序列克隆论文

序列克隆论文（共11篇）

序列克隆论文 篇1

Ghrelin最初是由日本科学家Kojima M等[1]从大鼠胃中提取的一种多肽, 纯化后的Ghrelin是一个含有28个氨基酸残基的多肽, 以后又逐渐发现它分布在如肠、垂体、下丘脑、淋巴组织等许多组织中, 肾脏、心脏、胎盘、性腺也有少量分布。Ghrelin是目前为止除了生长素释放激素 (growth hormone releasing hormone, GHRH) 和生长抑素 (somato statin , SS) 外, 第3个调节腺垂体GH (生长激素) 分泌的内源性物质。Ghrelin可以激活G蛋白偶联受体GHSR (growth hormone secretagogue receptor) , 并刺激GH分泌生长素, 刺激垂体前叶释放生长激素的能力和生长激素释放激素释放生长激素的能力相当[2]。Ghrelin的受体GHSR广泛分布于中枢神经系统及外周组织, 并具不同亚型, 如此广泛的受体分布决定了Ghrelin具有广泛的生物学效应[3,4]。

目前, 对于梅花鹿Ghrelin的研究甚少。试验以梅花鹿为研究对象克隆Ghrelin cDNA, 这将为进一步得到全序列及研究其表达调控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验动物及组织提取

梅花鹿1只, 由内蒙古包头市大圣鹿场提供。将梅花鹿屠宰后立刻刮取其皱胃黏膜上皮组织, 立即在液氮中冷冻, 备用。

1.1.2 试剂 DNA DL-2 000

Marker (大小为2 000, 1 000, 750, 500, 250, 100 bp) 、限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、PCR产物纯化试剂盒, 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;质粒提取试剂盒、pBlueselect T载体, 均购自上海生工生物工程技术服务有限公司;琼脂糖、溴乙锭、总RNA提取试剂盒 (Cat NO Z5110) 、一步法反转录PCR试剂盒 (Cat NO A1260) , 均购自Promega公司;E.coli JM感受态细胞, 由组织胚胎发育学研究实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 PCR引物的设计及合成

根据GenBank中驯鹿Ghrelin的部分基因序列, 根据保守区和引物设计原则设计1对PCR引物, 引物由北京赛百胜公司合成。上游引物Gr1 5′- GCGTGCTCTGGCTGGACTTG-3′, 下游引物Gr2 5′- AGAAGCCGACGAAACCCTGG-3′。

1.2.2 梅花鹿皱胃黏膜上皮组织总RNA的提取

采用Promega公司的总RNA提取试剂盒, 按其说明进行。最后用无RNase去离子水溶解RNA沉淀, -70 ℃保存, 备用。

1.2.3 RT-PCR反应

PT-PCR反应液的组成:总RNA 9 μL (约800 ng) , 5×反应缓冲液10 μL, 25 mmol/L MgCl2 2 μL, dNTP 1 μL, 5 U/μL AMV 反转录酶1 μL, 5 U/μL DNA Taq酶1 μL, 上游引物和下游引物各50 pmol, 加无RNase去离子水至50 μL。另外设阴性对照, 即在RT-PCR 反应液中不加反转录酶AMV, 以排除RT-PCR。反应条件为48 ℃保温45 min, 使RNA逆转录为cDNA;94 ℃预变性2 min;90 ℃变性30 s, 55 ℃退火1 min, 68 ℃延伸2 min, 45个PCR循环;最后68 ℃延伸7 min。

1.2.4 梅花鹿Ghrelin基因cDNA的克隆及重组质粒的筛选和鉴定

按PCR产物试剂盒说明先将RT-PCR扩增产物纯化;然后用T4 DNA连接酶将纯化的梅花鹿Ghrelin基因cDNA片段与pBlueselect T 载体连接, 连接反应产物转化E.coli JM感受态细胞, 涂布含氨苄西林和IPTG-Xgal的LB平板培养基上, 37 ℃培养14 h;从转化平板挑取白色菌落, 用质粒提取试剂盒提取质粒;用限制性内切酶EcoRⅠ和Hind Ⅲ对质粒DNA 作酶切鉴定。

1.2.5 DNA序列鉴定

酶切鉴定阳性的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行序列测定。

2 结果

2.1 RT-PCR的扩增

以梅花鹿皱胃上皮组织中提取的总RNA为模板, 通过RT-PCR技术获得其产物, 经1%琼脂糖凝胶电泳检查为长约300 bp的条带, 阴性对照无扩增产物, 见图1, 说明扩增产物是以mRNA为模板扩增出来的。

M.DL-2 000 Marker;1.RT-PCR产物;2.阴性对照。

2.2 梅花鹿Ghrelin基因cDNA的克隆及重组质粒的筛选和鉴定

pBlueselect T 载体具有Amplr 抗性基因, 其多克隆位点在LacZ基因编码区内, 通过α-互补原理, 可进行蓝白菌落筛选。连接产物转化E.coli JM感受态细胞后, 在含氨苄西林和IPTG-Xgal的LB平板上筛选白色菌落, 提取质粒, 经对限制性内切酶EcoRⅠ和 Hind Ⅲ酶切图谱分析证实, 含有插入的目的片段, 见图2。

M.DL-2 000 Marker;1.EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切产物。

2.3 PCR 产物的序列分析结果

将酶切鉴定正确的质粒送上海生工生物工程技术服务有限公司进行DNA序列测定, 其测序结果及通过DNASTAR (Lasergene5.01) 进行氨基酸序列预测结果见图3。梅花鹿Ghrelin基因的cDNA序列测定结果为300 bp, 该序列组成的开放读码框 (ORF) 编码序列编码99个氨基酸残基。

3 讨论

胃肠道是Ghrelin的主要来源, 胃体Ghrelin细胞的分布密度 (细胞/mm2) 是下部小肠的十几乃至上百倍, 主要位于泌酸腺腺体的体部至底部, 部分位于腺体颈部, 而十二指肠、回肠、盲肠、结肠的Ghrelin细胞分散, 分布于腺管上皮细胞间及绒毛内。因此, 试验以梅花鹿皱胃中提取的总RNA为模板, 通过RT-PCR技术, 从梅花鹿胃组织中获得了Ghrelin基因的cDNA序列, 通过基因序列分析确认PCR产物为梅花鹿基因的cDNA。该300个碱基的梅花鹿Ghrelin cDNA中包含由297个碱基组成的开放读码框, 该cDNA 开放读码框编码99个氨基酸残基。

Ghrelin是生长激素促泌素分泌物质受体 (GHSR) 的唯一一个内源性配体, 在调节营养、机体组成和生长过程中起到重要作用[5], 并且有利于精神病的治疗[6]。因此, 目前在医学领域中对Ghrelin的研究已成热点。研究首次通过RT-PCR技术克隆出梅花鹿Ghrelin cDNA, 进一步获得全长基因和研究其表达调控, 同时对填补Ghrelin在野生动物方面的相关资料具有重要意义。随着对Ghrelin研究的深入和相关技术的进步, 可以通过生物工程技术开发相关产品, Ghrelin的应用将会更加广泛。

参考文献

[1]KOJIMA M, HOSODA H, DATE Y, et al.Ghrelin is a growth hom-one releasing acylated islet peptide from stomach[J].Nature, 1999, 402:656-660.

[2]DIEGUEZ C, CASANUEVA F F.Ghrelin:a step forward in the un-derstanding of somatotroph cell function and growth regulation[J].JEndocrinol, 2000, 142:413-417.

[3]LIOGER D, FARDETA, FOASSERTP, et al.Influence of sourdoughprefermentation, of steam cooking suppression and of decreased su-crose content during wheat flakes processing on the plasma glucoseand insulin responses and satiety of healthy subjects[J].J Am CollNutr, 2009, 28 (1) :30-36.

[4]CHEN J, LIU X, SHU Q, et al.Ghrelin attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung injury through no pathway[J].Med SciMonit, 2008, 14 (7) :141-146.

[5]KATERGARI S A, MILOUSIS A, PAGONOPOULOUO, et al.Ghre-lin in pathological conditions[J].Endocr J, 2008, 55 (3) :439-453.

[6]SCHANZE A, REULBACHU, SCHEUCHENZUBER M, et al.Ghre-linand eating disturbances in psychiatric disorders[J].Neuropsycho-biology, 2008, 57 (3) :126-130.

序列克隆论文 篇2

提取经刀豆素(ConA)诱导培养的水牛外周血淋巴细胞的总RNA,采用RT-PCR技术扩增水牛IFN-γ基因,将其克隆到pMD18-T载体上,并进行测序.序列分析结果表明,获得的IFN-γ基因全长为544个碱基,其开放阅读框(ORF)为501个碱基,编码166个氨基酸.与GenBank上已发表的水牛、乳牛的IFN-γ基因进行同源性比较,其核苷酸同源性均高于97%,氨基酸同源性均高于96%;与其他种类动物的IFN-γ的.同源性相比,随其亲缘关系的远近有所降低.

作 者：熊毅 朱伟 徐贤坤 龙剑明 刘棋 XIONG Yi ZHU Wei XU Xian-kun LONG Jian-ming LIU Qi 作者单位：熊毅,朱伟,徐贤坤,刘棋,XIONG Yi,ZHU Wei,XU Xian-kun,LIU Qi(广西动物疫病预防控制中心,广西南宁,530001)

龙剑明,LONG Jian-ming(广西大学动物科学技术学院,广西南宁,530005)

序列克隆论文 篇3

关键词:洋葱;花青素合成酶基因;基因克隆;序列分析

中图分类号:Q785文献标识号:A文章编号:1001-4942(2010)01-0001-05

Cloning and Sequence Analysis of Anthocyanidin Synthase Gene in Onion

MIAO Jun, LIU Bing-jiang, YANG Yan-yan, HUO Yu-meng,ZHANG Yi-hui,HUO Feng-mei,XIU Jing-run,WU Xiong*

(Institute of Vegetables, Shandong Academy of Agricultural Sciences, Jinan 250100, China)

Abstract Bulb color is an important economic trait in onion (Allium cepa). The anthocyanidin synthase gene AcANS in onion was cloned by PCR, and its sequence alignment and bioinformatics analysis were carried out. The open reading frame(ORF) of AcANS gene was 1 059 bp, and it encoded a protein with 352 amino acids. An AT-rich intron of 107 bp, obeying the GT-AG rule, was in the DNA sequence. The 2OG-Fe (II) domain of oxygenase family gene was in the peptide from 210 to 309.

Key words Onion;Anthocyanidin synthase gene; Gene clone; Sequence analysis

洋葱(Allium cepa L.)以肥大的肉质鳞茎为食用器官,根据其鳞茎的皮色可分为红皮、黄皮和白皮等品种。皮色是洋葱的重要经济性状之一,具有其自身的遗传规律[1,2]。器官的颜色是植物最重要、最直观的表型之一,对其遗传规律的研究起始于孟德尔对豌豆花色的研究,当时的研究是将基因位点与易于观察的色彩变异联系起来。如今有关花[3～5]、玉米籽粒[6～8]和拟南芥种皮[9,10]的颜色等,在遗传学、生物化学和分子生物学等方面的研究已取得重要进展。

花青素是决定花、叶片、果实和种子等颜色的重要因素之一,属类黄酮(flavonoids)物质。类黄酮化合物是植物的次生代谢产物,其基本碳骨架结构为C6-C3-C6,C3部分与O形成吡喃杂环。类黄酮化合物因其结构差异可被分为6 种主要类型,包括查耳酮(chalcones)、黄酮(flavones)、黄酮醇(flavonols)、黄烷双醇(flavandiols)、花色素苷(anthocyanins)和缩合单宁(condensed tannins 或proanthocyanidins)[11～13]。类黄酮广泛分布于植物界且在植物体内具有重要生理学意义,现已知它们控制着生长素的运输、根系的发育分支和向重性、种子萌发、紫外保护和抵御等[9,10,14]。

花青素由一系列酶催化合成,经由苯基丙酸类合成路径(phenylpropanoid pathway)和类黄酮生物合成途径(flavonoids biosynthetic pathway)生成[11～13]。生物合成前体为丙二酰CoA 和对香豆酰CoA,由苯基乙烯酮合成酶(CHS)催化二者形成苯基乙烯酮。黄色苯基乙烯酮异构化形成无色的黄烷酮。在黄烷酮羟基化酶(F3H)催化下形成无色的二羟基黄酮醇,由二羟基黄酮醇还原酶(DFR)催化还原形成无色花色素,无色花色素在花青素合成酶(ANS)作用下转变成有色花色素。然后由UF3GT(UDP-葡萄糖类黄酮-3-氧-葡萄糖转移酶)催化,糖基化形成比较稳定的花青素。本文克隆了洋葱的花青素合成酶基因,并对其进行序列比对和生物信息学分析,以期为进一步探索洋葱不同皮色的形成原因和分子机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 植物材料及DNA、RNA提取

以洋葱(Allium cepa L.)的新鲜叶片和花为材料,采自山东省农业科学院蔬菜研究所试验基地,取样后迅速放入液氮中冷冻,于-80℃保存备用。基因组总DNA用植物基因组DNA提取试剂盒(Tiangen,北京)提取,用pH 8.0 的TE 稀释成50 ng/μl。总RNA用RNAsimple总RNA提取试剂盒(Tiangen,北京)提取,cDNA 第一链的合成用TIANScript RT Kit(Tiangen,北京)完成。

1.2 PCR反应及目的片段的克隆

本研究所用的上游引物P1:CGGGACAACATAACTCAGAACAATT和下游引物P2: CATAATCAAACATCAGAGTCATCC由博尚生物技术有限公司合成。

PCR反应总体积为25 μl,其中模板(基因组总DNA或cDNA)1 μl,2.5 mmol/L dNTPs 2 μl,引物各0.5 μl,10×Ex-Taq buffer 2.5 μl,Ex-Taq DNA polymerase(Takara,大连)0.13 μl,用灭菌蒸馏水补充至25 μl。

扩增程序:94℃预变性3 min;94℃变性30 s,58℃退火 1 min,72℃延伸1 min,35个循环;最后72℃保温7 min。

扩增产物经1%的琼脂糖凝胶电泳分离,然后在Fluor ChemTM5500凝胶成像系统(Alpha Innotech, USA)上检测并照相记录,分子量Marker DL2000从大到小依次为:2000、1000、750、500、250和100 bp。

PCR 扩增产物用凝胶回收试剂盒(Tiangen,北京)进行回收,与克隆载体pMD18-T(Takara,大连)连接,转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5 感受态细胞,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,将阳性克隆送到博尚生物技术有限公司进行测序。

1.3 序列分析

利用Blast进行序列比对(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi),主要采用DNAMAN 软件及http://www.expasy.org和http://www.softberry.com等网上软件进行生物信息学分析。

2 结果与分析

2.1 洋葱AcANS基因的克隆

洋葱总DNA扩增的PCR 产物和RT-PCR 产物经电泳分离(图1),再通过回收、连接、转化后,经蓝白斑筛选和PCR鉴定,将阳性克隆进行序列测定。测序结果显示总DNA扩增片段1 215 bp,RT-PCR 产物1 108 bp,将其序列进行ORF分析,发现有完整的开放读码框。其ORF序列1 059 bp,预测的蛋白质由352个氨基酸残基组成,将其命名为AcANS基因。

1.gDNA为模板 2.cDNA为模板 M.Marker DL2000

图1 洋葱AcANS基因扩增产物电泳图

2.2 洋葱AcANS基因的序列特征

将AcANS基因的基因组序列和cDNA序列进行比对,发现其编码区有一个107 bp的内含子(图2)。这一内含子符合GT-AG规则,即其5′端为GT核苷酸残基,而3′端为AG核苷酸残基。并且内含子区富含AT,其中A和T共 85个,G和C共 22个,AT含量高达79.4%;而外显子区的AT含量为53.1%。

AcANS的Blast P 分析结果表明,此蛋白第210～309肽段含有2OG-Fe(Ⅱ) 加氧酶家族基因的结构域(图3)。ProtParam 程序预测,AcANS的氨基酸组成中Leu占最大比例,高达12.2%;

黑体部分显示内含子序列(符合GT-AG规则)

图2 洋葱AcANS基因编码区的DNA序列

图3 洋葱AcANS的2OG-Fe(Ⅱ)加氧酶家族基因的结构域

Glu第二,占到8.0%。Signal P 3.0 Server 检测结果显示AcANS不含信号肽序列,为非分泌蛋白。

洋葱的AcANS与水稻的OsANS和拟南芥的AtANS蛋白序列比较(图4),显示它们具有一些保守的区段,其中第210～309肽段很保守,与Blast P 分析结果一致,含有2OG-Fe(Ⅱ) 加氧酶家族基因的结构域。

2.3 洋葱AcANS进化分析

将洋葱的AcANS与水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticum aestivum)、玉米(Zea mays)、红掌(Anthurium andraeanum)、荷兰鸢尾(Iris hollandica)、芥菜(Brassica juncea)、甘蓝(Brassica oleracea var.

图4 洋葱的AcANS与水稻的OsANS和拟南芥的AtANS蛋白序列比较

capitata)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago truncatula)和牵牛(Ipomoea nil)等的花青素合成酶进行聚类分析,结果(图5)单子叶植物和双子叶植物各聚成一类。十字花科的甘蓝、芥菜和拟南芥聚在一起;豆科的大豆和苜蓿聚在一起;洋葱和鸢尾有较近的亲缘关系,并且与禾本科的水稻、小麦和玉米聚在一起。这就提示我们在今后洋葱的研究中,可以优先借鉴其它单子叶植物的信息,同时参考双子叶植物的相关信息。

图5 植物ANS的系统进化

3 讨论与结论

本研究从洋葱基因组DNA和cDNA分别扩增了花青素合成酶基因(AcANS),通过两者的序列比较发现其含有一个内含子,这一内含子符合GT-AG规则。AcANS的开放阅读框为1 059 bp,编码352个氨基酸残基,其蛋白质第210～309肽段含有2OG-Fe(Ⅱ) 加氧酶家族基因的结构域。花青素合成酶(anthocyanidin synthase,ANS)是花青素合成后期的酶,也有人称其为无色花青素双加氧酶(leucoanthocyanidin dioxygenase,LDOX),是一种2-酮戊二酸铁依赖型双加氧酶,催化从无色花青素到有色花青素的转变,即催化无色翠雀素、无色矢车菊色素和无色天竺葵色素生成翠雀素、矢车菊色素和花葵素[15～17]。

花青素合成酶基因是决定植物器官颜色的关键因素之一。Rosati 等(1999)[4]从美国金钟连翘(Forsythia intermedia)中克隆得到了ANS基因和其启动子,并证明在花瓣中无花色素苷是由于缺少ANS基因的表达所至。Nakatsuka等(2005)[5]发现,ANS基因的突变是导致龙胆花变为白色的重要原因。

花青素合成酶只是类黄酮生物合成途径中的一个环节,整个途径由一系列酶催化完成;同时编码这一系列酶的结构基因又受调节基因的控制,调控其表达的强度和模式。随着洋葱类黄酮生物合成途径的相关基因逐步被揭示,我们将从这些基因的等位变异中开发与皮色相关的分子标记,并把这些标记应用于洋葱的杂交育种实践中,建立具有自主知识产权的洋葱杂交育种体系。

参 考 文 献:

[1] Clarke A E, Jones H A, Little T M. Inheritance of bulb color in the onion [J]. Genetics,1944,29(6):569-575.

[2] Patil B S,Pike L M,Yoo K S. Variation in the quercetin content in different colored onions(Allium cepa L.) [J].J. Amer. Soc. Hort.Sci.,1995,120(6):909-913.

[3] Martin C,Carpenter R,Sommer H,et al.Control of anthocyanin biosynthesis in flowers of Antirrhinum majus[J].Plant J.,1991,1:37-49.

[4] Rosati C,Cadic A,Duron M,et al.Molecular characterization of the anthocyanidin synthase gene in Forsythia intermedia reveals organ-specific expression during flower development[J]. Plant Sci.,1999,149:73-79.

[5] Nakatsuka T,Nishihara M,Mishiba K, et al. Two different mutations are involved in the formation of white-flowered gentian plants[J]. Plant Sci.,2005,169:949-958.

[6] Messen A,Hohmann S,Martin W,et al. The En/Spm transposable element of Zea mays contains splice sites at the termini generating a novel intron from a dSpm element in the A2 gene[J]. EMBO J.,1990,9:3051-3058.

[7] Weiss D,Vander L A H,Kroon J T M,et al. The petunia homologue of the Antirrhinum majus candi and Zea mays A2 flavonoid genes:homology to flavonone 3-hydroxylase and the ethylene forming enzyme[J] . Plant Mol. Biol.,1993,22:893-897.

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序列克隆论文 篇4

目前,植物分子生物学研究的热点之一是发掘野生植物资源中的优异基因并深入研究其生物学功能。其中,研究基因生物学功能的一个重要方面就是研究基因的时空表达模式,目前通常采用real time RT-PCR的方法进行检测,而这一研究手段通常需要首先确定一个稳定表达的持家基因(housekeeping gene)作为参考,即内参基因。Actin基因编码肌动蛋白,在真核细胞中普遍存在,在不同组织和细胞中恒定表达,是植物基因表达研究常用的内参基因。肌动蛋白是高等植物细胞骨架中微丝的主要组分,执行重要的生理功能,如细胞分裂、细胞内物质运输、细胞内信号传导等[1,2]。研究表明,高等植物中Actin基因的核苷酸序列高度保守,可通过设计简并性引物来扩增不同植物物种的Actin基因片段。到目前为止,已在许多种高等植物如木薯(Manihot esculenta Crantz)[3]、花生(Arachis hypogaea L)[4]、豌豆(Pisum sativum)[5]、向日葵(Helianthus annuus)[6]、火龙果(Hylocereus undatus)[7]、多浆植物霸王(Zygophyllum xanthoxylum)[8]、盐生植物碱蓬(Suaeda glauca)[9]中克隆获得了Actin基因片段。

厚藤(Ipomoea pes-caprae L)也称马鞍藤、沙藤、二叶红薯、马蹄草等,为旋花科(Convolvulaceae)多年生草质藤本;茎极长而匍匐地面;叶互生,形如马鞍;花期全年,以夏季最盛;聚伞花序,花冠漏斗状,辐射对称,粉红色至浅紫红色[10]。厚藤性喜高温、干燥和阳光充足的环境,耐盐、抗风和耐旱性极佳;多生长于热带亚热带地区的海滨沙滩及路边向阳处;在我国分布于浙江、福建、台湾、广东、广西和海南等地[11]。厚藤具有重要的药用价值,其组织中含有多种药用成分,具有祛湿消肿的功能,是一种常用民间草药[12]。厚藤是典型的海滩植物,同时也是沙砾不毛之地防风固沙的第一线植物,具有绿化、美化环境和防风固沙的作用[13,14]。因此,厚藤是一种优异的野生植物资源,在海岛和海岸带(特别是珊瑚砂环境)植被恢复及防风固沙方面有非常重要的应用价值。此外,由于厚藤的抗逆性极强,通过分子生物学的手段研究厚藤的抗逆分子机制具有重要的科学意义。针对植物功能基因特别是抗逆基因的研究不仅可以了解这些基因的功能,而且有助于更好地利用这些研究结果定向地改造植物性状,使其更好地服务于人类社会。目前,有关厚藤的功能基因研究方面未见报道。本文通过克隆厚藤的Actin基因并分析其序列,为后续克隆厚藤的功能基因,并研究功能基因的表达模式提供内参基因。

1 材料与方法

1.1 实验材料选取

厚藤于2015年10月引种自广东省汕尾市鲘门镇的海滩,并栽培于本实验室。取成熟叶片样品,用RNase-free的水清洗后,采用锡箔纸包裹,立即冻存于液氮中,之后置于-80℃超低温冰箱中保存备用。

1.2 试剂和主要仪器

大肠杆菌DH5α菌株由本实验室保存。RNA的提取采用Magen公司HiPure Plant RNA Kits(R4151)。cDNA链的合成依照全式金公司TransS-cript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的说明书进行。DNA回收采用Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits。高保真Taq酶采用TakaRa公司的ProbestTMDNA Polymerase。本论文所用的pMD-18T载体从TaKaRa公司购买,其他常规生化试剂均购自中国科学院喀斯玛科苑商城。

本研究所使用的主要仪器包括紫外/可见分光光度计(NanoDrop ND 1000,赛默飞世尔科技有限公司)、PCR仪(A300Fast Thermal Cycler,杭州朗基科学仪器有限公司)、琼脂糖凝胶电泳系统(JY300C,北京君意东方电泳设备有限公司)、凝胶成像分析系统(JS-680B,上海培清科技有限公司)等。其他常规仪器如移液器、培养箱、摇床、冰箱等均为本实验室自备。

1.3 方法

1.3.1 引物合成

通过查询NCBI网站上(http://www.dtd.nlm.nih.gov/)上公布的多种植物的Actin基因序列,经序列同源性比对后,设计简并性引物ActinP1和ActinP2,引物序列见表1。采用该简并引物扩增厚藤Actin基因的cDNA片段。推测该目的Actin基因的cDNA片段长度为600bp左右。所需引物由广州英潍捷基公司合成。

1.3.2 总RNA提取

取厚藤的成熟叶片提取总RNA,按照Magen公司HiPure Plant RNA Kits(R4151)的操作说明书提取。对提取的总RNA进行NanoDrop ND 1 000紫外可见分光光度计浓度检测和琼脂糖凝胶电泳。

1.3.3 cDNA单链的合成及Actin片段的扩增

采用两步法以总RNA为模板进行逆转录反应获取cDNA第一链。cDNA单链的合成依照全式金公司TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix的说明书进行。

以厚藤叶片的cDNA单链为模板,采用高保真DNA聚合酶ProbestTMDNA Polymerase扩增厚藤Actin基因。所采用的引物为ActinP1和ActinP2,PCR反应体积为50μL。PCR扩增反应体系为:10x PCR Buffer 5μL,10mmol·L-1dNTP Mixture4μL,10μmol·L-1ActinP1 1μL,10μmol·L-1ActinP2 1μL,ProbestTMDNA Polymerase 0.5μL,cDNA模板2μL,ddH2O236.5μL。各种成分混匀后置于PCR仪上进行反应。采用的PCR反应程序为:(1)94℃预变性5min;(2)94℃变性30sec、56℃退火45sec、72℃延伸45sec,30个循环;(3)72℃延伸10min。

采用1%的琼脂糖凝胶电泳对获得的PCR产物进行电泳检测,并获得单一的DNA条带,即为PCR扩增得到的Actin基因片段。Actin片段依照Magen公司HiPure Gel Pure DNA Kits说明书进行琼脂糖凝胶电泳回收。DNA片段回收后用普通Taq酶进行3′末端加A处理。

1.3.4 阳性克隆的筛选与鉴定

将回收的DNA片段连接于pMD-18T载体,转化大肠杆菌感受态DH5α菌株,连接及转化方法均参照TaKaRa公司的说明书。将转化后的菌液涂布在LB固体培养基(含Ampicillin/IPTG/X-Gal)上,进行蓝白斑筛选,白色菌落可初步确定为阳性克隆。随机挑取白色菌落进行菌落PCR鉴定,提取质粒,送至广州英潍捷基公司测序。

1.3.5 序列的生物信息学分析

序列的比较、翻译等在OMIGA生物软件上进行,序列同源性分析采用BLAST程序,在NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)网站上进行。

2 结果与分析

2.1 总RNA检测结果

以厚藤的成熟叶片为材料提取总RNA,经检测OD260nm/OD280nm平均比值为2.17,表明所提取的总RNA具有较高的纯度;电泳检测表明,28S rRNA、18SrRNA条带清楚(图1),表明总RNA未发生降解,可进行下一步的逆转录反应;总RNA浓度为75ng·μL-1。获得的总RNA可以用于下一步RT-PCR扩增实验,获得cDNA。

2.2 RT-PCR扩增

以逆转录反应获得的cDNA第一链做为PCR反应的模板,采用简并性引物ActinP1和ActinP2进行常规PCR扩增。获得的PCR产物经电泳检测显示,在600bp左右有一条特异性的条带(图2),推测有可能是我们所需要的厚藤Actin基因的cDNA片段,可进行下一步的DNA片段回收。

2.3 阳性克隆的鉴定与测序

特异性DNA片段经切胶回收后,连接于pMD-18T载体上,并将连接产物转化大肠杆菌感受态DH5α菌株。将转化菌液涂布于LB固体(含Ampicillin/IPTG/X-Gal)培养基平板上进行蓝白斑筛选,白色菌落可初步确定为阳性克隆。随机挑取白色单菌落,用引物ActinP1和ActinP2进行菌落PCR检测(反应体系中未加菌落为阴性对照),得到的扩增片段大小约为600bp(图3),与RT-PCR结果一致,表明这些克隆为阳性克隆,可以提取质粒,进行测序。

注:M:DNA Marker;C:未加菌落的阴性对照;1-3:三个阳性单菌落Note:M:DNA marker;C:negative control;1-3:positive clones

2.4 序列分析

随机挑取3个阳性克隆,扩增培养后提取质粒,将重组质粒进行测序,结果表明,3个阳性克隆均插入相同的cDNA序列,大小均为598bp,表明我们所获得的Actin基因在厚藤叶片中表达量最高,因此才最容易被扩增出来。去掉两端的简并性引物序列之后,获得的cDNA片段大小为554bp,该片段编码184个氨基酸(图4)。将该基因命名为IpActin1。并将该序列登录在GenBank上,序列号为KU564627。

将该cDNA片段在NCBI数据库中进行BLAST分析,发现该序列与烟草的Actin基因(XM_009789260.1)同源性最高,相对应区域的核苷酸序列一致性达到了87%,与其他植物的核苷酸序列一致性也均在80%以上。氨基酸序列分析表明,该Actin片段(184个氨基酸)与芝麻的Actin蛋白(AHY35167.1)的对应区域仅有一个氨基酸的差别,氨基酸序列一致性达到98%,与其他植物Actin的氨基酸序列一致性也均在90%以上。结果表明,所获得的厚藤IpActin1的cDNA片段确实为植物中高度保守的Actin基因片段,可用于下一步的研究工作中。

3 讨论与分析

植物肌动蛋白(Actin)是组成细胞骨架微丝的基本成分,通常在不同组织和细胞中普遍存在并稳定表达。正是由于Actin基因具有这种稳定表达特征,通常被认定为持家基因。在功能基因表达模式的研究中,通常需要选择一个稳定表达的持家基因作为分子内标,用来消除不同RNA样品在操作过程中可能存在的差别,从而对基因表达的定量分析进行归一化[15,16]。目前,在多个植物物种中,已采用Actin基因作为稳定表达的内参基因,对其功能基因的表达进行定量分析。

在本研究中,已成功地克隆了厚藤的Actin基因IpActin1。序列分析表明,在核苷酸序列同源性比较方面,IpActin1片段与其他植物Actin基因的同源性均在80%以上;在编码的氨基酸序列同源性比较方面,其同源性也达到了90%以上。由序列分析结果结合以往的研究,我们可以推测出,本研究所获得的IpActin1基因可能也是一个高度保守的持家基因。本实验采用厚藤的成熟叶片为材料,提取RNA,通过逆转录扩增Actin基因片段,随机挑取的3个重组克隆经测序均编码同一个Actin基因片段,由于植物体内的Actin基因通常由多基因编码,表明所获得的Actin基因可能是厚藤植株内表达最丰富的Actin基因,进一步确定了该基因可用作内参基因,可以用于后续厚藤功能基因表达模式的研究。

序列克隆论文 篇5

东乡野生稻重复序列的克隆分析及染色体定位

从东乡野生稻(Oryza rufipogon Griff)中克隆到7个重复序列,序列分析表明: 这些序列是与转座因子有关的.序列. 以序列H2为探针,对不同基因组水稻进行Southern杂交,表明该序列为稻属内AA基因组特异的重复序列. 其分布在水稻的多条染色体上,荧光原位杂交(FISH)结果显示该重复序列主要位于染色体的着丝粒以及端粒附近,重复单位序列长度为615 bp左右. 并就特异重复序列在水稻研究中的应用进行了讨论.

作 者：洪义欢 钱凯 秦秋琳 陈建民 HONG Yi-huan QIAN Kai QIN Qiu-lin CHEN Jian-min 作者单位：扬州大学,生物科学与技术学院,江苏,扬州,225009刊 名：扬州大学学报(农业与生命科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF YANGZHOU UNIVERSITY(AGRICULTURAL AND LIFE SCIENCE EDITION)年，卷(期)：27(3)分类号：Q343.1+2 S511.9关键词：东乡野生稻 重复序列 Southern分析 荧光原位杂交

序列克隆论文 篇6

关键词：红平菇；漆酶基因；启动子克隆；转录调控

中图分类号：S646.1+40.1 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0021-05

漆酶（laccase）是一种含铜的多酚氧化酶，属于氧化酶的蓝铜家族。漆酶含有4个铜原子，分别位于3个不同结合位点，并且高度保守^[1]。1883年吉田在漆树中发现漆酶，1893年Laborde在真菌中发现漆酶。目前证实漆酶普遍存在于细菌、真菌、植物、昆虫中^[2]。其中真菌中的白腐菌是最重要的漆酶生产菌。近年来，漆酶是医学、化学、生物学、环境科学等领域的研究热点^[3]。目前对漆酶生理生化的研究比较明确，已经研究到分子水平并深入基因工程阶段，已经克隆许多漆酶基因cDNA及Genomic DNA全长序列，并对其序列进行了核苷酸分析^[4]。真菌漆酶存在很多同工酶基因，由于菌株生长环境和生理状态不同，其表达量也有所不同^[5]。研究表明，真菌漆酶的分泌受金属离子、营养元素及芳香化合物影响，这些因素是在转录水平诱导漆酶上调表达^[6]。由起始密码子上游的启动子及相应顺式作用元件的作用，转录水平的表达量增加。因此，研究真菌漆酶基因上游的启动子结构及功能对于提高漆酶蛋白的表达产量非常重要。本研究从红平菇HP1中提取总DNA，利用SEFA-PCR技术克隆了漆酶基因的启动子序列并对其结构进行分析，以期为进一步了解漆酶基因的表达调控机制奠定基础。

1 材料与方法

1.1 菌株与试剂

红平菇HP1 Pleurotus djamor采集于凉水国家自然保护区，由齐齐哈爾大学微生物实验室保存。DNAquick_快捷型植物基因组DNA提取系统、DNAquick Plant System均购自TIANGEN公司；SMART RACE cDNA扩增试剂盒（Clontech）；E.Z.N.A真菌RNA提取试剂盒（OMEGA）；E.Z.N.A凝胶回收试剂盒（OMEGA）；两步法RT-PCR试剂盒、Genome Walking Kit试剂盒、3′RACE试剂盒均购自TaKaRa公司；E.coli JM109感受态细胞购自TaKaRa公司；pMD20-T Vector、LA Taq DNA聚合酶（Promega）；其余试剂为进口或国产分析纯。

1.2 基因组DNA和总RNA的提取

以陈军等报道的优化后的漆酶培养基^[7]培养红平菇HP1。提取红平菇HP1基因组DNA和总RNA，用核酸检测仪测定产物纯度，通过琼脂糖凝胶电泳检验完整性。

1.3 cDNA核心片段克隆

合成cDNA第1链参照两步法RT-PCR试剂盒使用说明进行。在GenBank中选取20条漆酶基因全长的氨基酸序列，根据比对结果查找出同源序列保守区，从而设计1对简并引物（表1），PCR反应体系30 μL，含10×PCR buffer 3 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 1μL，5 U/μL TaKaRa Ex TaqTM HS 0.5 μL，引物Lcc1-RT1和Lcc1-RT2各 1 μL，cDNA 2 μL。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃ 40 s，55 ℃ 35 s，72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃延伸8 min。取5 μL扩增产物用 12 g/L 琼脂糖凝胶电泳鉴定（以下检测方法同）。

1.4 漆酶cDNA3′/5′末端的RACE-PCR扩增

参照3′RACE试剂盒和SMART RACE cDNA扩增试剂盒使用说明合成cDNA，根据漆酶cDNA基因片段序列，设计3′/5′RACE特异性引物，获得其3′/5′末端序列（表1），cDNA 3′末端套式PCR反应体系25 μL，第1次PCR反应含10×LA PCR buffer Ⅱ（Mg2+Free）2 μL，25 mmol/L MgCl2 1 μL，1×cDNA Dilution buffer Ⅱ 1 μL，10 μmol/L 3′RACE Outer Primer 1 μL，5 U/μL TaKaRa LA Taq

15 min。第2次PCR反应含10×LA PCR buffer Ⅱ（Mg2+Free）2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.5 μL，2.5 mmol/L dNTP Mixture 4 μL，10 μmol/L Gene Specific Inner Primer 1 μL，10 μmol/L 3′ RACE Inner Primer 1 μL，5 U/μL TaKaRa LA Taq 0.25 μL，第1次 PCR产物 0.5 μL。反应条件：94 ℃预变性2 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 15 min。cDNA5′末端套式PCR反应体系25 μL，10×Advantage2 PCR buffer 2.5 μL，10 mmol/L dNTP Mix 0.5 μL，50×Advantage2 polymerase Mix 0.5 μL，5′ RACE-Ready cDNA 1.5 μL，10 μmol/L GSP1 0.5 μL，UPM（10×）2.5 μL。反应条件同3′ RACE。

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1.5 漆酶cDNA全长及漆酶Genomic DNA全长的扩增

根据cDNA 3′/5′末端核苷酸序列结果，分别在其3′和5′末端设计特异性引物，用于扩增漆酶cDNA全长序列（表1）。同时以基因组DNA为模板，扩增漆酶基因组全长。cDNA全长PCR反应体系50 μL，含5×Prime STARTM buffer（Mg2+ plus） 10 μL，10 mmol/L dNTP Mixture 4 μL，2.5 U/μL Prime STARTM HS DNA Polymerase 0.5 μL，引物Lcc1-S1和 Lcc1-S2 各1 μL，反转录cDNA 5 μL。Genomic DNA全长PCR反应体系及反应条件同“1.3”节。

1.6 SEFA-PCR法克隆漆酶基因的启动子序列

根据已获得的漆酶Genomic DNA全长序列，设计5′端启动子特异性引物，分别为Lcc1-SP1、Lcc1-SP2、Lcc1-SP3，以基因组DNA为模板进行3轮PCR扩增，获得漆酶基因5′端启动子序列（表1）。

1.7 漆酶基因结构及启动子结构分析

将上述得到的漆酶全长基因cDNA和基因组全长以及5′端启动子序列经过胶回收试剂盒纯化后，进行T载体克隆，并送交北京英俊公司测序。运用生物信息学技术对获得的漆酶全长基因cDNA和基因组以及5′端启动子序列进行同源性比较及结构特点分析。

2 结果与分析

2.1 总RNA检测

提取红平菇菌丝体总RNA后，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明，28S rRNA、18S rRNA条带较清晰，且2条带比值接近于2 ∶1，证明总RNA较完整。经核酸检测仪检测，280/260、260/230分别为2.01、2.57，说明纯度较高。所提取总RNA可以用于后续试验（图1）。

2.2 红平菇HP1漆酶基因cDNA全长的克隆与序列分析

根据真菌漆酶高度保守Cu-bind结构域Ⅰ、Ⅳ的氨基酸序列，设计1对简并引物并扩增漆酶基因cDNA片段，得到1条约1 000 bp大小条带，将其进行大肠杆菌转化并测序，测序结果为1 021 bp，进行Blastx比对后证明是漆酶基因（图2）。根据已知的漆酶cDNA片段，设计3′端特异性的正向引物：3′RACE GSP （outer）和3′RACE NGSP （inner），以反转录的 cDNA 第1条链为模板，扩增3′ cDNA末端，获得约750 bp大小条带，进行测序后漆酶基因片段为742 bp，其3′末端有典型的PolyA尾巴，并且具有加尾信号（AATAAA）（图3、图4）。根据已知的漆酶cDNA片段设计5′端特异性反向互补引物：5′RACE GSP，以反转录液为模板，扩增5′ cDNA末端，获得约 750 bp 大小条带，进行测序后基因片段为732 bp，5′端有一典型UTR区（1～66 bp），编码区长度为666 bp，该基因片段与RT-PCR扩增的基因片段有重复区域，进行Blastx比对后证明是漆酶基因（图5）。

将RT-PCR获得的漆酶基因片段与3′/5′RACE获得的漆酶基因片段进行剪切拼接，得到cDNA基因全长为 1 746 bp，命名为Pd-lac1。漆酶具有真核生物基因的一般特征，在其5′端有1个UTR区，长度为66 bp；3′端具有PolyA尾巴和加尾信号（AATAAA）。通过NCBI的ORF Finder检测到1条长1 590 bp的完整开放式阅读框，其编码529个氨基酸，预测蛋白分子质量为55.52 ku，限制性酶切位点有78个，等电点pI约为4.72。应用RPS-Blast软件进行Cu-bind结构域分析表明，该蛋白有3个Cu-bind结构域，即pfam07732、pfam07731、pfam00394，其中pfam07732、pfam07731是多铜氧化酶中与次级代谢物运输、分解代谢和生物合成相关的结构域；pfam00394是Cu离子保守结构域。利用SignalP V2.0软件分析位于氨基酸序列N端具有真核基因的信号肽序列（1～19aa），剪切位点为AHA-AI。利用Scanprosite软件分析得出，在漆酶基因编码的氨基酸序列中含有3个N-糖基化位点（N-X-S/T），天冬酰胺残基分别位于序列中的第216、311、444处，它们是潜在的糖基化位点。将漆酶编码的氨基酸序列与已知的蛋白序列进行Blastp比对后发现，它与桃红侧耳Pleurotus salmoneostramineus的氨基酸序列具有较高的同源性，相似性达97%，与齿耳菌Steccherinum murashkinskyi漆酶氨基酸序列相似性达到72%。

2.3 漆酶Genomic DNA全长的克隆与结构分析

根据漆酶全长cDNA序列设计1对特异性全长引物，以提取总DNA为模板通过全长PCR扩增得到该漆酶Genomic DNA的全长序列，全长为2 258 bp，命名为Pd-lac1（图6）。

利用NCBI網站的Align Sequences Nucleotide BLAST对漆酶基因cDNA全长和基因组DNA全长序列进行分析，在所克隆的漆酶基因组DNA中包含13个外显子和12个内含子。内含子长度分别为56、48、53、51、55、66、51、51、58、68、51、56 bp，是典型的真菌内含子长度（49～85 bp）。每个内含子剪切位点序列为5′GT…AG-3′（图7）。

2.4 漆酶基因启动子的获得与转录调控元件分析

根据漆酶Genomic DNA全长序列信息，参照Liu的方法^[8]，靠近5′端设计3条反向引物Lcc1-SP1、Lcc1-SP2、Lcc1-SP3，以红平菇HP1基因组DNA为模板对该基因上游片段进行hiTAIL_PCR扩增。3轮反应后，引物Lcc1-SP1、Lcc1-SP2、Lcc1-SP3获得了较长的PCR产物（图8）。对第3轮PCR中的Lcc1-SP3、AP3引物产物进行回收测序，获得了总长度1 500 bp的序列信息，分析发现该序列包括漆酶基因5′末端及其上游。

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利用Biological Services網站的Sequence Analysis对克隆得到的Pd-lac启动子序列进行分析。在Pd-lac启动子序列中，具有真核生物典型的启动子基本转录调控元件，Pd-lac的启动子序列中存在许多潜在的外源诱导物响应结合元件，1个CAAT框，位于第-105位；2个热击元件（CreA）（SYGGRG），分别位于-78、-396位；2个AP2元件，分别位于第-164、-566位；1个潜在的热击响应元件（HSEs）（TCNNGAAN），位于第-660位；2个潜在的压力响应元件（STRE）（CCCCT/AGGGG），分别位于第-157、-866位；4个金属应答元件（MRE）（TGCRCNG），分别位于第-381、-466、-803、-928位；1个异生物质反应元件（XRE）（CACGCW），位于第-687位；以及 4个氮因子结合位点（GATA）或其互补序列（TATC），分别位于第-299、-356、-708、-983位；1个NIT2元件，位于第-418位；1个热击元件（CreA）（SYGGRG），位于-396位^[9-10]（图7）。

2.5 红平菇HP1漆酶基因的系统进化分析

从150个菌株中选取34个相关性菌株，与Pleurotus djamor按照UPGMA聚类法进行系统进化树分析。从图9可以看出，35个菌株分为3大类群，其中1类是16个菌株聚成第1个大类群，为多孔菌（Polyporales）；2类是16个菌株聚成第2个大类群，为伞菌（Agaricales）；3类是3个菌株聚成第3个大类群，为子囊菌（Ascomycota）。红平菇漆酶cDNA基因属于伞菌，与Pleurotus salmoneostramineus遗传距离最近，同源性为97%。从系统进化树可以看出，同一菌株漆酶cDNA基因的同工酶遗传距离也具有差异，如Lenzites gibbosa等。

3 结论与讨论

红平菇漆酶5′端调控区域具有真核生物典型的启动子转录元件，CAAT-box、TATA-box、GC-box还具有金属离子效应位点（MRE），MRE对金属硫蛋白基因响应重金属离子的诱导起着至关重要的作用。另外，还分布有2个潜在的压力响应元件（STRE）和1个潜在的热激响应元件（HSEs），HSEs通过感受外界热刺激，进而激活金属硫蛋白基因的转录，因而STRE、HSEs可能会共同响应高浓度Cu2+的压力而激活红平菇漆酶基因的转录^[2]。红平菇漆酶5′启动子的克隆，为漆酶表达调控机制的研究奠定了基础。红平菇漆酶5′启动子属于可诱导型启动子，这为构建红平菇诱导型表达载体提供了理论基础。

1个漆酶cDNA全长基因和基因组DNA全长序列，这对于今后研究漆酶基因的同源表达、异源表达及蛋白质的纯化奠定了基础。利用SEFA-PCR技术在红平菇菌株中克隆1个漆酶5′启动子序列，这对于今后研究红平菇漆酶的表达调控具有十分重要的意义。

参考文献：

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序列克隆论文 篇7

研究GLUT 3的结构和功能, 能更深入了解其在细胞糖代谢过程中的重要作用和机理。目前, 已有很多关于GLUT 3的结构与功能及其调控机制研究的报道, 但对水牛GLUT 3基因结构及功能的研究的报道较少。本试验根据已有报道, 设计特异性引物扩增水牛GLUT 3基因并对其序列进行分析, 现报道如下。

1 材料与方法

1.1 样品的采集

从某屠宰场取水牛卵巢组织, 液氮冻存。

1.2 载体及菌株

克隆载体p MD18-T, Ta KaRa公司产品;大肠杆菌DH5α, 广西大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室提供。

1.3 引物的设计与合成

应用Oligo 6.0软件, 根据Gen Bank中检索到的牛GLUT 3 mRNA (登录号为NM2174067) 序列设计特异性引物, 并由深圳华大基因科技有限公司合成。序列:上游引物5'-GGACATTTTGGAGGTTTTG-3';下游引物5'-GGATGAGAAAGGAATGGAGT-3'。

1.4 酶及试剂

AMV酶、Taq DNA聚合酶、限制性内切酶SalⅠ及EcoRⅠ, 购自Ta KaRa公司;DL-2 000 Marker、DNA凝胶回收试剂盒, 购自Tiagen公司;DNA质粒提取试剂盒, 购自Dio Dec公司;TRIzol, 购自Invitrogen公司。

1.5 总RNA的提取

将水牛卵巢组织样品按100 mg/m L加入TRIzol匀浆, 采用TRIzol一步法提取 (按试剂盒说明进行) 。

1.6 RT-PCR

以Oligo (d T) 为引物, 水牛皱胃组织总RNA为模板, 用AMV酶进行RT反应合成c DNA第一链, 反应体系:总RNA 1μg, 5×RT缓冲液4μL, d NTPs (10 mmol/L) 2μL, Oligo (d T) 2μL, RNase抑制剂20 U, AMV 10 U, 用无RNA酶水补足20μL。反应条件:30℃10 min, 42℃60 min。合成c DNA第一链后进行PCR扩增。PCR反应体系:10×Buffer 2.5μL, d NTPs (10 mmol/L) 0.5μL, 模板1μL, 上、下游引物 (20μmol/L) 各0.5μL, Taq酶2 U, 用无菌水补足25μL。反应条件:95℃3 min;94℃30 s, 60℃30 s, 72℃30 s, 共35个循环;72℃10 min。用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测。

1.7 PCR产物的TA克隆与鉴定

PCR产物经琼脂糖凝胶电泳, 用DNA凝胶纯化试剂盒进行回收。将回收的目的片段与p MD18-T载体在T4 DNA连接酶作用下, 于16℃连接过夜, 连接产物命名为p MD18-GLUT 3;将连接产物转化大肠杆菌DH5α, 涂抹于含氨苄西林的LB琼脂平板, 37℃培养16 h;选取菌落数个, 用引物进行菌落PCR鉴定;再对阳性菌株进行质粒提取, 用SalⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定, 筛选出含p MD18-GLUT 3的阳性转化子, 送深圳华大基因科技有限公司进行测序验证。

2 结果与分析

2.1 总RNA的提取及RT-PCR

用TRIzol一步法提取水牛卵巢组织的总RNA, 电泳检测可见完整的28S rRNA、18S rRNA、5S rRNA3条带, 见图1。以此总RNA为模板进行RT-PCR, 通过琼脂糖凝胶电泳检测, 可得到1 701 bp的特异性条带, 见图2。

1, 2.卵巢组织总RNA。

1.DNA分子质量标准;2.GLUT 3 PCR产物;3.阴性对照。

2.2 p MD18-GLUT 3的鉴定

从转化的细菌平板上挑选菌落, 进行菌落PCR以鉴定抗性克隆, 结果见图3。

1.DNA分子质量标准;2.重组质粒酶切;3.重组质粒对照。

由图3可见, PCR扩增后, 各菌落样本均产生1 701 bp的特异性条带, 与目的基因片段大小相符, 而空白对照无扩增, 说明PCR结果非污染所致。挑取阳性菌落进行摇菌, 提取质粒后用SalⅠ和EcoRⅠ进行双酶切鉴定, 可切出1 701 bp目的条带。

2.3 序列测定与分析

将克隆得到的重组质粒送往生工生物工程 (上海) 有限公司进行测序。用DNAMan软件预测GLUT3的ORF大小为1 701 bp, 分子质量约为903 ku, A+T含量为47.54%。通过Prot Param分析水牛GLUT 3蛋白含494个氨基酸, 分子质量为54 099.9 u, 等电点为8.31, 其中Leu、Ile与Gly含量较高, 并预测该蛋白为稳定类蛋白。将得到的水牛核苷酸与氨基酸序列与NCBI中牛、人、猪、大鼠和山羊的GLUT 3进行同源性比对, 结果表明:水牛GLUT 3基因核苷酸序列与牛、山羊、人、大鼠、猪同源性分别为100%、100%、99%、94%和81% (见图4) ;氨基酸序列与牛、山羊、人、大鼠、猪同源性分别为100%、99%、99%、99%和97% (见176页彩图5) 。用MEGA4.0软件对水牛、牛、山羊、人、大鼠和猪GLUT 3核苷酸序列进行多重比对, 并对其构建系统进化树, 结果说明, 水牛GLUT 3与牛、山羊和猪的亲缘性最近, 与人和大鼠亲缘性较远, 见图4。说明GLUT 3是一组在进化上相对保守的蛋白质。

3 讨论

葡萄糖是一种极性分子, 不能经自由扩散通过细胞脂质双层膜结构的疏水区, 细胞从间液中摄取葡萄糖, 需要通过质膜上的一个或者更多的转运系统[3,4], 即所需的葡萄糖只有通过转运蛋白的转运才能进入下一步的代谢。葡萄糖由高浓度向低浓度梯度驱动的质膜穿越过程主要由两种不同的表达于细胞膜上的己糖转移酶介导, 即葡萄糖转运蛋白和钠-葡萄糖协同转蛋白。本试验研究对象GLUT 3为易化葡萄糖载体, 它是一类重要细胞膜溶质载体 (SLC) , 分属膜载体SLC2A家族。对于以葡萄糖为主要能源底物的神经元而言, GLUT 3就像一个总电闸。

人类GLUTs由429~524个氨基酸组成, 不同GLUT有39%~65%的氨基酸组成相同, 其序列相似性达50%~76%[5]。某一特定的亚型在种属间也略有差异, 其中GLUT 1最为保守, 人的GLUT 1蛋白与小鼠、大鼠和猪的GLUT 1蛋白同源性高达97%~98%[6];GLUT 3的保守性不如GLUT 1, 人、鼠之间的同源性为83%[7,8]。GLUTs是一组膜蛋白, 其多肽链骨架跨膜12次形成12个α螺旋即跨膜区 (M1~M12) , 多肽链的氨基端和羧基端均位于质膜的胞质面, 其长度和序列在不同GLUTs中有所不同。跨膜区和位于胞浆内侧连接跨膜区的短环氨基酸序列高度保守, 构成不同GLUTs葡萄糖转运的通道[9]。

水牛GLUT 3基因的克隆及分析尚未见报道。本试验首次克隆得到水牛GLUT 3基因, 用DNAMan软件预测核苷酸序列GLUT 3的ORF大小为1 701 bp, 分子质量约为903 ku, A+T含量为47.54%。通过Prot Param分析可知, 水牛GLUT 3蛋白含有494个氨基酸, 分子质量为54 099.9 u, 等电点为8.31, 其中Leu、Ile与Gly含量较高, 并预测该蛋白属于稳定类蛋白。同时, 将水牛GLUT 3基因ORF序列和蛋白序列与牛、山羊、人、大鼠、猪分别进行同源性分析, 并对其核苷酸进行多重比对, 构建系统进化树, 结果表明, 水牛GLUT 3与牛、山羊和猪的亲缘性最近, 与人和大鼠亲缘性较远, 说明该基因十分保守。通过对水牛GLUT 3成熟编码序列的克隆及分析, 为进一步研究该基因的结构与功能奠定理论基础。

摘要：为了研究GLUT 3的功能, 试验根据GenBank中公布的牛、人等物种的GLUT 3核苷酸序列设计、合成1对引物, 以水牛卵巢组织总RNA为模板, 采用RT-PCR法扩增出GLUT 3成熟蛋白编码cDNA序列, 将此扩增产物克隆入pMD 18-T载体, 进行PCR、双酶切鉴定及序列测定与分析。结果表明:扩增的水牛GLUT 3基因CDS序列长为1 701 bp, 经相关生物软件预测, 该基因编码494个氨基酸。水牛GLUT 3基因ORF序列与牛、山羊、人、大鼠、猪同源性分别为100%、100%、99%、94%和81%;蛋白序列与牛、山羊、人、大鼠、猪同源性分别为100%、99%、99%、99%和97%。说明GLUT 3是一组在进化上高度保守的蛋白质。

关键词：葡萄糖转运体3 (GLUT 3) ,水牛,序列分析

参考文献

[1]WOOD I S, TRAYHUM P.Glucose transporters (GLUT and SGLT) :expanded families of sugar transport proteins[J].Br J Nutr, 2003, 89 (1) :3-9.

[2]ULDRY M, THORENS B.The SLC2 family of facilitated hexose and polyol transporters[J].Pflugers Arch, 2004, 447 (5) :480-489.

[3]MARGER M D, SAIER M H Jr.A major superfamily of transmembrane facilitators that catalyse uniport, symport and antiport[J].Trends Biochem Sci, 1993, 18 (1) :13-20.

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[6]CORNFORD E M, HYMAN S, CORNFORD M E, et al.Downregulation of blood-brain glucose transport in the hyperglycemic nonobese diabetic mouse[J].Neurochem Res, 1995, 20 (7) :869-873.

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[8]VANNUCCI R C, VANNUCCI S J.Glucose metabolism in the developing brain[J].Semin Perinatol, 2000, 24 (2) :107-115.

序列克隆论文 篇8

根据目前研究,国内外关于肌肉生长发育和肉质性状的研究方法有很多,一般采用定位影响肉质的主效基因的方法来实现,所涉及的主要调节肌肉生长发育因素有如下几种:肌肉生长抑制素、瘦蛋白基因、钙素基因、生肌调节因子MyoG基因[2]、肾上腺髓质基因、腺苷酸环化酶2型基因[3]、胰岛素样生长因子[4]。

肌肉生长抑制素(简称MSTN),又称GDF-8,是TGF-β(transforming growth factor beta,转化生长因子β)超家族成员。MSTN在骨骼肌中广泛表达,是功能比较专一的肌肉发育负调控因子,在控制骨骼肌生长发育与分化上起着非常重要的作用。MSTN基因实现对肌细胞生长发育的负向调控的原理,是通过抑制成肌细胞的分化抗体家族成员的转录活性来实现的,肌肉重量大小的变化表现为与MSTN基因的表达量呈显著的负相关性[5]。已有最新报道表明,在不同的家畜动物中,可以使MSTN基因失活,从而导致肌肉增大重量增加现象[6]。肌肉生长抑制素基因的研究一直是近年来国内外分子遗传领域的研究热点之一,并已取得显著成果。

MicroRNA是一类进化上高度保守的非编码的单链内源性小分子RNA[7]。目前,大约有3 000种MicroR-NA已经被鉴定出来[8]。目前,已经被证实,在肌肉发育和肌肉细胞增殖和分化过程中MicroRNA具有重要的调节作用[9]。

1 材料与方法

1.1 血液与肌肉组织样品

试验以辽宁省培育的新品种——辽育白牛为研究对象进行多次采样分析。样品分别由辽宁省畜牧业经济管理站联系大连雪龙集团公司与辽宁绿源肉业有限公司提供。在大连雪龙集团公司,利用加有抗凝剂EDTAK2的采集管对20头辽育白牛静脉采血,将采集的样品低温保存,带回实验室-70℃冰箱中保存备用。在辽宁绿源肉业有限公司所属的屠宰场采集平均年龄约为5岁的辽育白牛肋脊部肌肉组织,以及心、肝、脾、肺、肾、睾丸、附睾组织,用提前经过灭菌的镊子和手术刀片分别取100 g并切成小块分装,装在纱布袋里,拴好并在绳上粘上标签,立即放入液氮罐中冷冻备用。

1.2 试剂

蛋白酶K(proteinase K)、Taq DNA聚合酶、5×SDS PAGE蛋白上样缓冲液、DEPC、dNTPs、6×Buffer、DL 2000 DNA Marker、RNA simple总RNA提取试剂盒、血液DNA提取试剂盒、RT-PCR反转录试剂盒、PCR试剂2×Taq PCR MasterMix、βActin抗体等,购自天跟生物有限公司和大连宝生物工程有限公司。

1.3 引物设计及合成

参考GenBank上公布的牛MSTN序列(登录号为NM＿001001 525.2),使用Primer 5.0和Oligo 6软件分别对基因的5'调控区,CDS和3'-UTR设计特异引物,由上海生工合成引物。5M1和5M2扩增5'调控区(位于编码区上游长约1 240 bp),5M1,F:5 CTAAGGTTGAGAGTTTGA 3,R:5 TCTTTT-GCTTTTGAGTAA 3,长度1 226 bp,退火温度51.0℃;5M2,F:5 AGACCTTACCCCAAATCCC 3,R:5 AGACAACTTGCCACACCAG 3,长度1 101 bp,退火温度61.0℃。M1、M2、M3扩增编码区(1～1 128 bp),M1,F:5 TTGGCTTGGCGTTACTCA 3,R:5CCATCTTCTCCTGGTTCT 3,长度826 bp,退火温度57.4℃,M2,F:5 TTGGGCTTGATTGTGAT 3,R:5GAATGGTAACCTGCGTAT 3,长度846 bp,退火温度55.0℃;M3,F:5 CCACAAAGTAGGGAT 3,R:5CATTGGATGTAAGA 3,长度977 bp,退火温度46.4℃。3M1、3M2、3M3扩增3'调控区(位于编码区下游长约1 058 bp),3M1,F:5 GTAGATCGCTGT-GGGTGT 3,R:5 CCATAGGGAGGAGTGTGA 3,长度700 bp,退火温度54.2℃;3M2,F:5 AG-GTCTTCCCCTCAACAA 3,R:5 CAGCCATTCAGCCTATTG3,长度552 bp,退火温度53.4℃;3M3,F:5 AG-GACATAAAAGCAAAAG 3,R:5 TACAATGACAGTAAACCA3,长度194 bp,退火温度48.5℃。

1.4 基因组DNA及总RNA的提取及检测

按照血液基因组DNA提取试剂盒(天根)提取基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA纯度,紫外分光光度计测定DNA浓度,采用RNA simple总RNA提取试剂盒(天根),对辽育白牛肌肉及心、肝、脾、肺、肾、睾丸、附睾八种组织的总RNA进行提取,并用0.8%的甲醛的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 产物扩增与序列鉴定

本试验采用设计的上、下游特异引物,分别在各自最适退火温度条件下获得MSTN基因各个区段目的片段。编码区的引物M1、M2、M3对基因扩增时,采用的模板是辽育白牛各组织中提取的RNA反转录后获得的cDNA。用MSTN基因的5'调控区和3'-UTR区域的基因引物进行基因扩增时,需要对10头辽育白牛种公牛血样提取的DNA分别进行扩增。然后根据巢式PCR方法,将检测后成功获得的MSTN基因的5'调控区和3'-UTR区域基因扩增产物每3管混在一起,将所有成功获得的MSTN基因扩增产物进行测序。目的序列与GenBank中相应基因序列比对分析,确定基因的序列结构。利用DNAStar,DNA-MAN 4.0,BLAST等软件与GenBank中序列进行比较分析。利用数据库和在线软件分别分析5'端非翻译区序列、预测TATAbox、转录因子结合位点、预测CpG岛、预测蛋白结构及功能位点、预测3'端非翻译区序列靶标MicroRNA。

2 结果与分析

2.1 目的基因片段扩增与测序

采用设计的上、下游特异引物,在最适退火温度条件下获得MSTN基因不同区段目的片段(图1)。测序结果显示,在5'调控区-805 bp位处发生G/C突变,编码区571 bp位处发生A/G突变,3'-UTR区5 387 bp处发生C/T突变(图2)。

2.2 MSTN基因分子特征分析

测序结果分析后,在MSTN基因5'调控区发现4个突变位点,分别是-805 bp位点G/C突变、-163 bp位点T缺失突变、-156 bp位点A插入突变、-130 bp位点A插入突变。利用Berkeley Drosophila Genome Project软件对MSTN基因5'端的启动子分析预测。结果显示发生SNP突变后,在-161 bp和-137 bp位点处的两个TATA box消失,推断-163 bp位点的T缺失突变,-156 bp位点的A插入突变和-130 bp位点的A插入突变很有可能都是潜在的功能性突变位点。利用TFSEARCH转录因子结合位点预测软件,比较发现发生SNPs后,导致MSTN的5'端结合的转录因子种类和数量都发生了变化。通过methprimer cpG岛软件查找发现5'调控区存在明显的cpG Islands。

借助ORF Finder在线分析软件,参照Kozak法则(起始密码子符合CCA/GCCATG),对得到的辽育白牛MSTN的DNA序列进行阅读框架的识别,发现MSTN基因开放阅读框由3个外显子组成长度分别为373、374和381 bp,编码375个氨基酸。测序结果中发现在571 bp处发生A/G突变。

ExPASy-Pr o tPar am分析结果表明其蛋白质氨基酸残基亲疏水性总和为-0.337,蛋白的不稳定系数为40.48(此值大于40为不稳定蛋白),说明辽育白牛MSTN蛋白的疏水性较弱,且不稳定。根据Signal P4.1和Server 4.1软件对辽育白牛MSTN基因编码的蛋白进行信号肽预测,结果显示辽育白牛的MSTN蛋白中存在明显的信号肽序列。成熟链序列(mature chain sequence)预测在19 bp、375 bp位置处,属分泌性蛋白,这与已有研究结果相一致。

通过ExPASy-ProtScale软件对辽育白牛MSTN蛋白进行蛋白疏水区的预测(图3)。从图3可见,辽育白牛MSTN基因编码蛋白的C端具有亲水性,N端具很强疏水性,位于分子内部;中间部分亲水性和疏水性表现交替出现。从总体上讲,该蛋白的亲水性更强,而疏水区相对较少。

对辽育白牛MSTN蛋白序列用SOPMA进行蛋白质二级结构预测。该蛋白二级结构中由22.93%的α螺旋(h)、21.33%的伸展链(e)、2.93%的β转角(t)和52.80%的随机线圈螺旋(c)组成。氨基酸的对应序列显示整个蛋白结构出现了3个大峰和2个较小峰,可见α螺旋结构出现的集中区域相对比较明显。

将辽育白牛MSTN蛋白序列用SWISS MODEL软件,进行搜索同源性高的三维结构建模模板。结果显示,与辽育白牛MSTN蛋白同源性最高的是Transforming growth factor beta 1蛋白因子(3rjr.1.B),同源性达到84%。基于Transforming growth factor beta-1(3rjr.1.B)的三维结构,所提交的氨基酸序列构建的辽育白牛蛋白质三维结构模式(图4),其含有多个α螺旋结构域,该三维空间结构的预测结果与二级结构的预测结果相一致。

2.3 MSTN基因组织表达谱

辽育白牛MSTN蛋白不同组织部位表达见图5,组织部位包括睾丸、心脏、肌肉、肺、肝、脾、肾、附睾,利用βactin作为参照基因,从图可知,MSTN在心脏、肌肉和肝中的表达量相对强些,而在睾丸、脾、肾、附睾中的转录信号相对较弱,但在辽育白牛的肺中没有检测到表达信号,MSTN在肌肉中的表达信号相对最强。

2.4 MSTN基因3'-UTR靶标miRNA分析

测序后通过基因序列与波峰的比对发现,在MSTN基因3'UTR区发现了三个突变位点,分别是+5 304 bp位点A到C的突变,+5 378 bp位点C到G的突变,+5 387 bp位点C到T的突变(图6)。

利用在线软件查找牛的miRNA,牛的靶标miRNA库包含687个相关miRNA,用MicroInspector软件将MSTN基因与牛的miRNA结合情况分析后发现MSTN基因的3'UTR可以结合5个miRNA(图7)。发生突变后结合的miRNA的情况没有发生变化,结合的miRNA详细信息见表1。

3 讨论

启动子是基因的重要组成部分,它位于基因5'端上游,参与基因的转录表达。它通过与RNA聚合酶特异性作用,来对基因的转录水平起作用。由于启动子在转录水平的功能,当5'调控区发生SNP后,可能会造成启动子发生相应的变化。本试验已经得到辽育白牛MSTN基因的5'调控区发生SNP后,启动子位置发生了明显的变化,且原区域的TATA box消失。这表明在辽育白牛MSTN基因上存在多个潜在的启动子区段。而在很多研究中,牛基因组中的5'调控区或外显子1和2附近并没有典型的TATA框序列。转录结合因子在基因转录中具有重要的意义,它也是通过与RNA酶结合来发挥功能,影响着基因的转录,不同的转录因子,会产生不同的结合物,最后影响基因转录成不同的转录本,继而影响到后续的进程[10]。本试验通过寻找SNP前后潜在的转录因子潜在的结合位点的变化,功能性SNP使辽育白牛MSTN基因5'端结合的转录因子种类数量和结合力上都发生了改变,产生了不同的潜在结合位点,而这些潜在的结合因子共同作用可能会对MSTN基因的表达产生一定的影响。

M为2 000bp Marker,1～8泳道对应的组织分别为睾丸、心脏、肌肉、肺、肝、脾、肾、附睾

MSTN基因在不同物种间是十分保守的:甚至小鼠、大鼠、人、猪、鸡和火鸡在C-端的同源性能达到100%,而牛羊相比只有1～3个碱基的差别,斑马鱼与其他动物比同源性最差也能达到88%。辽育白牛MSTN蛋白与多个哺乳动物MSTN蛋白序列的序列一致性都在90%以上,说明了该蛋白在哺乳动物中存在显著的相似性,因而可以认为其功能也存在保守性[11]。所以该基因在其他哺乳动物中的研究对辽育白牛的研究具有一定的借鉴意义。

MSTN在骨骼肌中广泛表达,是功能比较专一的肌肉发育负调控因子[12]。目前有关辽育白牛基因的相关研究还比较少,因此本试验将以生物信息学手段对MSTN的mRNA序列进行多物种比对并根据其保守区设计了辽育白牛MSTN基因克隆的引物,最终获得全长为1 128 bp的辽育白牛MSTN基因cDNA序列。再通过生物信息学分析对该未知序列进行初步的确认及功能预测,为后续试验确定初步的研究方向。

辽育白牛MSTN编码的蛋白总体上属于疏水性较弱、亲水性较强的分泌性蛋白,这一点与其他学者研究的普通牛MSTN相一致[13],虽然疏水区相对较少,但可以推测出这些疏水区对MSTN蛋白形成重要功能结构域上发挥一定的作用。经生物信息学分析王伟等也曾发现猪MSTN编码的蛋白质在细胞外,很有可能作为信号肽[14]。

随着动物发育时期的变化和物种的不同以及组织的不同,MSTN基因的表达也呈现一定差异[15]。Kim等[16]分析了新生牛不同时期MSTN基因在肌肉中的表达量逐渐发生变化。Sharma[17]研究在其他组织器官中MSTN蛋白的分布情况时,发现牛和绵羊心肌组织中该基因也表达。Ji等[18]发现,除骨骼肌外,在猪的心、肝、肺、肾、脑、舌、骨髓、小肠、乳腺和脂肪组织中也都有表达。本试验对于MSTN在不同组织中表达分析,发现其在辽育白牛肌肉组织中表达量相对很高,因此可以试图通过对其调控作用实现对肌肉性状的控制。MSTN基因5'端启动子、转录因子、cpG岛等都是都是在其转录水平起调控作用,可将其作为切入点实现对MSTN基因的表达进行调控。

4 结论

本试验克隆辽育白牛MSTN基因,发生SNPs后,启动子原区域两个TATA box消失,5'端结合的转录因子种类和数量都发生变化,且存在明显的cpG岛。编码区序列,全长为1 128 bp,编码375个氨基酸,MSTN蛋白存在信号肽序列,为分泌性蛋白,疏水性较弱、不稳定。辽育白牛不同组织部位MSTN基因具有组织部位差异性表达模式,且肌肉组织中表达信号最强。MSTN基因存在靶miRNAs,且比较保守。因此可将MSTN作为控制肌肉生长发育的候选基因,为开展辽育白牛分子育种研究奠定理论基础。

摘要：肌肉生长抑制素(简称MSTN)是肌肉发育负调控因子,为了实现将来对辽育白牛的分子育种,本试验对MSTN分子特征及其靶MicroRNA进行了分析。以辽育白牛为研究对象,利用分子生物学技术,设计特定引物对辽育白牛MSTN基因的编码区和调控区分段PCR扩增,并进行克隆和测序。借助生物信息学分析软件,寻找各个区域的单核苷酸多态性(SNP)并分析了MSTN基因分子特征、组织表达谱以及3'非翻译区靶标rniRNA。试验表明,MSTN基因5'调控区SNPs使启动子位置和转录因子结合情况发生变化,但编码区的突变未造成氨基酸改变。辽育白牛MSTN编码区序列全长为1 128 bp,编码375个氨基酸,该蛋白存在信号肽序列,为分泌性蛋白,疏水性较弱且不稳定。辽育白牛MSTN基因在不同组织中具有表达差异性,且肌肉中表达量最高。3'UTR存在肌肉生长发育功能miRNA,且比较保守。为开展辽育白牛分子育种研究奠定理论基础。

序列克隆论文 篇9

白细胞介素-1家族(interleukin-1 family,IL-1F)中的第10个成员即IL-F10,最近被重新定义为IL-38[1]。实际上,它首先是2001年由Lin H等[2]使用寡核苷酸探针杂交技术和计算机序列分析、发现并鉴定的细胞因子,当时被命名为IL-1HY2。人IL-38的基因位于2号染色体上,与IL-1Ra(IL-1受体拮抗剂)、IL-36Ra基因相近,并且其基因序列与IL-1Ra、IL-36Ra有较高的同源性[3]。IL-38是IL-1家族(IL-1 family,IL-1F)细胞因子的第10个新成员,也被称为IL-1F10。其结构和典型的IL-1家族成员类似,缺乏信号肽及caspase-1切割位点。另外,IL-38的N端结构仍未明确[2]。有研究者通过阻断IL-1Ra、IL-18BP(IL-18结合蛋白)、IL-36Ra来探究IL-38的生物学功能,发现它可能通过IL-1R通路、IL-18R通路及IL-36R通路来抑制Th17细胞因子的产生,继而对炎症反应产生抑制作用。在国内,我们首次从人皮肤中提取总RNA,应用逆转录-PCR技术成功地对人IL-38基因编码区进行克隆并构建了其真核表达质粒载体。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料

人皮肤组织取自于宁波市第一医院泌尿外科行包皮切除术者。

1.1.2 试剂

RNA抽提试剂Trizol Reagent、大肠杆菌TOP10、逆转录试剂盒M-MLV cDNA First Strand Kit均购自Invitrogen公司;质粒载体pcDNA3.1(+)-mST2由作者实验室构建保存;Hotstar Taq DNA聚合酶、PCR试剂、KpnⅠ、XbaⅠ和DL2000 DNA marker为TaKaRa公司(大连)产品;T4酶连接试剂为Thermo Scinetific公司产品;质粒提取试剂盒和凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。

1.1.3 培养基

①LB液体培养基:称取氯化钠5 g,蛋白胨5 g,酵母提取物2.5 g,加入适量蒸馏水溶解,用氢氧化钠调节pH至7.0～7.2,加水溶解至500 mL,121°C高压灭菌30 min。②含100 μg/mL Amp的LB液体培养基:配制如LB液体培养基,在灭菌后冷却至50℃左右加入氨苄青霉素使终浓度达到100 μg/mL。③含100 μg/mL Amp的LB固体培养基:称取氯化钠2 g,蛋白胨2 g,酵母提取物1 g,琼脂粉3 g,加入适量去蒸馏水溶解,用氢氧化钠调pH至7.0～7.2,加蒸馏水至200 mL,灭菌后冷却加入氨苄青霉素使终浓度至100 μg/mL,倒平皿,凝固后,至37℃培养箱培养过夜,4℃保存。

1.2 方法

1.2.1 引物设计与合成

用Omiga 2.0软件,根据GenBank中人IL-38 cDNA基因序列设计一对引物。P1:5’-CGGGGTACCATGTGTTCCCTCCCCATG-3’,P2:5’-GCTCTAGACTACCAGCTCTGTTCAAAG-3’。此对引物可以特异性扩增人hIL-38基因的全长编码序列(459 bp)。在P1的5’端设计了一个KpnⅠ限制性内切酶切位点;在P2的5’端设计了一个XbaⅠ限制性内切酶切位点(下划线)。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.2.2 RNA提取及基因扩增

按Trizol说明书步骤提取人包皮组织中的总RNA。按照M-MLV cDNA First Strand Kit操作说明合成cDNA第一链:在200 μL的Eppendorf管中加入5 μg RNA、1 μL oligo(dT)12-18、1 μL dNTP,加入灭菌蒸馏水至12 μL;混合物在65°C加热5 min后,迅速置于冰上冷却。短暂离心后,加入下列组分:4 μL 5×第一链合成缓冲液、2 μL DTT、4 μL RNaseOUTTM核酸酶抑制剂,轻轻振荡离心管使各组分混合均匀,37°C下孵育2 min后室温下加入1 μL M-MLV逆转录酶,轻轻吹打均匀,37°C孵育50 min,70°C加热15 min终止反应。PCR扩增循环条件:95°C,5 min;95°C,20 s,66°C,50 s,72°C,1 min,共32个循环;72°C,10 min。PCR产物进行1.2%的琼脂糖凝胶电泳。

1.2.3 人IL-38基因表达质粒的构建与鉴定

将上述PCR产物经KpnⅠ、XbaⅠ双酶切后进行电泳琼脂糖凝胶回收目的片段,与用KpnⅠ、XbaⅠ双酶切法进行酶切后的质粒pcDNA3.1(+)-mST2回收的载体大片段进行定向连接。然后将连接产物转化感受态大肠杆菌,蒋连接产物涂布在含Amp的LB琼脂平板培养皿上37°C培养约过夜。次日挑取培养皿上单菌落,用菌落PCR鉴定,同时挑取阳性菌落接种于LB液体培养基中,37°C振荡培养过夜,提取质粒,进行酶切鉴定。最后,选择酶切和PCR鉴定均为阳性的重组质粒pcDNA3.1-hIL-38送上海桑尼生物科技有限公司进行序列测定。

2 结果与分析

2.1 人IL-38的基因扩增

1:人皮肤总RNA。

1: total RNA of human skin.

M: DL 2000 DNA标准; 1: 人IL-38基因的PCR产物。

M: DL 2000 DNA marker; 1: PCR product of human IL-38 gene.

M: DL 2000 DNA标准; 1-3: IL-38。

M: DL 2000 DNA marker; 1-3: IL-38.

M: DL 2000 DNA标准; 1-2: 质粒pcDNA3.1-hIL-38的KpnⅠ和XbaⅠ酶切。

M: DL 2000 DNA marker; 1-2: pcDNA3.1-hIL-38 was digested by KpnⅠand XbaⅠ.

从人皮肤组织中提取总RNA,逆转录为cDNA后,利用热启动RT-PCR技术扩增目的片段,分别取5 μL总RNA和PCR产物与1 μL上样缓冲液及1 μL荧光染料SYBR Green混合后,经1%琼脂糖凝胶电泳,以DL2000 DNA Marker为对照。结果显示:提取的总RNA完整性良好(图1),PCR产物在约500 bp处有一条特异性条带带,与预期的结果相符(图2)。

2.2 IL-38基因表达质粒的构建与鉴定

人IL-38基因的PCR产物进行KpnⅠ、XbaⅠ酶切后纯化回收,插入pcDNA3.1(+)质粒,构建真核表达质粒pcDNA3.1-hIL-38,经菌落PCR可扩增出目的基因片段(图3);正确插入IL-38基因片段的重组质粒经KpnⅠ、XbaⅠ双酶切后,电泳结果显示为一条大小约为459 bp的条带,与预期的结果相一致(图4)。DNA序列分析显示,构建的重组质粒中含有人IL-38的全长编码区片段,经BLAST分析,与GenBank中登录的序列(序列号:AY029413.1)相一致(图5)。

3 讨论

IL-1家族细胞因子都具有典型的β-三叶草结构[4],近年来通过基因序列分析又发现了一些新成员,这些新成员与某些其它家族细胞因子具同源性。研究表明IL-38的基因序列与IL-1Ra、IL-36Ra基因分别有41%、43%的同源性,所以它们在功能上类似,但是与IL-1β及其它IL-1家族成员只有14%～30%的同源性。在结构上,IL-38和其他典型的IL-1家族成员类似,都缺乏信号肽及caspase-1切割位点,且N端结构尚不清楚[2]。IL-38的特异性受体是IL-36R,与IL-1Ra、IL-36Ra有类似的受体拮抗剂活性,且和IL-36Ra一样都被认定为部分受体拮抗剂,但是IL-38和IL-36Ra作为受体拮抗剂的活性都没有IL-1Ra的强。IL-38和IL-36Ra有类似作用的机制可能是通过特异性结合细胞表面特定的IL-36R而抑制IL-17和IL-22的产生[1]。IL-38基因可编码一个由152个氨基酸残基构成的蛋白,其分子质量约为16.9 kDa。研究表明,在CHO细胞中表达的IL-38重组蛋白无N/O糖基化位点[2]。IL-38可减少IL-17、IL-22和IL-8等促炎症细胞因子的产生,也可以增加IL-10等抗炎症细胞因子的产生,所以IL-38也可能作为一种抗炎因子在炎症性疾病中发挥重要作用。IL-38可能作为一种部分受体拮抗剂,在牛皮癣、关节炎、强直性脊柱炎等炎症性疾病的发病机制中发挥重要作用[1,5,6,7,8,9,10,11,12],但是其具体作用机制有待进一步研究。

与IL-38有类似功能的IL-1Ra、IL-36Ra与某些炎症性疾病相关,所以推测IL-38与炎症性疾病的发病机制也有密切关联。本文对人IL-38基因的克隆及其真核表达质粒的构建,为深入研究IL-38的生物学功能及与炎症性疾病的关系奠定了基础。

摘要：目的:克隆人IL-38基因全长编码区cDNA,并对其进行序列分析。方法:从人皮肤组织中提取总RNA,逆转录为cD-NA,用热启动PCR方法,扩增人IL-38基因的编码区cDNA,通过限制性内切酶酶切后,定向插入pcDNA3.1质粒载体,构建真核表达质粒载体pcDNA3.1-hIL-38,然后进行酶切鉴定与序列分析。结果:人IL-38基因的PCR产物和重组载体经凝胶电泳和酶切鉴定、序列分析证实,其序列与GenBank中数据一致。人IL-38基因的全长编码序列为459 bp,编码152个氨基酸。结论:成功的克隆了人IL-38基因并构建了其真核表达质粒载体,为以后深入研究IL-38的生物学功能奠定了物质基础。

关键词：IL-38,基因克隆,RT-PCR,序列分析

参考文献

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[9]Shen H.,Goodall J.C.,and Hill Gaston J.S.Frequency and pheno-type of peripheral blood Th17 cells in ankylosing spondylitis and rheumatoidarthritis[J].Arthritis Rheum,2009,60(6):1647-1656.

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序列克隆论文 篇10

山东省是水貂养殖大省，近年来，随着水貂养殖业规模的不断扩大，毛皮动物主要传染病流行严重，发病率和死亡率居高不下，造成了巨大的经济损失。特别是水貂犬瘟热、水貂细小病毒性肠炎、水貂阿留申病等严重威胁水貂养殖业的发展。

动物体内自身产生的干扰素极其微量，利用基因工程技术生产重组干扰素是获得干扰素的一条有效途径。本试验从水貂肝脏组织中提取基因组DNA，扩增出水貂IFN-β基因，并对其进行序列分析，为重组水貂IFN-β类生物制剂的研制和开发奠定了基础，同时为更好的控制水貂病毒性疫病提供资料。

1 材料与方法

1.1 材料

新鲜水貂肝脏组织采自于山东诸城某养貂场。p MD18-T为TaKaRa产品，大肠埃希菌DH5α由本实验室保存，引物合成和全自动测序由大连宝生物工程有限公司完成。PCR仪、质粒提取试剂盒、Taq酶、DNA凝胶回收试剂盒、6×DNA上样缓冲液、Marker E、goldview核酸染料为赛百盛产品。

1.2 方法

1.2.1 水貂肝脏组织基因组的提取

切取水貂肝脏组织5g左右，剔除结缔组织，吸水纸吸干血液，剪碎放入研钵 (越细越好) ，加入液氮，磨成粉末，加5ml生理盐水充分混匀，3000rpm离心5min，将上清400μl收毒入Eppendorf管，加入8μl蛋白酶K (20mg/ml) 和92μl细胞消化裂解液，52℃作用8h后，每管加入500μl酚/氯仿进行抽提，12000rpm离心15min，然后将上清转移到一新的Eppendorf管中 (若蛋白量大则再用酚氯仿抽提一次) 。再加入上清2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀1h, 12000rpm离心15min，弃上清，用70%乙醇400μl洗涤沉淀，待酒精挥发干燥后加适量TE溶解，置-20℃保存备用。

1.2.2 水貂IFN-β基因引物的设计和合成

根据Genbank已发表的水貂IFN-β基因序列，设计一对特异性引物，用于扩增IFN-β基因，预期扩增产物大小约为561bp。引物由大连宝生物工程有限公司合成，用dd H2O水稀释到20pmol/µl，-20℃保存备用。

1.2.3 水貂IFN-β基因的PCR扩增

以提取的水貂肝脏组织DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25l，反应程序为：95℃5min;94℃1min, 51～62℃1min, 72℃1min, 35个循环;72℃10min。对PCR反应条件进行摸索。取5μl PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外凝胶成像系统观察结果。鉴定正确后将剩余样品全部进行琼脂糖凝胶电泳，用回收试剂盒进行纯化回收。

1.2.4 水貂IFN-β基因的克隆与鉴定

将胶回收产物与p MD18-T载体连接，连接产物转化至E.coli DH5α感受态细胞，试剂盒提取重组质粒DNA，以PCR鉴定和EcoRⅠ及SalⅠ双酶切鉴定重组质粒。

1.2.5 IFN-β全基因的序列测定及分析

将鉴定为阳性的重组质粒送大连宝生物工程有限公司测序，利用DNAstar6.0 Meg Align软件，将所测定的IFN-β基因的核苷酸序列与GenBank已收录的序列进行比对分析。将测序确定为阳性的质粒命名为p MD18-IFN-β。

2 结果

2.1 目的基因片段的PCR扩增结果

设定梯度温度51～62℃退火，进行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳后可观察到在51℃时出现特异性条带，长度约为561bp，与预期结果相符，所以51℃为退火温度。如图1所示：

1、2、3、5、6分别为62、61.2、59.2、55.7、52.8℃时结果, 4Marker;7 51℃时目的条带

2.2 重组质粒的PCR鉴定及酶切鉴定

2.2.1 PCR鉴定结果将含有IFN-β基因的重组质粒进行PCR鉴定，在561bp处出现特异性条带，如图2所示。

1:目的条带;2:分子量标准

1:目的条带;M:marker

2.2.2 酶切鉴定结果

重组质粒经EcoRI和SalⅠ双酶切后得到约1000bp和约2250bp的片段，与预期结果相符，由此证明了目的基因已插入到p MD18-T载体中，重组质粒构建成功，结果见图3。

2.3 IFN-β测序结果

取含阳性重组质粒的菌落，培养后的菌液由大连宝生物工程有限公司进行测序。采用DNASTAR软件将该基因序列与Genbank上的水貂IFN-β基因的DNA序列进行同源性比较，结果所克隆到的水貂IFN-β基因全长56lbp，编码186个氨基酸，核甘酸序列同源性为100%。

2.4 同源性比较

试验扩增出的基因片段全长为561bp，共编码186个氨基酸。本试验结果扩增出的水貂IFN-β与GneBnak上已公布的人类的INF-β基因相比较，核苷酸序列同源性为34.06%，与鼠的同源性为37.60%，与犬的同源性为99.15%，与鼬的同源性为99.64%。将扩增的IFN-β基因序列与从Genbank数据库中获取的其他种属INF-β基因序列进行系统进化树分析，结果见图4。

3 讨论

上世纪30年代，人们发现机体感染某一病毒后，会对另一种抗原性毫无关系的病毒发生干扰现象。直到1957年，Isaacs和Lindenmann利用鸡胚绒毛尿囊膜研究流感干扰现象时才了解到病毒感染的细胞能产生一种因子，作用于其它细胞，干扰感染病毒的复制，因而命名为干扰素 (interferon, IFN) [3]。由于干扰素具有调节机体体液免疫反应和细胞免疫反应，增强机体对细菌、寄生虫和病毒感染的抵抗力等重要作用，所以对其研究一直是细胞因子研究方面的重点之一。1994年，Sekellick等首次成功克隆和表达ch IFN-α基因并进行结构分析[4]，1995年Digby等又成功地克隆了鸡IFN-γ基因[5]。干扰素是第一个在分子水平上进行研究的细胞因子，其经验很快用于其他细胞因子的研究，并获得了巨大的进展，促进了新药开发和分子生物学学科的发展。

目前关于水貂INF-β的研究报道比较少，对β干扰素克隆及表达方面的研究，还没有相关文章报道。通过本研究，对水貂一些疾病如水貂犬瘟热、水貂细小病毒性肠炎、水貂阿留申病的预防有指导性意义。另外，少量干扰素即可延迟和减少病毒的增殖，大量干扰素则可阻止病毒的复制。动物体内自身产生的干扰素极其微量，以传统的方法难以制备和纯化，因此利用基因工程技术生产重组干扰素是解决这一难题的有效途径。在我国干扰素研究起步较晚，而我国水貂养殖业发展迅速，干扰素对控制水貂病毒性疫病又具有很好的预防作用，因此对水貂干扰素的研究具有重要意义。

有关研究表明，干扰素的保护作用具有相对的种属特异性，如家禽产生的干扰素只能保护家禽，不能保护其它动物。本试验所克隆的IFN-β基因序列与Genbank上公布的水貂IFN-β基因序列同源性为100%，与GneBnak上已公布的人类的INF-β基因序列同源性为34.06%，与鼠的同源性为37.60%，与犬的同源性为99.15%，与鼬的同源性为99.64%。试验结果说明，不同种属动物产生的干扰素在基因水平上存在一定差异，这与上述研究结果一致。本研究首次从水貂肝脏组织中克隆得到干扰素β基因，所克隆的基因在同属动物中高度保守，为进一步原核表达和研制重组干扰素制剂提供前提条件。

摘要：采集新鲜水貂肝脏组织, 提取基因组DNA, 采用PCR技术扩增水貂IFN-β基因, 克隆到pMD18-T载体上, 转化大肠杆菌DH5α, 提取重组质粒, 经PCR和EcoRⅠ及SalⅠ双酶切鉴定, 筛选阳性重组克隆。核苷酸序列分析证实, 所克隆到的水貂IFN-β基因全长56lbp, 编码186个氨基酸, 核甘酸序列同源性为100%。与GneBnak上已公布的人类的INF-β基因序列同源性为34.06%, 与鼠的同源性为37.60%, 与犬的同源性为99.15%, 与鼬的同源性为99.64%。

关键词：水貂,干扰素,IFN-β基因,克隆,序列分析

参考文献

[1]郭小权, 谌南辉.干扰素的研究进展[J].广西畜牧兽医, 2000, 16 (6) :37-39.

[2]乔立东, 王金秋.干扰素在兽医临床中的应用研究[J].中国牧业通讯, 2009 (7) :9-11.

[3]侯云德, 吴淑华.干扰素[M].北京:北京人民卫生出版社, 1981.

[4]Sekellick M J, Ferrandion A F, Hopkins D A, etal.Chicken interferongene:Cloning, expression and analysis[J].J Interferon Res, 1994, 14:71.

序列克隆论文 篇11

关键词：五指山猪,Myf5基因,生物信息学分析,克隆,序列分析

骨骼肌生长发育受一系列转录因子的网络式调节,随着分子生物学技术的飞速发展和广泛应用,目前已经鉴定出多种肌肉特异性转录因子。生肌调节因子家族(Myogenic regulatory factors,MRFs)是参与肌肉发生过程分子调控的一个重要基因家族,是启动和维持骨骼肌细胞分化和生长的一个主要调控基因家族,它包括4个含有螺旋-环-螺旋结构的转录因子,分别是Myo D(myogenic differentiation 1)、Myf5(myogenic factor 5)、Myog(myogenin)和MRF4(又名Myf6)[1]。在成肌分化过程中,Myo D和Myf5是MRFs家族中最先表达的2个基因,起决定成肌的作用[2]。

五指山猪是我国著名的小型猪种之一,具有独特的遗传品质,体型小、耐粗饲、早熟、耐近交、放牧性好,是我国猪种多样性中的重要组成部分[3]。研究通过克隆测序寻找五指山猪Myf5基因中的突变位点,利用生物信息学软件对其序列进行分析和功能预测,为进一步研究五指山猪生长发育规律及矮小机制奠定基础。

1 材料

1.1 样品采集

从海南省农业科学院畜牧兽医研究所永发猪场采集4头五指山猪和4头大白猪血液样品用于基因组序列分析,采集血液样品后,于-20℃保存。

1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、d NTP、DL-2 000 Marker、血液基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒等,均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.3 引物设计与合成

根据Gen Bank中猪Myf5基因序列(登录号为NC_010447.4)设计合成2对引物,引物序列:P1上游引物5'-TGGTGGTAGTGTCTTTGTCTCA-3',P1下游引物5'-CGTCCATCAGGTCCATCTT-3';P2上游引物5'-GGTGGGATATGCTAATAGTGC-3',P2下游引物5'-ACTGATTTGATGGGCTGAAC-3'。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

2 方法

2.1 血液DNA的提取

使用血液基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA,用TE溶解,取部分DNA样品稀释至100 ng/μL,-20℃保存,备用。

2.2 PCR扩增与测序

PCR反应体系(25μL):模板DNA 1μL,10μmol/L引物0.5μL,10 mmol/L d NTP 0.5μL,10×PCR Buffer 2.5μL,25 mmol/L Mg2+2.0μL,1 U/μL Taq DNA聚合酶1μL,加灭菌后的去离子水补至25μL。PCR扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性40 s,退火40 s(退火温度P1为59℃,P2为57℃),72℃延伸120 s,共34个循环;72℃再延伸7 min。将扩增产物通过琼脂糖凝胶回收试剂盒回收、纯化,送至北京诺赛基因组研究中心有限公司进行测序,测序结果通过在线软件Clustal W2(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/)进行比对分析。

2.3 生物信息学分析

采用Prot Param软件(http://www.expasy.ch/tools/protparam.html)分析氨基酸序列,利用在线软件TFSEARCH(http://www.cbrc.jp/research/db/TF-SEARCH.html)预测启动子区潜在的转录因子结合位点。

3 结果与分析

3.1 PCR扩增结果

使用2对引物P1和P2扩增五指山猪Myf5基因,分别得到长度为1 798 bp与1 699 bp的DNA序列,见图1。

M.DL-2 000 Marker;1.P1引物扩增片段;2.P2引物扩增片段。

3.2 五指山猪Myf5基因组序列分析

通过比对4头五指山猪和4头大白猪Myf5基因的P1、P2扩增片段,共发现3处突变,见表1。这3处均属于单碱基突变,分别位于基因的第1外显子和第1内含子。

注:*表示翻译起始位点为+1。

3.3 五指山猪Myf5基因生物信息学分析

3.3.1 五指山猪Myf5基因分子特征

五指山猪Myf5基因有3个外显子,2个内含子,CDS序列全长为768 bp,共编码255个氨基酸,五指山猪Myf5蛋白分子质量为28.32 ku,等电点为5.90。

3.3.2 五指山猪Myf5基因启动子序列分析

使用在线软件TFSEARCH发现,五指山猪Myf5基因启动子区存在TATA框,此外还在该基因的启动子区域发现多种潜在的转录因子结合位点,如Sp1、GATA-1、C/EBPb、Cdx A、SRY、Nkx-2、AML-1a等,见图2。

用黑色边框标注ATG框和TATA框,用黑色下画线标注转录因子结合位点。

4 讨论

五指山猪因原产于海南省五指山区而得名,由于其体型小、灵活、头尖长、体形似鼠,俗称老鼠猪、五脚猪。20世纪80年代,五指山猪已处于濒危状态,1998年后海南省农业科学院畜牧兽医研究所在海口市灵山镇建立了五指山猪资源保种场,使得该猪种的数量有所增加。目前,关于五指山猪矮小性状的遗传机理还不清楚。Myf5是生肌调节因子家族成员之一,与Myo D一起被称为初级生肌调节因子,参与肌细胞的定型,在成肌细胞分化前表达[4]。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphisms,SNP)是指在基因组水平上由单个碱基的转换、颠换、插入或缺失引起的DNA序列多态性,广泛分布于整个基因组,是动植物中普遍存在的一种分子标记[5]。试验在Myf5基因中发现3个新的SNP,其中位于该基因+121处的C→G突变导致氨基酸的改变(脯氨酸/丙氨酸),属于错义突变;位于+288处的C→G突变没有引起氨基酸改变,属于同义突变。下一步将重点分析+121处的C→G突变是否影响Myf5的蛋白功能。基因启动子是重要的顺式作用元件,是位于基因5'端上游区的DNA序列,能指导酶与模板的正确结合,活化RNA聚合酶,决定转录的方向和效率[6]。试验利用TFSEARCH软件分析发现,猪Myf5基因启动子区域含有特征明显的TATA框,同时还存在Sp1等多个潜在的转录因子结合位点,随后将通过启动子活性分析等试验进一步揭示五指山猪Myf5基因的转录调控机制。

5 结论