大的差异。
NJ系统进化树可分为2支,一支由珠母贝属的种类组成,另一支由珍珠贝属的种类组成。在珠母贝属的分支中,2种大型珠母贝(珠母贝和大珠母贝)最早分支出来,表明与小型珠母贝之间亲缘关系最远,这一结果与ITS[14,15]和RAPD[16]的结果一致。小型珠母贝之间又形成2个大的分支,其中P.fucata和P.martensi聚在一起,遗传距离为0,表明它们有可能是同种,射肋珠母贝(P.radiata)与P.imbricata聚在一起,遗传距离为0.057,表明两者之间的亲缘关系很近,此结果与BEAUMONT和KHAMDAN[17]的等位酶(allozyme)分析结果一致。BEAUMONT和KHAMDAN认为海湾地区的常见种射肋珠母贝(P.radiata)与澳大利亚的P.imbricata和日本的P.fucata为同种,而且在形态上很难区分射肋珠母贝与合浦珠母贝[2]。因此,射肋珠母贝与合浦珠母贝是同物异名的可能性很大。喻达辉和朱嘉濠[18]用ITS序列和AFLP标记对P.fucata、P.martensi和P.imbricata这3个种的遗传关系进行了分析,3个种群的ITS1和ITS2的种间遗传距离非常小,与种内遗传距离相互重叠,而系统发育分析也表明不同种的个体相互混聚在一起。此外,种间的遗传分化也很低。认为这3个种实际上是同一物种。P.fucata和P.martensi以及射肋珠母贝与P.imbricata汇合后与斑珠母贝聚合在一起形成一个大的分支,表明斑珠母贝与射肋珠母贝和合浦珠母贝的亲缘关系较近。
另一大分支由黑珠母贝、白珠母贝和长耳珠母贝组成。其中黑珠母贝和白珠母贝聚在一起,遗传距离为0,表明它们亲缘关系很近或有可能是同种。黑珠母贝和白珠母聚合后与长耳珠母贝汇合。王祯瑞[2]认为黑珠母贝和白珠母贝的形态差别主要是颜色方面的差异。喻达辉等[14]利用ITS1序列构建的系统树,黑珠母贝和白珠母贝聚为一支成为类群Ⅱ,遗传距离为0.013,认为可能为2个亚种。HE等[19]对中国珠母贝属5个种的ITS 2序列进行了分析,发现大珠母贝和珠母贝、黑珠母贝的遗传距离较近。长耳珠母贝与黑珠母贝首先聚在一起,再与马氏珠母贝聚在一起。王嫣等[16]利用RAPD标记分析了马氏珠母贝、大珠母贝、珠母贝、解氏珠母贝(也叫长耳珠母贝)以及企鹅珍珠贝的系统发育。发现大珠母贝与珠母贝的遗传距离最小,与解氏珠母贝的遗传距离最大。马氏珠母贝与大珠母贝的遗传距离较与珠母贝的大。进化程度由低到高的等级顺序为解氏珠母贝-马氏珠母贝-珠母贝-大珠母贝。此研究利用PCR技术扩增获得合浦珠母贝、长耳珠母贝和企鹅珍珠贝16S rRNA基因长约439 bp可供分析的核苷酸片段,了解了这3个种群的遗传差异及与珍珠贝科其他珍珠贝的分子遗传关系,可为今后珍珠贝的遗传选育以及养殖生产提供分子遗传学基础。
摘要：利用PCR技术分别扩增合浦珠母贝(Pinctada fucata)、长耳珠母贝(P.chemnitzi)和企鹅珍珠贝(Pteria penguin)的16S rRNA基因片段,PCR产物直接测序,删去引物及部分端部序列后,得到439bp可供分析的核苷酸片段,用MEGA3.1软件分析了核苷酸差异。结果表明,合浦珠母贝种内个体间序列完全相同,长耳珠母贝种内个体间有2个颠换(Transversion)突变位点,而企鹅珍珠贝种内个体间有1个转换(Transision)突变位点,5个颠换(Transversion)突变位点。与GenBank数据库中其他9种珍珠贝的序列进行比较,得到464个同源比对位点,包括51个插入/缺失位点和231个变异位点(173个简约信息位点和53个单突变子)。合浦珠母贝与长耳珠母贝的同源性为83.2%,合浦珠母贝、长耳珠母贝与企鹅珍珠贝的同源性分别为55.4%和59%。NJ系统进化树表明合浦珠母贝和长耳珠母贝与珠母贝属的种类聚在一起,而企鹅珍珠贝与珍珠贝属的种类聚在一起,与形态学分类一致。