基因与葡萄酒（精选8篇）
基因与葡萄酒 篇1
金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 是一种能够引起人和动物发病的重要致病菌, 广泛分布于自然界中, 如空气、土壤、水及物品上, 也经常存在于人和动物的皮肤以及与外界相通的腔道中[1]。金黄色葡萄球菌通过产生多种毒力因子导致机体发病, 并且致病力较强[2], 给金黄色葡萄球菌性疾病的预防和治疗带来了巨大的困难。目前, 金黄色葡萄球菌对多种抗生素具有耐药性, 并日趋严重, 极易引起爆发流行, 已被人们广泛关注。IsdE是金黄色葡萄球菌铁调节表面决定子 (Iron-regulated surface determinant, Isd) 系统中的重要成员, 在金黄色葡萄球菌转运铁离子过程中发挥着重要作用[3]。试验对IsdE全基因进行了克隆和表达, 以期为研究其结构和功能奠定基础。
1 材料
1.1 菌株、质粒
E.coli BL21宿主菌、金黄色葡萄球菌标准菌株Wood46 (S.aureus Wood46) 、原核表达载体pET32a (+) , 均由黑龙江省八一农垦大学生物工程实验室提供。
1.2 主要试剂及酶
内切酶NcoⅠ和XhoⅠ、Taq DNA聚合酶、T4连接酶、DL-2 000 Marker、蛋白Marker、Biospin质粒提取试剂盒、异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG) 、琼脂糖凝胶回收试剂盒, 均购自宝生物工程 (大连) 有限公司;其他试剂均为常规试剂。
2 方法
2.1 表达载体的构建
2.1.1 引物的设计
根据GenBank中的IsdE基因序列, 利用生物软件Vector NTI Suite7.0和Premier Primer 5.0设计1对扩增IsdE编码全基因的特异性引物, 并且在引物两端分别加上酶切位点NcoⅠ和XhoⅠ的碱基序列 (下画线所示) , 经分析后引物具有很好的特异性。引物序列为上游引物 5′-GACCATGGTGAGAAATGTTAAACAAATTAC -3′, 下游引物 5′-CACTCGAGTCAAACTTGGTTACCTCTCTT -3′。引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
2.1.2 目的基因的获得
采用蛋白酶方法提取金黄色葡萄球菌Wood46 株的基因组DNA, 并将其作为模板进行PCR扩增879 bp片段。PCR反应体系 (20 μL) :去离子水14.3 μL, 上、下游引物 (25 μmol/L) 各1 μL, DNA 模板0.5 μL, 2.5 mmol /L dNTP 1 μL, 10×PCR 缓冲液2 μL, 10 U/μL LA Taq DNA 聚合酶0.2 μL。反应程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 40 s, 55 ℃ 50 s, 72 ℃ 1 min, 共30个循环;72 ℃ 10 min。PCR反应结束后, 取3 μL 产物以1%琼脂糖凝胶进行电泳, 观察并记录结果。
2.1.3 酶切与连接及转化
将纯化的IsdE PCR产物和pET32a (+) 载体酶切, 酶切体系:10×NEB缓冲溶液5 μL, DNA 8 μL, 100×牛血清白蛋白 (BSA) 0.5 μL, NcoⅠ 1 μL, XhoⅠ 1 μL, ddH2O 34.5 μL, 混匀, 37 ℃水浴中酶切4 h。将纯化的酶切产物进行连接, 连接体系为溶液Ⅰ (Solution Ⅰ) 5 μL (含T4连接酶) , PCR产物4 μL, 载体11 μL, 最后16 ℃连接5 h。将上述连接产物加入感受态细胞 (E.coli BL21) 中按热休克方法进行转化。
2.1.4 表达载体的鉴定
取转化后的菌株培养12 h, 用Biospin 质粒提取试剂盒提取质粒。采用酶切、PCR及序列测定分析的方法对提取的重组质粒进行鉴定, 将鉴定正确的重组质粒命名为pET32a (+) -IsdE, 从而获得IsdE原核表达载体。
2.2 基因序列分析
将含有重组质粒pET32a (+) -IsdE的阳性菌邮寄至上海生工生物工程技术服务有限公司进行测序, 测序完毕后对目的基因序列进行比较分析。
2.3 重组IsdE蛋白的诱导表达
取构建的重组菌50 μL接种于含100 μg/mL氨苄西林的LB培养基中, 37 ℃培养至OD600值为0.4时, 加入终浓度为1 mmol/L 的IPTG诱导表达4 h;取1 mL菌液以10 000 r/min 离心3 min;弃上清液, 收集菌体, 用PBS缓冲溶液 (pH值为7.2) 洗涤沉淀1～2次;在沉淀中加入1×上样缓冲液90 μL和1 mmol/L 二硫苏糖酵 (DTT) 10 μL, 混匀, 煮沸5 min;同时以未诱导重组菌和诱导的pET32a (+) 空载体的重组菌作为对照;取10 μL蛋白浓缩液用于SDS-PAGE电泳分析。
3 结果
3.1 IsdE基因PCR扩增结果 (见图1)
1.IsdE的PCR产物;M.DL-2 000 Marker。
以金黄色葡萄球菌DNA为模板, 经PCR扩增得到1条特异条带, 扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析, 获得约900 bp的条带, 与预期片段大小相符。
3.2 重组质粒的鉴定结果
首先, 以pET32a (+) -IsdE 质粒为模板对其进行PCR鉴定, 结果获得了约900 bp的条带 (见图2) ;另外, pET32a (+) -IsdE 质粒采用NcoⅠ与XhoⅠ双酶切后, 经过琼脂糖电泳分析后得到约为900 bp和5 900 bp的2条带 (见图3) 。另外, 基因测序结果也表明目的基因插入正确, 说明本研究成功构建了重组质粒pET32a (+) -IsdE。
M.DL-2 000 Marker;1.PCR扩增结果。
M.DL-2 000 Marker; 1.酶切鉴定结果。
3.3 IsdE基因序列测序结果与分析
对鉴定正确的重组菌株进行测序, 结果显示IsdE片段大小为879 bp, 登录NCBI进行Blast比对, 结果显示目的基因与GenBank上4种金黄色葡萄球菌标准菌株 (Staphylococcus aureus MW2、Staphylococcus aureus RF122、Staphylococcus aureus N315、Staphylococcus aureus Newman) 的核苷酸和氨基酸之间的同源性均为98.0%以上 (见图4和图5) , 说明不同菌株间IsdE具有较高的同源性。
3.4 重组菌的表达结果
经过优化表达的重组菌在37 ℃培养至OD600值为0.5时, 加入终浓度为1 mmol/L 的IPTG诱导表达4 h, 目的蛋白表达量较好。SDS-PAGE电泳结果显示, 含有pET32a (+) - IsdE的重组菌经过诱导能够产生1条明显的蛋白质电泳带, 形成分子质量约为50.3 ku的目的蛋白 (见图6) , 与预测的重组蛋白IsdE大小相符, 但是与IsdE蛋白的理论值30.3 ku有些差异, 这是由于pET32a (+) 质粒本身带有His标签序列, 其编码的蛋白与目的蛋白融合表达的结果所致。经Gel-pro软件分析, IsdE蛋白含量约占总蛋白的27.68%。
M.蛋白质质量标准;1～5.重组菌[pET32a (+) - IsdE ]诱导表达4 h结果。
4 结论与讨论
金黄色葡萄球菌是典型的革兰阳性菌, 它不仅是污染食品和引起食物中毒的主要病原菌, 也是引起化脓性炎性反应、败血症及脓毒血症的病原菌[4]。金黄色葡萄球菌的致病机制比较复杂, 侵入机体后能够产生许多致病因子, 破坏寄主的免疫系统[5], 降低机体的免疫功能。在金黄色葡萄球菌中, 铁收集及运输系统Isd包括细胞膜转运体、细胞壁嵌合亚铁血红素结合蛋白、亚铁血红素/接联球蛋白受体、2个血红素加氧酶和细胞壁上的肽基转移酶作用底物肽基转移酶B。Isd 途径的确定为研究细胞壁在细菌的致病性上的作用以及寻找抵御抗性金黄色葡萄球菌的治疗方法提供了重要依据。金黄色葡萄球菌的Isd 基因座编码的很多分子参与金黄色葡萄球菌铁离子的摄取, 铁离子在金黄色葡萄球菌的生长繁殖过程中起关键作用[6,7]。因此, Isd系统的研究能够促进人们深入了解金黄色葡萄球菌铁离子的摄取机制, 也为金黄色葡萄球菌性疾病的预防和治疗提供了新的研究方向[3,7]。IsdE是Isd系统组成的重要成员, 在铁离子转运系统中发挥关键作用。为了研究IsdE蛋白的结构和功能, 试验根据GenBank中的IsdE基因序列设计1对扩增IsdE特异性引物, 以金黄色葡萄球菌Wood46菌株全基因组DNA为模板, PCR 扩增出IsdE基因片段, 大小为879 bp, 再将其经酶切与载体连接, 成功构建了原核表达载体pET32a (+) - IsdE, 再将其转化到感受态细胞中, 经IPTG诱导后成功表达了目的蛋白IsdE, 与预期大小一致。
参考文献
[1] ARCHER G L.Staphylococcus aureus: a well-armed pathogen[J].Clin Infect Dis, 1998, 26:1179-1181.
[2]NOVICK R P.Autoinduction and signal transduction in the regula-tion of staphylococcal virulence[J].Mol Microbiol, 2003, 48:1429-1449.
[3] MARESSO A W, SCHNEEWIND O.Iron acquisition and transport in Staphylococcus aureus[J].Bio Metals, 2006, 19 (2) :193-203.
[4] YUKIKO K, STRANGER J, TAEOK B, et al.Vaccine assembly from surface proteins of Staphylococcus aureus[J].PNAS, 2006, 103 (45) :16942-16947.
[5]SUTRA L, POUTREL B.Virulence factors involved in the pathogen-esis of bovine intramammary infections due to Staphylococcus aureus[J].J Med Microbiol, 1994, 40:79-89.
[6]SKAAR E P, HUMAYUN M, DEBORD K L, et al.Iron source pref-erence of Staphylococcus aureus infections[J].Science, 2004, 305 (5690) :1626-1628.
[7]BRAUN V.Iron uptake mechanisms and their regulation in patho-genic bacteria[J].Int J Med Microbiol, 2001, 291 (2) :67-72.
基因与葡萄酒 篇2
关键词：金黄色葡萄球菌;生物被膜;奶牛乳房炎;生物被膜相关基因
中图分类号： S852.61+1 文献标志码： A
文章编号：1002-1302（2015）04-0055-04
收稿日期：2014-04-15
基金项目：国家自然科学基金地区基金（编号：31260628）;塔里木畜牧科技兵团重点实验室开放课题（编号：HS201204）。
作者简介：贺建忠（1977—），男，内蒙古五原人，硕士，副教授，研究方向为临床兽医学。E-mail：talimuhe_he@126.com。
通信作者：白万胜，副教授，研究方向为临床兽医学。E-mail：bwsdky@126.com。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，SA）是奶牛乳房炎（bovine mastitis）的主要病原之一，防治困难，常给乳业造成巨大的经济损失。SA易形成生物被膜（biofilm，BF），BF对抗生素治疗以及宿主免疫均可产生较强的抵抗力，因此被认为是乳房炎发病机制中一个重要毒力因子[1-2]。生物被膜形成受多种基因调控，这些调控基因统称为生物被膜相关基因（biofilm-associated genes，BAGs）。例如icaA和icaD的表达可促进BF的形成[3]，icaR通过抑制ica的转录而抑制BF的形成。此外，rbf、bap、sarA、SigB和SasG等均可直接或间接调节BF的形成。
对于BF形成及BAGs分布多有报道，但对于BF形成和BAGs关系的研究却鲜有报道。为此，本研究以全国9个省（区）102株SA为研究对象，进行了BF及BAGs分布情况调查，旨在分析地域性差异，为SA性發乳房炎的进一步防治提供基础数据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌株背景 102株SA均分离自亚临床性乳房炎乳样。菌株为本实验室鉴定、保存。鉴定程序包括溶血性观察、革兰氏染色、触酶试验、凝固酶试验、生化鉴定及SA特异性基因nuc的PCR检测等。鉴定后的菌株在含20%甘油的 Luria-Bertani（LB）肉汤中于-80 ℃超低温冰箱中保存。
菌株分离自全国9个省（市、区），共102株，其中河北省37株、北京市14株、内蒙古自治区7株、甘肃省7株、宁夏自治区11株、新疆维吾尔自治区7株、河南省6株、上海市5株、广西壮族自治区7株。
1.1.2 主要试剂与仪器 胰蛋白胨大豆胨肉汤（TSB）、胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）、脑心侵液（BHI）琼脂/肉汤购自北京奥博星生物技术有限责任公司，细菌基因组DNA提取试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司，刚果红购自天津科密欧试剂有限公司，蔗糖购自天津市致远化学试剂有限公司，磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）和磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）分别购自国药集团化学试剂有限公司和北京化学试剂有限公司，琼脂糖、Taq mix和Marker购自北京艾德莱生物科技有限公司，引物由北京三博远志生物技术有限公司合成。
台式微量高速离心机（TG-16S）：四川蜀科仪器有限公司;气浴恒温振荡器（THZ-82A）：金坛市医疗仪器厂;数显电热培养箱（HPX-9052MBE）：上海博讯实业有限公司医疗设备厂;电泳仪（DYY-6D）：北京市六一仪器厂;凝胶成像分析系统（Tanon-4100）：上海天能科技有限公司;DNM-9602酶标分析仪：北京普朗新技术有限公司。
1.2 方法
1.2.1 BF检测 刚果红法（congo red agar，CRA）：将36 g蔗糖和0.8 g刚果红溶于1 L脑心浸液培养基（BHI）中，121 ℃高压灭菌15 min，倾倒平板（CRA平板），备用。挑取复苏后的单菌落接种于CRA平板，于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后观察菌落形态。凡粗糙、干燥、水晶样的黑色菌落均为生物被膜阳性株（biofilm-positive strains）;而红色的光滑型菌落为生物被膜阴性株（biofim-negative strains）。
半定量黏附试验（semi-quantitative assay，SQAA）：挑取复苏后的单菌落接种于BHI肉汤，37 ℃恒温振荡器中过夜培养。取过夜培养的BHI肉汤，用含20 g/L葡萄糖的BHI肉汤按1 ∶ 100的比例稀释。用微量移液器吸取200 μL稀释后的菌液转移到96孔板。每组设3个重复，以BHI肉汤作阴性对照。将96孔板置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h后，将96孔板中的液体移除，用PBS液清洗2遍，以除去剩余的浮游菌。倒置自然干燥后，加入100 μL 95%乙醇固定 5 min，再用100 μL 1%结晶紫染色5 min。染色后，用灭菌蒸馏水清洗3遍，以除去剩余的染液。自然干燥后，用酶标仪测定570 nm下的D值。凡D570 nm≥0.1的为生物被膜阳性株，D570 nm<0.1的为生物被膜阴性株。D值取3组的平均值。
nlc202309040444
1.2.2 BAGs检测 按照索莱宝细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提供的步骤进行。提取的DNA模板保存于-20 ℃冰箱中备用。8个生物被膜形成相关基因（icaA、icaD、icaR、sigB、sarA、bap、rbf、sasG）采用PCR法进行检测，引物序列、退火温度、产物大小及参考文献见表1。PCR反应体系（20 μL）分别含有1 μL上下游引物、7 μL ddH2O、10 μL Taq Mix和1 μL DNA模板。PCR反应条件如下：95 ℃ 预变性8 min;95 ℃ 变性30 s，相应的退火温度（表1）退火30 s，72 ℃ 延伸10 min，30个循环。含0.5 μg/mL溴乙锭（EB）的1.5%琼脂糖凝胶中电泳，PCR产物在凝胶成像系统中观察。
表1 引物设计
基因 引物序列（5′→3′） Tm
（℃） 目的片段长度
（bp） 参考文献
icaA CCTAACTAACGAAAGGTAG;AAGATATAGCGATAAGTGC 56 1 315 [4]
icaD ATGGTCAAGCCCAGACAGG;CGTGTTTTCAACATTTAATGCAA 56 198 [5]
bap CCCTATATCGAAGGTGTAGAATTG;GCTGTTGAAGTTAATACTGTACCTGC 60 971 [6]
icaR CAATAATCTAATACGCCTGAG;AGTAGCGAATACACTTCATCT 54 246 [5]
sarA TTTTTTTACGTTGTTGTGCATTAACA;CATTTAAACTACAAACAACCACAAGTTG 56 135 [7]
rbf ACGCGTTGCCAAGATGGCATAGTCTT;AGCCTAATTCCGCAAACCAATCGCTA 62 164 [8]
SasG CGGATCCGGTGTGACAATCAGTATGAC;CGGAATTCGCGACATTTATGTGGATACAC 55 937 [9]
2 结果与分析
2.1 BAGs的分布情况
BF相关基因广泛分布于乳房炎性SA分离株中，所有的102株SA至少携带1种BAG。相比较而言，同时存在7种基因的菌株最多，所有菌种阳性菌株Total（t）、CRA检测BF阳性菌株CRA（+）、SQAA检测BF阳性菌株SQAA（+）、CRA和SQAA检测均为阳性的菌株CRA（+）& SQAA（+）比例分别为66.7%、725%、65.3%、63.6%。其次，同时携带6种基因的菌株较多，且SQAA（+）和CRA（+）& SQAA（+）比例最高。所有被测菌株均未扩增出bap基因，因此没有同时存在8種被测基因的菌株。
本研究共检测了8种BF相关基因，出现的组合形式共20种，其中比例最高的是7种基因的组合，最少的仅有1种基因存在。最流行的组合是SigB-icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG，比例高达66.7%;SigB-icaR-icaA-sarA-rbf-SasG、SigB-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG、SigB-icaR-icaD-sarA-rbf-SasG、SigB、icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG、SigB-icaA-rbf-SasG的比例分别是6.9%、3.9%、2.9%、29%、2.0%、2.0%;其余组合均为1.0%，即组合形式仅出现1次（表2）。
表2 BF相关基因组合的流行情况
相关基因组合
SigB icaR icaA icaD sarA rbf SasG
比例
（%）
+ + + + + + + 66.7
+ + + - + + + 6.9
+ - + + + + + 3.9
+ + - + + + + 2.9
+ - - - - - - 2.9
- + + + + + + 2.0
+ - + - - + + 2.0
- + - - - - - 1.0
- - - - - + + 1.0
+ - - - - + - 1.0
+ - - + - + - 1.0
+ - - + - + + 1.0
+ + + - - + - 1.0
+ - - + + + - 1.0
- - + + - + + 1.0
+ - + - + + + 1.0
+ + + - + + - 1.0
- + + + - + - 1.0
+ + + + + - + 1.0
+ + + + + + - 1.0
2.2 BF的检测结果
由图2可以看出，河北省BF阳性株BAGs的比例均低于菌株总数。宁夏和甘肃BF阳性株BAGs的比例均高于或等于菌株总数，而且SQAA（+）和CRA（+）& SQAA（+）全部为100%，说明BAGs和SQAA+存在完全的一致性。除了北京市的icaD基因和内蒙古的icaR基因，这2个地区BAGs在SQAA（+） 和 CRA（+）& SQAA（+）中均高于或等于菌种总
数中的比例。新疆除SigB和rbf2个基因外，其他的变化趋势与河北相似。
由图3可以看出，河南BAGs在CRA（+）和菌株总数中的比例全部相同，BAGs在SQAA（+）和CRA（+）& SQAA（+）中的比例也全部相同。广西和上海BAGs在SQAA（+）和CRA（+）& SQAA（+）中均为100%，BAGs分布与BF形成表现出很好的一致性。就全国范围总体而言，CRA（+）中BAGs的比例均高于菌种总数和其他BF阳性株，说明CRA（+）在全国范围内与BAGs的符合度较高。
nlc202309040444
3 讨论
SA是引发临床型乳房炎和亚临床型乳房炎最主要的病原之一[10]，可降低牛奶质量，造成严重的经济损失，是影响奶业发展的主要问题[11]。SA具有多种毒力因子，其中BF形成被认为是引发慢性感染的主要原因[12]。BF的形成与BAGs的分布密不可分，本研究结果显示，BF阳性株均存在较高比例的BAGs，其中同时存在7种和6种被测基因的占有绝对优势。在20种流行组合中，最流行的组合是SigB-icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG，比例高达66.7%，其次是SigB-icaR-icaA-sarA-rbf-SasG（6.9%）、SigB-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG（3.9%）、SigB-icaR-icaD-sarA-rbf-SasG（29%）、SigB（2.9%）、icaR-icaA-icaD-sarA-rbf-SasG（2.0%）和SigB-icaA-rbf-SasG（2.0%）。以上结果表明，多种BAGs组合是我国乳房炎性SA流行的重要特征之一，同时这些基因可能在BF形成过程发挥重要作用。icaA和icaD共同表达增加N-乙酰葡糖胺转移酶活性，促进BF的形成[13]，而icaR可通过限制ica表达抑制BF的形成。SigB、rbf与SasG的表达能够促进BF的形成[14-16]，而SarA的表达能够限制BF的形成[17]，迄今，尽管bap基因表达能够促进SA在乳房内的黏附和BF的形成[18]，但是在本研究所有被测菌株中均未扩增出该基因，说明该基因在我国乳房炎性金黄色葡萄球菌BF形成和发病机制中居于次要地位。
不同地区BF形成与BAGs分布的一致性存在一定差别。广西、上海、北京、内蒙古、宁夏和甘肃7个省（市、区） BAGs分
布BF形成保持高度一致性，而河北、河南和新疆BAGs分布和BF形成的一致性相對降低，提示在BF形成和乳房炎发病机制中发挥重要作用的可能是本研究未检测的某些基因。具体到基因种类，rbf和SigB分布最广，在大多数省份均为100%，提示这2个基因在SA性乳房炎发病机制中可能发挥着重要作用。Rbf可抑制icaR的表达，能够间接激活icaADBC的表达，促进BF的形成，但是并不依赖于ica通路[16]。sigB能够促进不同毒力因子表达的调控，促进BF形成的同时能够调节抗生素耐药性[19]。因此，通过rbf和SigB基因功能调节入手，研究我国乳房炎性SA的致病机制，可能是一种新的思路。
综上所述，多种BAGs组合流行是我国乳房炎性SA流行的主要趋势，各地区金黄色葡萄球菌BF形成和BAGs分布存在一定的差异。
参考文献：
[1]Brady R A，Omay G A，Leid J G，et al. Resolution of staphylococcus aureus biofilm infection using vaccination and antibiotic treatment[J]. Infection and Immunity，2011，79（4）：1797-1803.
[2]Vergara-Irigaray M，Valle J，Merino N，et al. Relevant role of fibronectin-binding proteins in staphylococcus aureus biofilm-associated foreign-body infections[J]. Infection and Immunity，2009，77（9）：3978-3991.
[3]Manuela O F. Invasive potential of biofilm-forming staphylococci bovine subclinical mastitis isolates[J]. J Vet Sci，2011，12（1）：95-97.
[4]Vasudevan P，Nair M K，Annamalai T，et al. Phenotypic and genotypic characterization of bovine mastitis isolates of Staphylococcus aureus for biofilm formation[J]. Veterinary Microbiology，2003，92（1/2）：179-185.
[5]Chaieb K，Mahdouani K，Bakhrouf A. Detection of icaA and icaD loci by polymerase chain reaction and biofilm formation by Staphylococcus epidermidis isolated from dialysate and needles in a dialysis unit[J]. Journal of Hospital Infection，2005，61（3）：225-230.
[6]Cucarella C，Tormo M A，Knecht E，et al. Expression of the biofilm-associated protein interferes with host protein receptors of Staphylococcus aureus and alters the infective process[J]. Infection and Immunity，2002，70（6）：3180-3186.
[7]Rode T M，Langsrud S，Holck A，et al. Different patterns of biofilm formation in Staphylococcus aureus under food-related stress conditions[J]. International Journal of Food Microbiology，2007，116（3）：372-383.
nlc202309040444
[8]Cue D，Lei M G，Luong T T，et al. Rbf promotes biofilm formation by Staphylococcus aureus via repression of icaR，a negative regulator of icaADBC[J]. Journal of Bacteriology，2009，191（20）：6363-6373.
[9]李 麗，杨宏军，刘代成，等. 奶牛乳腺炎葡萄球菌生物被膜形成及相关基因分析[J]. 中国农业科学，2011，44（1）：160-166.
[10]Demon D，Ludwig C，Breyne K，et al. The intramammary efficacy of first generation cephalosporins against Staphylococcus aureus mastitis in mice[J]. Veterinary Microbiology，2012，160（1/2）：141-150.
[11]Graber H U，Pfister S，Burgener P，et al. Bovine Staphylococcus aureus：diagnostic properties of specific media[J]. Research in Veterinary Science，2013，95（1）：38-44.
[12]Valle J，Solano C，Garcia B，et al. Biofilm switch and immune response determinants at early stages of infection[J]. Trends in Microbiology，2013，21（8）：364-371.
[13]Atshan S S，Shamsudin M N，Karunanidhi A，et al. Quantitative PCR analysis of genes expressed during biofilm development of methicillin resistant Staphylococcus aureus （MRSA）[J]. Infection Genetics and Evolution，2013，18：106-112.
[14]Mitchell G，Brouillette E，Séguin D L，et al. A role for sigma factor B in the emergence of Staphylococcus aureus small-colony variants and elevated biofilm production resulting from an exposure to aminoglycosides[J]. Microbial Pathogenesis，2010，48（1）：18-27.
[15]Geoghegan J A，Corrigan R M，Gruszka D T，et al. Role of surface protein SasG in biofilm formation by Staphylococcus aureus[J]. Journal of Bacteriology，2010，192（21）：5663-5673.
[16]Lim Y，Jana M，Luong T T，et al. Control of glucose-and NaCl-induced biofilm formation by rbf in Staphylococcus aureus[J]. Journal of Bacteriology，2004，186（3）：722-729.
[17]Reyes D，Andrey D O，Monod A，et al. Coordinated regulation by AgrA，SarA，and SarR to control agr expression in Staphylococcus aureus[J]. Journal of Bacteriology，2011，193（21）：6020-6031.
[18]Latasa C，Solano C，Penadés J R，et al. Biofilm-associated proteins[J]. Comptes Rendus Biologies，2006，329（11）：849-857.
[19]Pfrtnera H，Burian M S，Michalik S，et al. Activation of the alternative sigma factor SigB of Staphylococcus aureus following internalization by epithelial cells：an in vivo proteomics perspective[J]. International Journal of Medical Microbiology，2014，304（2）：177-187.
基因与葡萄酒 篇3
关键词：金黄色葡萄球菌,耐药性,耐药基因
金黄色葡萄球菌是一类重要的病原菌，与人类的关系非常密切。它属于葡萄球菌属（Staphylococcus）革兰阳性，能够引起多种严重的感染。正因为它在周围环境中存在的多少严重影响着人类的健康，因此对其临床方面的研究日渐突出[1]。临床上对病原菌耐药性进行研究意义重大，对于正确指导抗生素类药物的使用以及严格控制医院内部感染具有重要的指导意义。有研究表明，在医院内获得性感染的患者中，金黄色葡萄球菌是最为常见和最容易被分离得到的病原菌之一，且部分具有多重耐药性，给临床患者的治疗带来了很大的困难[2]。本研究对我院呼吸内科2010年11月至2012年11月感染金黄色葡萄球菌患者的临床资料进行了详细的回顾性研究，将分离到的菌株用全自动微生物分析仪进行菌株确认，采用微量肉汤稀释法进行耐药性分析并采用PCR方法分离耐药性基因。旨在为降低医院内金黄色葡萄球菌的感染率提供理论依据。现将研究结果报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料
我院呼吸内科2010年11月至2012年11月感染金黄色葡萄球菌的患者共100例，采用PCR方法对100株菌株的耐药性基因进行检测。其中，男性患者62例，女性患者38例。年龄在20～50岁，平均年龄为35岁。患者基本资料没有统计学差异（P>0.05）。分离耐药性基因所采用的100株金黄色葡萄球菌均来自我院呼吸内科100例感染患者，将分离、培养的菌株做低温冷冻保藏、待用。采用PCR方法对100株菌株的耐药性基因进行检测。
1.2 方法
耐药性检测方法：将分离的到的菌株用英国先德AutoReader全自动微生物分析仪进行菌株确认，避免出现同一患者的重复菌株。药物敏感试验采用微量肉汤稀释法。
耐药基因检测方法：采用蛋白酶K消化法提取菌株DNA，将纯培养菌挑出置于0.5mL离心管内，56℃下水浴2h, 95℃下水浴10min, 15000r/min离心30s，将上清液于-20℃下保存待用；耐药基因采用PCR方法分离；凝胶电泳后在成像系统下观察、拍照。
1.3 数据分析
用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析，计量资料以均数±标准差表示，组间比较采用卡方检验。剂量资料采用平均数标准差表示。两组不同时间点间的比较采用两组多因素水平重复测量的方差分析。P<0.05表明差异具有统计学意义。
2 结果
见表1。
3 讨论
金黄色葡萄球菌在革兰阳性菌中的分离率很高，它也是化脓感染中最常分离得到的病原菌，是医院内感染的主要病原菌之一。被金黄色葡萄球菌感染的患者病死率为27%，有时可能更高[3]。金黄色葡萄球菌的感染方式主要为内感染，由其产生的毒素以及酶是导致患者治病的主要原因。由于医院内大多数患者的免疫力都比较低，因此给金黄色葡萄球菌提供了可乘之机，这一点从医院各个科室都能分离得到该菌的结果不谋而合。金黄色葡萄球菌在医院各个科室的分离率不同，这和科室环境，患者疾病种类等原因有关，同时也和金黄色葡萄球菌的毒力和侵袭力有关[4]。有研究结果显示，ICU、呼吸内科等科室的金黄色葡萄球菌的分离率较高。重症监护病房由于是综合性医院中危重患者较为集中的病房，因此容易导致金黄色葡萄球菌在其内部的爆发性感染。金黄色葡萄球菌预防感染的主要方式有：第一，防止金黄色葡萄球菌污染食品。对于患有上呼吸道感染以及相关感染疾病的患者，暂停工作或暂时调换工作岗位，对于受到感染的食物如肉等应该除掉感染部位并经过高温消毒。第二，防止金黄色葡萄球菌肠毒素的生成。容易感染金黄色葡萄球菌的食物应保存在低温通风的环境中防止肠毒素的产生。第三，对于金黄色葡萄球菌菌体，应及时杀死。因为金黄色葡萄球菌的耐热性较强，因此应该适当的延长灭菌时间[5]。本研究中黄色葡萄球菌感染患者的主要年龄段为20～40岁左右，从性别的角度来看，男性感染者多于女性；耐药性研究表明，青霉素的耐药率高达99%；苯唑青霉素、四环素、庆大霉素和红霉素的耐药率也都达到90%或以上；此外，100株金黄色葡萄球菌中，耐药性基因的检出率高达90%，其中多数为qacA基因。从结果上来看，医院呼吸内科病房内细菌的耐药性问题非常严重，应该引起足够的重视。为了有效控制耐药菌株的产生，应当合适的使用抗生素并做好隔离措施。金黄色葡萄球菌的感染患者不仅局限于老年人，青壮年同样是易感群体。从科室角度来看，ICU依然是金黄色葡萄球菌分离率最高的区域，应该引起足够的重视。临床上应该根据科室的情况结合本研究中耐药性和耐药基因的研究选取合适的消毒剂种类，减少耐药性消毒剂的使用，降低医院内耐药菌株的产生，最大限度的避免院内感染。
参考文献
[1]Ito T, Katayama Y, Asada K, et al.Structural comparison of three typesof staphylococcal cassette chromosome mec integrated in the chrom-osome in methicillin resistant Staphylococcus aureus[J].AntimicrobAgents Chemother, 2001, 45 (5) :1323-2336.
[2]Wisplinghoff H, Rosato AE, Enright MC, et al.Related clones containingSCCmec type IV predominate among clinically significant staphylo-coccus epidermidis isolates[J].Antimicrob Agents Chemother, 2003, 47 (11) :3574-3579.
[3]孙光明, 马筱玲, 戴嫒嫒.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌SCCmec基因分型的研究[J].中国抗生素杂志, 2006, 31 (5) :287-290, 302.
[4]张建敏, 王佳玲, 郭瑞霞, 等.859株临床常见病原菌分布及耐药性分析[J].中华医院感染学杂志, 2008, 18 (5) :716-718.
转基因葡萄酒是爱还是恨 篇4
当今世界,最有资格代表红葡萄酒品位的当首推法国产的葡萄酒。尤其是法国夏朗德地区出产的比诺葡萄酒更是闻名遐迩,备受葡萄酒爱好者的青睐。然而,自影片《另辟蹊径》将美国加里福尼亚州的葡萄酒产地栩栩如生地搬上银幕,推荐给大众以来,红葡萄酒便红得发紫,美国加州红葡萄酒更是人们争相抢购的“香饽饽”。在美国,它持续以年销售量增加1.4倍的好成绩称霸葡萄酒市场。
更令人惊讶的是,葡萄酒品酒大师们对加州葡萄酒的评价几乎众口一词、出乎意料地高。与法国的比诺葡萄酒相比,加州葡萄酒具有更柔润的口感。品酒大师托里芬女士这样说道:“加州葡萄酒的口感上乘是无与伦比的。人们用舌尖稍品一下,立刻就有一种赏心悦目、心旷神怡之感。任何人都无法抗拒它的诱惑力,都难以说半个‘不’字。”
加州葡萄酒之所以能在一夜之间成为众星捧月的佼佼者,一个关键因素是其原料——法国比诺葡萄做了转基因优化。在著名科学杂志《自然》上,曾全文发表了破译比诺葡萄完整遗传基因信息(即染色体)的最新成果。这篇论文的发表,使得全球的葡萄酒爱好者和品酒大师们感到茫然,甚至不知所措。特别是对那些视葡萄酒为生命的欧洲人来说,更是当头一棒。他们强调,葡萄的品种与生产地域之间有着相濡以沫的内在关系,打破植物原本存在的优秀结构,人为制造出更为可口的产品,对葡萄酒业来说,可能要冒重大风险,甚至会给葡萄酒文化带来巨大冲击。葡萄酒的品质,只能通过遗传基因的纯洁性来彰显。一些人士甚至试图组织抗议游行来发泄不满。
然而,被贬为“邪恶葡萄酒”的策源地——财大气粗的美国,却对各种说法不以为然,甚至不屑一顾。美国葡萄酒业界的大亨们,一如既往地全力支持DNA转基因葡萄酒的研发事业。审时度势,法国和意大利如今也对DNA葡萄酒转悲为喜,并对其光明前景充满信心,在政府投资的国家葡萄酒研究所不遗余力地工作。为达到继续称霸市场的目的,两国都正全力以赴地投入比诺葡萄遗传基因转换技术的研发,力争捷足先登,赶在美国前面。
法国葡萄酒魅力昭然若掲
迄今为止,还没有哪位品酒大师置疑过,法国的比诺葡萄是全球最优秀品种这一事实。所以说,若能破译比诺葡萄的遗传信息,就有可能大规模种植更具品位的葡萄,酿造更为上乘的葡萄酒。届时,其市场前景将十分的诱人。
然而,若想真正掌握葡萄的转基因知识和技术,并将其应用到具体操作上,也并非一桩易事。如果研究出来的品种虽好但病毒很强,则势必就要多喷洒农药,对环境造成污染和损害。所以在研究时,必须兼顾农业法制定的环境条款,在尽可能减少农药量的前提下,达到事半功倍之目的。令人欣喜的是,充满神秘色彩、结构极其复杂的比诺葡萄的魅力之谜终于昭然若揭。
闻名遐迩的法国比诺葡萄酒之所以能香漂四海,历久不衰,一个极其重要的原因便是,用于酿造比诺葡萄酒的葡萄拥有多达89个遗传因子。若想解剖它,就必须首先弄清楚其中的遗传因子分别都起着什么样的作用,即各自都在发挥着什么机能。只有破译其基本密码,才能设法使葡萄的特定性质得到深入解剖,而应用转基因操作技术则是唯一可行的有效途径。通过研究,人们发现,法国比诺葡萄中存在43种与健康相关的遗传基因,其中有一种遗传基因与某种抗氧化物质“白菊芦”的生成直接相关。若将这种遗传基因通过人工手段移植到其他品种内,则比诺葡萄以外的红葡萄酒也就可能像法国比诺葡萄酒那样,甚至会青出于蓝而胜于蓝,拥有更高的健康价值和诱惑力。经过转基因操作的法国比诺葡萄,在地球上的任一角落都能生根开花结果,且不受品种和产地的制约和影响。
转基因葡葡酒爱恨交加
为提高葡萄酒的纯香浓度,并使之大大超过法国的比诺葡萄酒,遗传基因的操作至关重要。实际上,在北美,任何一种农作物的遗传基因转换几乎都无章可循。部分葡萄酒生产者在对葡萄种子实施转基因操作的同时,还利用酵母来改良品种。施加酵母的种子其发酵的速度加快,能降低培育成本。然而,美国人的这种揠苗助长的做法,在法国和意大利却是严格禁止的。
专家指出,专门生产转基因葡萄酒的生产者之所以还没形成规模化的进出口业务,究其原因,主要是该项产业尚未成熟。葡萄的品种和产地以及葡萄酒的质量和品位参差不齐,再加上褒贬不一的社会舆论以及消费者的拒绝接受等原因,都是未能全面开拓市场的重要因素。“法国比诺葡萄的热衷者们实际上打心眼里讨厌和排斥这经转基因葡萄酒,又找不出更有说服力的理由。”加州大学巴克莱学院葡萄栽培和葡萄酒酿造系的麦莱迪斯教授一语道破了玄机。
由于在某些转基因葡萄的生产基地只有两三名生产者在从事DNA葡萄酒的生产,广大消费群体担心这些游兵散勇的生产者会给产品造成污染,致使某些地区的葡萄酒严重滞销,甚至根本卖不动。转基因食品的健康指数公示业务尤其在北美根本形同虚设。所以,面对用转基因技术生产出来的葡萄酒,消费者只能莫衷一是或持顺其自然的态度。
既然转基因葡萄酒对某些消费者来说形同雾里看花或大逆不道,那么,是谁打开了转基因葡萄酒这扇禁门?
迄今为止,几乎还没有因北美的葡萄酒生产者使用转基因技术并施加了酵母而引发抗议和排斥事件,但对其始终耿耿于怀的仍大有人在。向来对转基因作物持高度警惕和排斥立场的欧洲并没有放松警惕,甚至变本加厉。许多科学家也因为对自古以来即公元4 000多年前的纯葡萄酒饮料和其他农作物等情有独钟,而在是否支持转基因葡萄酒的立场上态度暧昧、摇摆不定。有的人甚至将其视为洪水猛兽。
基因与葡萄酒 篇5
1 材料与方法
1.1 菌株来源
84株金葡菌均为我科2008年1月~2009年1月从临床标本中分离的菌株,分别来源于痰液、脓液、血液、分泌物、腹腔引流物、肾囊肿穿刺液、胸腔积液、脓疱液、疱液、导管下段及导管尖端,经美国DADE-BERING公司Walk Away-40全自动微生物分析仪鉴定核实为金葡菌。
1.2 细菌鉴定质控菌株
金葡菌ATCC25923,购于卫生部临床检验中心。
1.3 仪器与试剂
Walk Away-40全自动微生物分析仪(美国DADE-BERING公司产品),PCR仪(美国Eppendorf公司产品),测序仪(美国ABI公司),凝胶成像仪(美国FOTODYNE),电泳仪(瑞典Phermacia公司)。PCR试剂购于上海生工生物工程有限公司。
1.4 引物设计
根据Gen Bank中已发布的基因序列,利用Primer Premier 5.0软件及参考文献[2]设计mec A基因、TSST-1基因、PVL基因引物,扩增产物预期长度分别为892 bp、578 bp和578 bp,由上海生工生物工程有限公司合成。
mec A:P1 5'-GCC GTA GTT GTC GGG TTT GG-3',P25'-GGC GGA TGT GCG ATT GTA TTG C-3'。
PVL:P1 5'-GTG ATG GCG CTG AGG TAG TC-3',P25',-GCT GGG GGT AAT TCA TTG TCT G-3'。
TSST-1:P1 5'-GCT ATC GTA AGC CCT TTG TTG C-3',P2 5'-GCT GGA TCC GTC ATT CAT TGT T-3'。
1.5 细菌DNA的提取
将冰冻保存的84株实验菌株用胰酶大豆肉汤复苏、转种哥伦比亚羊血琼脂培养基。用接种环挑取24 h培养的单个菌落,置于100μl裂解液(1 mol/L Na OH+20 g/L SDS)中,100℃水浴30 min,冷却后用等量的1 mol/L盐酸中和,离心10 min(13 000 r/min)去沉淀,再用乙醇沉淀DNA(加入400μ无水乙醇),混匀后-20℃冰冻30 min,13 000 r/min离心15 min,弃上清。加入70%乙醇200μl,静置5 min,13 000 r/min离心5 min,吸干上清液,完全晾干沉淀后,用30μl双蒸水溶解DNA,作为PCR扩增模板。
1.6 多重PCR扩增体系及反应条件
把3对引物放入同一反应体系建立多重PCR。PCR体系:采用20μl反应体系,模板1μl,起始引物和终末引物各1μl,d NTP 1.5μl,Taq酶0.2μl,10×Buffer 2μl,Mg2+2μl,双蒸水11.3μl。PCR反应条件:94℃预变性4 min,然后进入循环,94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸150 s,共进行35个循环,最后72℃延伸15 min,PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳,然后在溴化乙锭溶液中染色20 min,清水冲洗后用凝胶成像系统观察结果。
1.7 序列测定
将PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序,结果与Gen Bank中的核苷酸序列进行同源性比较。
2 结果
2.1 多重PCR扩增产物的电泳分析
84株金葡菌中检出mec A基因阳性49株,检出率为58.3%;检出PVL基因20株,占临床分离株的23.8%,其中,MRSA为13株(13/49,26.5%),MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因阳性菌株。部分菌株的PVL基因PCR扩增结果见图1。
(1~6、9~11泳道为PVL基因阴性菌株;7、8泳道为PVL基因阳性菌株;M:PCR marker)
2.2 PVL基因阳性金葡菌的分布特点
PVL基因阳性的分离株中,有7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离自血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液。
2.3 测序结果的分析
将测序结果与Gen Bank中的已有序列进行比较,同源性为100%。
3 讨论
最近,国内学者报道葡萄球菌已是医院感染分离率最高的细菌,其中MRSA占较高的比例[3]。近年来,其临床分离率呈明显上升趋势,因具有多重耐药特征和携带多种毒力因子(如PVL、TSST-1、SEC等)已成为临床治疗的难点。笔者对我院金葡菌感染情况分析发现,我院MRSA感染占58.3%,MSSA占41.7%,明显高于马筱玲等[4]报道的MRSA检出率(42%),说明我院MRSA感染率较高,并且多为院内感染,应引起临床重视。MRSA的甲氧西林耐药决定簇(mec A)位于SCCmec盒上,该结构类似于转座子,可以介导mec A基因游离传播,使敏感的金葡菌获得甲氧西林耐药;同时SCCmec盒还可以整合许多其他耐药基因。因此,MRSA菌株常表现为多重耐药。MRSA的产生还与临床上抗生素的不合理应用有密切关系。
PVL是金葡菌产生的一种外毒素,该毒素特异性地吸附并作用于白细胞,改变白细胞的通透性,造成大量白细胞损伤,丧失吞噬能力。同时,由于白细胞的破坏,处理抗原和呈递抗原信息的能力下降,损害了机体的防御屏障和免疫应答,从而不能建立有效的特异性免疫。近年来由产PVL金葡菌所致感染而导致死亡病例逐渐增多,尤其是携带PVL基因的MRSA[5]。本研究结果显示,84株金葡菌中PVL基因阳性的检出率为23.8%,明显高于闫中强等[6]报道的PVL基因检出率(15.7%)。20株PVL阳性菌株中,7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离直血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液,说明不同临床标本中都可能检出PVL阳性的金葡菌,PVL阳性的金葡菌主要造成化脓性感染、肺部感染、血液感染及尿路感染。PVL基因阳性菌株在MRSA中的分离率高于MSSA,PVL基因阳性的MRSA具有多重耐药性且携带PVL,其毒性强,有一定的致死性,将会给患者带来严重的后果。
TSST-1是金葡菌产生的一种产热毒素,作为超抗原,TSST-1与MHC-Ⅱ类分子结合,作用于T细胞受体,使其大量增殖,并产生白细胞介素-1、白细胞介素-2及干扰素等多种细胞因子,是引起中毒性休克的主要原因[7]。本研究对84株金葡菌进行检测,未检出TSST-1基因,可能与感染类型不同、其金葡菌携带的毒素基因不同有关。
摘要：目的:了解金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)耐药基因及所携带致病毒素基因PVL与TSST-1的特点。方法:应用多重PCR法检测mecA基因、TSST-1基因及PVL基因。结果:84株金葡球经多重PCR法对其mecA基因进行检测,检出率为58.3%(49/84)。PVL基因阳性菌株的分离率为23.8%(20/84),PVL阳性的MRSA为13株(13/49,26.5%),PVL阳性的MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因。结论:金葡菌的耐药性呈上升趋势,且金葡菌可产生多种毒素,在分离金葡菌的同时,应加强其耐药基因及毒素基因的检测。
关键词：金黄色葡萄球菌,中毒休克综合征毒素-1基因,杀白细胞毒素基因
参考文献
[1]Becker K,Friedrich AW,Lubritz G,et al.Prevalence of genes encoding pyrogenic toxin superantignes and exfoliative toxins among strains of staphylococcos aureus isolated from blood and nasal soecinens[J].J Clin Microbiol,2003,41(4):1434-1439.
[2]Yamasaki O,Kaneko J,Morizane S,et al.The association between staphylococcos aureus strains carrying panton-valentine leukocidin genes and the development of deep seated follicular infection[J].Clin In-fect Dis,2005,40(3):381-385.
[3]姚春艳,府伟灵.葡萄球菌医院感染的耐药性分析[J].中华医院感染学杂志,2004,14(1):104-106.
[4]马筱玲,孙光明,戴媛媛,等.金黄色葡萄球菌耐药性监测[J].临床输血与检验杂志,2007,9(1):18-20.
[5]Lopez-Aguilar C,Perez-Roth E,Moreno A,et al.Association between the presence of the panton-valentine leukocidin-encoding gene and a lower rate of survival among hospital pulmonary patients with staphylo-coccal disease[J].J Clin Microbiol,2007,45(1):274-276.
[6]闫中强,沈定霞,罗燕萍,等.多重PCR检测临床分离金黄色葡萄球菌Luks/PV基因和mecA基因[J].中国感染与化疗杂志,2008,8(4):255-259.
基因与葡萄酒 篇6
关键词：金黄色葡萄球菌,葡萄球菌肠毒素B,聚合酶链反应
金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus,SA)是目前细菌性食物中毒和人类化脓性感染中最常见的病原菌之一,该菌产生的葡萄球菌肠毒素(staphylococcal enterotoxins,SEs)是引起食物中毒的主要原因。在美国,由SEs引起的食物中毒占细菌性食物中毒的33%,加拿大则更多,占45%[1],我国每年发生的此类食物中毒事件也很普遍。近年来,SEs除了SEA、SEB、SEC、SED、SEE 5种传统的血清型外, 还发现了SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK等新型的肠毒素[2,3]。以SEA 引起的食物中毒最多见,SEC和SED 次之,SEB 在医院感染分离的金黄色葡萄球菌中多见。SEB因其“超抗原”特性以及在中毒休克综合征中的特殊意义而倍受关注。近年发现,造成医院感染的耐青霉素金黄色葡萄球菌,80%以上产生SEB,个别医院分离株几乎100%产肠毒素[2,4]。对于SEs的检测[5],目前主要依靠免疫学的方法,但其特异性和敏感性较差,已不能满足公共卫生检测的需要,随着聚合酶链反应(PCR)技术的出现,已有较多利用PCR技术检测SEs的报道[6,7]。我们以葡萄球菌肠毒素B(staphylococcal enterotoxin B,SEB)基因为检测靶基因,旨在建立快速、灵敏、特异地检测SEB的PCR方法,现报道如下。
1 材料及方法
1.1 菌株来源
阳性对照菌株:产SEB金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC 14458)购自中国药品生物制品检测所。9株阴性对照菌株:大肠埃希菌、沙门菌、志贺菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、小肠结肠耶尔森菌、空肠弯曲菌、溶血性链球菌、非产肠毒素金黄色葡萄球菌均为本实验室保存菌株。
1.2 主要试剂
DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit)为北京天根公司产品,Premix Taq PCR试剂为宝生物工程(大连)有限公司产品,琼脂糖凝胶为英国Oxioid公司产品,5×TBE为生工生物工程(上海)有限公司产品,GelRed染料为美国Biotium公司产品,600 bp DNA Marker B(100bp Ladder,100 bp-600 bp)为美国Bio Basic公司产品.所有试剂均在有效期内使用,其配制严格按使用说明进行。
1.3 主要仪器
梯度PCR扩增仪C1000-SERIES(美国Bio Rad公司),核酸蛋白电泳系统(美国Bio Rad公司),GDS8000凝胶成像系统(基因公司)。
1.4 方法
1.4.1 引物设计与合成
引物序列,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成和纯化,各引物序列见表1。
1.4.2 模板DNA的提取
将阳性对照菌株和9株阴性对照菌株分别接种于营养肉汤增菌液中,37 ℃恒温培育16～18 h,取1 ml增菌液10,000 min离心1 min(RCF=9391),菌沉淀加入20 mg/ml的溶菌酶溶液180 μl,37 ℃处理45 min,其余步骤按TIANamp Bacteria DNA Kit试剂盒说明书进行,最后加200 μl TE洗脱DNA收集备用。
1.4.3 PCR反应体系
PCR反应体系体积为20 μl,其中模板DNA 2.0 μl,相应的上、下游引物(20 UM) 各0.2 μl,Premix Taq 10 μl,ddH2O 7.6 μl,轻弹混匀,稍微离心后放入PCR仪内进行PCR扩增反应,反应条件为:①95 ℃ 10 min;②95 ℃30 s;③54 ℃30 s;④72 ℃30 s;⑤72 ℃10 min,其中②～④步循环40次。
1.4.4 扩增产物的电泳检测
取0.9 g琼脂糖凝胶粉末与60 ml TBE缓冲液混合,于微波炉上加热煮沸,冷却至60 ℃左右加入GelRed 6 μl制备成1.5%的琼脂糖凝胶。取5 μl扩增产物与1 μl 6×loading buffer混匀后点样于琼脂糖凝胶中,于1×TBE电泳缓冲液中以70 V电泳70 min后放于凝胶成像系统中成像,观察PCR扩增产物有无预期大小的目标DNA片段(494 bp)。
1.4.5 特异性分析
将阳性对照菌株、阴性对照菌株按上述方法进行DNA提取、PCR扩增及电泳检测分析。
1.4.6 灵敏度分析
产SEB金黄色葡萄球菌标准菌株(ATCC14458),37 ℃培养16～18 h,增菌液用无菌水作10倍梯度稀释,平板菌落计数得知各梯度浓度为2.6×104、2.6×103和2.6×102 CFU/ml,分别用上述方法进行DNA提取、PCR扩增及电泳检测分析。
1.4.7 SEB基因情况分析
PCR检测本实验室保存的30株金黄色葡萄球菌SEB基因。30株菌株中分离自食物中毒患者的吐泻物10株,分离自市场采样检测食品16株,分离自医院(物体表面)消毒检测样品4株。
2 结果
2.1 SEB基因PCR扩增产物的电泳图谱及特异性分析结果
见图1。
注:SEB—葡萄球菌肠毒素。M:DNA marker(100 bp Ladder,100～600 bp);1:产SEB金黄色葡萄球菌;2:空白对照;3:大肠埃希菌;4:沙门菌;5:志贺菌;6:副溶血性弧菌;7:霍乱弧菌;8:小肠结肠耶尔森菌;9:空肠弯曲菌;10:溶血性链球菌;11:非产肠毒素金黄色葡萄球菌
图1结果显示,产SEB金黄色葡萄球菌PCR扩增产物有494 bp大小的目的DNA片段,9株对照菌PCR扩增产物未出现任何条带。SEB基因PCR引物只对产SEB金黄色葡萄球菌出现PCR阳性扩增反应,显示了良好的特异性。
2.2 产SEB金黄色葡萄球菌不同菌浓度SEB基因PCR扩增产物的电泳图谱
见图2。
注:SEB—葡萄球菌肠毒素。M:DNA marker(100 bp Ladder,100～600 bp);1:菌液浓度为2.6×104 CFU/ml;2:菌液浓度为2.6×103 CFU/ml;3:菌液浓度为2.6×102 CFU/ml
及灵敏度分析结果
图2结果显示,在菌液浓度分别为2.6×104 CFU/ml、2.6×103 CFU/ml时PCR扩增产物有预期大小的目标DNA片段(494 bp),在菌液浓度分别为2.6×102 CFU/ml时,PCR扩增产物无预期大小的目标DNA片段(494 bp)。
2.3 产SEB金黄色葡萄球菌不同菌浓度SEB基因PCR扩增产物灵敏度分析
见表1。
注:①PCR反应结果:未扩增出494 bp目标DNA片断为阴性;扩增出494 bp目标DNA片断为阳性。②试验中,取1 ml菌液进行DNA提取,DNA最终溶解于200 μl缓冲液TE中,PCR时取2 μl DNA作为模板,PCR反应体系中金黄色葡萄球菌菌落数=菌液浓度×增菌液体积×DNA模板体积/缓冲液TE体积。SEB—葡萄球菌肠毒素B。
2.4 30株金黄色葡萄球菌SEB基因携带情况
分离自市场采样检测食品的金黄色葡萄球菌SEB基因携带率高,为12.5%。见表2。
注:SEB—葡萄球菌肠毒素B。
3 讨论
在《WS/T 80-1996 葡萄球菌食物中毒诊断标准及处理原则》中规定,分离的金黄色葡萄球菌必须进行SEs的检测,且SEs为同一型别时才能作为引起食物中毒的病原学诊断依据。以往对于金黄色SEs的检测,主要用免疫学方法,但常出现假阳性或假阴性的结果,因为有些菌株虽然含有毒素基因,但基因表达不好,或是缺乏稳定的遗传成分,这就容易出现假阴性。有些菌株的血清型容易产生交叉反应,因而又常常出现假阳性[7]。为满足食物中毒快速检测的需要,很多实验室采用了PCR方法检测SEs。PCR检测金黄色SEs基因的方法具有快速、准确、灵敏度高、特异性好,具有广泛的应用前景。
本研究针对SEB基因进行检测,特异性好,可排除其他常见食物中毒病原菌的干扰,灵敏度高,菌浓度为2.6×103 CFU/ml,PCR反应体系中仅有26 CFU的金黄色葡萄球菌既可检出,快速,整个检测从模板制备到PCR产物分析只需4 h左右,为产SEB金黄色葡萄球菌引起的食物中毒和医院感染的快速查因及流行病学调查提供了可行的方法。
参考文献
[1]高涛.食品中金黄色葡萄球菌肠毒素及检验方法的研究进展[J].福建分析测试,2003,12(2):1775-1778.
[2]雷祚荣.葡萄球菌毒素和葡萄球菌毒素病[M].北京:中国科学技术出版社,1992,120-140.
[3]Zschock M,Kloppert B,Wolter W,et al.Pattern of enterotoxin genesseg,seh,sei and sej positive Staphylococcus aureus isolated from bovinemastitis[J].VetMicrobiology,2005,108:243-249.
[4]陈国兵,唐朝晖.金黄色葡萄球菌肠毒素B研究进展[J].微生物学免疫学进展,2008,36(1):59-63.
[5]向阳.食品中金黄色葡萄球菌及其肠毒素的检测方法[J].中国食品学报,2002,2(2):57-61.
[6]杨玉军,黄韦唯,王志云,等.多重PCR快速检测金黄色葡萄球菌四型肠毒素基因的研究[J].现代预防医学,2009,36(9):1713-1715.
基因与葡萄酒 篇7
应用于生产中的α-葡萄糖苷酶主要来源于真菌, 真菌的发酵周期较长, 酶的产量和特性也不易控制。因此, 构建和利用基因工程菌作为大规模生产该酶制剂的宿主, 成为研究该酶的一种新途径。A Martino[4]等从Sulfolobus solfataricus MT-4菌株总DNA中通过PCR将α-葡萄糖转苷酶基因克隆到E.coli中。Akira N[5]等利用合成探针从Aspergillus niger GN-3中克隆出α-葡萄糖转苷酶基因 (胞外酶) , 将该基因引入到Aspergillus nidulans。Amaud Galichet[6]等从Thermococcus hydrothermalis AL662菌株中, 通过建立基因文库, 克隆了α-葡萄糖转苷酶基因, 将该基因克隆到S.cerevisiae突变株TCY70中。Aspergillus niger (CU-1) 是作者实验室自主筛选得到的一株优秀菌株[7], 其所产的胞内α-葡萄糖苷酶具有很高的转苷活性, 其作用于淀粉糖化液生成的低聚异麦芽糖的产率高达88%以上, 远高于目前国内同类报道。本文对该菌株的α-葡萄糖苷酶基因进行克隆和序列分析, 以及α-葡萄糖苷酶真核表达载体的构建, 为其分子水平的研究提供重要依据和该酶在真核宿主中的高效表达研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 菌种与质粒
Aspergillus niger (CU-1) 菌株和大肠杆菌DH5α为作者实验室保存。真核表达载体pGAPZαA由湖南农业大学生科院张学文教授惠赠, pMD-18T simple vector购自大连宝生物公司。
1.1.2 酶和化学试剂
pfu酶购自捷瑞生物工程有限公司;rTaq酶、T4 DNA连接酶、XhoⅠ酶和NotⅠ酶购自MBI公司;Marker λDNA/HindⅢDNA购自大连宝生物公司;抗生素Zeocin购自Sigma公司、氨苄青霉素、IPTG、X-gal、DEPC均购自上海生工公司;AMV逆转录酶购自Promega公司;RNA提取试剂盒为购自华美生物工程公司;PCR产物纯化试剂盒、凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司, 其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 培养基
PDA培养基 (马铃薯200g/L、葡萄糖18g/L) 用于黑曲霉A.niger (CU-1) 的活化;麸皮培养基 (麸皮30g/L, 淀粉20g/L, 麸皮煮沸40min, 然后用4层纱布过滤, 冷却后加入淀粉, 溶解后加水补足至1L) 用于黑曲霉A.niger (CU-1) 诱导表达α-葡萄糖苷酶;LB培养基 (酪蛋白胨10g/L, 酵母抽提物5g/L, NaCl 10g/L, pH7.0) 用于大肠杆菌的培养, 培养基中加氨卞青霉素终浓度为100μg/mL;低盐LB培养基 (酪蛋白胨10g/L, 酵母抽提物5g/L, NaCl 5g/L, pH 7.5) 用于大肠杆菌的培养, 培养基中加抗生素Zeocin终浓度分别为50μg/mL。
1.2 实验方法
1.2.1 Aspergillus niger (CU-1) 菌株的诱导培养及样品处理
将保存的Aspergillus niger (CU-1) 菌株在PDA斜面培养基上活化, 30℃培养4d, 用10mL无菌水洗涤孢子, 接种于100mL麸皮培养基中, 30℃、140r/min 摇床培养3.0d。将培养基内液体小心倒掉, 留下白色的菌体, 用PBS缓冲液和无菌水反复冲洗。冲洗完后室温抽滤10min左右, 至水分完全抽干。然后分装0.1g/份, 装入离心管中, 立即投入液氮中速冻, 移入-80℃超低温冰箱中保存备用。
1.2.2 Aspergillus niger (CU-1) 菌株总DNA和总RNA的提取
将超低温冰箱中保存的菌体取出, 在液氮中研磨后, 采用CTAB法[13]提取菌株的总DNA, 按照RNA提取试剂盒推荐方法提取总RNA。
1.2.3 RT-PCR合成目的基因
在Oligo (dT) 18引物引导下通过逆转录合成cDNA第一链, 冰上取4μl总RNA, 加入Oligo (dT) 18引物2μl, DEPC-H2O 4μl, 70℃加热5min, 于冰上加4μl 5×RT buffer, 1μl RNase抑制剂, 2μl dNTP (2.5mmol/L) , lμl M.MLV逆转录酶 (200U/μl) , 42℃反应60min后, 再70℃加热10min停止反应。
以GenBank中编号为D451796的α-葡萄糖苷酶基因为模板设计合成一对PCR引物[8]:SP1: 5′-CCGCTCGAGATGGCCGGTCTAAAAAGCTTCCTTGCCAGTTCT-3′, SP2:5′-ATTTGCGGCCGCTCACCATTTCAGTACCCAGTCCTTCGCCCA-3′, 引物由上海生工公司合成。
以cDNA第一链为模板进行PCR扩增, PCR反应程序:先94℃ 4min预变性, 94℃ 1min, 63℃ 1min, 72℃ 5min进行30个循环后, 72℃延伸10min。PCR产物 (D2) 采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, 并用DNA产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。
1.2.4 以总DNA为摸板PCR扩增目的基因
以总DNA为模板, 引物 (SP1/SP2) 进行PCR扩增, PCR反应程序:先95℃ 5min预变性, 94℃ 1min, 61℃ 1min, 72℃5min进行30个循环后, 72℃延伸10min。PCR产物 (D1) 采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测, 并用DNA产物纯化试剂盒对PCR产物进行纯化。
1.2.5 基因测序分析[9]
将纯化的PCR产物D1、D2与pMD-18T simple vector连接, 转化E.coli DH5α感受态细胞, 用含X-gal、IPTG和氨苄青霉素的LB平板于37℃培养12～16h, 通过重组质粒双酶切筛选阳性重组子pMD-D1和pMD-D2。基因测序由上海生工公司, 测序后登录NCBI网站进行BLAST比对分析。
1.2.6 agdA的扩增
重新设计引物:
SP3:5′-CCGCTCGAGGCCGGTCTAAAAAGCTTCCTTGCCA-GTTCT-3′, SP4:5′-ATTTGCGGCCGCCCATTTCAGTACCCAGT-CCTTCGCCCA-3′, 不含起始密码子ATG 和终止密码子TCA。其余的操作与1.2.3 中的操作相同, 结果见图8。
1.2.7 真核重组表达载体pGAPZαA-agdA的构建[9]
用XhoⅠ和NotⅠ分别双酶切方法1.2.6中纯化的基因agdA和载体pGAPZαA, 然后回收目的片段和载体片段, 用T4连接酶连接进行定向克隆, 构建真核重组表达载体pGAPZαA-agdA, 并用双酶切鉴定阳性重组子。
2 结果与分析
2.1 Aspergillus niger (CU-1) 菌株总DNA和总RNA的提取
经过电泳检测 (见图1) , 可以看到完整的总DNA条带, DNA降解少, 质量好, 可用作PCR模板。经过电泳检测 (见图2) , 可以看到rRNA清晰的三条带:28S、18S和5.8S。RNA样品的OD260/OD280均值为1.8, 总RNA质量较好, 可满足RT-PCR实验要求。
2.2 Aspergillus niger (CU-1) 菌株基因agdA扩增和克隆
经0.8%琼脂糖凝胶电泳 (见图3、图4) , Aspergillus niger (CU-1) 菌株的总RNA为模板RT-PCR产物 (D2) 大小约为3.0kb, 以Aspergillus niger (CU-1) 菌株总DNA为模板的PCR产物 (D1) 大小约为3.2kb, 两者都与预期结果相符。将重组质粒pMD-D1和pMD-D2用XhoⅠ和NotⅠ分别双酶切 (见图5、图6) , 双酶切重组质粒pMD-D1得到3.2kb和2.7kb两个片段, 双酶切重组质粒pMD-D2得到3.0kb和2.7kb两个片段, 表明目的片段已克隆到了T载体上。
1-2:the total DNA;M:λDNA HindⅢMarker.
M:λDNA HindⅢMarker;1:PCR production (D2) .
M:λDNA HindⅢMarker;1:PCR production (D2) .
2.3 Aspergillus niger (CU-1) 菌株的agdA序列分析
经测序, Aspergillus niger (CU-1) 菌株的agdA大小为3 127bp, 含有3个外显子和4个内含子。该基因的cDNA序列 (见图7) 共有2 958bp, 包含完整的编码框, 编码985个氨基酸。序列在NCBI上经BLAST比对分析, 表明该cDNA序列与GeneBank中登记号为XM00182023的基因序列的同源性达到了99%, 证明所获得的cDNA序列确实为α-葡萄糖苷酶基因, 可以继续进行下面的研究。该cDNA序列与XM-00182023的基因序列比对有6个位置的碱基发生了变化, 第286位的碱基 (A→G) , 第495位的碱基 (T→C) , 第557位的碱基 (A→G) , 第840位的碱基 (C→T) , 第1249位的碱基 (T→C) , 第1834位的碱基 (T→C) 。
1:pMD-D1 XhoⅠ+NotⅠ;M:λDNA HindⅢMarker.
1, 2:pMD-D2 XhoⅠ+NotⅠ;M:λDNA HindⅢMarker.
2.4 真核表达载体pGAPZαA-agdA的构建及鉴定
基因agdA的cDNA与载体pGAPZαA连接后构成真核表达载体pGAPZαA-agdA, 通过抗生素Zeocin筛选阳性重组子, 重组子经XhoⅠ和NotⅠ双酶切和EcoRⅠ单酶切, 电泳结果 (见图9) , 表明成功构建了含有基因agdA的真核表达载体pGAPZαA-agdA。
M:λDNA HindⅢ;1:RT-PCR production.
1-3:pGAPZαA-agdA XhoⅠ+NotⅠ;4-6:pGAPZαA-agdA EcoRⅠ;M:λDNA HindⅢ.
3 讨论
α-葡萄糖转苷酶是生产低聚异麦芽糖的关键酶, 在医学研究、临床诊断等领域具有重要的价值。国外研究者已经将研究方向转向基因工程方面, 国内相关报道较少。于岚[10]等克隆及表达黑曲霉α-葡萄糖苷酶基因;樊少华[11]等从中华蜜蜂克隆α-葡萄糖苷酶基因并对其序列分析;杨捷琳[12]等从阪崎肠杆菌中克隆α-葡萄糖苷酶基因, 重组到pET22b (+) 质粒在大肠杆菌中进行表达及活性研究。
Aspergillus niger (CU-1) 菌株其所产的胞内α-葡萄糖苷酶具有很高的转苷活性, 其作用于淀粉糖化液生成的低聚异麦芽糖的产率高达88%以上, 远高于目前国内同类报道。该菌株的α-葡萄糖苷酶基因是一个具有研究开发价值的特殊基因资源, 因此开展该菌的α-葡萄糖转苷酶基因方面的的克隆和表达的研究具有重要意义。本文对该α-葡萄糖苷酶基因序列进行分析为构建高产具有高转苷活性的α-葡萄糖苷酶的基因工程菌株奠定重要的理论基础。考虑到真核基因在原核系统中表达不能得到正确的修饰, 采用真核宿主系统进行表达可能会大大提高该外源蛋白的活性, 尝试通过构建真核表达载体pGAPZαA-agdA, 来实现α-葡萄糖苷酶在毕赤酵母中高效表达酶的工作还在进行中。
摘要：目的:Aspergillus niger (CU-1) 菌株α-葡萄糖苷酶基因 (agdA) 克隆并对其序列进行分析, 构建该基因的真核表达载体。方法:设计合成的一对特异性引物, 采用PCR以总DNA为模板, 扩增得到DNA片段 (D1) ;采用RT-PCR方法扩增得到DNA片段 (D2) 。将DNA片段D1和D2转入大肠杆菌中并进行了序列测定, 序列进行BLAST比对分析。将α-葡萄糖苷酶基因的cDNA片段与表达载体pGAPZαA连接, 构建重组表达载体。结果:基因agdA大小为3 127bp, 含有3个外显子和4个内含子。该基因的cDNA序列大小为2 958bp, 包含完整的编码框, 编码985个氨基酸。agdA基因序列与已发表的α-葡萄糖苷基因序列同源性达99%, 其中有6个位置的碱基发生了变化。已成功构建重组表达载体pGAPZαA-agdA。结论:Aspergillus niger (CU-1) 菌株α-葡萄糖苷酶基因序列分析及重组表达载体pGAPZαA-agdA的构建为在毕赤酵母中表达Aspergillus niger (CU-1) 菌株的α-葡萄糖苷酶奠定基础。
基因与葡萄酒 篇8
1 材料与方法
1.1 菌株和主要仪器、试剂
1.1.1 菌株来源
96株MRCNS均由2011年9月～2012年5月我院收治的病人临床标本分离而来,包括:1株华纳葡萄球菌(Warner Aureum),2株科氏葡萄球菌(Staphylococcus coriolis),2株里昂葡萄球菌(Staphylococcus lugdunensis),2株松鼠葡萄球菌(Staphylococcus sciuri),2株模仿葡萄球菌(Staphylococcus simulans),7株耳葡萄球菌(Staphylococcus auricularis),12株人葡萄球菌(Staphylococcus hominis),29株溶血葡萄球菌(Staphylococcus haemolyticus)以及39株表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。
1.1.2 主要仪器
PCR仪(美国Bio-Rad,BS97MyCycler),凝胶成像系统(上海欧翔科学仪器有限公司,SHFC-Tocan240),电泳仪(北京市六一,DYCP-31DN),全自动微生物分析仪(法国biosMerieumx,VITEK-60)。
1.1.3 主要试剂
溶菌酶、M-H琼脂以及LB培养基均来自北京白浩生物科技有限公司;庆大霉素纸片、头孢西丁纸片、莫匹罗星纸片、氨苄西林纸片、万古霉素纸片、红霉素纸片以及四环素纸片均来源于法国biosMerieumx公司;DNA Marker以及PCR反应试剂盒来自北京天根生化科技有限公司;细菌总DNA提取试剂盒来自天津金思德生物技术有限公司;引物由上海生工合成。
1.2 方法
1.2.1 细菌总DNA的提取
选择单个菌落接种于3 mL LB液体培养基,35℃振荡培养至生长对数期,收集菌体,经溶菌酶对菌体进行处理后,用Omega细菌总DNA提取试剂盒提取细菌总DNA。
1.2.2 药敏实验
选择K-B纸片扩散法对6种抗生素开展药敏实验。挑取3～4个单克隆调成0.5麦氏单位浓度的菌悬液涂布于M-H琼脂平板上,待液体稍干后贴上含有定量抗生素的纸片。孵育18～24 h后量取抑菌环的直径,以2009年版临床实验室标准研究所(CLSI)制定的标准为判定结果。
1.2.3 耐药基因的检测
① PCR扩增参数
PCR检测所用的引物、退火温度及产物长度如表1所示。PCR反应条件设置为:95℃ 3 min;94℃ 30 s,退火30 s,72℃延伸1 min,共35个循环;72℃延伸2 min。
② PCR扩增体系
以细菌总DNA提取试剂盒提取的细菌总DNA为模版,按如下体系扩增: 21.5 μL去离子水,1 μL细菌DNA 模板,1 μL上游引物,1 μL下游引物,0.5 μL Golden DNA聚合酶以及25 μL 2×Reaction Mix,反应体积合计50 μL。
③ PCR产物的检测
将5 μL PCR 产物在有溴化乙锭成分且2%浓度的琼脂糖凝胶孔中点样进行电泳,置凝胶成像系统成像。
2 结果
2.1 药敏实验结果
96株MRCNS对红霉素、庆大霉素、莫匹罗星以及四环素的耐药性各有差异,具有耐药性的菌株比例分别为85.42%、60.42%、27.08%和30.21%,见表2;对氨苄西林的耐药性达到100%,未发现对万古霉素具有耐药性的菌株。
2.2 耐药基因检测结果
96株MRCNS都检测出mecA基因,如图1所示。mecA基因与青霉素类和头孢菌素类抗生素耐药性有关[2]。药敏实验结果表明,96株MRCNS均对氨苄西林具有耐药性,与mecA耐药基因的检测结果一致。
对万古霉素耐药性基因vanA和vanB的检测结果表明,96株MRCNS均不携带这两个基因,这也与药敏实验中无万古霉素耐药性菌株的结论一致。
对红霉素耐药性基因ermA、ermB、merC和msrA进行检测,96株MRCNS中未检测出ermA,但是ermB的检出率为10.42%(10/96),ermC的检出率为77.08%(74/96),msrA的检出率为46.86%(45/96),说明96株MRCNS大部分具有红霉素耐药性,但是其耐药性与ermA基因无关,是由ermB、ermC和msrA基因导致的。
对庆大霉素耐药性基因ant(6’)-I、aac(6’)-aph(2”)和aph(3’)-III为进行检测,发现96株MRCNS均不携带ant(6’)-I基因,75.00%(72/96)的菌株携带aac(6’)-aph(2”)基因,39.58% (38/96)的菌株携带aph(3’)-III基因,合计共有75株(78.13%)MRCNS携带有aac(6’)-aph(2”)或(和)aph(3’)-III基因。此结果表明,本实验所检测的MRCNS的庆大霉素耐药性主要是由aac(6’)-aph(2”)和aph(3’)-III基因导致的。药敏实验显示仅有60.42%的MRCNS具有庆大霉素耐药性,推测这一差异可能是由于这些耐药基因在不同的菌株中表达程度不一,部分MRCNS携带的耐药性基因未能有效表达从而未能产生耐药性。
莫匹罗星耐药性基因mupA的检测结果表明,25% (24/96) 的MRCNS携带此基因。但药敏实验表明,27.08%(26/96)的MRCNS具有耐药性,说明还有2株MRCNS具有其他的耐药性基质。
对四环素耐药性基因tetM和tetK的检测结果表明,仅有2.08%(2/96)和5.21%(5/96)的菌株分别携带tetM和tetK基因,而药敏实验结果表明,30.21%(29/96)的MRCNS具有四环素耐药性。由于目前已经发现了众多与四环素耐药性相关的基因,本次检测的耐药性MRCNS应该还携带了其他四环素耐药性的基因。
M:Marker;N:阴性对照;1~9分别为:mecA、ermB、ermC、msrA、tetM、tetK、aac(6’)-aph(2”)、aph(3’)-III、mupA阳性标本
综合PCR检测结果,发现某些MRCNS携带多个耐药基因,携2种、3种、4种、5种、6种以及7种带耐药基因的MRCNS分别为13株(13.54%)、28株(29.17%)、18株(18.75%)、21株(21.88%)、10株(10.42%)以及2株(2.08%),说明MRCNS是一种多重耐药菌。
3 讨论
3.1 β-内酰胺类药物耐药性相关基因
mecA基因可编码形成青霉素结合蛋白异构体蛋白(PBP2),此蛋白改变了菌体与β-内酰胺类药物的亲和力,从而对此类抗生素产生耐药性[2,3]。本研究显示,96株MRCNS均携带mecA基因,这和药敏实验得出的结论相符。
3.2 红霉素耐药性相关基因
erm类基因主要有ermA、ermB以及ermC。erm基因编码细菌23S rRNA甲基化酶,对细菌核糖体23S rRNA进行甲基化,从而削弱大环内脂类药物与细菌核糖体之间的结合,导致菌体对红霉素高水平耐药[4]。外排基因msrA也与红霉素耐药性有关,其编码的主动转运蛋白体可以将药物从菌体内排出,最终形成耐药性[5]。在本研究中,有84株(87.50%)可以扩增出基因msrA、ermB以及ermC,这和药敏实验得出的结论基本一致。
3.3 四环素耐药性相关基因
四环素通常结合在核糖体上,阻止氨酰-tRNA与核糖体结合,从而抑制蛋白质的合成,属于广谱抗生素。核糖体保护蛋白可以把细菌30S亚基内的四环素释放出来,而外排泵蛋白可以将四环素排出菌体。目前已经发现了多个核糖体保护蛋白基因如tetM、tetO、tetS、tetW、tetQ、tetT,以及众多与药物排出泵机制相关的耐药基因如tetA、tetB、tetC、tetD、tetE、tetG、tetH等[6]。由PCR结果可知仅7株(占到7.29%)携带tetM或tetK基因,但药敏实验结果表明,有29株(30.21%)具有四环素耐药性,说明被检测的MRCNS还携带了其他四环素耐药基因。
3.4 庆大霉素耐药性相关基因
氨基糖苷类修饰酶可作用于氨基糖苷类药物的氨基或羟基,降低或使抗生素丧失对16s RNA的亲和力,使细菌在抗生素存在的情况下也能存活,进而形成耐药性[7]。氨基糖苷类修饰酶的编码基因有ant(6’)-I、aac(6’)-aph(2”)以及aph(3’)-III。PCR结果显示,共有75株(78.13%)MRCNS携带aph(3’)-III或(和)aac(6’)-aph(2”)基因,但药敏实验结果显示仅有58株(60.42%)具有庆大霉素耐药性,5株(5.21%)对于庆大霉素耐药性属于中介。药敏试验得出的耐药率比耐药基因检出率低,这可能是因为质粒表面上的耐药基因在不同菌种中表现出不同的耐药程度。
3.5 莫匹罗星耐药性相关基因
莫匹罗星可作用于细菌体内的异亮氨酸tRNA合成酶的异亮氨酸结合位点,选择性抑制异亮氨酸tRNA合成酶,阻碍氨基酸的合成,导致蛋白质合成受影响,进而发挥抗菌功能。mupA基因可以编码一种新型异亮氨酸tRNA合成酶,它不与莫匹罗星结合,使细菌产生耐药性;此外,细菌体内的异亮氨酸tRNA合成酶发生点突变导致空间构想变化,降低与莫匹罗星的结合力,也可导致耐药性[8]。
通过PCR检测可知,mupA基因有24株(25.00%)属于阳性株,但药敏实验发现有26株(27.08%) MRCNS具有莫匹罗星耐药性。2株没有携带基因mupA却具有耐药性MRCNS,推测可能是由异亮氨酸tRNA合成酶发生点突变而产生了耐药性。
3.6 万古霉素耐药性相关基因
糖肽类抗生素如万古霉素常被用于其他抗生素耐药的感染,被认为是抗感染的最后防线,在临床治疗中被广泛使用。万古霉素的耐药机制目前尚未完全研究清楚,已知的研究表明,其耐药性可能与携带耐药基因、细胞壁增厚、染色体突变及糖聚肽交联减少有关[9]。与万古霉素耐药性相关的基因有vanA、vanB、vanC、vanD、vanE和vanE6种,其中以vanA和vanB最为常见[10]。本研究中,未发现具有万古霉素耐药性的MRCNS,PCR检测也表明它们均未携带vanA或vanB基因,二者结果一致。
4 结论
终上所述,对于氨苄西林、红霉素、庆大霉素、四环素和莫匹罗星5种抗生素,MRCNS可携带以上一种或多种药物的耐性基因,产生多重耐药性。96株MRCNS中未检测到对万古霉素具有耐药性的MRCNS。
参考文献
[1]林镯,陈永平,叶海油,等.6类抗生素耐药基因在耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌中的分布及分析[J].中国微生态学杂志,2008,26(3):325-326.
[2]邵亚娟,乔惠平,吴玉莲.医院感染常见细菌分布与耐药性分析[J].中国感染控制杂志,2006,5(2):153-156.
[3]黄辉,周建党,聂新民,等.MecA基因在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌对β-内酰胺类抗生素耐药中的作用[J].中南大学学报(医学版),2012,36(7):567-571.
[4]宁立芬,汪玉珍,张家芳,等.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌耐药性及erm基因的检测与分析[J].中华医院感染学杂志,2009,5:484-486
[5]罗润齐,叶晓光.耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌耐药谱动态分析[J].医学信息,2009,22(4):512-514.
[6]Chopra I,Robert M.Tetracycline antibiotics:mode ofaction,applications,molecular biology,and epidemiolo-gy of bacterial resistance[J].Microbiol Biol Rev,2001,65(2):232-260.
[7]吴蓉,张蓉,戴俊华,等.产ESBLs大肠埃希菌对氨基糖苷类抗生素的耐药表型与修饰基因研究[J].现代检验医学杂志,2010,25(3):31-33.
[8]刘媚娜,刘庆中,陆红,等.金黄色葡萄球菌对莫匹罗星的耐药性研究[J].中华临床感染病杂志,2008,1(3):533-536.
[9]赵晓东,刘爱玲.耐万古霉素金黄色葡萄球菌作用机制及治疗药物研究进展[J].医学军事科学院院刊,2009,33(3):285-287.
【基因与葡萄酒】推荐阅读：
葡萄酒的文化、品质与鉴赏(论文)05-12
基因与智力的关系07-17
父亲与葡萄作文10-02
生物材料与基因技术05-14
转基因技术与产品安全09-18
基因工程与伦理道德07-01
转基因作物与安全性05-28
转基因技术与农业发展09-17
狐狸与葡萄读后感08-21
甘蓝MLPK基因的克隆与序列分析06-11