VEGF多克隆抗体（精选9篇）
VEGF多克隆抗体 篇1
本研究为对Wistar大鼠脑胶质瘤增殖中应用VEGF多克隆抗体与榄香烯联合应用的抑制效果进行分析与探讨, 构建Wistar大鼠脑胶质瘤模型, 具体报道如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料
由吉林医学院生化研究机构提供胶质瘤细胞株, 并从佳木斯大学动物实验中心购置Wistar大鼠, 选用美国BD公司生产的流式细胞仪, 日本CK公司生产的倒置显微镜, L eica CM1100 切片机。
1. 2 方法
1. 2. 1 动物接种与分组
通过酒精与强力碘为大鼠背部进行消毒, 6 号针头注射器将1m L大鼠细胞悬液抽取出来, 接种在大鼠脑部尾状核, 并于每2d对肿瘤生长情况进行观察, 5d左右即可触及皮下肿瘤, 14d皮下肿瘤直径就可达15mm, 把呈椭圆形或者圆形, 直径大约15mm生长合格的肿瘤当作试验肿瘤模型, 随机分为4 组, 每组有大鼠8 只, 将其分开饲养, 且命名为A、B、C、D组, A组 ( 对照组) 大鼠给予生理盐水, B组 ( 研究组) 大鼠给予榄香烯, C组 ( 研究组) 大鼠给予VEGF多克隆抗体, D ( 研究组) 组大鼠给予VEGF多克隆抗体与榄香烯。
1. 2. 2 悬液制备与细胞培养
SHG - 44 来源于人额叶星形胶质瘤的稳定培养, 具有特异性标志胶质酸性纤维蛋白 ( GFAP) , SHG - 44 是目前较理想的细胞株, 能够稳定的培养, 并在Wistar大鼠尾状核区成功植入, 将复苏成功的SHG - 44 细胞株, 放于50cm2培养瓶中接种, DMEM培养基中含有10% 灭活的胎牛血清, 还含有链霉素100mg /m L、青霉素100U/m L、Na HCO33. 7g / L, 培养瓶置于5% CO2的培养箱中, 温度恒定于37℃, SHG - 44 细胞满瓶后, 将培养液倾倒出去, 0. 25% 胰酶消化培养瓶中的SHG - 44 细胞, 显微镜下观察SHG - 44 细胞, 当细胞开始皱缩时, 加入营养液, 并反复吹打, 使SHG - 44 细胞脱壁, 并用离心机离心5min, 离心转数为1000r/min, 将上清液弃出, 制成106细胞/瓶的细胞悬液, 接种于25cm2培养瓶中[1]。
1. 2. 3 动物模型制作前准备
全实验过程每周两次注射地塞米松, 0. 15mg腹腔内注射, 接种前3d, 每日给予地塞米松, 剂量为100g体重1mg, 给药方式为灌胃, 降低排斥反应, 用10% 水合氯醛麻醉, 给药剂量为每10g体重0. 4m L, 剪去穿刺点周围毛, 面积约1. 0cm × 1. 5cm。
1. 2. 4 模型制作
植入靶点为右侧尾状核区, 穿刺点为矢状缝右旁开3. 5mm和前囟中点前1. 0mm, 麻醉满意后, 将Wistar大鼠固定于立体定向仪上, 剪去穿刺点周围毛, 高效碘消毒, 铺无菌洞巾, 切开内眦连线与正中矢状面交点向后1mm, 定位预先穿刺点, 牙科钻颅骨钻孔, 直径1. 2mm, 用1mm微量注射器针头刺破硬膜, 向下垂直进入硬膜下6mm, 再后撤1mm, 将细胞悬液1 × 106/20μL, 以每分钟1μL的速度缓慢注入右侧尾状核区, 穿刺针停留5min, 骨蜡封闭骨孔, 缝合头皮[1]。
1. 2. 5 给药方法
VEGF多克隆抗体给药量为50 只, 榄香烯为20mg / kg, 根据1mg: 1000m L的比例对VEGF多克隆抗体进行稀释, 1% 榄香烯剂型是20m L中含20mg, 通过生理盐水将榄香烯配置为100m L中含100mg, 大鼠腹腔隔日给予VEGF多克隆抗体与榄香烯。
1. 3 肿瘤病理学观察
10% 中性甲醛固定肿瘤组织, 石蜡包埋, 5μm层厚切片, HE常规染色, 并于光镜下对组织切片进行分析。7d时进行头部MRI检查, 将成瘤的大鼠作为实验对象, 分别于接种后的7、14、21d、自然死亡的几个时间点观察大鼠的生存状态, 包括如下几个方面: 饮食情况; 肢体是否有活动障碍; 颅神经是否有功能确实; 以及视觉反应; 全身抽搐和持续时间等。21d处死大鼠和死亡的大鼠进行HE染色, 光镜下观察。
1. 4 统计学方法
采用SPSS13. 0 软件进行统计学处理, 两组采用Q检验, 方差分析多组, P < 0. 05 为差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 肿瘤病理学观察
在光镜下对Wistar大鼠胶质瘤标本进行观察发现呈小梭形, 具有较大细胞核, 呈异形, 易发现核分裂相, 染色质丰富, 很少有细胞质, 细胞略微突起, 研究组肿瘤标本坏死灶较多, 肿瘤细胞中含有大量核破裂, 肿瘤血管减少量与组织坏死程度D组明显多于B组与C组。
2. 2 各组影响肿瘤细胞凋亡机制
A、B、C、D组细胞凋亡率分别是 ( 0. 47 ±0. 18) % 、 ( 13. 0 ± 1. 60) % 、 ( 11. 8 ± 1. 60) % 、 ( 19. 5± 1. 31) % , 组件肿瘤细胞凋亡率相比, 差异性比较明显, 具有统计学意义 ( P < 0. 05) , 见表1。
3 讨论
临床中, 神经质瘤具有较高的发病率, 而且是一种比较常见的颅内恶性肿瘤, 其所占比例大约为37. 5% ~ 60. 5% , 目前在治疗该方面的进展也比较慢, 现阶段常规治疗胶质瘤主要是手术治疗, 术后再行化疗与放疗。近年来, 阐明肿瘤血管病理生理后, 为治疗肿瘤开辟更多新途径。VEGF ( 血管内皮生长因子) 对血管发生与形成具有调节作用, 在形成肿瘤过程中具有关键作用[3]。而且VEGF抗体可结合循环VEGF, 是VEGF蛋白构向得以转变, 有效遏制VEGFR和VEGF结合位点, 避免VEGF结合内皮细胞VEGFR, 对VEGF信号通路具有阻断作用, 有效抑制内皮细胞迁移与增殖, 而且对血管形成也具有抑制性作用[4]。榄香烯提取物为姜科植物温郁金, 其主要成分为 β - 榄香烯, 属于萜烯类化合物, 且含少量 γ 与 α 榄香烯, 相关药理学研究发现, 榄香烯能够有效杀伤与抑制体内肿瘤细胞。临床研究显示, 在多种肿瘤中, 榄香烯疗效确切, 而且能够有效对抗神经胶质瘤。本研究结果显示, 研究组肿瘤标本坏死灶较多, 肿瘤细胞中含有大量核破裂, 而对照组肿瘤标本具有较多血管数量, 血管管壁增厚, 肿瘤血管减少量与组织坏死程度D组明显多于B组与C组。研究表明, VEGF多克隆抗体与榄香烯联合使用对肿瘤组织生长具有有效抑制作用, 具有协同作用, VEGF多克隆抗体与榄香烯对细胞凋亡具有促进作用, 两者联合使用存在协同效应。
参考文献
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VEGF多克隆抗体 篇2
目的:表达和纯化幽门螺杆菌HP0762蛋白,并制备该蛋白的多克隆抗体.方法:从幽门螺杆菌SS1中经PCR扩增得到了hp0762基因,将其克隆至含有6xHis编码序列的原核表达载体pET-28a(+)中,再将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在IPTG诱导下进行蛋白表达;用HiTrap Chelating HP亲和柱纯化重组蛋白,Western印迹进一步鉴定;以纯化后的蛋白为抗原免疫新西兰大耳白兔,制备该蛋白的`多克隆抗体;用EUSA和Western印迹检测抗血清.结果:目的蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中获得了可溶性表达,纯化后纯度可达90%以上;制备了针对HP0762重组蛋白的抗血清,抗体ELISA效价为1:256 000,Western印迹分析表明该抗体能特异性识别内源性HP0762.结论:完成了HP0762蛋白的原核高效表达与纯化,并制备了其高效价的多克隆抗体,为进一步对其进行疫苗研制与基因功能研究奠定了基础.
作 者：李丛胜 邱炎 王艳春 韩秀萍 陶好霞 徐兴然 刘纯杰 LI Cong-Sheng QIU Yan WANG Yan-Chun HAN Xiu-Ping TAO Hao-Xia XU Xing-Ran LIU Chun-Jie 作者单位：李丛胜,LI Cong-Sheng(西南大学,药学院,重庆,400716;军事医学科学院,生物工程研究所,病原微生物与生物安全国家重点实验室,北京,100071)
邱炎,王艳春,韩秀萍,陶好霞,刘纯杰,QIU Yan,WANG Yan-Chun,HAN Xiu-Ping,TAO Hao-Xia,LIU Chun-Jie(军事医学科学院,生物工程研究所,病原微生物与生物安全国家重点实验室,北京,100071)
徐兴然,XU Xing-Ran(西南大学,药学院,重庆,400716)
VEGF多克隆抗体 篇3
关键词：亲和纯化；甲氧基有机磷农药；广谱特异性抗体；免疫分析
中图分类号： TQ450.7 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0033-03
收稿日期：2013-08-20
基金项目：国家自然科学基金（编号：30871658）。
作者简介：贺江（1983—），男，江西萍乡人，博士，讲师，主要从事食品安全与食品生物技术研究。E-mail：hejiang1119@163.com。农药残留作为食品安全问题中的重要方面之一，深受世界各国的普遍关注。建立有效的农药残留监测体系是对农药残留问题进行控制的前提与基础，目前公认的理想农药残留监测体系包括以农药残留快速检测技术作为现场初筛工具、以农药残留检测标准方法作为最终的定性定量确证工具[1]。免疫检测技术是一种简单、快速且灵敏的检测方法，已被广泛用于农药残留的快速检测[2-6]。抗体的特异性和亲和力等特性是决定这类方法检测效果的核心因素。基于动物免疫的多克隆抗体[6-7]、基于杂交瘤技术的单克隆抗体[2，8]以及基于噬菌体展示等分子技术的重组抗体[9-10]等均已在农药免疫残留检测领域有应用，但无论利用哪类抗体进行免疫分析都存在一些会影响检测效果的干扰物质。例如，在多克隆抗血清中存在非特异性或者低亲和力免疫球蛋白；杂交瘤细胞培养液或小鼠腹水中存在白蛋白和轉铁蛋白等宿主蛋白；而重组抗体中往往也同样存在来自于宿主（如大肠杆菌）的各类蛋白。因此，在建立特异性强、检测限低、线性范围广的免疫检测技术时，往往需要结合抗体纯化过程来实现[11-13]。对抗体进行纯化的方法很多，其中亲和层析技术应用最广泛。关于应用亲和层析技术对抗体进行纯化的研究，已有学者进行了深度的概述[14-16]。抗体亲和纯化效果主要取决于亲和层析柱上所固定的配体。基于A蛋白和G蛋白的抗体亲和纯化技术研究引用最广泛，除此之外，基于组氨酸、金属离子、植物凝集素等新型配体的亲和层析技术也同样被应用于抗体的纯化。然而，直接应用固相抗原进行相应抗体的亲和纯化无疑是最有效的方法，尤其是对多克隆抗血清而言。笔者所在的课题组前期合成了甲氧基有机磷农药通用半抗原，并进一步免疫了新西兰大白兔，从而获得了针对这类农药的广谱特异性抗体[17]。本研究拟在此基础上偶联通用半抗原至琼脂糖固相载体制备亲和层析柱，并进一步应用于抗血清的纯化。
1材料与方法
1.1材料与试剂
甲氧基有机磷农药广谱特异性抗体（兔血清）、甲氧基有机磷农药通用半抗原、通用半抗原与卵清蛋白偶联物（Hapten-OVA）等由笔者所在的实验室自行制备保存；碳二亚胺缩合剂99% 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳二亚胺盐酸盐（EDC·HCl）购自百灵威科技有限公司；氨基活化的琼脂糖凝胶（EAH 琼脂糖凝胶 4B）购自通用电气医疗集团；丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、四甲基乙二胺（TEMED）、四甲基联苯胺（TMB）等购自Sigma公司；30～200 ku 蛋白Marker购自北京全式金生物有限公司；HRP标记的羊抗兔抗体购自武汉博士德生物工程有限公司；马拉硫磷、乐果、稻丰散、亚胺硫磷、杀扑磷等农药标准品（99.9%）购自中国农业部农药检定所；其他试剂均为分析纯。
1.2仪器与设备
Agilent 1200型高效液相色谱仪、Agilent G6410A型三重四级杆串联质谱仪（配ESI离子源）；DYY-31A 型稳压稳流电泳仪、微型垂直电泳槽（北京六一仪器厂）；微量紫外可见分光光度计（通用电气医疗集团）；MK2酶标仪、全自动洗板机（Thermo Fisher）；其他实验室常规仪器设备。
1.3方法
1.3.1甲氧基有机磷农药通用半抗原免疫亲和柱的制备以EDC·HCl为偶联剂，采用碳二亚胺法将带有羧基活性基团的甲氧基有机磷农药通用半抗原与带有氨基活性基团的EAH 琼脂糖凝胶 4B 凝胶链接，反应原理如图1所示。取EAH 琼脂糖凝胶 4B 5 mL，用超纯水（pH值 4.5）和 0.5 mol/L NaCl 各交替洗涤3次；同时用5 mL 连接反应液（50% 甲醇，pH 值4.5）溶解10.0 mg 通用半抗原；然后将二者混合，于冰浴中缓慢振摇反应，反应前1 h 分10 次加入EDC 溶液至终浓度为0.1 mol/L；冰浴中反应过夜，将温度逐渐升高至室温，总反应时间为24 h。反应结束后，用0.1 mol/L 醋酸缓冲液（含0.5 mol/L NaCl，pH值 4.0）和0.1 mol/L Tris-HCl 缓冲液（含0.5 mol/L NaCl，pH值 8.0）交替洗涤连接产物各3次，最后用体积分数为50%的甲醇洗涤，并装填成 1 mL 的亲和柱备用。对照反应中不加EDC，采用液相色谱-串联质谱的选择离子监测模式（selective ion monitoring，SIM）测定反应后半抗原与副产物的量，进而判断反应是否顺利进行。
1.3.2甲氧基有机磷农药广谱特异性抗体的亲和纯化甲氧基有机磷农药广谱特异性抗体经饱和硫酸铵法初步纯化，
再用自制的通用半抗原免疫亲和柱进一步纯化。亲和纯化具体过程如下：以10 mL 结合缓冲液平衡亲和柱；加入1 mL经0.45 μm滤膜过滤的粗提抗体样品，用结合缓冲液洗涤至流出液中无蛋白检出；以4 mL 洗脱缓冲液洗脱目的抗体，并用加有中和缓冲液的小管收集；最后用5 mL 结合缓冲液洗涤亲和柱。纯化结束后，通过不连续体系非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）鉴定纯化效果，间接非竞争ELISA测定抗体纯化后的活性。SDS-PAGE电泳操作过程参照相关试验手册。间接非竞争ELISA操作过程如下：（1）包被。用CBS缓冲液将Hapten-OVA包被原稀释至2 μg/mL后加于96孔板中，100 μL/孔，4 ℃过夜。（2）封闭。用PBST洗板3次，加入200 μL/孔封闭液（含2% OVA的PBS溶液），37 ℃孵育 1 h。（3）加样。用PBST洗板3次，将纯化后的抗体样品用PBS适当稀释后再加入微孔中，100 μL/孔，37 ℃孵育2 h。（4）加酶标二抗。用含2% OVA的PBS液将酶标二抗稀释 5 000 倍（工作浓度），100 μL/孔，37 ℃温浴1 h。（5）显色。加入TMB底物液100 μL/孔，显色15 min，再加入50 μL/孔浓度为 2 mol/L的 H2SO4快速终止反应，最后用酶标仪读取D450 nm。每个样品重复3个孔。
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1.3.3抗体纯化前后的特异性和亲和力比较采用间接竞争ELISA鉴定纯化后抗体对马拉硫磷、乐果、稻丰散、亚胺硫磷、杀扑磷等甲氧基有机磷农药的反应活性，并与纯化前抗体的反应活性进行比较，以判定纯化过程对抗体广谱特异性的影响。先用Hapten-OVA包被原包被并用OVA封闭96孔板，然后加入纯化抗体和不同浓度的农药标准溶液进行竞争结合，后续加酶标二抗、显色等过程同前。计算纯化抗体对各种农药对象的半抑制浓度（IC50），并以马拉硫磷为基准计算交叉反应率。
2结果与分析
2.1甲氧基有机磷农药通用半抗原免疫亲和柱的制备
由偶联反应机理可知，随着反应的进行，反应体系中的半抗原逐渐消耗，而同时伴随着脲类副产物的产生。因此，试验中通过采用液相色谱-串联质谱（LC-MS）中的选择离子监测模式测定反应后半抗原与副产物的量，进而判断反应能否顺利进行。测定结果表明，反应结束后偶联体系中的半抗原（[M+H]=231.0）的量显著少于对照体系，同时偶联体系中有大量副产物（[M+H]=1742）产生，说明半抗原分子与固相载体偶联成功，经计算偶联效率约为60%。偶联小分子化合物至固相载体的过程在合成化学中相对比较成熟，有研究认为，在应用此类反应时往往只是直接反应，而对反应是否发生不进行监控[18]。本研究所采用的鉴定方法较简单有效，可为相关学者提供参考。
2.2甲氧基有机磷农药广谱特异性抗体的亲和纯化
将上述连接产物装填成1 mL 的亲和柱，用于甲氧基有机磷农药广谱特异性抗体的纯化。收集纯化过程中各步骤样品分别采用不连续体系的非变性SDS-PAGE 电泳和直接非竞争ELISA 进行纯度和活性鉴定。SDS-PAGE 电泳结果表明，广谱特异性抗体纯化效果良好（图2-a），并对样品纯化前后的体积和蛋白浓度进行计算，得到纯化产率约为78.5%。将各部分样品的蛋白浓度调为一致进行直接非竞争ELISA，结果显示，纯化后抗体的D450 nm略高于纯化前的样品，而纯化洗涤液的D450 nm较小（图2-b）。说明亲和纯化过程能够将一些低亲和力的抗体去除，而高亲和力的抗体能够保留下来。抗体纯化效果主要受洗涤液的类型、体积和流速等条件影响，本研究采用典型的洗涤条件进行抗体纯化，获得了较好的纯化效果。
2.3抗体纯化前后的特异性和亲和力
笔者所在的课题组前期研究结果表明，所用广谱特异性抗体能够识别马拉硫磷、乐果、稻豐散、亚胺硫磷、杀扑磷等一系列甲氧基有机磷农药。因此，本试验进一步鉴定了纯化后的抗体对上述农药的识别活性，并与纯化前进行比较，结果如表1所示。纯化后，广谱特异性抗体对乐果的交叉反应率略变大，而对稻丰散、亚胺硫磷和杀扑磷的交叉反应率有所减小。可能因为在纯化过程中去除的低亲和力抗体主要是特异识别这3种对象的。但总体而言，经过纯化后的抗体依然能够识别上述5种甲氧基有机磷农药，并且其IC50比纯化前更低。这说明纯化后的抗体对这些农药的亲和力有所增强，能够建立起更灵敏的检测方法。
3结论
本研究成功地将甲氧基有机磷农药通用半抗原偶联至固相载体中制备成亲和纯化柱，并应用其对甲氧基有机磷农药抗血清进行了亲和纯化。经鉴定，亲和纯化效果良好，纯化产率约为78.5%；纯化后抗体的亲和活性有所增强，而其对马拉硫磷、乐果、稻丰散、亚胺硫磷、杀扑磷等农药对象的交叉反应性未受影响。
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SHN3多克隆抗体纯化与鉴定 篇4
SHN3是一种具有跨膜结构的树突细胞因子，我们前期研究发现shn3基因在没有分化的神经干细胞中高表达，而在分化终末的神经细胞中表达较低;随后的研究表明shn3基因可以维持神经干细胞的状态，与神经干细胞的分化有关，各种研究结果显示shn3在神经系统中起着重要作用[1]。
抗体是生物科学研究之中最为重要的科学研究工具之一，利用抗原抗体特异性结合的原理，在蛋白水平上，可以用于各类蛋白的免疫识别，利用免疫共沉淀的方法分离特定蛋白;在细胞水平上，可以应用流式细胞技术区分和鉴定细胞;在组织水平上，则可以分析待检测组织中表达的蛋白质或是显微镜下直接观察[2]。
抗体不仅在科学研究中占据重要地位，随着越来越多的研究转向人类疾病的研究与治疗，抗体的医用价值也备受人们关注。无论是在诱导癌细胞凋亡还是心血管疾病中利用“生物导弹”的导向治疗等，抗体作为新型的治疗手段和药物的医学价值日益显著[3]。
无论是抗体的科研价值还是医用价值的体现，都对抗体的免疫特异性要求越来越高。所以，本实验创新性的改进传统Ig G纯化技术，创新性的通过筛选免疫特异性肽段，并结合亲和层析纯化的方式改进出一种有效地提高抗体免疫特异性的方法。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1实验材料
作者实验室自制SHN3多克隆抗体[4];HEK293T和U251细胞系购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心;Pmal-C2载体和BL21(DE3)表达宿主菌由作者实验室保存。
1.1.2 试剂
Bam HⅠ、SalⅠ限制性内切酶购于Fermanters公司;T4DNA连接酶、Tag酶连接酶购于Takara公司;羊抗兔、羊抗鼠红外标记二抗(Odyssey)购于Invitrogen公司;β-actin抗体购于Abcom公司;mbp抗体购于康为世纪公司;硝酸纤维素膜NC膜(Whatman);IPTG购于北京拜尔迪公司;引物合成于上海捷瑞公司。
1.1.3 引物设计
根据实验室前期所制备的鼠源shn3 c DNA中130～228位碱基序列，设计抗体纯化特异性片段复性引物。4条片段复性后分别用Bam HⅠ、SalⅠ限制性内切酶插入到Pmal-C2载体中，引物序列如下:
1.2 方法
1.2.1 重组表达载体的构建
将合成好的4对引物用灭菌后的dd H2O稀释到100μmol/L，再用1*Annealing Buffer稀释至10μmol/L，分别取上下游引物25μl混合后运行Anneal PCR程序。Anneal PCR程序为:先95℃预变性10min，再按从95℃至25℃每3min降低5℃复性，得到PCR产物回收，dd H2O溶解4℃保存。Pmal-C3载体Bam HⅠ、SalⅠ限制性内切酶双酶切过夜，割胶回收后分别与复性后4个片段T4DNA连接酶16℃连接过夜，构建PmalC2-Part-1、Pmal-C2-Part-2、Pmal-C2-Part-3、PmalC2-Part-4。利用热激法将构建好的载体转化入BL21(DE3)中，菌种PCR鉴定、测序[5]。
1.2.2 融合蛋白的原核表达
从平板上挑单菌落至装有4mL LB培养基的试管中，37℃、220r/min摇床摇约5h，测OD600为0.8时，加入IPTG至终浓度为0.5mmol/L进行诱导培养，37℃继续振荡培养4h后，取100μl菌液12 000r/min,5min离心后取上清，100μl 1*SDS-PAGE loading Buffer裂解，孵育器99℃煮蛋白10min,-20℃保存。
1.2.3 Western blotting筛选特异片段
取煮好的蛋白，经SDS-PAGE电泳转入硝酸纤维素膜后，分别用兔抗SHN3多克隆抗体抗体和鼠抗MBP多克隆抗体进行Western blotting，用Odyssey成像系统检测4段重组蛋白。
1.2.4 亲和层析纯化目的抗体
将人工合成筛选出的特异性片段与预先处理膨胀的Thiolsepharose 4B混合装载成柱，4℃旋转混合过夜。将实验室自制SHN3多克隆抗体PBS透析后稀释过柱，得到目的抗体，Western blotting检验亲和特异性[6]。
2 结果与分析
2.1 抗体特异性片段设计
原抗体免疫原为c DNA 130bp～228bp共99个碱基，为了增强抗体识别的特异性，避免杂带，将这99个碱基换分为4个等长且互相重叠的区段，分别为Part-1(112～159bp)、Part-2(142～186bp)、Part-3(172～219bp)、Part-4(202～249bp)四个片段。则片段示意图如图1。
2.2 4个抗体特异性片段阳性克隆PCR鉴定
连接产物经转化、抗性筛选后，挑取克隆菌种PCR鉴定，以每个片段的上游引物和设计的用于鉴定的Part-5下游引物进行PCR鉴定，理论目的片段长为514bp，鉴定结果如图2。
Note:1:Marker;2:control;3:Pmal-C2-Part-1;4:Pmal-C2-Part-2;5:Pmal-C2-Part-3;6:Pmal-C2-Part-4.
2.3 特异性片段的筛选
将鉴定正确的4个载体的克隆测序正确后，原核诱导后抽提蛋白，用抗体Western blotting检验特异性最强的片段，Pmal-C2载体上本身带有标签MBP(麦芽糖结合蛋白)，用MBP抗体作蛋白表达的阳性对照，筛选特性片段。结果表明，4个片段中，Part-3表达的肽段与抗体的特异性最强，则选取Part-3肽段序列人工合成肽段，作为纯化抗体的配基与抗体结合。
Note:1:Part-1;2:Part-2;3:Part-3;4:Part-4.
2.4 Western纯化后抗体特异性
HEK-293T细胞转染人源和鼠源SHN3后，培养48h抽提细胞蛋白，小鼠海马组织蛋白，人源胶质瘤细胞系U251细胞蛋白，Western检验纯化抗体特异性。结果表明，无论是在过表达HEK细胞中，还是在小鼠脑组织细胞人源胶质瘤细胞抽提蛋白中，纯化后抗体杂带减少，免疫特异性明显增强。
3 讨论
抗体不仅是现代生物科学研究的重要工具之一，更在医学治疗方面拥有巨大潜力[7]。然而，无论是科学研究还是医学应用[8]，对抗体的亲和特异性都越来越高。
传统的抗体纯化技术仅是以Ig G特异性蛋白protein A为结合蛋白，纯化得到单一的Ig G抗体，但并不能提高抗体本身的特异性。本研究则是创新的以本实验室自制SHN3多克隆抗体为基础，结合蛋白亲和层析原理[9]，将免疫原分割成更小的片段来减少由于过长的肽段结构而产生的非特异性，筛选并合成亲和特异性最高肽段，再用亲和层析的方法筛选获得与目的蛋白特异性结合的多克隆抗体。
Note:A:Expression of SHN3 in HEK293T cells(1:Murine;2:Humanized);B:The hippocampus of mice;C:U251.
研究结果表明，在原免疫原中确实存在特异性更高更小的片段，以其为亲和层析的结合片段，不仅排除了冗余结构免疫的干扰，同时也将动物免疫过程中的非特异干扰除去。无论是细胞水平还是组织水平的蛋白特异性均获得显著提高。本研究不仅为SHN3的进一步研究提供了更为可靠的工具，也为各种实验室自制非商业性多克隆抗体的纯化提供了较为可行的方法。
参考文献
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[8]Gregory P Adams,Louis M Weiner,Monoclonal antibody therapy of cancer[J].Nature Biotechnology,2005,23(9):1147-1157.
VEGF多克隆抗体 篇5
1 材料和方法
1.1 主要试剂及试验动物
p GEX-6p-1原核表达载体、E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)感受态细胞,均由黑龙江八一农垦大学动物科技学院基础兽医学实验室提供;DNA凝胶回收试剂盒及质粒提取试剂盒,购自北京索莱宝生物技术有限公司;Ex Taq DNA聚合酶、T4 DNA Ligase、Bam HⅠ和XhoⅠ限制性内切酶,购自Fermentas公司;IPTG,Biosharp公司产品;HRP标记羊抗鼠Ig G,购自北京中杉金桥生物技术有限公司;IRDye700DX羊抗鼠Ig G,购自Li-COR公司;ECL发光液试剂,购自Biotopped公司;弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂,Sigma-Aldrich公司产品;8周龄的Balb/c雌性小鼠,购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所。
1.2 基因的合成及引物的设计
参考Gen Bank中猪整合素β3核苷酸序列(GenBank NM_214002),利用CBS网站(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)在线分析该氨基酸序列的疏水性,分析蛋白的跨膜区,截取胞外区氨基酸部分,再利用DNAStar软件中的Protean工具分析氨基酸的主要抗原区,并优化针对大肠杆菌具有偏嗜性的密码子,分别在5'和3'末端加入Bam HⅠ和XhoⅠ两种酶切位点,人工合成了猪整合素β3核苷酸序列。将合成的基因连接至p GH载体上,该重组质粒p GH-β3由哈尔滨博仕生物技术有限公司合成。然后利用Primer Premier 5.0软件设计1对引物,序列为:β3-F(上游引物)5'-ATCGGATCCATGCGTGGTGT-GAGCTCCTGC-3',β3-R(下游引物)5'-GGACTCGAGTTAGTCAGGGCCCTTCGGACA-3',用于猪整合素β3基因载体构建的鉴定。
1.3 猪整合素β3基因的原核表达及纯化
用重组质粒p GH-β3和p GEX-6p-1载体分别进行Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切,酶切后产物利用胶回收试剂盒进行胶回收,然后将纯化后的猪整合素β3基因和p GEX-6p-1载体进行连接,转化E.coli DH5α感受态细胞。随机挑取10个单菌落,利用β3-F和β3-R引物进行菌落PCR鉴定。将筛选出的阳性菌提取质粒,然后转化入E.coli BL21(DE3)感受态细胞中,挑取单菌落于含有100μg/m L Amp+的LB液体培养基中培养,当OD600值到0.6时,用终浓度为1 mmol/L的IPTG诱导4 h,然后利用SDS-PAGE电泳鉴定猪整合素β3基因重组蛋白的表达。表达猪整合素β3基因的菌体用PBS洗5次后,进行超声破碎,取菌体的上清液和沉淀分别进行SDS-PAGE电泳鉴定,然后将含有目的蛋白的凝胶切下,用电透析的方法将蛋白洗脱下来,100 V电离1 h,获得纯化的猪整合素β3重组蛋白。
1.4 猪整合素β3重组蛋白的鉴定
将纯化后的重组蛋白进行SDS-PAGE电泳,转印至硝酸纤维膜(NC膜)上。用5%的脱脂乳封闭,37℃封闭2 h,用PBS洗3次,每次10 min。以GST单克隆抗体(m Ab)为一抗(1∶3 000),37℃孵育2 h,洗涤同上。以山羊抗鼠HRP-Ig G为二抗(1∶2 000),37℃孵育1 h,洗涤同上。将NC膜置于Super ECL Plus超敏发光液中,用扫描成像系统进行扫描。
1.5 猪整合素β3重组蛋白抗体的制备
将纯化的猪整合素β3重组蛋白与弗氏佐剂等体积混合,充分乳化后,按50μg/只的剂量于皮下、腹腔多点注射,对Balb/c小白鼠进行免疫。首次免疫用弗氏完全佐剂,二免和三免用弗氏不完全佐剂,对照组为健康Balb/c小白鼠。每次免疫间隔14 d,三免3 d后对小鼠进行采血,分离血清,于-20℃保存。
1.6 猪整合素β3重组蛋白抗体效价的ELISA检测
用终浓度为1μg/m L的纯化蛋白包被96孔板(100μL/孔),置于4℃过夜。次日弃去液体,用PBS洗3次,每次5 min。拍尽孔中液体后每孔加5%的脱脂乳150μL,37℃封闭2 h,洗涤同上。以待测血清为一抗,并利用方阵法确定血清稀释度(每孔100μL,37℃孵育1 h,洗涤同上)。以山羊抗鼠HRP-Ig G(1∶2 000)为二抗,37℃孵育1 h,洗涤同上。每孔加入100μL TMB底物显色液,避光作用10 min,每孔再加入2 mol/L硫酸终止液100μL终止其反应,用酶标仪读取OD450值。
1.7 猪整合素β3重组蛋白抗体的Western-blot鉴定
利用含有天然整合素β3蛋白的猪小肠黏膜上皮细胞(IEC细胞)、猪睾丸细胞(ST细胞)、猪肾细胞(PK15细胞)及仔猪小肠组织,分别利用裂解液获取总蛋白,样品处理后进行SDS-PAGE电泳,转印至NC膜上。用5%的脱脂乳室温封闭2 h,用PBS洗3次,每次10 min。以制备的猪整合素β3多克隆抗体作为一抗(1∶200),室温孵育2 h,洗涤同上。以IRDye700DX羊抗鼠Ig G为二抗(1∶5 000),室温孵育1 h,洗涤同上。在荧光扫描成像系统上进行扫膜分析,进一步验证制备的猪整合素β3多克隆抗体是否与天然整合素β3蛋白具有反应原性。
2 结果
2.1 猪整合素β3跨膜区与抗原性分析结果
利用CBS网站(www.cbs.dtu.dk/services/TM-HMM-2.0/)对猪整合素β3的跨膜区进行预测,结果表明,第1~6位和738~784位氨基酸为胞内区,第7~29位和715~737位氨基酸为跨膜区,第30~714位氨基酸为胞外区(见275页彩图1)。进一步利用DNAStar软件中的Protean工具对猪整合素β3胞外区(第30~714位氨基酸)进行抗原性分析,结果表明,猪整合素β3胞外区(第30~714位氨基酸)具有较好的抗原性(见276页彩图2)。
2.2 猪整合素β3主要抗原区的原核表达结果
猪整合素β3主要抗原区重组质粒p GH-β3用Bam HⅠ和XhoⅠ进行双酶切,获得了2 907 bp和2 079 bp 2个片段,与预期大小相符(见图3)。重组质粒p GEX-6p-1-β3以IPTG诱导后,经SDS-PAGE分析,在100 ku左右可见特异性的表达条带,与预期条带大小相符(见图4)。
M.DL-10 000 Marker;1.合成的猪整合素β3质粒DNA双酶切;2.合成的猪整合素β3质粒DNA PCR扩增。
M.蛋白Marker;1.诱导后p GEX-6p-1对照;2.诱导后p GEX-6p-1-β3菌体裂解物;3.超声后p GEX-6p-1-β3沉淀物;4.纯化的目的蛋白。
2.3 猪整合素β3主要抗原区重组蛋白纯化结果
细菌经超声破碎后,经SDS-PAGE电泳,结果目的蛋白存在于沉淀内,表明蛋白以包涵体形式存在。将含有目的蛋白条带的胶条切下进行纯化,获得了纯化的猪整合素β3重组蛋白,见图4。
2.4 猪整合素β3重组蛋白的Western-blot分析结果
纯化后的重组蛋白经Western-blot分析,在100 ku左右有1条特异性条带,与预期的102 ku大小一致(见图5),表明猪整合素β3主要抗原区与p GEX-6p-1载体的GST标签正确融合。
2.5 猪整合素β3抗体鉴定结果
ELISA检测结果表明,猪整合素β3多克隆抗体效价为1∶12 800。Western-blot检测结果表明,制备的猪整合素β3多克隆抗体能够识别IEC细胞、ST细胞、PK15细胞和仔猪小肠组织中的天然整合素蛋白(见图6)。
M.蛋白Marker;1.纯化蛋白;2.GST标签对照。
M.蛋白Marker;1.PK15细胞;2.仔猪小肠组织;3.ST细胞;4.IEC细胞。
3 讨论
病毒表面囊膜蛋白与宿主细胞表面受体蛋白的相互作用是病毒能否侵入宿主细胞以及复制的关键所在。随着对病毒以及病毒受体研究的不断深入,目前认为病毒受体是一组位于细胞表面的蛋白质分子复合物[11]。大量研究显示,整合素在众多病毒感染中发挥作用,具有成为共性受体蛋白的趋势,在病毒学研究领域倍受关注。前期研究揭示,在Vero E6细胞中鉴定的627个膜蛋白中17种蛋白与病毒受体相关,其中包括整合素蛋白[12]。D.Sun等[13]报道,猪流行性腹泻病毒(PEDV)感染Vero E6细胞后,整合素β3蛋白表达水平上调。进一步分析表明,PEDV的纤突蛋白S中含有整合素配体识别序列DGE、KGE、RLD和LDV,具有与整合素相互作用的氨基酸基序[14]。猪整合素β3在PEDV感染过程中可能发挥着潜在作用。
VEGF多克隆抗体 篇6
空肠弯曲菌(Campylobacter jejuni, C.jejuni)是一种革兰氏染色阴性的嗜热微需氧菌,[1],该菌菌体纤细,无芽孢,有鞭毛,运动活泼,在光镜下呈螺旋状运动,具有多形性。本菌广泛分布于温带、亚热带和热带地区。作为鸟类肠道的寄生菌,自1972年由Dekeyser等首次从腹泻患者粪便中分离出来以后逐渐认识到,C.jejuni和C.coli是世界性分布的细菌性腹泻最常见的病原菌之一。人类通常通过摄入未煮熟的禽类而感染空肠弯曲菌。空肠弯曲菌感染人类肠道的的致病机制了解的相对比较贫乏,包括黏膜粘附,侵袭宿主细胞和毒素分泌[2]。Pei等纯化了可能位于外膜的只有在经过甘氨酸处理后才会释放的同源的不同的4种蛋白PEB1—4[3]。通过与HELA细胞的结合能力调查了空肠弯曲菌和结肠弯曲杆菌属的外膜成分的功能,Fauchere 等证明分子量在26—30 kDa的几种蛋白在黏附中起重要作用,制备的这些蛋白的兔抗血清与菌HELA细胞共同孵育,明显减少了这些细菌与HELA细胞的黏附[4]。重要的是,PEB1a突变株显示在组织培养中粘附减弱,并且在小鼠感染模型中菌量也是明显减少的[5]。目前研究表明 PEB1蛋白是由PEB1A基因编码,分子量28 kDa,存在于所有C.jejuni 的表面,具有保守性,无血清型改变,是空肠弯曲菌的共有抗原和主要细胞粘附分子[6]。通过电子显微镜证明表面暴露的PEB1,具有很高的免疫原性,在空肠弯曲菌黏附在HELA细胞上的过程中是必需的[7],指示PEB1a是空肠弯曲菌重要的毒力因子和主要黏附分子,在CJ与肠道黏膜的粘附中发挥重要作用。为制备抗原特异性的肠道高亲和力口服疫苗创造了条件。本实验小组前期构建了胞壁形式表达融合蛋白Der p2-PEB1重组BCG[8],为进一步研究介导PEB1的rBCG的免疫特性及功能,我们纯化了PEB1蛋白,并大量制备了它的高效价的多克隆抗体,为肠道粘附疫苗的进一步研究提供了基础。
1 材料
1.1 试剂
表达PUC19-PEB1质粒的E.coli DH5α菌种由本研究小组前期构建保存,氨苄青霉素(Amp)购自北京鼎国生物技术有限公司。谷胱甘肽—琼脂糖树脂(上海锐谷生物科技有限公司)、分子筛(上海雨青分子筛有限公司),蛋白分子量Marker (Fermentas公司),异丙基硫代-G-D-半乳糖苷(IPTG)(大连TaKaRa公司),辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔IgG均购自博士德生物工程有限公司;其余试剂为国产分析纯或分子生物学专用试剂。
1.2 实验动物
新西兰兔,体重2—3 kg,由第四军医大学实验动物中心提供。
1.3 主要仪器
Heraeus Eppendoff高速台式离心机(Biofuge Pico公司),Soniprep 150型超声破碎仪(MSE公司),H2Q—X100振荡培养箱(哈尔滨东联电子开发技术有限公司),酶标仪(SUN公司),DY—3B稳压稳流定时电泳仪(江苏兴化分析仪器厂),超净工作台(杭州超净器材厂)。
2 实验方法
2.1 PEB1蛋白的纯化及鉴定
取10μl表达PUC19-PEB1质粒的E.coli DH5α菌种接种到50 mL含Amp的LB液体培养基中,培养过夜,第二天早上取20 mL接种到1 L含Amp的LB液体培养基中 ,培养3 h后,加入1 mL 1 mol/L的IPTG进行诱导,继续培养4 h后。取菌液离心,用100 mL pH7.0的PBS悬浮细菌,超声波破碎细胞,离心后取上清和沉淀,分别电泳。留上清,去沉淀。根据上清电泳分析,表达的蛋白量比较高。根据蛋白质的等电点9.04,我们将上清调pH到9.04,在4 ℃放置过夜,在4 ℃条件下离心30 min,离心速度16 500 r/min。离心沉淀用pH 7.0的PBS复溶。将复溶的蛋白调pH到4.2,上阳离子交换柱。用pH 7.0 PBS+0.25 mol/L的氯化钠洗脱。用分子筛脱盐,即得到目标蛋白,将纯化蛋白制样行12%SDS—PAGE分析
2.2 PEB1抗体的制备
2.2.1 动物免疫
PEB1蛋白经变性、复性后,按500 μg/kg的纯化蛋白加等量弗氏完全佐剂(FCA)乳化后接种于兔颈背部皮内,间隔2w后再进行第二、三、四次免疫。
2.2.2 免疫兔血清中PEB1蛋白特异性抗体滴度的测定
用间接ELISA法测定免疫兔血清中PEB1特异性抗体的滴度。用纯化的PEB1蛋白包被96孔板,20 μg/孔,4 ℃过夜。PBST液洗板4次,甩干后加入10 g/L的BSA,37 ℃封闭30 min。PBST洗涤后加入倍比稀释的待测免疫兔血清,37 ℃孵育1 h,PBST洗涤后再加入HRP—羊抗兔IgG,37 ℃孵育1 h,洗涤后加入OPD底物溶液显色,测定波长490 nm光吸收值。以未经免疫的兔血清为阴性对照。
2.2.3 免疫兔血清中PEB1蛋白特异性抗体的western-ploting检测
检测抗体效价达到标准后颈动脉插管收集血液,将血液离心,将血细胞去掉,留血清,过PROTEIN A柱纯化抗体,最后WB检测抗体效果。以1∶1 000稀释的兔抗血清为一抗,二抗为1∶5 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG抗体,Western印记分析多克隆抗体能否特异识别PEB1蛋白。
3 结果
3.1 PEB1蛋白的纯化
对洗脱液进行SDS—PAGE分析的结果表明获得了纯化的PEB1蛋白。定量检测: lorry法测定蛋白浓度1.12 mg/mL,总体积95 mL左右。
M—低分子量蛋白Marker,1—纯化的重组蛋白, 2—菌裂解液上清中的蛋白
3.2 兔抗PEB1抗体的效价测定
第四次免疫结束2 w后从兔子身上取2 mL的血液进行ELISA的效价检测。间接ELASA法检测表明鼠抗PEB 1血清效价达到1∶10 000,而作为阴性对照的未经免疫的血清以及未加抗原的孔管全部呈阴性。
3.3 免疫兔血清中PEB1蛋白特异性抗体的western-ploting检测
制备的多克隆抗体,经Western印记检测表明,该抗体能与PEB1蛋白发生特异性结合,其特异性与敏感性均较好。如图2。
M—低分子量蛋白Marker,1—纯化蛋白与制备的 抗PEB1多克隆抗体的Western印迹
4 讨论
哮喘是呼吸系统常见疾病,近年发病率和死亡率持续上升,严重影响人类健康。Th2优势的Th1/Th2平衡紊乱是哮喘的免疫基础。BCG可调节TH1/TH2平衡,引起TH1优势的免疫应答,同时又是一种很好的免疫佐剂。本实验小组将过敏原Der p2基因转入BCG中表达,制备出Der p2重组BCG(Recombinate BCG,rBCG)。结果表明改变了以往对Der p2抗原Th2特征的应答方式,转变为Th1优势的应答[9,10]。这意味着哮喘等过敏性疾病可以利用过敏原rBCG作为疫苗而得到治疗。实践证明,短期内重复注射接种会引起局部严重的迟发变态反应(DTH),严重影响注射接种的可重复性,甚至有可能影响疗效。为此,我们采用口服接种Der p2-rBCG,结果同样诱导了抗原特异性的Th1应答[11]。因为BCG不是肠道定植菌,为提高免疫刺激的效果,我们曾给予大量rBCG口服,结果导致肠道正常菌群失调和口咽部感染,免疫效果仍不理想。
C.jejuni侵袭、定植宿主肠道细胞之前需要黏附到宿主肠道细胞表面,目前研究认为可溶性蛋白PEB1在C.jejuni的黏附中发挥着重要作用。Pei 等[6]的研究说明PEB1可以黏附Hela细胞。Kervella等[12]等发现,C.jejuni与Hela细胞的黏附可以被抗PEB1血清明显抑制,并且纯化的PEB1蛋白可以竞争性地抑制细菌与Hela细胞的黏附。为提高rBCG疫苗与肠道的亲和力,提高口服免疫的效力,本实验小组利用基因重组技术,又制备了胞壁形式表达融合蛋白Der p2-PEB1的重组BCG。本试验中利用纯化的蛋白免疫兔,所获得的抗体血清效价高达1∶10 000。Western印记检测表明,该抗体能与PEB1蛋白发生特异性结合,其特异性与敏感性均较好。为下一步观察肠黏膜高亲和力重组BCG的口服免疫特性打下了坚实的基础。
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VEGF多克隆抗体 篇7
细胞内的信号转导通路由多种蛋白调控,其中一类接头蛋白 (adapter proteins) 在调控过程中起着至关重要的作用。它们能够利用特有的结构域 (domain)和氨基酸序列/基序 (motif),特异性调节信号蛋白分子之间或信号蛋白与脂类分子之间的结合,在连接上游与下游信号转导途径中起着重要的衔接和调控作用[1,3]。
作为一个新发现的蛋白,NRBP (nuclear receptor binding protein)存在于人类的大部分正常组织中,其中在胸腺中表达量最低,而在睾丸和胎盘中表达最高[4]。NRBP也被发现存在于293细胞,HeLa细胞等15种人的肿瘤细胞株中[4]。NRBP蛋白由535个氨基酸组成,其进化保守并含有多个功能结构域,富含谷氨酸和丝氨酸的N末端序列可能介导NRBP与其它含有SH2结构域蛋白之间的结合[4,5]。同时,推测NRBP可能还是一个核受体结合蛋白,具有两个核受体结合域、一个核定位信号 (NLS:nuclear localization signal)及核输出信号 (NES:nuclear export signal)[4]。目前,对于NRBP功能方面的研究不多,已有报道它能够与Rac3、Mlf1、NS3、Jab1等蛋白结合,并调节相关功能[5,6,7,8]。由于目前尚无商品化的抗NRBP抗体,本文采用基因工程表达的方法制备了原核表达的NRBP融合蛋白,并制备和纯化了人NRBP的特异性多克隆抗体,为进一步对接头蛋白NRBP进行功能研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 质粒、细胞及菌株
pGEX-6P-1、pET-21a、PEF-NRBP等质粒来自上海睿星基因技术有限公司;HEK293 T细胞、克隆宿主菌E.coli DH5α及表达宿主菌E.coli BL-21 (DE3)等均为作者实验室保存。
1.1.2 酶及其它试剂
Taq 酶购自Takara公司,BamHⅠ及EcoRⅠ购自NEB公司,T4 连接酶购自MBI公司;anti-Flag抗体来自上海睿星基因技术有限公司;IPTG、胰酶 Trypsin-EDTA、Protein G beads、弗式完全佐剂及不完全佐剂均购自Sigma公司;DMEM 高糖培养基及胎牛血清(GIBCO公司);蛋白酶抑制剂(Roche公司);Lipofectamin 2000 转染试剂购自Invitrogen公司;ECL显色试剂盒购自PIERCE公司。
1.2 方法
1.2.1 NRBP抗原的制备和纯化
根据GenBank报道的NRBP基因cDNA序列,设计两对引物,以PEF-NRBP为模板,进行PCR反应,获得NRBP全长cDNA及编码N端1-99位氨基酸的cDNA片段,在两端分别加入了BamHⅠ 和EcoRⅠ 酶切位点。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析鉴定,切下目的条带进行回收纯化。用BamHⅠI和EcoRⅠ双酶切纯化的PCR产物,载体PGEX-6P-1及PET-21a,琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段和载体。T4连接酶连接,转化感受态大肠杆菌DH5α,阳性克隆经测序正确后抽提质粒。
将测序正确的原核重组表达质粒接种到5 ml含氨苄青霉素100 mg/L的LB培养基中,摇床培养过夜并诱导表达后[8],收集菌液,去上清,加入适量裂解缓冲液[20 mmol/L Tri-HCl (pH 8.0),150 mmol/L NaCl,1 mmol/L EDTA,1 mmol/L DTT,0.2% Triton X-100]重悬菌体沉淀,冰浴条件下超声破碎细胞,离心后分别取少量上清和沉淀进行SDS-PAGE检测,分析诱导表达蛋白的表达形式。然后用GSTrap亲合层析柱和Ni2+-NTA柱纯化融合蛋白,收集融合蛋白,用Bradford方法进行定量检测。
1.2.2 兔抗NRBP多克隆抗体的制备
以纯化的融合蛋白His-NRBP免疫家兔2只,免疫加强制备抗血清,取目的蛋白200 μg (约0.25 mL)与0.25 mL弗式完全佐剂混合,用搅拌机使其充分混匀(6 000 r/min,10 min),乳化后采用皮下多点注射的方法免疫家兔。30 d后用100 μg目的蛋白与弗式不完全佐剂充分混匀乳化后进行加强免疫,此后每隔2w加强免疫1次,70 d时,取耳静脉血,用ELISA方法检测抗体效价。再加强免疫1次,10 d后颈动脉采血,分离血清,分装后置-20℃保存。同时改进方法,先以纯化的融合蛋白GST-NRBP (1-99) 免疫家兔2只,在免疫加强时用融合蛋白His-NRBP (1-99) 进行皮下多点注射,制备抗血清。
1.2.3 间接ELISA法检测抗体效价
用1.0 mg/L浓度的His-NRPP融合蛋白包被ELISA板,4℃过夜。PBST (1×PBS,含0.5 mL/L Tween 20) 洗涤3次后加入 3% BSA-PBS封闭,37℃温育2h,PBST洗涤3次,每次3 min。按梯度稀释抗血清每孔加入100 μL(阴性对照为未免疫兔血清),37℃温育1 h,洗涤3次后每孔加HRP标记的羊抗兔IgG 100 μL (1:1 000稀释),37℃温育1 h,洗涤后每孔加100 μL新配制的TMB显色液,37℃温育20 min,终止反应后,酶标仪读取490nm吸光值。
1.2.4 抗体特异性鉴定
(1) Western印迹检测抗体特异性
HEK293 T细胞用DMEM培养基加10% FBS在常规条件下进行培养,用Lipofectamin 2000 按照说明书转染PEF-NRBP质粒,转染24 h后收取全细胞蛋白,变性后10% SDS-PAGE进行蛋白电泳。并将蛋白用湿转法转移至PVDC膜上,以5 %脱脂奶粉于室温封闭1 h后,加入1∶1 000稀释的兔抗NRBP抗体或anti-Flag抗体37℃温育1 h,以TBST室温洗膜3次后,加入1∶3 000稀释的HRP标记的羊抗兔IgG作为二抗温育1 h,TBST洗膜,ECL法显色。
(2) 免疫沉淀及Western印迹检测抗体
收集HEK293 T细胞,用RIPA细胞裂解液裂解细胞,取上清和免疫前兔血清IgG 或兔抗NRBP抗体在4℃下摇晃孵育2 h,在细胞裂解液中加入Protein G-agarose 4℃ 摇晃过夜。免疫沉淀反应后,4℃、3 000 r/min离心3 min,收集Protein G agarose,加入RIPA细胞裂解液洗3～4次,离心收集Protein G agarose。最后加入2×SDS上样缓冲液重悬,沸水煮5 min,样品进行Western印迹分析。
2 结果与分析
2.1 NRBP抗原的制备和纯化
利用PCR方法,以质粒PEF-NRBP为模板,获得NRBP全长cDNA及编码N端1-99位氨基酸的cDNA片段,双酶切PCR产物和载体连接,构建得到重组质粒,测序结果与GenBank中的基因序列一致,正确的重组质粒包括pET-21a-NRBP、pGEX-6P-1-NRBP (1-99)及pET-21a-NRBP (1-99)。
(a) pET-21a-NRBP:1.Bacterial lysates uninduced; 2.Supernatant of bacterial lysates induced; 3.Precipitation of bacterial lysates induced; 4.Ni2+-NTA binding; 5.Purified protein 1μg; 6.Purified protein 2μg; 7.Purified protein 5μg. (b) pET-21a-NRBP:1.purified His-NRBP protein before Gel Filtration 2.purified His-NRBP after Gel Filtration. (c) pGEX-6P-1-NRBP(1-99):1.Bacterial lysates uninduced; 2.Precipitation of bacterial lysates induced; 3.Supernatant of bacterial lysates induced; 4.Washing effluent of GST-NRBP(1-99); 5.Purified protein 1μg; 6.Purified protein 2μg; 7.Purified protein 5μg. (d) pET-21a-NRBP(1-99):1.Bacterial lysates uninduced; 2.Bacterial lysates uninduced; 3.Supernatant of bacterial lysates induced; 4.Precipitation of bacterial lysates induced; 5.Flow through of His-NRBP(1-99); 6.Purified protein 5μg;M:Protein marker.
我们进一步在大肠杆菌中诱导表达并纯化了融合蛋白His-NRBP、GST-NRBP (1-99)及His-NRBP(1-99)。pET-21a-NRBP重组菌经IPTG诱导表达融合蛋白His-NRBP,亲和层析纯化后进行SDS-PAGE检测,可见一条60kD的目的蛋白,这和NRBP重组蛋白的理论相对分子质量一致(图1 a)。在30 kD左右有一条明显的杂蛋白带,过分子筛后可去除,得到纯度较大的目的蛋白(图1 b)。pGEX-6P-1-NRBP (1-99)重组菌及pET-21a-NRBP (1-99) 重组菌在诱导后分别表达融合蛋白GST-NRBP (1-99)及His-NRBP (1-99),经SDS-PAGE检测分别得到约45kD及30kD的蛋白带(图1 c、图 1 d),与生物信息学预期大小基本相符。纯化蛋白的纯度可以满足免疫兔子制备抗体的要求。
2.2 兔抗NRBP多克隆抗体的制备和间接ELISA法检测抗体效价
分别以纯化的融合蛋白免疫4只家兔,制备抗血清。以纯化后的融合蛋白His-NRBP包被抗原,间接ELISA法测定免疫后获得的多克隆抗血清的效价,结果显示经3次免疫后,上述4只免疫家兔产生的抗NRBP血清的效价为1:5 120～1:40 000 (Cut off 〉2.1),其中应用改进方法得到的3#及4#免疫家兔抗体的效价比较高(表1)。
2.3 兔抗NRBP多克隆抗体的特异性鉴定
2.3.1 兔抗NRBP多克隆抗体的Western印迹
真核表达质粒PEF-NRBP的表达标签Flag位于目的基因NRBP的N端,转染真核表达质粒PEF-NRBP到HEK293 T细胞,24 h后收细胞,用制备的多克隆抗体在过表达NRBP的细胞裂解液中检测到特异性条带,大小在60 kDa,与用抗Flag抗体检测到的特异条带大小一致(图2)。结果表明4只免疫家兔产生的抗NRBP血清均能特异性地识别真核细胞中外源的NRBP蛋白,且与ELISA的结果一致。
Total whole cell lysate of HEK 293 T cells transfected with PEF-NRBP,Western blot with 1.antibody 1# ; 2.antibody 2#; 3.antibody 3#; 4.antibody 4#; 5.anti-Flag; 6.normal rabbit serum.
2.3.2 兔抗NRBP多克隆抗体的免疫沉淀
我们选用HEK293T细胞,分别将4只免疫家兔产生的NRBP抗血清加入到细胞裂解液中进行免疫沉淀反应,并用相应的抗血清对反应产物进行Western印迹检测。结果显示以pET-21a-NRBP融合蛋白免疫家兔获得的抗血清,无法免疫沉淀内源的NRBP(图3)。而在改进的方法中,运用只表达NRBP的N端1-99位氨基酸的融合蛋白作为抗原(图1c、图1d),初次免疫时取200 μg GST-NRBP (1-99) 融合蛋白免疫家兔,加强免疫时取100 μg His-NRBP (1-99) 融合蛋白免疫家兔,这样加强了抗原的特异性,由此获得的抗血清不仅能够特异识别真核细胞中外源表达的NRBP,更具有较强的免疫沉淀内源NRBP的能力(图3),其中免疫家兔3 #的免疫沉淀能力相对较强,我们将用此抗血清进行后续研究。
Immunoprecipitation with anti-NRBP polyclonal antibody.1.antibody 1# ; 2.antibody 2#; 3.antibody 3#; 4.antibody 4#; 5.Western blot with anti-Flag,lysates of HEK 293T cells transfected with PEF-NRBP.
3 讨论
人类的很多疾病,如癌症,自身免疫性疾病等都与信号转导通路密切相关,细胞内的信号转导系统能够调节生命活动的所有过程,包括细胞的增殖、神经活动、发育和分化、新陈代谢以及肌肉收缩等。而接头蛋白参与多个信号通路,是信号转导过程中不可替代的重要蛋白,对它们的研究将使人类了解更多更复杂的细胞信号通路,为开发信号通路相关的药物靶点提供必要的理论依据[10,11]。人NRBP基因定位于染色体2p23区域,该带或邻近带的易位与肿瘤及造血功能失调疾病等关系密切[12]。2002年,De Langhe等科学家发现NRBP与Rho家族的Rac3结合,过表达的NRBP能够阻断高尔基体标记蛋白p58从内质网向高尔基体的传输[5]。鼠MADM与人NRBP氨基酸序列的同源性高达98%,研究发现其可与骨髓白血病因子Mlf1相互作用,并招募丝氨酸激酶磷酸化Mlf1,启动Mlf1与重要蛋白14-3-3ζ的结合,M1期单核母细胞中过表达的MADM可通过调控Mlf1的细胞分布,抑制细胞因子诱导的细胞分化[7]。同时,我们的前期研究发现NRBP可能通过转录激活因子Jab1在TCR通路的下游发挥重要的负调控作用,过表达的NRBP能够显著抑制Jurkat T细胞中TCR或PMA诱导的转录因子NFAT和AP-1的活性[8,9]。
抗体是研究基因功能的重要工具,因为目前尚无商品化的抗NRBP抗体,之前的一些报道都是在哺乳动物细胞中过表达NRBP蛋白来研究其功能[5,6,9],而对于生理条件下,内源性NRBP与其结合蛋白之间的关联及功能报道很少,这在一定程度上阻碍了对NRBP的进一步研究。在本实验中,为了深入探讨NRBP的功能,我们制备了NRBP的兔多克隆抗体。首先在大肠杆菌BL21菌株中分别诱导表达了带有不同tag标签的NRBP全长蛋白及其N端的截短体蛋白,用不同的方法免疫家兔并获得抗血清(表1)。ELISA及Western印迹检测结果表明通过改进方法所获得的抗血清效价及特异性更高,并且具有免疫沉淀能力,这为我们进一步研究内源性NRBP的功能提供了必要条件。实验也再次证实在制备兔多克隆抗体的过程中,如何选择抗原至关重要,根据蛋白的结构设计不同的抗原进行免疫,抗原的纯度,免疫的方法、剂量以及加强免疫的间隔时间和次数等多种因素都可能影响所获得抗体的质量。
根据NRBP的氨基酸序列推测它可能与含SH2结构域的蛋白相结合,并参与相关信号通路以及核受体信号传递的过程,尽管目前关于NRBP与肿瘤等疾病相关的研究报道并不多,通过获得的多克隆抗体对NRBP功能的进一步深入研究将使我们对这个新接头蛋白更加了解。
4 结论
本文制备的高效价兔多克隆抗体能够特异性识别真核表达的接头蛋白NRBP,并具有较好的免疫沉淀能力,它可以作为筛选NRBP结合蛋白的有效工具,为进一步研究NRBP的功能和作用奠定基础。
摘要：目的:制备接头蛋白NRBP的兔多克隆抗体,并检测该抗体的效价及特异性。方法:PCR方法以重组质粒PEF-NRBP为模板,获得NRBP全长及NRBP(1-99Aa)cDNA,构建到原核表达质粒pET-21a及pGEX-6P-1中。分别转入大肠杆菌BL21菌株,IPTG诱导表达后,纯化并鉴定表达产物将其免疫家兔,间接ELISA法及免疫印迹等方法鉴定抗体。结果:成功获得人NRBP的cDNA,构建得到相关的原核表达质粒,在大肠杆菌中可诱导性高表达,纯化后蛋白免疫家兔制备得到的抗血清经ELISA检测为阳性结果,4只免疫家兔的抗体效价约为1:5 200～1:40 000。Western印迹结果显示,该抗体可特异性的识别真核细胞外源性及内源性约60kDa的NRBP蛋白,并且具有较强免疫沉淀能力。结论:NRBP多克隆抗体具有很好的特异性和敏感性,该抗体的成功制备为进一步研究NRBP的功能提供了重要工具。
关键词：NRBP,接头蛋白,原核表达,多克隆抗体
参考文献
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VEGF多克隆抗体 篇8
FKBPs 是一个高度同源的伴侣分子蛋白家族,它可以和免疫抑制剂结合从而起到免疫抑制的作用。自1989 年首次在《Nature》报道以来,已经陆续找到了多种FKBPs[1]。FKBPs广泛分布于不同种属的各类细胞中,含量丰富,分子大小从12kD到35kD不等。FKBPs是一个很大的家族,其中含量最丰富、最先被确定的成员是FKBP12[2]。目前为止已经在哺乳动物中发现了15种FKBP,它们绝大多数在脑中高浓度表达,特别是FKBP12[3]。FKBP12基因在植物中具有肽基-脯氨酰顺反异构酶活性和分子伴侣功能,在受到逆境胁迫时,植物FKBP12 基因能起到调控作用。有研究表明FKBP12能够与NF-YC相互作用,在青杄花粉管的生长发育中发挥重要作用[4]。
本研究将青杄FKBP12基因克隆到原核表达载体pET-48b中,利用大肠杆菌系统表达并纯化获得FKBP12 融合蛋白。将获得的融合蛋白免疫兔子,制备青杄FKBP克隆抗体,并对多克隆抗体的效价和特异性进行分析,为研究FKBP12基因在植物组织中的定位及响应逆境胁迫过程中的功能等奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
表达菌株BL21为北京天根生化科技有限公司产品;pET-48b表达载体由清华大学生命科学学院张大鹏实验室惠赠;2只健康的SPF级成年新西兰大白兔(每只体重约2kg)。
1.1.2 试剂
限制性内切酶、T4 DNA连接酶、蛋白marker、反转录试剂盒均为Fermentas公司产品;RNA提取试剂盒、胶回收试剂盒、Tag酶、质粒小量提取试剂盒、DNA marker都由北京天根生化科技有限公司提供;溶菌酶购自amresco公司;Ni-NTA-His-Bind Resin为Novagen产品;PVDF(聚偏二氟乙烯膜)转印膜、AP标记的羊抗兔抗体、His标签抗体均购自北京亚太恒信生物技术有限公司;其他常规化学药品均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 FKBP12基因的克隆
根据Genebank数据库中的PwFKBP12基因的cDNA用RNA提取试剂盒提取青杄的RNA,反转录成cDNA(登录号GQ140630.1),用Primer 5.0设计扩增其全长引物P1,P2。
上游引物P1:5’CCGGAATTCTATGGGAGTGGAGAAGGAGAT 3’(划线部分为EcoRⅠ酶切位点),
下游引物P2:5’CCCAAGCTTCTAGTTTACACTCAGAACTTCAATC 3’(划线部分为HindⅢ酶切位点)。
以上述cDNA为模板,PCR反应体系为:模板1×10-6L,引物各0.5×10-6L(0.00002mol/L),2×Taq酶1×10-5L,去离子水补充体积至2×10-5L。PCR反应的条件是:95℃预变性5 min;95℃变30s;55℃退火30s;72℃延伸45s;循环30次;72℃延伸10 min[5]。扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测,以确定目的条带是否在合适位置,并切胶回收(参照说明书)。
1.2.2 原核表达载体FKBP12-Pet48b的构建
取10μL Pet48b大肠杆菌接种到含卡那霉素(50μg/mL)的LB液体培养基中,37℃、260r/min过夜培养,离心去上清,进行质粒回收(参照说明书)。琼脂糖凝胶电泳检测,质粒和目的片段DNA分别进行双酶切,消化12h,回收酶切产物。在T4连接酶的作用下连接,然后转入BL21感受态细胞中,将其涂布在Kan+(50mg/L)抗性平板上,37℃过夜,挑取单菌落。一部分进行菌落PCR,另一部分接入液体Kan+(50mg/L)LB培养基中培养,提质粒,用EcoRⅠ和HandⅢ双酶切,琼脂糖凝胶电泳检测目的基因是否转入,并送上海英俊生物技术公司测序,最终得到正向插入的FKBP12-Pet48b的原核表达载体。
1.2.3 探索不同条件中融合蛋白的表达量
将上述菌液按1:10的比例,接入Kan+ (50mg/L)LB培养基中培养OD600值达到0.7左右时,加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)至终浓度为0.5×10-3mol/L,分别在4h、6h、8h、10h的时候取样,SDS-PAGE检测,在不同的转速温度组合下重复上述实验。
1.2.4 融合蛋白FKBP12的诱导表达及可溶性分析
含有重组表达质粒的菌种在0.5L的Kan+(50mg/L)LB培养基中培养,至OD600值0.5～1.0时加入IPTG至终浓度为0.5×10-3mol/L,37℃、260r/min 8h后13 000r/min离心,收集菌体。加入蛋白酶抑制剂和溶菌酶用30mL清洗缓冲液(2.5mol/L NaCl,0.25mol/L NaH2PO4,0.01mol/L咪唑,pH 8.0)重悬。超声破碎仪破碎菌体,释放蛋白,加TritonX-100,冰上震荡0.5h后4℃下分离上清和沉淀。
包涵体的处理:100mL的清洗缓冲液重悬上步沉淀,离心后去上清,去除可溶性蛋白,剩余沉淀用30mL含8mol/L尿素的裂解缓冲液溶解,冰浴孵育1h,彻底溶解包涵体,离心去除不溶成分。
SDS-PAGE检测融合蛋白的可溶性:经IPTG诱导后的表达产物经12%的SDS-PAGE电泳后转移硝酸纤维膜上,以抗His标签兔多克隆抗体为一抗,山羊抗兔IgG AP标记抗体作为二抗,用NBT/BCIP显色,检测分析Western blotting结果。
1.2.5 融合蛋白的纯化
将目的蛋白载入Ni-NTA琼脂糖亲和层析柱中,冰上结合2～4h,用4倍体积的漂洗缓冲液(2.5mol/L NaCl,0.25mol/L NaH2PO4,0.01mol/L咪唑,pH 8.0)洗3次,以彻底去除杂蛋白和分特异性结合蛋白,用1倍体积的洗脱缓冲液(2.5mol/L NaCl,0.25mol/L NaH2PO4,0.01mol/L咪唑,pH 8.0)洗脱目的蛋白3～5次,分别收集组分。
1.2.6 抗体的制备及效价的检测
在免疫前,对多只兔子进行血清背景检测,在每只兔子耳缘静脉处取血0.5～1ml,分离抗血清,以目的蛋白为抗原,免疫前血清为一抗,山羊抗兔IgG AP标记抗体作为二抗,进行Western blotting分析。
首次免疫600μg/只,在抗原溶液中加等体积弗氏完全佐剂乳化,在皮下多点注射。第2 d时进行第二次免疫,400μg/只,在抗原溶液中加等体积弗氏不完全佐剂乳化,皮下多点注射。在第35 d和第49 d时分别进行三免和四免,方法同二免。
免疫10d之后,在每只兔子耳缘静脉处取血0.5～1 ml,并分离抗血清,然后进行间接ELISA检测免疫后血清效价。各以2μg/ml的浓度将目的蛋白包被到酶标板中,100μl/孔,在4℃过夜;PBST洗涤(3次,每次振板5 s,下面的洗涤步骤条件均同此)。5%脱脂奶粉封闭,300μl/孔,在37℃封闭2h。PBST洗涤,将待检测抗血清按照不同的倍数的浓度进行稀释,加入酶标板中,100μl/孔,在37℃孵育2h。PBST洗涤,用HRP标记的山羊抗兔 IgG(1:10 000)稀释后,加入酶标板中,100μl/孔,在37℃孵育50min。PBST洗涤,加入配好的TMB底物显色工作液,100μl/孔,显色10min。加入2mol/L H2SO4 终止显色,50μl/孔。用ddH2O洗3次,酶标仪测450nm波长的OD值。如效价达到指标要求,则在检测效价后的第2d采用心脏穿刺的方法采全血,分离抗血清。
1.2.7 ProteinA纯化后抗血清
用结合缓冲液平衡protein A亲和柱至基线平稳,将用结合缓冲液稀释的血清样品负载上柱,收集流穿液,将流穿液再次上柱,继续平衡至基线平稳。加入洗脱缓冲液洗脱,收集洗脱峰,用SDS-PAGE检测抗血清的纯度。用浓度为0.01mol/L、pH 7.2的 PBS透析收集的洗脱峰,纯化后的IgG保存在0.01mol/L、pH 7.2 的PBS环境中。蛋白定量检测仪测定纯化后总IgG的浓度,SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度。
1.2.8 抗体的Western blotting检测
Western blotting:12%的SDS-PAGE电泳后将凝胶转移至硝酸纤维膜上,在转移电泳缓冲液中转膜,电压100V,电流400A,时间为80min,然后将硝酸纤维膜置于含5%BSA的TBST溶液中室温封闭2h,TBST溶液洗膜,1∶3 000稀释一抗于含5%BSA的TBST溶液中4℃过夜,洗膜,1∶5 000稀释山羊抗兔IgG AP二抗于含5%BSA的TBST溶液中室温摇动孵育2h,洗膜,NBT/BCIP室温下显色。
2 结果分析
2.1 FKBP12基因全长的扩增
以青杄cDNA模板,用设计好的引物在合适的条件下进行PCR,扩增全长,得到一个长约339bp的条带,检测到的条带大小与目的片段的大小相符。
1.FKBP12基因的PCR产物;2.DL2000分子质量标准。
1.PCR products of FKBP12;2.DL2000 marker.
2.2 重组表达载体FKBP12-pET48b的鉴定
FKBP12基因与原核表达载体质粒分别双酶切,连接后转入BL21中,在固体的Kan+ LB培养基中培养,挑取单菌落,与之前设计的引物进行菌落PCR,琼脂糖凝胶电泳显示的条带位置与预期相同。将重组质粒FKBP12- pET48b用EcoRⅠ和HandⅢ酶切,琼脂糖凝胶电泳检测,发现有一大一小两个条带,大条带是pET48b质粒被酶切后剩余的片段,小的条带位置与目的片段大小相符,证明了原核表达载体FKBP12- pET48b构建成功。
1.重组质粒FKBP12- pET48b经EcoRⅠ和HandⅢ双酶切;2.DL2000分子质量标准。
1.The recombinant plasmid FKBP12-pET48b digested with EcoRⅠ and HandⅢ;2.DL2000 marker.
2.3 融合蛋白的表达量及可溶性分析
融合蛋白大量表达时,设置对照组,对照组不加IPTG诱导。取诱导之后的菌,超声破碎后,分离上清和沉淀,SDS-PAGE检测,对照组中融合蛋白表达不明显,实验组中上清里融合蛋白很少,表明该诱导表达蛋白大部分以包涵体的形式存在或是超声波破碎不彻底。
1.蛋白分子量标准;2.没加IPTG诱导的重组菌FKBP12-pET48b;3.加IPTG诱导的重组菌FKBP12-pET48b;4.重组菌FKBP12-pET48b裂解沉淀物;5.重组菌FKBP12-pET48b裂解上清。
1.Protein molecular weight marker;2.FKBP12-pET48b without IPTG induction;3.FKBP12-pET48b induced with IPTG;4.The lysate precipitant of FKBP12-pET48b;5.The lysate supernatant of FKBP12-pET48b.
1.重组菌FKBP12-pET48b不加IPTG诱导;2～4.重组菌FKBP12-pET-48b加IPTG分别诱导4、6、8h。
1.FKBP12-pET48b/BL21 without IPTG induction;2-4.FKBP12-pET48b/BL21 induced with IPTG for 4h,6h and 8h,respectively.
2.4 融合蛋白的亲和层析纯化
由于融合蛋白中带有His标签,所以采用Ni-NTA HiS.Bind Resin纯化,将收集到的洗脱缓冲液洗脱的组份进行SDS-PAGE分析,发现过柱子后,第1、第2次的洗脱产物杂蛋白较多,第3次的杂蛋白占得比重较小,为了保证抗体的效价,一般都要求目的蛋白的纯度尽可能高,而且浓度不低于1mg/mL,所以综合考虑,第3次洗脱的蛋白符合要求。
1.破碎处理后的总蛋白;2～4.第1、2、3次洗脱的杂蛋白;5～7.第1、2、3次洗脱的目的蛋白。
1.The total protein;2-4.The elution of unnecessary protein for three times,respectively;5-7.The elution of necessary protein for three times,respectively.
2.5 本底反应
采集多只兔子的血清进行本底反应,以兔血清为一抗,山羊抗兔IgG AP标记抗体作为二抗,进行Western blotting分析,筛选出在目的条带(34kD左右)位置无明显特异结合的2只兔子,排除兔子自身抗原对实验的干扰。
1.蛋白分子量标准;2.兔血清免疫印记检测条带。
1.Protein molecular weight marker;2.Western blotting assay of rabbit serum.
2.6 FKBP12多克隆抗体的间接ELISA检测
以纯化后的融合蛋白FKBP12包被酶标板,免疫后抗血清稀释比例分别采用1:1 000、1:3 000、1:9 000、1:27 000、1:81 000、1:243 000,1:729 000,进行间接ELISA测定多克隆抗血清的效价。对照组为免疫前的抗血清。结果如图所示,OD阳/OD阴>2.1,且OD值>0.1。以A450阳/A450阴>2.1为标准[6],当血清稀释到729 000倍数时,A450值为0.701,而阴性对照A450为0.055,呈阳性。表明制备的FKBP12兔抗血清效价在1∶729 000以上。ELISA结果表明融合蛋白具良好的免疫原性。
2.7 Protein A纯化后抗血清的检测
经Protein A纯化后抗血清获得总IgG的量为181.4mg,体积为20ml,纯化后抗体浓度为9.07mg/mL。用SDS-PAGE检测纯化后抗体纯度,如图8所示。间接ELISA法检测纯化后抗体效价,表明纯化后抗FKBP蛋白兔多克隆抗体效价高,检测灵敏度为16ng/mL。
2.8 免疫印记检测抗体特性
为了验证抗体对抗原的特异反应,进行Western blotting分析。抗体与AP标记的羊抗兔二抗杂交显色在膜上出现条带,条带位置与目的蛋白大小相符。而没有诱导的菌体没出现条带,说明制备的抗体识别融合蛋白。
1.纯化后的FKBP12融合蛋白;2.未经诱导的FKBP12融合蛋白;3.不含融合蛋白的凝胶为抗原,免疫后兔抗血清孵育。
1.Purified FKBP12 fusion protein;2.Unpurified FKBP12 fusion protein;3.Negative control(gel without protien).
3 讨论
在水稻、玉米、蚕豆、拟南芥、番茄上已陆续找到了FKBP12基因,但是关于其在植物体内具体功能的研究还很少。一些研究表明植物的FKBP12具有两个相对独立的功能:一个是肽基-脯氨酰顺反异构酶活性,其可以被免疫抑制剂FK506 和纳巴霉素所抑制;另一个是分子伴侣功能,能够参与蛋白质的折叠,这种功能不受免疫抑制剂的影响。Luan[7]等在植物保卫细胞中所做的实验结果表明FK506 必须在FKBP12 存在的情况下,才能阻断保卫细胞中钙信号的传递。Qiang Xu[8]等发现,植物FKBP12基因序列与动物、菌类中的序列相似,但在免疫抑制剂存在的条件下,并不能发挥免疫抑制的作用,还发现高等植物FKBP12 具有氧化还原的调控作用,这一点和酵母、人类的FKBP12 并不相同。
在植物中,FKBP12在细胞中参与的信号转导还可能与诸多环境因子有关,如光、胁迫因子、病毒侵害等。在受到逆境胁迫的情况下,FKBP12 基因可以起到调控作用。Esther[9]等研究表明水稻中的3种FKBPs(rFKBP64、rFKBP65 、rFKBP75)都包含有三个类似FKBP12 的结构和一个TPR区域。在植物中研究最多的是拟南芥FKBPs,据研究表明拟南芥中的FKBPs 有些是受外界伤害、NaCl、丙二醛等诱导表达的[10]。早期研究结果[11]表明,当斑茅受到干旱胁迫的时候,FKBPs被明显激活,实时荧光定量PCR结果表明,FKBP12 基因明显参与了植物的抗旱调节。
VEGF多克隆抗体 篇9
萎锈灵( Carboxin) 是发现的第一个内吸性杀菌剂,为芳酰胺类杀菌剂,能够防治植物种子携带的病菌,防止植株早期受病原菌危害[1]。Carboxin为琥珀酸脱氢酶抑制剂,对担子菌类有特异的抑制作用[2,3],因此能够防治水稻纹枯病、玉米黑穗病、麦类锈病、麦类赤霉病等[4,5,6,7]。
由于Carboxin特异的抑菌性及其特有代谢产物,近些年来,科学家们将Carboxin的抗性基因CbxR基因广泛应用于丝状真菌遗传转化的筛选标记,是转基因食用菌及食用菌生物反应器研究的重要组成部分[8,9]。本研究通过对CbxR基因进行原核表达, 纯化出CbxR蛋白,经免疫大白兔,制备CbxR蛋白多克隆抗体,为带有CbxR筛选标记的真菌检测及基因功能的研究提供理论基础。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1实验材料
原核表达载体p ET - 28a( + ) 、p HD3 - hsp70质粒为作者实验室保存; 大肠杆菌T1、大肠杆菌BL21 ( DE3) 、质粒提取试剂盒和胶回收试剂盒购自北京全式金公司。
1.1.2试剂
限制性内切酶Nde Ⅰ、Hind Ⅲ购自Ta KaRa公司; T4 DNA连接酶购自Fermentas公司。
1.1.3仪器
PCR仪TC - 5000( 英国TECHNE) ; 高速冷冻离心机CT15RE( 日本HITACHI) ; 洗板机ELx50( 美国Bio Tek) ; 酶标仪ELx800( 美国Bio Tek) 、垂直电泳槽DYCZ - 24DN ( 中国北京六一 ) ; 蛋白转移印记仪Mini Protein Tetra System( 美国BIO - RAD) 。
1.2方法
1.2.1原核表达载体的构建和鉴定
根据Gen Bank报道的CbxR基因核酸序列,设计原核表达 引物: 上游引物5 ’- TATCTATCTACATATGTCGCTATTCAACGTCAG - 3 ’( 下划线处为Nde Ⅰ 酶切位点 ) ,下游引物: 5 ’- TATCTATCTAAAGCTTTTACGACGAAGCCATGATAG - 3 ’ ( 下划线处为Hind Ⅲ酶切位点) ,引物由上海生物工程公司合成。以p HD3 - hsp70为模版扩增CbxR基因,PCR反应总体积为50 μl: CbxR模版DNA 1 μl,上下游引物各1 μl,2 !PCR Mix 25 μl,Sterial dd H2O 22 μl。PCR反应条件: 94℃ 预变性2 min; 94℃ 变性15 s,58℃ 退火30 s,72℃ 延伸1 min,进行30个循环; 72℃ 再延伸10 min。1. 0% 琼脂糖凝胶电泳,胶回收试剂盒纯化PCR产物。
运用Nde Ⅰ 和Hind Ⅲ 限制性内切酶双酶切PCR产物,与同样经Nde Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切的表达载体p ET - 28a( + ) 用T4 DNA连接酶进行连接后, 转化大肠杆菌T1,双酶切鉴定的阳性克隆送往上海生物工程公司进行测序,并对所测得的序列进行比对分析。
1.2.2CbxR在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达
将重组质粒p ET - 28a( + ) - CbxR转化入大肠杆菌BL21( DE3) 中,挑取单个菌落进行鉴定后扩大培养,采用不同的IPTG浓度、诱导时间、温度、培养基抗生素浓度进行优化,确定最佳诱导条件。进行SDS - PAGE凝胶电泳分析,鉴定重组质粒p ET -28a( + ) - CbxR表达情况。
1.2.3CbxR蛋白纯化及鉴定
采用优化的表达条件进行诱导,收集菌体,超声波破碎菌体,8mol/L尿素缓冲液重 悬菌体,4℃、 12 000 r / min离心20 min除去不溶解物质。取上清蛋白,0. 45 nm滤器下过滤,注入镍离子亲和层析柱,分别用p H 8. 0、6. 0、4. 0缓冲液( 100 mmol/L Na H2PO4、10 mmol/L Tris、8 mol/L urea) 进行洗脱, 收集目的蛋白,SDS - PAGE电泳。
Western blot法鉴定CbxR蛋白: 将已经纯化的CbxR蛋白和菌体未被诱导表达后裂解产生的沉淀进行SDS - PAGE电泳,转入PVDF膜,5% 脱脂奶封闭,PBST缓冲液洗膜,一抗为稀释至1∶ 2 000的6 × His单克隆抗体,二抗为稀释至1 ∶ 5 000的鼠源酶标抗体,DAB显色。
1.2.4CbxR蛋白多克隆抗体制备及效价检测
以CbxR蛋白作为免疫抗原,和等体积完全弗氏佐剂混合,充分乳化,对家兔肌肉及皮下进行基础免疫,剂量为100 μg /只。每隔2 w以100 μg CbxR蛋白加入等体积不完全弗氏佐剂加强免疫3次,末次免疫2 w后,耳静脉取血,提取血清,检测抗体效价。
采用间接ELISA法检测抗体效价,CbxR蛋白2 μg /孔包被酶标板,3个平行,一抗: 制备的兔源抗体血清( 1∶ 100 ~ 1∶ 256 000梯度稀释) ,二抗: 兔源酶标抗体1∶ 5 000倍稀释,OPD显色。测定OD490值,取P / N > 2时的抗体最大稀释倍数为其效价。
1.2.5Westernblot检测抗体特异性
纯化后的CbxR蛋白SDS - PAGE电泳,转入PVDF膜,一抗为稀释至1 ∶ 1 000的多克隆抗体血清,二抗为稀释至1 ∶ 5 000的兔源酶标抗体,DAB显色。
2结果与分析
2.1pET-28a(+)-CbxR重组载体的构建与鉴定
以质粒p HD3 - hsp70为模版进行PCR扩增, 1% 琼脂糖凝胶进行电泳分析。结果表明( 图1) ,在750 ~ 1 000 bp有1条特异性带,与CbxR基因大小 ( 888 bp) 相吻合。回收PCR产物经双酶切后,与经双酶切的p ET - 28a( + ) 质粒相连,p ET - 28a( + ) - CbxR重组质粒双酶切产生大小约5 369 bp和888 bp两条带( 图2) 。对p ET - 28a( + ) - CbxR重组质粒进行测序分析,插入序列全长为888 bp,p ET- 28a( + ) - CbxR重组质粒的开放阅读框架正确,表明重组载体构建成功。
图1 PCR 扩增产物的结果 A、B: marker; C、D: CbxR。 Figure 1 PCR amplification results A,B: marker; C,D: CbxR.
图2 双酶切重组质粒 p ET28a( + ) - CbxRA: marker; B: p ET28a( + ) - CbxR; C: p ET28a( + ) 和 CbxR。 Figure 2 The results of the digestion products of recombinant plasmid p ET28a( + ) - CbxRA: marker; B: p ET28a( + ) - CbxR; C: p ET28a( + ) and CbxR.
2.2CbxR重组蛋白表达
转化p ET - 28a( + ) - CbxR的BL21( DE3) 菌株经IPTG诱导后,SDS - PAGE电泳发现( 见图3) ,在相对分子量( Mr) 为32. 6k Da处,沉淀中有1条特异性条带,而可溶性上清没有特异性条带。
2.3CbxR蛋白的纯化及鉴定
以包涵体形式表达的CbxR重组蛋白经镍离子亲和层析纯化( 图3) ,得到清晰的单一条带,分子量大小与CbxR蛋白相符,说明经过纯化后获得了高纯度的CbxR蛋白。
图3 CbxR重组蛋白表达及纯化 M1、M2: marker; A ~ E: 纯化后的 CbxR蛋白; F: 菌体被诱导表达后裂解产生的沉淀; G: 菌体未被诱导表达后裂解产生的沉淀。 Figure 3 SDS - PAGE analysis of CbxRrecombinant protein expression and purification M1,M2: marker; A - E: elute of purification; F: sediment before induction; G: sediment after induction.
以6 × His单克隆抗体作为 捕获抗体,采用Western blot法鉴定纯化后的蛋白,结果表明( 图4) , 纯化后所获得的蛋白为CbxR蛋白。
图4 纯化后 CbxR蛋白 Western blot 分析 1: 空白对照; 2、3: 纯化后的 CbxR蛋白; 4: 未经诱导的菌体裂解后产生的沉淀。 Figure 4 Western blot analysis of CbxRprotein purification 1: blank control; 2,3: the recombinant CbxRprotein purification; 4: sediment before induction.
2.4CbxR蛋白多克隆抗体效价检测
纯化后的CbxR蛋白包被酶标板,免疫后的兔源抗体血清稀释比例为1 ∶ 500、1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 000、 1∶ 4 000、1∶ 8 000、1 ∶ 16 000、1 ∶ 32 000、1 ∶ 64 000和1∶ 128 000,进行间接ELISA测定多克隆抗体血清效价,阴性对照为未免疫的兔源血清。结果如图5所示,当血清稀释到1∶ 64 000时,P/N > 2. 1,呈阳性。 表明制备的CbxR蛋白兔源血清效价在1∶ 64 000以上,重组蛋白具有良好的免疫性,在大白兔体内产生较高的抗体血清。
2.5Westernblot检测抗体特异性
为了见证多克隆抗体对CbxR的特异性反应,进行Western blot分析。图6所示,PVDF膜上出现一条带,位置与目的蛋白大小相符,说明制备的多克隆抗体能够特异性识别CbxR蛋白。
3讨论
本研究的表达体系中,采用p ET - 28a( + ) 表达载体,CbxR基因通过Nde Ⅰ和Hind Ⅲ两个酶切位点将CbxR基因插入到翻译的起始位置,使得表达的CbxR重组蛋白更接近天然蛋白,有利于保持CbxR蛋白的抗原性,也利于多克隆抗体的制备。
制备CbxR蛋白的多克隆抗体,相比较单克隆抗体,多克隆抗体制备成本低,时间短,适合实际应用。 另外,多克隆抗体能够识别多个抗原表位,即使有少数几个 抗原表位 被破坏,仍然不会 影响检测 结果[10]。
CbxR基因作为筛选标记,学者将其归类为除草剂和杀菌 剂抗性筛 选标记或 代谢产物 选择标记[9,11,12],对定向培育抗虫、抗病、优质的食用菌新品种,以及食用菌基因工程的进展具有极大的促进作用[13]。2000年Yoichi Honda等[14]通过基因点突变获得萎锈灵的抗性基因,转入平菇,获得转化子, 为首次将同源标记基因应用于食用菌分子育种研究。Toshikazu Irie等[15]和Takahisa Tsukihara等[16]相继报道了以CbxR为筛选标记,转化Mn P3酶成功, 为世界首次报道表达外援基因的重组平菇。本研究制备的多克隆抗体能够特异性识别CbxR蛋白,为以CbxR基因为筛选标记的转基因食用菌产品的检测奠定了基础。
4结论
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