分子克隆技术

分子克隆技术（共4篇）

分子克隆技术 篇1

辽育白牛是辽宁省新培育出来的肉牛新品种,其生长性状具有一定的优势和典型性,由于初培育目前对辽育白牛的深入研究现在还非常少,要想让该种群扩大并保持生长性状的优越性,仅用传统的育种手段,其遗传进展无疑是缓慢的,效果也是不理想的。借助先进的分子育种技术手段找寻辽育白牛重要经济性状的主基因或与之连锁的分子标记,是提高我国辽育白牛生产水平,尤其是产肉和肉品质性状的一条有效途径[1]。

根据目前研究,国内外关于肌肉生长发育和肉质性状的研究方法有很多,一般采用定位影响肉质的主效基因的方法来实现,所涉及的主要调节肌肉生长发育因素有如下几种:肌肉生长抑制素、瘦蛋白基因、钙素基因、生肌调节因子MyoG基因[2]、肾上腺髓质基因、腺苷酸环化酶2型基因[3]、胰岛素样生长因子[4]。

肌肉生长抑制素(简称MSTN),又称GDF-8,是TGF-β(transforming growth factor beta,转化生长因子β)超家族成员。MSTN在骨骼肌中广泛表达,是功能比较专一的肌肉发育负调控因子,在控制骨骼肌生长发育与分化上起着非常重要的作用。MSTN基因实现对肌细胞生长发育的负向调控的原理,是通过抑制成肌细胞的分化抗体家族成员的转录活性来实现的,肌肉重量大小的变化表现为与MSTN基因的表达量呈显著的负相关性[5]。已有最新报道表明,在不同的家畜动物中,可以使MSTN基因失活,从而导致肌肉增大重量增加现象[6]。肌肉生长抑制素基因的研究一直是近年来国内外分子遗传领域的研究热点之一,并已取得显著成果。

MicroRNA是一类进化上高度保守的非编码的单链内源性小分子RNA[7]。目前,大约有3 000种MicroR-NA已经被鉴定出来[8]。目前,已经被证实,在肌肉发育和肌肉细胞增殖和分化过程中MicroRNA具有重要的调节作用[9]。

1 材料与方法

1.1 血液与肌肉组织样品

试验以辽宁省培育的新品种——辽育白牛为研究对象进行多次采样分析。样品分别由辽宁省畜牧业经济管理站联系大连雪龙集团公司与辽宁绿源肉业有限公司提供。在大连雪龙集团公司,利用加有抗凝剂EDTAK2的采集管对20头辽育白牛静脉采血,将采集的样品低温保存,带回实验室-70℃冰箱中保存备用。在辽宁绿源肉业有限公司所属的屠宰场采集平均年龄约为5岁的辽育白牛肋脊部肌肉组织,以及心、肝、脾、肺、肾、睾丸、附睾组织,用提前经过灭菌的镊子和手术刀片分别取100 g并切成小块分装,装在纱布袋里,拴好并在绳上粘上标签,立即放入液氮罐中冷冻备用。

1.2 试剂

蛋白酶K(proteinase K)、Taq DNA聚合酶、5×SDS PAGE蛋白上样缓冲液、DEPC、dNTPs、6×Buffer、DL 2000 DNA Marker、RNA simple总RNA提取试剂盒、血液DNA提取试剂盒、RT-PCR反转录试剂盒、PCR试剂2×Taq PCR MasterMix、βActin抗体等,购自天跟生物有限公司和大连宝生物工程有限公司。

1.3 引物设计及合成

参考GenBank上公布的牛MSTN序列(登录号为NM＿001001 525.2),使用Primer 5.0和Oligo 6软件分别对基因的5'调控区,CDS和3'-UTR设计特异引物,由上海生工合成引物。5M1和5M2扩增5'调控区(位于编码区上游长约1 240 bp),5M1,F:5 CTAAGGTTGAGAGTTTGA 3,R:5 TCTTTT-GCTTTTGAGTAA 3,长度1 226 bp,退火温度51.0℃;5M2,F:5 AGACCTTACCCCAAATCCC 3,R:5 AGACAACTTGCCACACCAG 3,长度1 101 bp,退火温度61.0℃。M1、M2、M3扩增编码区(1～1 128 bp),M1,F:5 TTGGCTTGGCGTTACTCA 3,R:5CCATCTTCTCCTGGTTCT 3,长度826 bp,退火温度57.4℃,M2,F:5 TTGGGCTTGATTGTGAT 3,R:5GAATGGTAACCTGCGTAT 3,长度846 bp,退火温度55.0℃;M3,F:5 CCACAAAGTAGGGAT 3,R:5CATTGGATGTAAGA 3,长度977 bp,退火温度46.4℃。3M1、3M2、3M3扩增3'调控区(位于编码区下游长约1 058 bp),3M1,F:5 GTAGATCGCTGT-GGGTGT 3,R:5 CCATAGGGAGGAGTGTGA 3,长度700 bp,退火温度54.2℃;3M2,F:5 AG-GTCTTCCCCTCAACAA 3,R:5 CAGCCATTCAGCCTATTG3,长度552 bp,退火温度53.4℃;3M3,F:5 AG-GACATAAAAGCAAAAG 3,R:5 TACAATGACAGTAAACCA3,长度194 bp,退火温度48.5℃。

1.4 基因组DNA及总RNA的提取及检测

按照血液基因组DNA提取试剂盒(天根)提取基因组DNA。琼脂糖凝胶电泳检测基因组DNA纯度,紫外分光光度计测定DNA浓度,采用RNA simple总RNA提取试剂盒(天根),对辽育白牛肌肉及心、肝、脾、肺、肾、睾丸、附睾八种组织的总RNA进行提取,并用0.8%的甲醛的琼脂糖凝胶电泳检测。

1.5 产物扩增与序列鉴定

本试验采用设计的上、下游特异引物,分别在各自最适退火温度条件下获得MSTN基因各个区段目的片段。编码区的引物M1、M2、M3对基因扩增时,采用的模板是辽育白牛各组织中提取的RNA反转录后获得的cDNA。用MSTN基因的5'调控区和3'-UTR区域的基因引物进行基因扩增时,需要对10头辽育白牛种公牛血样提取的DNA分别进行扩增。然后根据巢式PCR方法,将检测后成功获得的MSTN基因的5'调控区和3'-UTR区域基因扩增产物每3管混在一起,将所有成功获得的MSTN基因扩增产物进行测序。目的序列与GenBank中相应基因序列比对分析,确定基因的序列结构。利用DNAStar,DNA-MAN 4.0,BLAST等软件与GenBank中序列进行比较分析。利用数据库和在线软件分别分析5'端非翻译区序列、预测TATAbox、转录因子结合位点、预测CpG岛、预测蛋白结构及功能位点、预测3'端非翻译区序列靶标MicroRNA。

2 结果与分析

2.1 目的基因片段扩增与测序

采用设计的上、下游特异引物,在最适退火温度条件下获得MSTN基因不同区段目的片段(图1)。测序结果显示,在5'调控区-805 bp位处发生G/C突变,编码区571 bp位处发生A/G突变,3'-UTR区5 387 bp处发生C/T突变(图2)。

2.2 MSTN基因分子特征分析

测序结果分析后,在MSTN基因5'调控区发现4个突变位点,分别是-805 bp位点G/C突变、-163 bp位点T缺失突变、-156 bp位点A插入突变、-130 bp位点A插入突变。利用Berkeley Drosophila Genome Project软件对MSTN基因5'端的启动子分析预测。结果显示发生SNP突变后,在-161 bp和-137 bp位点处的两个TATA box消失,推断-163 bp位点的T缺失突变,-156 bp位点的A插入突变和-130 bp位点的A插入突变很有可能都是潜在的功能性突变位点。利用TFSEARCH转录因子结合位点预测软件,比较发现发生SNPs后,导致MSTN的5'端结合的转录因子种类和数量都发生了变化。通过methprimer cpG岛软件查找发现5'调控区存在明显的cpG Islands。

借助ORF Finder在线分析软件,参照Kozak法则(起始密码子符合CCA/GCCATG),对得到的辽育白牛MSTN的DNA序列进行阅读框架的识别,发现MSTN基因开放阅读框由3个外显子组成长度分别为373、374和381 bp,编码375个氨基酸。测序结果中发现在571 bp处发生A/G突变。

ExPASy-Pr o tPar am分析结果表明其蛋白质氨基酸残基亲疏水性总和为-0.337,蛋白的不稳定系数为40.48(此值大于40为不稳定蛋白),说明辽育白牛MSTN蛋白的疏水性较弱,且不稳定。根据Signal P4.1和Server 4.1软件对辽育白牛MSTN基因编码的蛋白进行信号肽预测,结果显示辽育白牛的MSTN蛋白中存在明显的信号肽序列。成熟链序列(mature chain sequence)预测在19 bp、375 bp位置处,属分泌性蛋白,这与已有研究结果相一致。

通过ExPASy-ProtScale软件对辽育白牛MSTN蛋白进行蛋白疏水区的预测(图3)。从图3可见,辽育白牛MSTN基因编码蛋白的C端具有亲水性,N端具很强疏水性,位于分子内部;中间部分亲水性和疏水性表现交替出现。从总体上讲,该蛋白的亲水性更强,而疏水区相对较少。

对辽育白牛MSTN蛋白序列用SOPMA进行蛋白质二级结构预测。该蛋白二级结构中由22.93%的α螺旋(h)、21.33%的伸展链(e)、2.93%的β转角(t)和52.80%的随机线圈螺旋(c)组成。氨基酸的对应序列显示整个蛋白结构出现了3个大峰和2个较小峰,可见α螺旋结构出现的集中区域相对比较明显。

将辽育白牛MSTN蛋白序列用SWISS MODEL软件,进行搜索同源性高的三维结构建模模板。结果显示,与辽育白牛MSTN蛋白同源性最高的是Transforming growth factor beta 1蛋白因子(3rjr.1.B),同源性达到84%。基于Transforming growth factor beta-1(3rjr.1.B)的三维结构,所提交的氨基酸序列构建的辽育白牛蛋白质三维结构模式(图4),其含有多个α螺旋结构域,该三维空间结构的预测结果与二级结构的预测结果相一致。

2.3 MSTN基因组织表达谱

辽育白牛MSTN蛋白不同组织部位表达见图5,组织部位包括睾丸、心脏、肌肉、肺、肝、脾、肾、附睾,利用βactin作为参照基因,从图可知,MSTN在心脏、肌肉和肝中的表达量相对强些,而在睾丸、脾、肾、附睾中的转录信号相对较弱,但在辽育白牛的肺中没有检测到表达信号,MSTN在肌肉中的表达信号相对最强。

2.4 MSTN基因3'-UTR靶标miRNA分析

测序后通过基因序列与波峰的比对发现,在MSTN基因3'UTR区发现了三个突变位点,分别是+5 304 bp位点A到C的突变,+5 378 bp位点C到G的突变,+5 387 bp位点C到T的突变(图6)。

利用在线软件查找牛的miRNA,牛的靶标miRNA库包含687个相关miRNA,用MicroInspector软件将MSTN基因与牛的miRNA结合情况分析后发现MSTN基因的3'UTR可以结合5个miRNA(图7)。发生突变后结合的miRNA的情况没有发生变化,结合的miRNA详细信息见表1。

3 讨论

启动子是基因的重要组成部分,它位于基因5'端上游,参与基因的转录表达。它通过与RNA聚合酶特异性作用,来对基因的转录水平起作用。由于启动子在转录水平的功能,当5'调控区发生SNP后,可能会造成启动子发生相应的变化。本试验已经得到辽育白牛MSTN基因的5'调控区发生SNP后,启动子位置发生了明显的变化,且原区域的TATA box消失。这表明在辽育白牛MSTN基因上存在多个潜在的启动子区段。而在很多研究中,牛基因组中的5'调控区或外显子1和2附近并没有典型的TATA框序列。转录结合因子在基因转录中具有重要的意义,它也是通过与RNA酶结合来发挥功能,影响着基因的转录,不同的转录因子,会产生不同的结合物,最后影响基因转录成不同的转录本,继而影响到后续的进程[10]。本试验通过寻找SNP前后潜在的转录因子潜在的结合位点的变化,功能性SNP使辽育白牛MSTN基因5'端结合的转录因子种类数量和结合力上都发生了改变,产生了不同的潜在结合位点,而这些潜在的结合因子共同作用可能会对MSTN基因的表达产生一定的影响。

M为2 000bp Marker,1～8泳道对应的组织分别为睾丸、心脏、肌肉、肺、肝、脾、肾、附睾

MSTN基因在不同物种间是十分保守的:甚至小鼠、大鼠、人、猪、鸡和火鸡在C-端的同源性能达到100%,而牛羊相比只有1～3个碱基的差别,斑马鱼与其他动物比同源性最差也能达到88%。辽育白牛MSTN蛋白与多个哺乳动物MSTN蛋白序列的序列一致性都在90%以上,说明了该蛋白在哺乳动物中存在显著的相似性,因而可以认为其功能也存在保守性[11]。所以该基因在其他哺乳动物中的研究对辽育白牛的研究具有一定的借鉴意义。

MSTN在骨骼肌中广泛表达,是功能比较专一的肌肉发育负调控因子[12]。目前有关辽育白牛基因的相关研究还比较少,因此本试验将以生物信息学手段对MSTN的mRNA序列进行多物种比对并根据其保守区设计了辽育白牛MSTN基因克隆的引物,最终获得全长为1 128 bp的辽育白牛MSTN基因cDNA序列。再通过生物信息学分析对该未知序列进行初步的确认及功能预测,为后续试验确定初步的研究方向。

辽育白牛MSTN编码的蛋白总体上属于疏水性较弱、亲水性较强的分泌性蛋白,这一点与其他学者研究的普通牛MSTN相一致[13],虽然疏水区相对较少,但可以推测出这些疏水区对MSTN蛋白形成重要功能结构域上发挥一定的作用。经生物信息学分析王伟等也曾发现猪MSTN编码的蛋白质在细胞外,很有可能作为信号肽[14]。

随着动物发育时期的变化和物种的不同以及组织的不同,MSTN基因的表达也呈现一定差异[15]。Kim等[16]分析了新生牛不同时期MSTN基因在肌肉中的表达量逐渐发生变化。Sharma[17]研究在其他组织器官中MSTN蛋白的分布情况时,发现牛和绵羊心肌组织中该基因也表达。Ji等[18]发现,除骨骼肌外,在猪的心、肝、肺、肾、脑、舌、骨髓、小肠、乳腺和脂肪组织中也都有表达。本试验对于MSTN在不同组织中表达分析,发现其在辽育白牛肌肉组织中表达量相对很高,因此可以试图通过对其调控作用实现对肌肉性状的控制。MSTN基因5'端启动子、转录因子、cpG岛等都是都是在其转录水平起调控作用,可将其作为切入点实现对MSTN基因的表达进行调控。

4 结论

本试验克隆辽育白牛MSTN基因,发生SNPs后,启动子原区域两个TATA box消失,5'端结合的转录因子种类和数量都发生变化,且存在明显的cpG岛。编码区序列,全长为1 128 bp,编码375个氨基酸,MSTN蛋白存在信号肽序列,为分泌性蛋白,疏水性较弱、不稳定。辽育白牛不同组织部位MSTN基因具有组织部位差异性表达模式,且肌肉组织中表达信号最强。MSTN基因存在靶miRNAs,且比较保守。因此可将MSTN作为控制肌肉生长发育的候选基因,为开展辽育白牛分子育种研究奠定理论基础。

摘要：肌肉生长抑制素(简称MSTN)是肌肉发育负调控因子,为了实现将来对辽育白牛的分子育种,本试验对MSTN分子特征及其靶MicroRNA进行了分析。以辽育白牛为研究对象,利用分子生物学技术,设计特定引物对辽育白牛MSTN基因的编码区和调控区分段PCR扩增,并进行克隆和测序。借助生物信息学分析软件,寻找各个区域的单核苷酸多态性(SNP)并分析了MSTN基因分子特征、组织表达谱以及3'非翻译区靶标rniRNA。试验表明,MSTN基因5'调控区SNPs使启动子位置和转录因子结合情况发生变化,但编码区的突变未造成氨基酸改变。辽育白牛MSTN编码区序列全长为1 128 bp,编码375个氨基酸,该蛋白存在信号肽序列,为分泌性蛋白,疏水性较弱且不稳定。辽育白牛MSTN基因在不同组织中具有表达差异性,且肌肉中表达量最高。3'UTR存在肌肉生长发育功能miRNA,且比较保守。为开展辽育白牛分子育种研究奠定理论基础。

关键词：辽育白牛,MSTN基因,MicroRNA,单核苷酸多态性

分子克隆技术 篇2

山西省晋中市榆次区泰山庙小学五年级段艺伟

克隆技术渐渐的成为了科学界的重点，有许多年轻的科学家研究克隆。每个国家都盼望早日掌握克隆技术。

终于在2036年，我国科学家首先掌握了克隆技术，那一天，举国大街上人山人海，好不热闹。我也和大家一样开心不已。

紧接着，人们开始滥用克隆技术，首先，有一个人把黄金克隆出了一批，瞬间成为了大富豪。其余人也纷纷效仿，一个个都成了大老板，同时，黄金的价格也急速下降，不出一年，黄金可以在大街上随处可见，黄金的价格竟然低到了一元钱一公斤，哪怕这样，来的人也十分稀少。黄金商甚至还打算降低。

渐渐地，“黄金**”过去了，人们又把目光聚集到了孩子们的身上。

众所周知，人人都希望自己的孩子变聪明，好好学习，给自己长脸，一些学习不好的孩子们也希望自己做题时不用绞尽脑汁，于是，一个大胆的设想出现在了人们的心中：给孩子“换脑袋”.这个想法一旦出现便挥之不去。一些一直希望自己孩子聪明的家长认为这个方法十分可靠。他们说“既然可以克隆，为什么不让自己的孩子‘换脑袋’呢?”于是，他们请一些科学家来证实一个。

刚开始科学家听了这个天马行空的想法之后，愣了好一会儿，才反应过来，“你是说给孩子‘换脑袋’?”“对呀，有什么不对吗?”,“这个，我得回家好好思考一下。”这位科学家觉得自己并不可以定夺。于是把中国所有的科学家叫起来一起商量。

听了科学家的提议后，所有人都陷入了沉思，如果真的可以成功的话，那中国是不是就成了名副其实的‘聪明国’。可是，如果真‘换脑袋‘会不会有什么副作用了。

于是，科学界分成了两派，一派支持，一派反对。

一些科学家认为这个方法很可行，一些则认为不可行。如果人人都换上高材生的脑袋，那不是就不用上学了，那得多少人失业?

最后竟是一个小孩解决了这个问题，只是这么一席话：人有再聪明的脑袋，如果不努力，还是不可以，学习靠的是勤奋而不是一个聪明的大脑。

是呀，一个聪明的大脑是代替不了勤奋的。

我们不能完全依靠克隆，是不行的，还要勤奋!

所以克隆不是万能的!永远不是!

克 隆 的 世 界

(448000 )湖北省荆门市 许艳姣

蓝蓝的天空，清澈的河水，到处是一片绿色的树林，人类没有了疾病，到处是一片欣欣向荣的景象。

原来，自从克隆基因被人类发现之后，我们的世界变得更加美好了。人类克隆出了许多人类所需要的东西，比如说：一片绿叶可以克隆出一片大森林，使地球上的植物增多了，到处都是绿色植被，同时也净化了空气。

科学家们克隆出了许多将要灭绝的.野生珍稀动物，如东北虎、大熊猫、白鳍豚、丹顶鹤等等，还克隆出了一座座绿色的大山，让那些野生动物有栖息之地。

随后，植物学家又克隆出了不怕干旱的一种植物，把它们种植在沙漠地区，使沙漠变成绿洲。当沙漠发生沙尘暴时，这种绿的植物便挡住了风沙，防止了沙尘暴的袭击。

农场里的人们克隆出了一种吃食量少，产奶量多的奶牛，使人们都能喝上新鲜的牛奶，增强了人们的体质，提高了工作效率。

人类没有疾病是由于医学专家发现了人类的抗癌基因，使人们的免疫能力大大提高了，每个人都能健康长寿。

由于地球上十分拥挤，人类用智慧在月球、火星上建立移民基地，创造出了像地球的大气层一样的保护层移到月球、火星上去，人类纷纷搬出了地球，到别的星球上去居住，每人都拥有属于自己的地盘，因此，使我们拥有了美好的家园。

随着克隆技术的飞速发展，我相信，未来将会给我们带来一个更加美好的世界。

【简快评语】小作者插上理想的翅膀，展开了丰富的想象，以环保为线索，通过克隆“绿色植被”、“珍稀动物”、“沙漠绿洲”、“抗癌基因”等向我们展示了一个克隆的世界。这些，既有科学依据，也是人们渴望实现的愿望。希望通过小作者的勤奋学习，早日实现“克隆世界”的梦想。

全文语言朴实，文笔流畅，很有创意。

分子克隆技术 篇3

应用动物模型是现代医学 (兽医学) 认识生命科学客观规律的实验方法和手段。建立遗传稳定、微生物背景清楚的实验动物封闭群, 利用基因敲除、转基因等遗传工程技术建立模式动物, 并在此基础上进行固有免疫研究已成为实验动物领域的研究热点[7]。中国农业科学院哈尔滨兽医研究所培育的封闭群巴马小型猪具有体型小、易饲养、成本低和基因纯度高等优势, 是进行猪固有免疫研究的良好对象。本研究旨在为进一步完善巴马猪作为实验动物的生物学信息奠定基础。

1 材料

1.1 试验动物

封闭群广西巴马小型猪的外周血, 由哈尔滨兽医研究所实验动物研究室保存。

1.2 主要试剂

猪淋巴细胞分离液, 购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司;M-MLV反转录酶、d NTP Mixture、RNase抑制剂、Oligod T、LA Taq酶, 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;DNA纯化试剂盒、质粒小提取试剂盒、总RNA小量制备试剂盒, 均购自AXYGEN爱思进生物技术 (杭州) 有限公司。

1.3 登录号

本试验扩增的TLR7、TLR8、TLR9、VISA、STING和IRF3序列登录号分别为KC860783、KC860784、KC860785、KC860782、KC860780、KC860781。序列比对选择的猪序列登录号为NM_001097434、GU013761、GU138029、EU082069、FJ455509和NM_213770;牛序列登录号为GU903503.1、GQ499855.1、HQ242779.1、NM_001046620、NM_001046357和DQ103889;犬序列登录号NM_001048124和AY859723;马序列登录号为NM_001081771、NM_001111301和NM_001081790;猫序列登录号为NM_001080133、EF484949和AY859724;人序列登录号为NM_016562、NM_138636、NM_017442、DQ174270、HQ448605和HM357932。

2 方法

2.1 引物的设计与合成

根据Gen Bank中猪TLR7、TLR8、TLR9、VISA、IRF3和STING基因设计引物 (由博仕生物技术有限公司合成) , 序列见表1。

2.2 淋巴细胞总RNA的提取及反转录

参照参考文献[8]进行。

2.3 固有免疫分子的RT-PCR扩增

注:下画线部分表示酶切位点。

取反转录产物5μL, 上、下游引物 (10 pmol/L) 各1μL, 10×Buffer 2.5μL, d NTP 2.5μL, LA Taq0.5μL, 用dd H2O补足50μL。反应程序:94℃预变性5 min;94℃变性30 s, 55~60℃退火30 s, 72℃延伸4 min, 共35个循环;72℃延伸10 min。PCR产物在1%琼脂糖凝胶中电泳观察结果。

2.4 固有免疫分子的克隆

RT-PCR产物的回收提纯按照Axygen DNA纯化试剂盒说明书提供的方法。纯化后经过限制性双酶切连接至pc DNA3.1中16℃过夜, 转化至E.coli DH5α中, Ampicillin抗性LB固体培养基筛选阳性菌落, 挑取单克隆37℃培养。

2.5 重组质粒的提取及酶切鉴定

重组质粒的提取按照Axygen说明书进行, 酶切体系见参考文献[8]。

2.6 测序及序列分析

将酶切鉴定正确的阳性质粒送于北京六合华大科技有限公司测序, 测序结果采用DNASTAR软件进行分析。

2.7 同源性分析

从Gen Bank中下载不同种属 (人、犬、牛、马、小鼠) 的TLR7、TLR8、TLR9、VISA、IRF3和STING这6种固有免疫分子的序列, 通过MEGA4.0进行进化树分析。

3 结果与分析

3.1 巴马猪固有免疫分子的RT-PCR扩增

以巴马猪外周血淋巴细胞总RNA为模板, 按照特异引物进行RT-PCR, 与预期值3 075, 3 087, 3 097, 1 575, 1 260, 1 137 bp一致, 见图1。

3.2 固有免疫分子重组质粒的酶切鉴定

提取重组质粒后, 分别用Bam HⅠ/NotⅠ, Bam HⅠ/NotⅠ, HindⅢ/EcoRⅠ, HindⅢ/XhoⅠ, HindⅢ/EcoRⅠ和EcoRⅠ/NotⅠ进行双酶切鉴定, 酶切产物电泳出现预期大小的目的片段, 见图2。

M.DL-10 000 Marker;1.Toll样受体7;2.Toll样受体8;3.Toll样受体9;4.VISA;5.IRF3;6.STING;7.无模板对照。

M.DL-10 000 Marker;1~6.分别为pc DNA-TLR7、pc DNA-TLR8、pc DNA-TLR9、pc DNA-VISA、pc DNA-IRF3、pc DNA-STING重组质粒。

3.3 巴马猪固有免疫分子的同源性分析

3.3.1 TLR7同源性分析

将得到的固有免疫分子序列与猪、牛、犬、马、猫和人TLR7核苷酸序列和氨基酸序列进行同源性分析, 结果见表2。

%

注:核苷酸同源性/氨基酸同源性;-表示未提交序列。

采用Meg Align软件对序列进行分析, 结果表明:TLR7与猪的核苷酸和氨基酸同源性较高, 高达99.8%;与人同源性较低, 为87.4%。在氨基酸水平上, 与猪同源性较高, 高达99.7%;与人同源性较低, 为85.2%。进化树分析结果表明, 猪TLR7与牛TLR7在同一进化分支上, 见图3。

3.3.2 TLR8同源性分析

将得到的固有免疫分子的序列与猪、牛、马、猫、人TLR8核苷酸序列、氨基酸序列进行同源性分析, 结果见表2。采用Meg Align软件对序列进行分析, 结果表明:TLR8与猪同源性高达99.2%, 其次与牛同源性较高;在氨基酸水平上, 与猪同源性最高达到98.3%;与牛、马、猫、人同源性较低, 均低于80%。进化树分析结果表明, 猪TLR8与牛TLR8处于同一分支上, 见图4。

3.3.3 TLR9同源性分析

将得到的固有免疫分子的序列与猪、牛、犬、马、猫和人TLR9核苷酸序列、氨基酸序列进行同源性分析, 结果见表2。根据软件Meg Align对序列分析可知, TLR9与猪TLR9同源性高达99.5%, 其次与牛同源性较高;氨基酸水平上, 与猪同源性最高达98.9%, 与其他种属同源性较低。进化树分析结果表明, 猪TLR9与牛TLR9进化处于同一分支, 见图5。

3.3.4 VISA同源性分析

将得到的固有免疫分子的序列与猪、牛、人VISA核苷酸序列、氨基酸序列进行同源性分析, 结果见表2。采用Meg Align软件对序列进行分析, 结果表明:VISA与猪、牛、人VISA同源性分别为98.8%、83.4%、76.2%;在氨基酸水平上, 同源性分别为98.3%、73.2%、60.3%。进化树分析结果表明, 猪VISA与牛VISA处于同一分支上, 见图6。

3.3.5 STING同源性分析

将得到的固有免疫分子的序列与猪、牛、人STING核苷酸序列、氨基酸序列进行同源性分析, 结果见表2。采用Meg Align软件对序列进行分析, 结果表明:STING与猪、牛、人STING同源性分别为99.2%、88.4%、84.4%;在氨基酸水平上, 同源性分别为99.2%、87.1%、77.8%。进化树分析结果表明, 猪STING与牛STING处于同一分支上, 见图7。

3.3.6 IRF3同源性分析

将得到的固有免疫分子的序列与猪、牛、人IRF3核苷酸序列、氨基酸序列进行同源性分析, 结果见表2。采用Meg Align软件对序列进行分析, 结果表明:IRF3与猪、牛、人IRF3同源性分别为99.8%、87.0%、83.3%;在氨基酸水平上, 同源性分别为99.8%、82.8%、78.3%。进化树分析结果表明, 猪IRF3与牛IRF3处于同一分支上, 见图8。

4 讨论

本试验参考Gen Bank中猪TLR7、TLR8、TLR9、VISA、STING、IRF3序列设计引物, 以广西巴马小型猪外周血淋巴细胞mRNA为模板, 成功克隆上述分子, 序列分析结果表明, 其同源性与猪较高。TLR7、TLR8、TLR9与病毒的应答相关, 定位在内吞溶酶体中。TLR7、TLR8、TLR9在人的浆样树突状细胞 (plasmacytoid dentric cells) 中大量表达, 在静息状态下, 主要定位于内质网;在受到病原体刺激后, 可与内质网跨膜蛋白UNC93B1相互作用, 并转移至胞内体膜上以识别相应的PAMPs[8,9]。TLR7和TLR8可识别RNA病毒的ssRNA, 包括人类免疫缺陷病毒、水泡性口炎病毒和甲型流感病毒, 诱导IFN-α的产生[10,11]。TLR9主要识别未甲基化的Cp G-DNA, 如小鼠巨细胞病毒、Ⅰ型单纯疱疹病毒和腺病毒[12]。VISA定位于线粒体, 对于激活下游信号转导非常重要, 超表达的VISA能有效激活NF-κB、IRF3以及Ⅰ型干扰素的表达[13,14]。IRF3在大多数细胞中呈高水平组成性表达, 病毒感染时使得IRF3磷酸化导致其转录活性明显增加[15]。STING的N端与VISA的C端存在持续的相互作用, 并以病毒依赖的方式招募TBK1至VISA从而激活IRF3。利用RNA干扰技术沉默这个基因, 能够抑制IRF3的激活, 从而加剧病毒的感染[16,17]。

巴马小型猪凭借体型小、便于应用和与人更接近的生物学特性的优势在医学及药学研究中被广泛应用, 并被用于建立糖尿病等人类重大疾病的动物模型, 是极具潜力的实验动物。本课题组以巴马小型猪作为试验动物成功建立了猪繁殖与呼吸障碍综合征、猪瘟的感染模型[18,19]。本试验通过核苷酸和氨基酸序列同源性分析发现, 巴马小型猪的固有免疫分子与猪属高度同源, 表明巴马猪和家猪有相似的固有免疫激活途径, 这与上述巴马猪感染性疾病的研究结果相一致, 提示巴马猪可以作为试验动物代替家猪进行感染试验。本试验对巴马猪的固有免疫分子的克隆及序列分析进行了研究, 为进一步开展固有免疫的研究奠定了基础。

摘要：为了开展巴马猪的固有免疫相关研究, 试验采用巴马小型猪的外周血分离淋巴细胞, 提取总RNA, 利用特异性引物进行RT-PCR, 将克隆片段与pc DNA3.1载体相连接, 转化到大肠杆菌DH5α中, 筛选阳性克隆并进行测序, 并将测序结果提交NCBI, 比较克隆序列与已知序列的同源性。结果表明:克隆的巴马猪TLR7、TLR8、TLR9、VISA、STING和IRF3序列长度分别为3 075, 3 087, 3 097, 1 575, 1 260, 1 137 bp, 测序结果与预期相符, 各序列与猪的同源性较高。

克隆技术的伦理问题教案 篇4

（一）语文基础知识目标

（二）阅读能力目标

1. 品味说明文与议论文的区别。

2. 理清说明顺序和论证过程。

（三）写作能力目标

练习写简单的一事一议的议论文，表明自己的观点。

（四）思想教育

体会科学家对人类负责的精神。

教学过程

一、导入新课

（一）语文基础知识目标

1. 生字词语

克隆lóng 畸形jī 哺乳bǔ 概率lǜ 干预gān 鳍qí

蹼pǔ 挠 náo 溯sù 赭色zhě 孤僻pì 腺xiàn

克隆：生物体通过体细胞进行无性繁殖，复制出遗传性状完全相同的生命物质或生命体。

父本：生物繁殖过程中，雄性的亲代。

母本：生物繁殖过程中，雌性的亲代。

门：这里指生物学分类范畴的第二级。门以上是界，门以下是纲、目、科、属、种。

多利：2月由英国胚胎学家威尔穆特培育出来的世界上第一只克隆羊。

显性基因病：明显地因基因遗传而产生的疾病。

基因库：一个进行有性生殖的生物群中各成员所共有的全部基因。

培养基：人工配制的适合微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。

畸形：不正常的形状。

辛普森：美国橄榄球明星。

星象学：根据星象推测世事的一种学说

星座：天文学上为了研究方便，把星空分为若干区域，每一个区域叫做一个星座。

手相：手的形状及手掌的纹理。

截然不同：形容完全不相同。

孤僻：性格古怪、不合群。

振幅：振动的幅度。

二、作者

邱仁宗，毕业于清华大学文学院，华中科技大学生命伦理学研究中心主任，北京大学医学部兼职教授，国家人类基因组北方研究中心伦理委员会主任委员，世界技术网络20xx年度伦理学奖获奖人，国际单体型图委员会委员，国际妇产科联合会生殖健康和妇女健康伦理

委员会委员。邱仁宗教授是我国著名的生命伦理学家，他对人类胚胎干细胞中的伦理争议深有研究。在20世纪80年代初，把生命伦理学系统地介绍到中国。

（二）阅读能力目标

1. 品味说明文与议论文的区别。

2. 理清说明顺序和论证过程。

（三）写作能力目标

练习写简单的一事一议的议论文，表明自己的观点。

（四）思想教育

体会科学家对人类负责的精神。

三. 教师建议

《克隆技术的伦理问题》

（一）指出本文各项推理论证的共同前提。

此前提为：克隆人也是人，一样是具有在特定环境下形成的特定人格，具有特殊心理、

行为、社会特征的人。详见练习一。

（二）本文运用反面例证的具体情况及其作用。

“辩护”全节及“反论证”节的前半部分均为反面例证。以反面例证为主，最后才推出

正面例证，各种可能情况特别是一般论证未予考虑的情形尽可能考虑了，使全文论证更加全

面、严密、彻底，结论显得更为雄辩。详见练习二。

（三）比较“反论证”节与《梁》文奈良故事节表达方式的异同。

同在“非一般”和“彻底”：一般论证未予考虑的，反论证节涉及了，显示出论证的彻

底性；亦因奈良故事非同一般的特殊性，而把主人公思想行为的彻底性表现了。异在前者为

典型的议论推理，后者为饱含抒情、议论的叙事。详见练习二。

《克隆技术的伦理问题》

（一）指出本文各项推理论证的共同前提。

此前提为：克隆人也是人，一样是具有在特定环境下形成的特定人格，具有特殊心理、

行为、社会特征的人。详见练习一。

（二）本文运用反面例证的具体情况及其作用。

“辩护”全节及“反论证”节的前半部分均为反面例证。以反面例证为主，最后才推出

正面例证，各种可能情况特别是一般论证未予考虑的情形尽可能考虑了，使全文论证更加全

面、严密、彻底，结论显得更为雄辩。详见练习二。

（三）比较“反论证”节与《梁》文奈良故事节表达方式的异同。

同在“非一般”和“彻底”：一般论证未予考虑的，反论证节涉及了，显示出论证的彻

底性；亦因奈良故事非同一般的特殊性，而把主人公思想行为的彻底性表现了。异在前者为

典型的议论推理，后者为饱含抒情、议论的叙事。详见练习二。

四. 课文讲解

（一）文章主旨

本文从两个角度具体分析了可不可以克隆人的问题，运用举例论证、道理论证的方法阐明不能克隆人的观点。

（二）文章思路

全文由三个小标题把文章分为四部分。

第一部分：通过介绍人是生物、心理、社会的集合体，说明所谓的“克隆人”是什么意思。

第二部分：反驳在伦理上可以克隆人的理由。

第三部分：辨析反对克隆人的理由。

第四部分：得出结论，在技术上可能做的克隆人，在伦理上不应该做。

（三）写作特点

1.本文结构清晰，层次感强。全文由三个小标题把文章分为四部分，按照“引论——本论——结论”的顺序结构全文。小标题概括了主要问题，使人对文章内容一目了然。

2.采取了正反论证，先从反面驳斥，接着从正面辨析。论证过程十分严密。本文的结论是通过多个具体推理、具体结论而最后得出的，即主编导读说的，对论题进行细致分析，层层演进，最后得出结论。而这些具体推理都涉及一个共同的大前提，即“克隆人也是人”，这就是对本题第一问的回答。而“克隆人也是人”，一样是具有特殊的心理、行为、社会特征的人，已在文章一开始的前头部分作了说明，因而作为已知判断成为后文各项推理的共同前提。

3. 作者善于运用设问句、反问句来加强论证力度。

（四）课后练习解答

第一题 “前提”是逻辑中的概念，是逻辑推理中作为推理依据的已知判断。推出某一结论可能涉及多个前提（多个已知判断）。

第一问为：“克隆人也是人”；如对“克隆人是为了进行研究”的驳斥，涉及一个大前提：克隆人也是人，又涉及一个前提：人应该受到尊重，不能强迫人做他不愿意做的事，所以克隆人一样应受到尊重，不能强迫克隆人当受试者。本文中绝大多数的具体推理都属于这样较简单的只涉及两个前提的推理。

第二问为：胡劝说钱访美，也涉及多个前提：1. 钱在国际上影响很大；2. 对推动中外交流有很大影响；3.改革开放的需要；4.今天，世界、中国、美国都在变，几十年前的事过去了就算了。其中第4前提是直接关系访美的，另三条关系出访但不一定去美国。钱直接回答的也是第4点，即他还记在心里，也就是推翻了这个前提。

第二题

作用：使论证更加全面、严密、彻底、雄辩。两种表达方式之同：因所议或所叙超出一般情形而显示出其彻底性：之异：一是典型的议论推理，一是饱含抒情、议论的叙事。

本文“反论证”一节，正、反面例证都有，而有了反面例证，其作用就是本题题干中说的“文章就会更全面、更雄辩”，并应加上：更严密，更彻底。但这要全文一起分析。本节是对克隆人的反论证，而本文的结论却是：不要克隆人（完整的提法为：发展克隆技术、不要克隆人的方针是正确的）。具体说，“对克隆人的反论证”一节的后半部分，即“对克隆人的根本性的反论证”四点为本文结论的正面例证。

第三题

关于克隆人问题，课文的观点和两则材料所表达的观点已非常明确。但此问题的有关资料很多，引发的联想也比较丰富。故本题可作锻炼思辨能力及辩论能力的项目，设立正、反方展开讨论。同时也可借此加深对本课推理特色的理解。一. 下列加点字的注音全都正确的一项是（ ）

A. 克隆（lún） 干涸（gù） 窥见（kuī） 满腹经纶（lún）

B. 惬意（qiè） 伦理（lóng） 褴褛（lǒu） 沽名钓誉（gū）

C. 迄今（qì） 坎坷（kǎn） 歼灭（qiān） 斗转星移（dǒu）

D. 会计（kuài） 奥秘（ào） 憎恶（wù） 惟妙惟肖（xiào）

二. 下列词语没有错别字的一项是（ ）

A. 痴心妄想 络绎不绝 雷历风行 闻名遐尔

B. 行云流水 欲擒故纵 五彩缤纷 星罗棋布

C. 不屑置辨 心驰神往 怨天忧人 汗牛充栋

D. 如愿以尝 依山傍水 赫然在目 名负其实

三. 依次填入下列句子横线处的词语，最恰当的一项是（ ）

①画家的心应该像一面镜子，永远把它所 事物的色彩射进来。

②平凡的人，好像都是一个 铸成的，太类似了！

③舜在 继位人时，十分注重接班人的群众基础。

A. 反映 模型 考察

B. 反应 模型 考查

C. 反应 模样 考查

D. 反映 模样 考察

四. 下列句子中加点的成语使用正确的一项是（ ）

A. 一浪高过一浪的涨价风潮，使杭州房地产成了炙手可热的话题。

B. “崇尚科学，反对迷信愚昧”图片展将伪科学的真面目暴露得淋漓尽致。

C. 在美伊战争中，最让全世界文史专家痛不欲生的是伊拉克国家博物馆惨遭洗劫。

D. 他在文学上的造诣很深，所以才能见仁见智，写出极有价值的文章来

答案： 一. D 二. B 三. A 四. B

课后反思：