表达相关性

表达相关性（共12篇）

表达相关性 篇1

急性心肌梗死是由冠状动脉急性、持续性缺血缺氧而引起的心肌坏死, 有较高的发病率和死亡率, 最根本的发病原因还是心血管疾病所造成[1]。患者多发生在冠状动脉粥样硬化狭窄的基础上, 冠状动脉粥样斑块由于某些诱因而导致破裂, 在破裂的斑块表面聚集着血中的血小板, 之所以出现这种现象, 是因为粥样斑块中的炎症因子在不断分泌。有研究表明, 在心肌梗死的发生、发展过程、疾病的严重程度及预后的评估TNF-α和IFN-γ都发挥着重要的作用[2]。尤其最新发现的一种促炎症细胞因素IL-32, 在对其他细胞因子调控时及炎症的发生发展中, 可用IL-32进行调节[3]。目前, 临床医学对IL-32的具体机制没有详细的阐明。该研究则是急性心肌梗死为切入点, 分析L-32在此病的表达以及与IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α和IL-10等细胞因子表达水平的相关性, 最终得出在急性心肌梗死中IL-32的作用[4], 选取2012年12月—2013年11月该院急性心肌梗死的住院患者为研究对象, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

病例来自该院急性心肌梗死的住院患者, 男24例, 女12例, 年龄47~72岁, 均符合2001年中华医学会心血管病学分会“急性心肌梗死诊断和治疗指南”中的诊断标准[5], 排除有糖尿病、恶性肿瘤、感染性疾病、肝肾功能不全等患者。对照组为30例体检健康者, 男20例, 女10例, 年龄46~71岁。

1.2 标本的采集与测定

采集:急性心肌梗死组AMI组标本于患者发病的6 h内采集静脉血5 m L, 静置, 2 h内用3 000 r/min离心10 min分离血清, 于-40℃冷冻保存。对照组标本在早晨空腹时采集, 处理方法同急性心肌梗死组。测定:血清IL-32、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、IL-10等含量采用酶联免疫法测定, 采用酶联免疫吸附双抗体夹心法 (深圳晶美生物工程有限公司) 测定TNF-α及IL-18, 采用ACL200型全自动血凝仪自动检测血浆中Fg浓度。操作均按试剂盒说明书进行。

1.3 统计方法

该次所有调查数据均采用软件SPSS20.0进行统计分析, 两组IL-32、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、IL-10水平用 (±s) 表示, 比较采用t检验。

2 结果

两组血清IL-32、IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α、IL-10等水平比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

注:与正常组比较, aP<0.05。

3 讨论

炎症细胞因子指参与炎症反应的各种细胞因子, 起主要作用的是TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-8等, 在心肌缺血缺氧损伤中也起着重要的作用[6]。如TNF-α是炎症反应过程中出现最早和最严重的炎性介质, 激活淋巴细胞, 增加血管内皮洗脑通透性。IL-6能诱导T细胞增殖和B细胞分化和产生抗体, 是炎性反应的促发剂。IL-8能刺激中性粒细胞或T淋巴细胞的趋化, 促进中性粒细胞脱颗粒, 损伤内皮细胞。IL-32是新发现的炎症细胞因子, 尤其在类风湿性关节炎及自身免疫疾病中, 可激活NF-κB、P38/MAPK等信号通路, 调整其他细胞因子的表达, 使炎症反应的发展得以促进[7]。该研究则是急性心肌梗死为切入点, 分析L-32在该病的表达以及与IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α和IL-10等细胞因子表达水平的相关性, 结果表明, 心肌梗死组的心肌细胞在梗死后, 只有IL-32表达水平升高, 还有明显升高的则是抗炎症细胞因子IL-10和促炎症细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-8。IL-32可在其他细胞因子缺氧的条件下上调或上述细胞因子的表达, 导致心肌细胞损伤情况增重, 也间接说明IL-32表达水平与个细胞因子表达水平的相关性呈正比。也有文献说明[8], 在心肌缺氧过程中, IL-32的表达可能是通过NF-κB、P38/MAPK等信号通路上调上述。总之, IL-32基因及蛋白表达水平会在心肌细胞缺氧后明显升高, 一定程度上会损伤其它细胞因子, 进而加剧心肌细胞的损伤程度。

该研究结果表明, AMI发生时IL-32水平增高更为显著, IL-1β、IL-6、IL-18TNF-α和IL-10的变化共同参与了AMI的发生和发展, 与国外的研究结果相一致[9], 调节炎性细胞因子的释放均可能有利于减轻或阻止AMI的发生及严重程度, 改善AMI患者的预后, 抗炎因子治疗和调整机体免疫是治疗AMI的重要途径。

参考文献

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[9]Dinarello CA, Kim SH.IL-32, a novel cytokine with a possible role in disease[J].Ann Rheum Dis, 2006, 65:61-64.

表达相关性 篇2

A---外观(appearance)散热孔：louver 加热区：cooking zone;heating zone 微晶板：ceramic glass top 显示屏：LED display 操作面板：operation panel 电源开关键：on/off 功能键：function 加大/减小调节键：up/down 定时设定键：timer 童锁键：lock 指示灯：indicator light 丝印：screen print 后盖：back 排气口：exhaust 吸气口：intake 双风扇：dual fan 电源线：mains lead 插头：plug

B---烹饪功能(cooking choice)火锅(煮)：boil 煲汤(炖)：simmer 煎炸：fry 烧烤：sear 解冻/保温：melt/warm

C---组件(components)电路主板：circuit board 灯板：light board 磁性线圈：induction coil 其他：accessory 包装：package

D---性能(nature)功率(power): 2000W 控制方式(operation): 触摸按键,微电脑操作---digital sensor touch control 时间设定(timing): 480min 能效等级(energy efficiency): third 机身尺寸(size): 385*310*27mm 净重(net weight): 2.5kg 电源性能(power supply): 220V(volt)/50HZ(hertz)面板材质(material): ceramic glass panel

E---品质(character)轻：lightness 薄：thinness 超薄：ultra-thin 流线型：streamlined 一体化：all-in-one 自动化：automatic 人性化：humanization 超静音：noiseless 经济：economic(saving time and money)快捷：efficient(gathering energy in seconds)精确：accurate(digital control, 480-minute timer with auto shut-off, 10 power levels, 10 temperature settings)安全：secure(no open flame, heat-resistant glass surface, anti-radiation, low carbon)方便：convenient(touch control, intelligent)F---锅具选择(cook ware)铸铁/铁质：cast iron/irony 不锈钢：stainless steel平底锅：pan 其它平底容器：other flat-bottom container 直径(diameter): over 12cm but under 26cm(centimeter)NO: 铝(aluminum), 铜(copper), 陶(ceramic), 玻璃(glass), 弧形(arc-shaped bottom), 附脚(bottom with pins)

G---保养(maintenance)清洁：clean 污渍：stains 湿抹布或海绵：damp cloth or sponge 防虫(如蟑螂)，防尘，防潮：protection against insects(as cockroach), dust and damp 售后服务：after service 维修人员：accendant NO: 易燃物(inflammable), 酸性/碱性物品(acid/alkaline items), 蒸汽清洁器(steamer)

附：

基因表达载体相关问题解读 篇3

一、基因表达载体的一般结构及各部分的功能

如上图，基因表达载体一般由目的基因（插入基因）、启动子、终止子、标记基因（抗生素抗性基因）等结构组成。

启动子是复制原点附近的一段有特殊结构的DNA，位于基因的首端。启动子和特定的物质（如激素）作用后，通过一系列复杂的正反馈机制，激活复制原点（复制原点通常与某些酶结合）。

终止子位于基因的尾端，也是一段有特殊结构的DNA。终止子相当于一盏红色信号灯，使转录或复制在所需要的地方停止下来。

复制原点处的A和T特别多，氢键相对较少，不稳定，DNA容易解旋，因此易与引物结合，成为转录的起点或复制的起点。

抗生素抗性基因作为标记基因，其作用是鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。标记基因又称报告基因，抗生素抗性基因是其中的一种。

二、基因表达载体中启动子、终止子的来源及特点

（1）如果目的基因是从自然界中已有的物种中分离出来的，在构建基因表达载体时，不需要在质粒上目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子，因为目的基因中已含有启动子、终止子。（2）如果目的基因是通过人工方法合成的，或通过cDNA文库获得的，则目的基因是不含启动子和终止子的。若只将基因的编码序列导入受体细胞，目的基因没有启动子、终止子，是无法转录或复制的，因此，在构建基因表达载体时，在与质粒结合之前，需要在目的基因的前后端接上特定的启动子、终止子。（3）特异性启动子。组织特异性启动子又称器官特异性启动子。在这类启动子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。如用乳房生物反应器生产药用蛋白，使用的便是该类基因。

三、标记基因是否为质粒结构

作为运载体必须具备以下几个特点：能够在宿主细胞中复制并稳定地保存；具有多个限制酶切点，以便与外源基因连接；具有某些标记基因，便于进行筛选。质粒是基因工程最常用的运载体，它存在于许多细菌等生物体中，是能够自主复制的很小的环状DNA分子。根据此分析可知，标记基因是质粒上固有的。但在实践中，由于构建载体的目的不同，需要的标记基因也会不同，有的标记基因是需要另外加上的，如将绿色荧光蛋白基因与目的基因做成融合基因，根据荧光蛋白的特性来确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位。

四、载体上标记基因的标记原理

表达相关性 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取该院2013年3月—2014年2月收治的妊娠期流产对象42例和30例正常剖宫产对象临床资料进行分析, 其中依据流产方式对42例妊娠期流产对象进行分组, 人工流产组22例, 年龄22~36岁, 平均年龄 (25.6±5.4) 岁, 孕周5~11周, 平均孕周 (7.5±2.0) 周, 自然流产组20例, 年龄23~37岁, 平均年龄 (25.2±5.1) 岁, 孕周6~10周, 平均孕周 (7.3±2.1) 周。另外取42例流产对象的绒毛组织标本作为绒毛组, 剖宫产对象取其胎盘作为胎盘组, 年龄23~37岁, 平均年龄 (26.5±4.4) 岁。人工流产组和自然流产组、绒毛组和胎盘组研究对象的资料差异无统计学意义, 具有可比性。

1.2 方法

Jagged-1、Jagged-2和CD56+NK细胞均采用免疫组化方法进行测定。首先进行固定标本、对其进行脱水、透明、浸蜡然后包埋, 将其切至厚度为3~5μm。染色之前37℃烤箱过夜, 脱蜡, 水化, 酒精、水进行清洗, 制成玻片放在湿盒内, 加入3%过氧化氢, 蒸馏水冲洗, 缓冲液浸泡振荡, 进行抗原修复。分别滴加鼠抗人单克隆抗体CD56和CD16, 兔抗人多克隆抗体Jagged-2、Jagged-1在组织上, 通过PBS冲洗切片, 加酶标抗鼠/兔聚合物, 37℃孵育30 min, 冲洗切片, 缓冲液浸润、振荡, 加入DAB进行显色, 1min通过蒸馏水终止显色, 通过苏木素进行复染。通过高倍显微镜进行观察, 随机选择15个高倍视野, 计算每隔视野阳性细胞面积和视野总面积的比值, 呈现黄色或者棕黄色为阳性反应。

1.3 观察指标

(1) 观察绒毛组和胎盘组Jagged-1、Jagged-2表达情况; (2) 观察自然流产组和人工流产组绒毛中的CD56+、Jagged-1及Jagged-2的表达情况; (3) 观察CD56+、Jagged-1及Jagged-2表达的相关情况。

1.4 统计方法

通过采用统计学软件SPSS 19.0建立数据库进行统计学分析, 通过t检验主要对计量资料进行分析, 运用直线相关性的分析。

2 结果

2.1 绒毛组和胎盘组Jagged-1、Jagged-2表达情况

绒毛组和胎盘组Jagged-1、Jagged-2表达情况, 见表1。胎盘组Jagged-1高于绒毛组, Jagged-2低于绒毛组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。

2.2 人工流产组和自然流产组绒毛中Jagged-1、Jagged-2及CD56+的表达情况

自然流产组和人工流产组绒毛中CD56+、Jagged-1及Jagged-2的表达情况, 见表2。自然流产组Jagged-1、Jagged-2及CD56+的表达均低于人工流产组, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。

2.3 Jagged-1阳性细胞和Jagged-2阳性细胞的表达水平

CD56+NK细胞和绒毛组织中的Jagged-1阳性细胞表达水平、Jagged-2阳性细胞表达水平均呈现明显正相关, 差异有统计学意义 (r=0.91, 0.95, P<0.05) 。

3 讨论

胚胎与母体之间接触的界面称为母胎界面, 它包含了胎儿滋养层和母体子宫蜕膜。由当蜕膜化诱导因子对子宫的内膜间质刺激时导致增殖分化从而形成了异质性组织, 这种组织叫做脱膜组织。脱膜组织由多种细胞组成[2]。胚胎及其附属物的主要营养来源是蜕膜, 其不仅具有很好的营养作用, 同时也是一种局部的免疫器官, 对于妊娠有着重要的作用。免疫细胞的入侵和蜕膜化是妊娠早期的主要过程, 蜕膜中的B淋巴细胞和T淋巴细胞的在早期妊娠中的数有所减少, 大约占蜕膜组织中20%左右的免疫细胞, 子宫蜕膜自然杀伤细胞占子宫淋巴细胞的70%, 主要分布在受精卵着床部位的周围。Notch信号通路主要包括Notch受体、Notch配体、CSL DNA结合蛋白, 其中Notch受体在T细胞、B细胞、干细胞、巨噬细胞等多种细胞表面分布, 其包括五种配体, 主要是Jagged-1、Jagged-2、Delta-like1、Delta-like3、Delta-like4.Jagged-1在胎盘、心脏、肺、肾均有广泛的表达, 其主要是对组织发育进行调控, 对造血前体细胞发育有效的维持, 并且参与增殖分化[3]。有研究表明[4], Notch信号在人胎盘中有重要的调节作用, Notch信号和配体Jagged-1参与了血管的塑性和稳定。Jagged-1通过Notch信号系统参与T/NK细胞的更新和发育。以往资料显示[5], 人体侵袭性胃癌和Notch配体Jagged-1有着密切的关系。经过实验证实Jagged-1对Notch型号途径介导, 从而诱发多发性骨髓瘤发生增殖。有资料显示[6], Jagged-2在造血干细胞上表达丰富, 提高了造血祖细胞的增生能力。在正常的妊娠绒毛组织中, 有四种Notch受体进行表达, 其中第一期绒毛组织中的Jagged-1表达远远低于在妊娠第三期的胎盘组织中的Jagged-1表达, 而Jagged-2的表达和Jagged-1正好相反, Jagged-2、Jagged-1、对妊娠成功起着显著的重要的作用[7]。在早期妊娠中, 有不同功能的NK细胞和外周血表型在蜕膜中, 其主要是CD56bright CD16dim, 此类因子在滋养层细胞和受精卵着床周围浸润。资料显示[8], 自然流产蜕膜中的表达量远远低于人工流产蜕膜中CD56+NK细胞表达量, 通过研究显示, 当自然流CD56+NK细胞的数量下降, 可以导致母胎界面细胞因子中的GM-CSF和TGF-β表达的降低, 进一步的对胎儿的生长发育环境造成了影响, 最终导致流产。Jagged-1会刺激造血祖细胞发生分化, 形成NK细胞Jagged-2可以诱导脐带血CD34+细胞表达CD56bright CD16-、CD94-和CD117+NK细胞, 并且表达NKG2D表达, 对于K256细胞有一定的杀伤活性。综上所述, Jagged-1、Jagged-2可能共同参与了NK细胞表型的变化, 从而对妊娠结局造成影响, 并且形成妊娠免疫耐受。

摘要：目的 探讨绒毛和胎盘中Jagged-1/Jagged-2的表达与蜕膜中CD56+NK表达相关性情况。方法 分析该院2013年3月—2014年2月收治的妊娠期流产对象42例和正常剖宫产30例的临床资料, 对Jagged-1、CD56+NK细胞和Jagged-2应用免疫组化方法检测, 通过对其测定的情况。结果 胎盘组Jagged-1高于绒毛组, Jagged-2低于绒毛组, 自然流产组Jagged-1、Jagged-2及CD56+的表达均低于人工流产组, CD56+NK细胞和绒毛组织中的Jagged-1阳性细胞表达水平、Jagged-2阳性细胞表达水平均呈现明显正相关性, 差异有统计学意义 (r=0.91, 0.95, P<0.05) 。结论 Jagged-1、Jagged-2对NK细胞表型的变化可能两者一起参与, 因而对妊娠结局造成影响, 并且形成妊娠免疫耐受。

关键词：绒毛,胎盘,Jagged-1,Jagged-2,蜕膜,CD56+NK

参考文献

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表达相关性 篇5

目的 构建15-羟基前列腺素脱氢酶(PGDH)原核表达质粒,并在大肠杆菌中诱导表达PGDH蛋白.方法 以人正常大肠黏膜组织总RNA为模板,利用RT-PCR扩增PGDH基因的编码序列,克隆入原核表达载体pBV220,转化E.coli DH5a,经温控诱导表达,并经Ni2+ -NTA亲和层析纯化,目的 蛋白进行SDS-PAGE和Western blot鉴定.结果 重组质粒pBV220-PGDH-Hia6经PCR及酶切鉴定,证明质粒构建正确.经温控诱导后,可表达出相对分子质量约为29 000的PGDH-His6蛋白,表达产物以包涵体形式存在,3 h诱导表达量最高,约占菌体总蛋白的`30%.Western blot验证了表达蛋白的特异性.纯化后目的 蛋白纯度大于95%.结论 已成功构建PGDH原核表达质粒,并在大肠杆菌中表达了PGDH蛋白.

作 者：李美宁 冯燕 常冰梅 解军 张悦红 殷云勤 程牛亮 作者单位：李美宁,冯燕,常冰梅,解军,张悦红,程牛亮(山西医科大学生物化学与分子生物学教研室,太原,030001)

殷云勤(山西医科大学第一医院消化检验中心,太原,030001)

表达相关性 篇6

关键词：中华蜜蜂；OBP17；克隆；生物信息学；狄斯瓦螨

中图分类号： S895.3+2文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）11-0045-04

收稿日期：2015-01-22

基金项目：国家自然科学基金（编号：31372382）；江苏农牧科技职业技术学院重点科研课题（编号：NSFRC1401）。

作者简介：殷玲（1983—），女，江苏泰兴人，博士，讲师，主要从事蜜蜂分子生物学研究。E-mail：lingyin_txx@163.com。昆虫通过嗅觉受体神经元的调节来识别并区分成千上万种气味复合物，而气味结合蛋白（odorant binding proteins，OBPs）家族则承担特异性识别、转运气味复合物至受体的运输功能[1]，因此气味结合蛋白与昆虫的嗅觉敏感性密切相关。目前，国内外关于蜜蜂OBPs家族的基因功能研究较少，关于中华蜜蜂OBPs家族的研究更少。李红亮等对ASP2进行CDs的克隆，并对其功能模式进行分析[2-3]；张小辉等克隆了中华蜜蜂气味结合蛋白5、9、11、12的完整基因序列[4]；陈扬等对中华蜜蜂头部CSP3基因的CDS序列进行分析[5]。OBP17是蜜蜂气味结合蛋白质家族中的成员，是低分子量水溶性酸性蛋白质，有6个保守的半胱氨酸位点，在西方蜜蜂的身体各部位均有表达[6]，但其具体功能却不得而知。

狄斯瓦螨（Varroa destructor）别称大蜂螨，是对世界养蜂业威胁最大的蜜蜂病虫害，对西方蜜蜂产业造成了巨大损失[7]，也是我国最重要、必须严加防范的蜜蜂寄生虫害[8]。中华蜜蜂（Apis cerana cerana）是东方蜜蜂的地理品种，生活于我国境内，狄斯瓦螨对其并不造成伤害[9]。周婷对我国主要中蜂饲养区的大蜂螨寄生状态进行了调查，发现中蜂群中螨的寄生率极低，有些地区的中蜂群中甚至难以找到狄斯瓦螨的踪迹，但也有极少数群体出现与西方蜜蜂感染蜂螨相同的症状，如花子、残翅等[10]。很多研究表明，嗅觉敏感性强的蜜蜂可以迅速察觉并区分正常与不正常幼虫的气味，其清洁行为更易被激发[11-12]。蜜蜂嗅觉敏感性的差异可导致其清洁及梳理行为的差异，从而导致抗螨性状的差异[13]；虽然这一机理被广泛接受，但其分子机制却不清晰。

本研究以中华蜜蜂头部组织cDNA为模板，PCR扩增OBP17基因完整CDS序列，利用生物信息学方法分析CDS序列及其编码的氨基酸序列，并在蜂螨胁迫及没有蜂螨胁迫的条件下，利用RT-PCR方法检测OBP17基因在不同抗螨性状的中华蜜蜂头部组织中的相对表达量，以期为蜜蜂OBP17基因的功能及其与抗螨性状相关性的研究提供参考。

1材料与方法

1.1试验蜂群及蜂螨胁迫

本试验选用广东昆虫研究所实验蜂场内具有蜂螨抗性、蜂螨敏感性的中华蜜蜂群体各2群。将2张狄斯瓦螨感染程度相当的巢脾分别放入蜂螨抗性中华蜜蜂、蜂螨易感性中华蜜蜂的蜂箱内，对照组放入无蜂螨感染的西方蜜蜂巢脾，胁迫24 h后进行样本采集，4个蜂群各采集150只哺育蜂（18日龄以内）。

1.2总RNA的提取、检测、反转录

采用Trizol法提取中华蜜蜂头部组织的总RNA。以总RNA为模板，使用First Strand cDNA Synthesis Kit（TaKaRa公司产品）并参照说明书进行反转录，合成cDNA第1链。

1.3CDs的克隆测序

1.4序列分析

利用BLAST软件（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）分析序列的同源性；利用clustalw软件（http：//www.ebi.ac.uk/clustalw/index.html）分析OBP17基因与近源物种相同基因的差异；利用ExPASy网站的ProtScale程序（http：//us.expasy.org/cgi-bin/protscale.pl）分析蛋白疏水性结构；对蛋白质跨膜结构进行预测（http：//www.ch.embnet.org/sortware/TMPRED-form.html），并对信号肽区域进行分析（http：//www.cbs.dtu.dk/services/signalP/）；利用在线工具（http：//www.ch.embnet.org/software/COILs-form.html/）进行跨膜螺旋预测；利用PSIPRED v3.0软件（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred）预测目的蛋白的二级结构。

1.5实时定量PCR引物设计及目的片段扩增

根据获得的OBP17基因CDs序列及β-actin（登录号：AB023025）外显子序列，利用Premier primer 5.0软件设计引物（表1）。

nlc202309021028

2结果与分析

2.1东方蜜蜂OBP17基因克隆及序列分析

PCR扩增OBP17基因目的条带（466 bp），经1%琼脂糖凝胶电泳检测，在400～500 bp之间可见1条清晰的特异性条带（图1）。测序结果显示，其长度为466 bp，包含完整的CDS序列408 bp，编码135个氨基酸，序列已提交至Genbank（登陆号KM591216.1）。

利用clustal x软件将中华蜜蜂与其他昆虫类的OBP17基因氨基酸序列进行相似度比较（图2），与西方蜜蜂（A. mellifera，NP_001035297.1）的相似度高达100.00%， 其

余依次为金小蜂（Nasonia vitripennis，CCD17786.1）21.74%、棉铃虫（Helicoverpa armigera，AFI57166.1）20.59%、烟夜蛾（Helicoverpa assulta，AGC92792.1）20.59%、拟谷盗（Tribolium castaneum，EFA02861.1）13.42%、刺舌蝇（Glossina morsitans morsitans，EFA02861.1）11.10%。

2.2东方蜜蜂OBP17基因氨基酸的理化性质

利用ExPASy服务器分析中华蜜蜂OBP17基因蛋白的理化性质，其共有135个氨基酸，分子式为C656H1078N168O210S11、分子量15 031.4、理论等电点4.54、估计半衰期30 h、不稳定

指数28.71（为稳定蛋白）、脂肪指数111.19、亲水指数 0.146。使用ProtScal程序在线分析东方蜜蜂OBP17基因的疏水性（图3），疏水性指数的最大值、最小值分别为3.322、-2.256，由此推测中华蜜蜂OBP17基因蛋白为疏水性蛋白。使用PSIPRED v3.0程序分析东方蜜蜂OBP17基因蛋白的二级结构，预测结果表明OBP17基因没有β-折叠，属于全α型蛋白。

2.3东方蜜蜂OBP17基因的蛋白序列信号肽及蛋白质跨膜区域预测

使用SignalP-4.1程序[15]在线分析东方蜜蜂OBP17基因的信号肽，结果（图4）显示，东方蜜蜂OBP17基因具有信号肽，最可能的剪切位点预测在第16位点至第17位点间，成熟蛋白启动的位置为17，预测信号肽的长度为第1位点至第16位点氨基酸。使用TMHMM service 2.0程序在线分析东方蜜蜂OBP17基因的跨膜区，并未发现OBP17基因具有跨膜区。

2.4OBP17基因在不同抗螨性能蜂群中的表达

对蜂螨胁迫处理组、蜂螨抗性对照组、蜂螨敏感性对照组的中华蜜蜂头部组织中OBP17基因的表达水平进行比较分析。蜂螨抗性对照组的样品命名为C，受蜂螨胁迫24 h的样品命名为C+；蜂螨易感对照组的样品命名为M，受蜂螨胁迫

24 h的样品命名为M+。结果（图5）表明，在蜂螨胁迫下的抗性群体头部组织中，OBP17基因的表达量显著高于未受胁迫的抗性群体和受同等蜂螨胁迫的敏感性群体，可见中华蜜蜂OBP17基因的表达变化与蜂螨感染过程相关，说明OBP17基因可能在中华蜜蜂的抗螨行为中起重要作用。

3结论与讨论

本试验以中华蜜蜂头部组织为材料，克隆出OBP17基因完整CDS序列，采用生物信息学方法对序列及其编码的蛋白质进行分析和预测。结果表明，OBP17基因CDS序列全长为408 bp，编码135个氨基酸；将该基因CDS区与GenBank中其他昆虫纲的同源基因进行比对，发现其与西方蜜蜂（NP_001035297.1）的同源性高达100%，充分体现了2个物种的近缘关系，同时表明气味结合蛋白在这2个物种间高度保守，其功能很可能相似。对OBP17基因蛋白氨基酸序列进行分析和功能预测，显示其为分泌性疏水蛋白，无跨膜结构，这与气味结合蛋白转运气味分子的功能相符合，并证明试验所克隆序列的正确性。

嗅觉敏感性差异是导致蜜蜂抗螨性状差异的重要原因[16-18]，而气味结合蛋白OBPs对蜜蜂感受外界气味起重要作用。OBPs与脂溶性气味分子发生的作用，是昆虫专一性识别外界气味物质所发生的第1步生化反应[6]。经RT-PCR分析发现，OBP17基因在蜂螨胁迫下的抗性东方蜜蜂中高度表达，而在未受蜂螨胁迫的抗性群体及敏感性群体中表达量很低，可见OBP17基因在中华蜜蜂的抗螨过程中起重要作用。目前，梳理行为、卫生行为是最普遍接受的蜜蜂抗螨机制。很多研究表明，具有抗螨性状的蜜蜂能够发现、抓住、撕咬正在移动的蜂螨，梳理自己和同伴身上的蜂螨，还可检查房内已被病害感染的蜜蜂幼虫，咬开封盖房并清除感染幼虫[9，19-20]。蜂箱内为暗环境，蜜蜂很可能通过有效识别蜂螨的特殊气味（螨害体表表皮碳氢化合物）而将其清除[21]。由此推测，蜂螨抗性群体、敏感性群体对蜂螨气味的敏感度差异造成了其蜂螨抗性的差异，而OBP17基因可能在此过程中起重要作用。本试验的推测尚须进一步研究加以论证。

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表达相关性 篇7

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2012年1月-2014年12月足月生产胎儿宫内受限胎盘绒毛100例和正常胎盘绒毛30例石蜡标本, 由郑州市妇幼保健院提供, 年龄19~35岁, 平均年龄27岁。所有研究病例均经过患者的知情同意和医院伦理委员会的批准, 有完整的临床病理记录和随访资料。

1.2 标本收集

胎盘的收集和处理:在胎盘娩出后由经验丰富的产科医师和病理科医师进行胎盘脐带的大体观察, 并详细记录, 在胎盘中央和边缘部分分别贯穿各取一块2 cm×1.5 cm×0.2cm, 标本用10%中性甲醛固定48 h常规石蜡包埋, 连续切片后3μm, 作HE染色及免疫组织化学染色。

1.3 试剂

兔抗人Ki-67, VEGF单克隆抗体 (试剂为上海基因科技有限公司产品[Gene Tech (shanghai) Company Limited], 即用型。免疫组化超敏SP试剂盒和DAB显色试剂盒均购于上海基因科技有限公司产品[Gene Tech (shanghai) Company Limited], TUNEL试剂盒购自罗氏公司 (roche) 。

1.4 方法

免疫组化染色采用SP法, 实验步骤严格按照说明书操作;凋亡指数测定严格按照TUNEL试剂盒说明书操作。

1.5 判定标准

(1) 免疫组化结果:分别在400倍视野下观察Ki-67占的百分比进行定量判断, VEGF抗体是细胞浆着色, 以细胞胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性细胞, 无明显棕黄色颗粒为阴性细胞。随机选择5个高倍镜视野 (×400) , 每个视野计数100个细胞, 按胞浆的着色深浅分为不着色, 淡棕色和棕色, 计数每一着色程度的细胞所占的百分比例, 为0~100%, 无阳性反应为 (-) , <50%的细胞呈胞浆弱阳性为低表达 (+) , ≥50%的细胞呈强阳性为高表达 (++) , 结果均由两名病理医师计数。 (2) 凋亡指数结果判定标准:TNNEL检测细胞凋亡, 取中性甲醛固定后的胎盘组织, 常规制片, 采用TUNEL行细胞凋亡检测, 试剂盒购自美国Pmmega Madison公司, 操作方法严格按照说明书进行。凋亡细胞胞核呈棕黄色着色。每片随机选上、下、左、右、中5个视野, 显微镜下 (×400倍) 观察, 每个视野计数100个细胞, 计算5个视野的500个细胞中, 呈棕黄色着色的凋亡细胞数 (凋亡率) 。

1.6 统计学方法

采用秩和卡方检验比较检测指标, 采用Spearman等级相关检验分析检测指标的相关性, 采用SPSS 16.0统计软件进行分析, 以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KI-67在胎盘绒毛中的表达

免疫组化检测结果显示Ki-67阳性表达于绒毛细胞滋养细胞和绒毛间质细胞的细胞核, 呈棕黄色颗粒状。该研究组Ki-67表达阳性率在正常胎盘绒毛组织中为2%~5%, 占90% (27/30例) , 在FGR中为13%左右, 占77% (77/100例) , FGR中Ki-67表达高于正常绒毛组织 (P<0.01) 。

2.2 VEGF在胎盘绒毛中的表达

VEGF蛋白定位于胞浆着色, 定位于胎盘的细胞滋养细胞、合体滋养细胞、血管内皮细胞和绒毛间质细胞, 为棕黄色。VEGF在FGR中低表达的占76% (76/100) , 高表达的占24% (24/100) ;而在正常妊娠绒毛组织中低表达占13% (4/30) , 高表达的占87% (26/30) , FGR中VEGF的表达强度显著低于正常绒毛组织, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.01) 。

2.3 TUNEL指数

凋亡小体 (TI) 的判断:在荧光显微镜下观察, 凋亡小体可见绿色荧光;光镜下, 可见凋亡的细胞变小, 胞膜完整但出现空泡现象, 晚期凋亡小体染色质浓缩, 边缘化, 核膜裂解, 染色质呈块状, 出现核固缩、核碎裂、核溶解。FGR组平均凋亡率为16.35%;正常妊娠为3.78%, 两组比较差异有统计学意义 (P<0.01) , 可见FGR组凋亡明显高于正常妊娠组。

2.4 FGR胎盘绒毛组织中VEGF表达与Ki-67、TI的相关性

免疫组化检测结果显示FGR组织中VEGF表达与Ki-67表达呈负相关 (r=-0.398, P<0.01) , 与绒毛TI表达呈显著负相关 (r=-0.235, P<0.01) , 见附表。

3 讨论

引起胎儿宫内生长受限的因素很多, 但各种因素最后都能引起胎盘绒毛的发育不良或者功能障碍, 而胎盘血管的形成状况对于正常妊娠是至关重要的。近年来有学者对人胎盘微环境的基础研究发现, 胎盘绒毛合体滋养细胞和基质巨噬细胞产生的血管内皮生长因子 (vascular ndothelial rowth actor, VEGF) 具有促进胎盘绒毛血管发生和血管发育的作用[4]。

VEGF存在于各种血管内皮细胞, 在胎盘中还位于胎盘的细胞滋养细胞、合体滋养细胞和绒毛间质细胞, 血管内皮生长因子是一种具有高度保守性的糖蛋白, 具有高度特异性的促血管内皮细胞分裂原[5]。有研究发现, VEGF在受精卵着床过程中发挥重要作用, 并参与整个妊娠期间胎盘生长过程中的血管形成, 妊娠后胎盘组织VEGF m RNA表达与胎盘VEGF水平均有明显上升。在整个孕期胎盘的合体滋养细胞和绒毛滋养细胞均有VEGF表达, 滋养细胞源性VEGF以自分泌方式对滋养细胞的浸润、分化、代谢起作用, 以旁分泌方式促进胎盘床的血管形成和维持胎盘血管的通透性[6,7]。在该研究结果中用免疫组化的方法证实了在FGR患者的胎盘绒毛中VEGF的表达低于正常妊娠组。

在对FGR患者胎盘的各种研究中, 胎盘细胞存在凋亡现象被大多数学者证实, 在该研究结果中, FGR组凋亡明显高于正常妊娠组, 充分证明了在FGR患者中胎盘绒毛细胞存在凋亡促使了FGR的发生。

吴松等[8]研究发现在胎盘绒毛在妊娠晚期FGR组表达的阳性率高于正常妊娠组, 也有研究显示在胎儿生长受限胎盘的细胞滋养细胞存在一种异常增殖, 而导致绒毛基膜物质增多, 血管壁增厚, 管腔狭窄, 在绒毛合体滋养细胞过度凋亡的基础上进一步阻碍母体-胎儿间的物质能量交换, 加重FGR[9]。在该研究中, 在FGR组高于正常妊娠组, 实验结果有统计学意义, 并且和TI呈负相关, 提示胎盘合体细胞的凋亡也可能引起胎盘滋养细胞增殖, 并且在部分FGR的患者, 绒毛间质内霍夫氏细胞增多, 提示部分绒毛成熟障碍, 促进了FGR的发生。

在对FGR胎盘绒毛的VEGF表达和凋亡、增殖的相关性数据比较, 可知FGR组织中VEGF表达与Ki-67表达呈负相关, 与绒毛TI表达也呈显著负相关, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 说明VEGF的表达量的下降有可能引起绒毛细胞凋亡, 也有研究显示FGR患者血清中的VEGF水平较正常妊娠组低[10], VEGF的表达下降可能引起滋养细胞的分化和增殖, 造成滋养细胞侵入功能的障碍, 影响螺旋小动脉的生理变化, 也影响胎盘血管的形成, 造成胎盘血流的减少, 进一步影响胎盘血管内皮细胞的功能, 特别是失去维持小血管正常状态的功能, 造成胎盘供血不足, 缺血缺氧的环境造成胎盘营养缺乏, 引起胎盘细胞的进一步凋亡, 进而胎儿营养缺乏, 导致胎儿FGR的发生。该研究由于存在一定的局限性, 更深层次的相关联系还有嗲进一步分析证实。

摘要：目的 该研究旨在探讨胎儿生长受限 (FGR) 胎盘绒毛内皮细胞生长因子 (VEGF) 的表达与凋亡、增殖的相关性。方法对100例胎儿生长受限患者的胎盘和30例正常胎盘进行病理学分析比较。结果 FGR胎盘中VEGF的表达明显低于正常胎盘 (76/100) ;Ki-67的表达高于正常胎盘 (77/100) ;TI明显低于正常胎盘 (85/100) , 差异均有统计学意义 (P<0.01) 。结论 FGR胎盘绒毛的内皮细胞生长因子的表达和增值因子呈正相关, 与绒毛细胞凋亡指数呈负相关。了解其相关性, 对FGR患者进行围产期干预治疗, 有助于提高围产期胎儿的出生质量, 降低病死率。

关键词：胎儿生长受限,围生儿,胎盘,VEGF,Ki-67,凋亡指数

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表达相关性 篇8

1 材料与方法

1.1 材料

取2004-2006年行胃癌手术并有5年以上完整随访资料的患者病理石蜡切片112例。所做研究均经患者及家属知情同意。其中女32例,男80例,女∶男为1∶2.5;年龄30~82岁,平均59岁。生存期计算:(1)自手术日期至随访截止日期;(2)自手术日期至因肿瘤死亡的日期。胃癌TNM病理分期:参照2010年第七版美国癌症联合委员会(American Joint Committee on Cancer,AJCC)标准[7]。对照组:同期距胃癌肿瘤边缘5 cm以上非肿瘤胃黏膜50例。

1.2 试剂

Hsa-micro RNA-224(38501-05,Exiqon,美国);MK1030敏感性加强型原位杂交检测试剂盒(武汉博士德);即用型DAB显色液:(SP-9000,北京中杉生物制品有限公司)。

1.3 方法

术后胃癌组织标本予10%中性福尔马林固定后,梯度酒精脱水,常规予石蜡包埋,并连续4μm切片再次确认。采用MK1030敏感性加强型原位杂交检测试剂盒检测,80℃恒温烤片过夜,其后予常规脱蜡至水,1∶300稀释hsa-micro RNA-224探针后予原位杂交。严格按原位杂交试剂盒说明书进行实验。其后予组织切片脱水、透明、封片。并予PBS代替一抗做空白对照。

1.4 判定标准

原位杂交结果判定micro RNA-224阳性信号:胞浆出现棕黄色。双盲法评定实验结果:两名资深的病理专家根据染色程度及染色细胞所占百分比分别评定和分析。评分标准如下,(1)切片着色程度判定:不着色0分,着色淡1分,着色适中2分,着色深3分;(2)面积判定:着色细胞的百分比≤5%0分,6%~25%1分,26%~50%2分;≥51%3分;(3)乘积判定:染色程度和染色细胞百分比得分相乘0~1分为(-),2~3分为(+),4~6分为(++),>6分为(+++);(4)结果判定:(-)及(+)为阴性表达,(++)及(+++)为阳性表达[8]。

1.5 统计学处理

采用SPSS 18.0对所得数据进行统计学分析,计数资料以率(%)表示,比较采用字2或Fisher确切概率检验,计量资料以(±s)表示,比较采用t检验,Kaplan-Meier行生存分析,独立预后因素分析采用COX风险模型进行,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 micro RNA-224在非肿瘤胃黏膜组织及胃癌组织切片中表达情况

micro RNA-224的表达部位主要是在胃癌组织的胞浆(图1)。50例非肿瘤胃黏膜组织micro RNA-224阴性表达。112例胃癌组织中55例(49.1%)阳性表达,57例(50.9%)阴性表达。

注:图A:micro RNA-224在非肿瘤胃黏膜组织中的表达(-);图B:micro RNA-224在中分化腺癌中的表达(+++)

2.2 胃癌患者肿瘤组织中micro RNA-224的表达与临床病理特征的关系

micro RNA-224的阳性表达与肿瘤的TNM分期、淋巴结转移、远处转移及浸润深度存在相关性(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤的部位、分化程度、Lauren分型无关(P>0.05)。胃癌组织中micro RNA-224的阳性表达在TNM分期Ⅲ、Ⅳ期、有淋巴结转移、T3~4期和有远处转移的表达明显高于TNM分期Ⅰ、Ⅱ期、无淋巴结转移、T1~2期和无远处转移的患者,差异均有统计学意义(P<0.05),见表1。

2.3 胃癌患者肿瘤组织micro RNA-224的表达与预后的相关性

Kaplan-Meier生存分析示:胃癌患者micro RNA-224在肿瘤组织中阳性表达与其5年生存率存在相关性。其阴性表达与阳性表达相比5年生存率分别为60.0%、21.1%,差异有统计学意义(字2=20.673,P<0.001)(图2)。建立COX回归模型,对可能影响胃癌预后的危险因素:性别、年龄、分化程度、肿瘤大小及部位、Lauren分型、淋巴结转移、远处转移、浸润深度、TNM分期和micro RNA-224表达行COX多因素方差分析,结果显示micro RNA-224的阳性表达及远处转移是影响胃癌患者预后的独立因素,差异有统计学意义(P<0.05)。

3 讨论

微小RNA(micro RNAs)长度约为22个核苷酸,是一类非内源性的非编码小分子RNA。其中约60%位于基因的内含子区域,仅有少数micro RNAs位于蛋白的编码区。成熟的micro RNAs能够形成RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silenced complex,RISC),当靶m RNA的3′末端与其完全互补或接近完全的互补时,它能够通过RISC进而触发m RNA的降解;当它们之间不能够互补配对时,则能够通过调控核糖体阻断m RNA的翻译过程,从而能够控制一系列的生物过程,其中包括细胞的增殖,细胞凋亡和细胞分化[9]。也是由于这个原因,micro RNAs能够通过调节下游编码蛋白的靶m RNA表达起到致癌或抗癌的作用。

在micro RNAs与胃癌的相关性方面近年也做了大量研究,研究发现micro RNAs具有较高的组织特异性。在胃癌患者肿瘤发生发展中,既有致癌性的micro RNAs(如micro RNA-106b-93-25、micro RNAs-21、micro RNAs-10b、micro RNAs-17等)[6],也有抑癌性的micro RNAs(如micro RNA-101c、micro RNA-101、micro RNAs-451、micro RNA-149等)[9]。这提示在胃癌早期诊断和判断预后方面micro RNAs可能是一种非常有效的肿瘤相关标志物,并有可能成为肿瘤发展过程中的筛查手段、治疗靶点及判断预后的依据。

micro RNA-224作为其中一员也成为研究热点,文献[10,11,12]称其在人类多种肿瘤组织中阳性表达,并参与肿瘤形成和发展的调节过程。Ueda等[7]曾报道称micro RNA-224在胃癌组织中阳性表达。但是未有其在胃肿瘤组织中的表达与临床病理特征之间关系及对患者预后影响的报道。

本研究显示,micro RNA-224在非肿瘤胃黏膜组织中的表达均为阴性。而胃癌患者肿瘤组织之中主要表达于肿瘤组织的胞浆内,其阳性率为49.1%(55/112),且阳性表达情况与浸润深度、TNM分期、淋巴结转移和远处转移存在相关性,差异均有统计学意义(P<0.05),其关系仍需进一步研究;而与患病年龄、肿瘤的部位、大小、分化程度等无相关性(P>0.05)。Kaplan-Meier生存分析亦显示,胃癌患者肿瘤组织中阳性表达者相对于阴性表达者总体5年生存率明显降低,差异有统计学意义(P<0.001),其阳性表达影响患者生存。进一步行COX多因素分析显示micro RNA-224的阳性表达是胃癌的独立预后因素之一。这些结果表明micro RNA-224可能在促进胃癌患者肿瘤的发生、发展、肿瘤浸润和转移等方面发挥了重要的作用,其阳性表达预示预后不良。此外micro RNA-224在胃癌的较早阶段亦有统计学差异,也许可以作为早期诊断的标记物。micro RNA-224在胃中的调控机制尚未清楚,但目前Mees等[10]研究发现micro RNA-224在胰腺导管肿瘤中,能够通过调控CD40的表达进而在胰腺导管癌中发挥着作用;Gokhale等[11]研究发现其通过WNT通路在成神经管细胞瘤中起到调控的作用;Li等[13]的研究表明micro RNA-224在Hep G2细胞内通过调控PAK4以及MMP9表达进而起到促进肿瘤细胞扩增、侵袭及迁移的作用;而在卵巢癌的发生发展中通过调控KLK蛋白表达,起到调控卵巢肿瘤细胞增殖的作用[12]。也许在胃癌的发生发展中也有同样的分子机制、通路及作用蛋白靶点的存在,需要进一步的研究。

总之,micro RNA-224在胃癌患者肿瘤组织中的表达与肿瘤TNM分期、浸润深度、淋巴结转移、远处转移存在相关性,其阳性表达患者的5年生存率低,提示其阳性表达与胃癌患者预后相关,并是影响胃癌患者的预后独立因素之一。但胃癌的发生、发展、浸润、转移是多种基因及机制共同作用的结果[14,15,16],仍需要进一步的探索。

摘要：目的:探讨micro RNA-224于胃癌组织中的阳性表达与患者临床病理特征及预后的相关性。方法:应用原位杂交技术检测micro RNA-224在50例石蜡固定癌旁非肿瘤胃黏膜组织及112例石蜡胃肿瘤组织切片中的表达情况,分析其与肿瘤患者各病理参数及预后的相关性。原位杂交按照原位杂交试剂盒的说明书进行。结果:micro RNA-224在胃癌组织中阳性表达率49.1%(55/112),癌旁非肿瘤胃黏膜组织中阴性表达。其阳性表达与TNM分期、淋巴结转移、远处转移及浸润深度存在相关性(P<0.05),而与性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤的部位、分化程度、Lauren分型无关(P>0.05)。micro RNA-224阴性表达比阳性表达者5年生存率高,差异有统计学意义(P<0.001)。经COX多因素分析显示:micro RNA-224的表达是影响胃癌患者预后的独立因素之一(P<0.05)。结论:micro RNA-224在肿瘤组织中阳性表达与TNM分期、淋巴结转移、远处转移及浸润深度密切相关,是影响胃癌患者预后的独立因素之一。

表达相关性 篇9

1材料与方法

1.1 样本

收集本院2009年1月至2010年10月手术切除且临床资料完整的50例胆管癌标本(胆管癌组),患者术前均未行放疗及化疗,术后经病理学证实组织类型为胆管腺癌。其中,男34例,女16例,年龄37～83岁,中位年龄60岁。同期收集50例经病理学证实的正常胆管组织标本作为对照组,正常对照与病例组在年龄和性别方面差异无统计学意义,具有可比性。

1.2 试剂及方法

兔抗人MMP-9多克隆抗体和鼠抗人VEGF多克隆抗体购自武汉博士德生物工程有限公司;DAB显色试剂盒购自沈阳博尔美公司。应用免疫组织化学SP法检测50例胆管癌组织和50例正常胆管组织中VEGF和MMP-9的表达,分别用已知的MMP-9和VEGF染色阳性的肿瘤组织作阳性对照,以PBS代替一抗,做阴性对照,操作严格按照说明书进行。

1.3 结果判定

先按染色强度评分:基本不着色为0分,浅黄色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;然后每张切片随机取10个高倍镜视野(×400),每高倍镜视野计数100个细胞,计算出每个视野阳性染色细胞的百分数,并取其平均值进行评分:无阳性细胞为0分,阳性细胞<10 %为1分,≥10 %为2分,≥30 %为3分,≥70 %为4分;最后将阳性率评分与强度评分相乘,所得之积为该组织的免疫组化最终评分,乘积>3分为免疫组化反应阳性[3]。阅片均由同一病理医师完成。

1.4 统计学处理

所有数据使用SPSS 13.0统计软件包分析,组间比较采用χ2检验,相关性检验采用Spearman相关分析,以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1 VEGF和MMP-9的表达

VEGF和MMP-9在胆管癌中的阳性表达率高于正常胆管组织,差异具有统计学意义。详见表1。

2.2 VEGF与MMP-9表达的相关性

经Spearman等级相关分析,胆管癌组织VEGF表达与MMP-9表达呈正相关,r=0.327,P<0.05。详见表2。

3讨论

血管芽生成新的毛细血管是肿瘤发生、发展所必需的病理过程。有研究表明,在没有新生血管生成以前,肿瘤只生长到1～2 mm,并不发生转移,而新血管生成后肿瘤成数倍增长并转移[4]。VEGF在肿瘤血管生成中处于核心地位[2],VEGF在肿瘤细胞和培养的肿瘤细胞中均高表达,可通过抑制内皮细胞凋亡而引起内皮细胞的增殖和迁移,诱导血管生成,为肿瘤细胞提供氧气和水分,从而促进肿瘤的生长和转移。本研究显示VEGF在胆管癌中高表达,提示VEGF可能与胆管癌的发生发展密切相关。MMPs是一蛋白水解酶家族,与肿瘤侵袭转移关系十分密切。MMP-9是MMPs家族中的重要一员,又名Ⅳ型胶原酶或明胶酶,能降解弹性纤维及纤维粘连蛋白等基底膜和细胞外基质成分;还能降解Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型胶原,从而促进肿瘤的恶性演变[5]。本研究结果显示VEGF和MMP-9在胆管癌中均过度表达并呈正相关关系,说明二者可能在胆管癌的发生、发展过程中有协同作用。若联合检测MMP-9和VEGF的表达水平,对胆管癌的诊断可能具有重要意义。

参考文献

[1]Polette M,Nawrocki-Raby B,Gilles C,et al.Tumor inva-sion and matrix metalloproteinases[J].Crit Rev Oncol He-mat,2004,49(3):179-186.

[2]Kaio E,Tanaka S,Kitadai Y,et al.Clinical significance of angiogenic factor expression at the deepest invasive site of ad-vanced colovectal carcinoma[J].Oncology,2003,64(1):61-73.

[3] Wang JX,Zheng S.Caspase-3 and survivin expression in pediatric neuroblastoma and their roles in apoptosis [J].Chin Med J(Engl),2004,117(12):1821-1824.

[4]Lu YP,Zhang AL,Wang SX,et al.Role of vascular endothe-lial growth factor overexpression in ovarian tumor invasionand mechanism[J].Chin J Obstet Gynecol,2002,37(5):147-157.

表达相关性 篇10

1 材料与方法

1.1 标本

收集2011-12~2014-01经病理证实的喉癌标本72例, 及正常喉部黏膜组织10例。其中I期患者2例, Ⅱ期患者14例, Ⅲ期患者27例 (T1N1M0患者3例、T2N1M0患者4例、T3N0M0患者20例) Ⅳ期患者29例 (T4N2M0患者2例、T4N3M0患者2例、T4N1M0患者6例、T4N0M0患者19例) ;声门上型22例、声门型41例、声门下型9例。所有病理均为行放化疗治疗。

1.2 试剂

Survivin和caspase-7试剂盒均由上海生工公司提供。

1.3 检测步骤

严格按照说明书进行操作, 对材料进行取材、固定、包埋及脱水脱蜡等操作;使用3%H2O2孵育样品10min, 灭活内源性过氧化物酶;使用PBS冲洗样品后滴加封闭液孵育15min;滴加一抗, 4℃过夜;使用PBS冲洗样品后滴加二抗, 37℃孵育15min;使用PBS冲洗样品后滴加DAB显色液, 避光孵育5min。

1.4 结果判定

显微镜下观察不同样品的染色强度, survivin和caspase-7染色阳性细胞的细胞质以黄色或棕黄色为主。对染色层度进行计分:无色计0分, 淡黄色计1分, 黄色计2分, 棕黄色计3分。每个样品随机选取5个不重复事业, 计算阳性细胞所占比重及阳性计分, 无阳性细胞计0分, 0%~10%计1分, 10%~50%计2分, 50%~75%计3分, >75%计4分。

1.5 统计学方法

采用SPSS 18.0软件分析, 计数资料采用χ2检验, 相关分析采用Spearman相关分析法。P<0.05为具有统计学差异。

2 结果

2.1 survivin和caspase-7在喉癌组织及正常组织中的表达

survivin及caspase-7在喉癌组织中的阳性率均与喉正常组织存在统计学极显著差异 (P<0.01) , 见表1。

由上表可知, 在两种蛋白的表达水平比较中发现, 在喉癌组织中, survivin及caspase-7的表达阳性率均与喉正常黏膜组织存在极显著差异 (P<0.01) , 其中survivin表达量显著增加, caspase-7表达量显著降低。提示, survivin及caspase-7的表达与喉癌的发生具有相关性。

2.2 survivin及caspase-7在喉癌组织中的表达与喉癌分级分期的关系

不同的喉癌的发生部位及不同分化程度喉癌组织中survivin及caspase-7的阳性率均存在显著差异, 见表2。

由上表可知, survivin及caspase-7的阳性率在不同发病部位及不同临床分期均具有统计学差异 (P<0.05, P<0.01) 。在不同部位的喉癌类型比较中发现, 声门下型的survivin阳性率最高而声门型最低;而在caspase-7阳性率的比较发现, 其在声门型中的表达率最高, 而声门上型的表达率最低。在不同临床分期的比较中发现, 随着临床分期的升高, survivin的阳性率也随之升高, 而caspase-7则呈现相反的趋势, 随着病情的严重, 表达率逐渐下降。

2.3 survivin及caspase-7表达的相关性

在喉癌组织中, survivin及caspase-7的表达具有显著相关性 (r=0.631, P<0.05) , 两者呈负相关, 见表3。

r=0.631, P<0.05, 两者负相关。

由上表可知, survivin的表达与caspase-7的表达负相关, 在喉癌组织中survivin阳性而caspase-7阴性的概率最高, 说明在喉癌组织中普遍呈现survivin表达而caspase-7不表达的现象。且证实survivin的表达与caspase-7的表达负相关。可作为临床检测依据。

3 讨论

目前, 对肿瘤的认识已得到了巨大的发展, 大部分研究者均认为喉癌及其他种类的发生不仅是细胞的复制功能不受调控导致复制过快, 其发生也与细胞凋亡比例降低相关[4]。Survivin是一种已知的功能最为强大的凋亡一直因子, 与多种肿瘤的发生具有密切关系[5]。Survivin可抑制细胞凋亡途径中的caspase-7蛋白活性发挥抗凋亡作用, 其在多少恶性肿瘤组织中均有表达, 而在正常组织中表达量极低或不存在表达[6]。而caspase-7蛋白则是细胞凋亡途径中的重要蛋白之一, 参与了细胞凋亡的发生, 当caspase-7蛋白的表达及活性受到抑制时, 细胞凋亡的发生便会受到抑制[7~9]。目前尚无研究对喉癌组织的Survivin及caspase-7的表达关系进行研究, 仅有对喉癌组织中survivin和VEGF的表达研究, 或其他癌症中survivin和caspase-7的研究[10,11]。因此, 研究Survivin及caspase-7在喉癌组织中的表达关系, 对了解喉癌、治疗喉癌具有重要意义。

研究证实, 喉癌组织中的survivin蛋白表达量显著提高, 提示survivin表达量的升高可能是喉癌发生的原因之一, 且通过不同临床分期喉癌组织中survivin表达量的对比研究发现, 随着临床分期的增加, 患者survivin的表达量也随之增加, 这一结果与其在其他癌症中的表现相符。而caspase-7的表达量则是与survivin相反, 其在健康人群的喉组织中的检测率为100%, 提示其是细胞凋亡途径中的重要组成部分, 当caspase-7的表达受到抑制时便会导致癌症的发生。同时, 研究对survivin以caspase-7的相关性研究证实了在喉癌组织中survivin的表达与caspase-7的表达负相关。可能的原因是survivin的表达不仅抑制了caspase-7的活性, 同时对caspase-7的表达产生了负面影响。

综上所述, 在喉癌组织中Survivin及caspase-7的表达与在正常组织细胞中存在有统计学极显著差异 (P<0.05) 。Survivin与caspase-7的表达负相关, 提示可能是survivin的过量表达不仅抑制了caspase-7的活性, 不同抑制了caspase-7的表达, 从而导致了癌症的发生。

参考文献

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[6]Altieri D C.12Survivin[J].Targeted Therapies in Oncology, 2013, 197

[7]李珂, 郝艳, 王建亭, 等.Omi/HtrA2和caspase-7在喉癌组织中的表达及相关性[J].山西医科大学学报, 2011, 42 (7) :583-586

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[9]Lamkanfi M, Kanneganti T D.Caspase-7:aprotease involved in apoptosis and inflammation[J].The International Journal of Biochemistry&Cell Biology, 2010, 42 (1) :21-24

[10]白云飞, 覃洁, 彭诗东.喉癌组织中Survivin和VEGF的表达及其临床意义[J].中国耳鼻咽喉颅底外科杂志, 2012, 18 (1) :5-9

表达相关性 篇11

资料与方法

随机选取2006年10月～2010年3月手术切除胰腺癌标本40例。

试剂及方法：兔抗人β2-AR多克隆抗体原液0.1ml；鼠抗人MMP-2、VEGF单克隆抗体、PV-6000二步法检测试剂盒及DAB显色试剂盒。采用PV-6000二步法进行免疫组化染色，具体操作步骤按说明书进行。

结果判定：β2-AR、MMP-2、VEGF均以细胞浆内出现黄色或棕黄色颗粒为阳性着色。采用双盲法判定四者的阳性表达，每张切片随机选择10个400倍视野，每个高倍视野计数100个癌细胞，阳性细胞百分率计分：着色细胞占计数细胞百分率≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，＞50%为3分。着色强度计分：无色为0分，淡黄色为1分，黄色为2分，棕黄为3分。最后得分为上述二者的乘积：0～1分为阴性(-)，2～3分为弱阳性(+)，4～6分为中阳性(++)，6分以上为强阳性(+++)。

统计学处理：使用SPSS16.0统计软件进行统计学分析。相关性分析采用Spearman等级相关性检验，P＜0.05为差别有统计学意义。

结果

β2-AR、MMP-2及VEGF在胰腺癌中的表达：β2-AR、MMP-2及VEGF主要表达于肿瘤细胞的胞浆。40例胰腺癌组织中β2-AR、MMP-2及VEGF阳性表达率分别为77.5%(31/40)、70.0%(28/40)、62.5%(25/40)。

胰腺癌组织中β2-AR与MMP-2、VEGF表达的相关性：经Spearman等级相关分析发现，在胰腺癌组织中β2-AR与MMP-2、VEGF的表达呈显著正相关(r=0.450、0.611，P＜0.05)。见表1。

讨论

精神心理因素可以影响肿瘤生长和转移［1，2］，已在临床工作中逐渐引起大家的注意和重视。郭坤等人证实了β受体在去甲肾上腺素(NE)诱导胰腺癌细胞侵袭能力增强的发展过程中发挥重要作用，NE通过β受体介导上调MMP-2、MMP-9和VEGF的表达进而增强胰腺癌细胞的侵袭能力［3］。国外研究证明，β1和β2受体存在于胰腺癌细胞株Panc-1、BxPC-3和永生化胰腺细胞HPDE6-c7中，并且胰腺癌细胞表面β2受体多于β1受体的表达，这也支持β2-AR在胰腺癌的发展中起着重要的作用。

本实验结果表明，β2-AR在胰腺癌组织中有较高的阳性表达(77.5%)，本实验经Spearman等级相关分析发现，在胰腺癌组织中β2-AR和MMP-2以及β2-AR和VEGF的表达呈显著正相关，提示肿瘤细胞微环境中交感神经兴奋而释放的NE，以及应激时由肾上腺髓质分泌的去甲肾上腺素通过其受体β2-AR上调MMP-2和VEGF的表达从而增强胰腺癌细胞的侵袭转移能力，这与前人所得的结论相符［4］。

综上所述，β2-AR在40例胰腺癌组织中高表达，β2-AR通过与其相应的配体结合可上调MMP-2、VEGF水平，从而诱导肿瘤细胞迁移，促进胰腺癌细胞向周围侵袭以及淋巴结或远处器官的定向转移。

参考文献

1 李建,況小红,张才全,等.慢性束缚应激对昆明小鼠MFC移植瘤血管形成的影响［J］.四川医学,2008,29(3):262-263.

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3 郭坤,马清涌,胡恒通,等.β受体在人胰腺癌细胞株中的表达及其在细胞侵袭中的作用［J］.中华实验外科杂志,2009,26(7):827-829.

4 吴凤英,欧周罗,邵志敏.经典神经递质与肿瘤转移［J］.国外医学·肿瘤医学分册,2005,32(9):678-680.

表达相关性 篇12

脂肪肥胖相关基因(FTO)是T.M.Frayling等[10]在寻找2型糖尿病致病基因时新发现的人类肥胖相关基因,定位于人类16号染色体长臂上,包含9个外显子,共410 507个碱基。FTO能编码核酸去甲基化酶,可通过修饰基因的甲基化位点进而调节基因的表达[11]。研究表明,FTO在人体和小鼠组织发育各阶段均广泛表达,且在下丘脑和垂体中高表达,是调控脂肪沉积的关键基因之一。动物模型研究表明,敲除FTO后小鼠表现出生长缓慢、脂肪组织显著减少[12],而过表达FTO的小鼠则表现为摄食量增加、体重增加[11]。

试验以成都麻羊为研究对象,采用实时荧光定量PCR方法检测FTO在各组织中的表达规律,并对肌肉组织中FTO的相对表达量与IMF含量进行相关性分析,为进一步阐明FTO在肌内脂肪沉积过程中的作用提供重要数据。

1 材料

1.1 试验动物及样品采集

2.5岁健康成都麻羊公羊6只,购自四川茂县山丘农户。快速无菌活体采集心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪、背最长肌、股二头肌、臂三头肌组织样品,3 g/只,放入EP管中液氮速冻,转入-80℃冰箱保存,备用。同时各采集300 g/只背最长肌、股二头肌、臂三头肌用于肌内脂肪含量测定。

1.2 主要试剂及仪器

TRIzol、荧光定量试剂盒SYBRPremix Ex TaqTM(2×),由Ta KaRa公司生产;反转录试剂盒Revert AiddFirst Strand c DNA Synthesis Kit,由Thermo公司生产;石油醚,由成都康迪生物技术有限公司生产;PCR仪、离心机,由Eppendorf公司生产;超净工作台,由苏州安泰空气技术有限公司生产;索氏提取仪,由北京盈盛恒泰科技有限公司生产;核酸蛋白定量仪,由西南民族大学生命科学与技术学院实验室提供。

2 方法

2.1 引物的设计

使用Primer Premier 5.0软件设计FTO与内参基因(GAPDH)的扩增引物,由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。基因登录号、引物序列、产物长度见表1。

注:GAPDH为3-磷酸甘油醛脱氢酶。

2.2 样品总RNA的提取及反转录

用TRIzol试剂提取9种组织样品总RNA,用核酸蛋白定量仪测定OD260/OD280值,OD260/OD280=1.8~2.0,并经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定其完整性后备用;根据反转录试剂盒Revert Aid First Stranddc DNA Synthesis Kit说明书进行操作,反转录获得c D-NA,-20℃保存,备用。

2.3 实时荧光定量PCR

以上一步反转录获得的9种组织c DNA及表1中设计的FTO引物,使用Bio-Rad CFX96TM荧光定量PCR仪进行实时荧光定量PCR,每个样品设3个重复。反应体系(20μL):c DNA 1μL,上、下游引物各1μL,RNase Free dd H2O 7μL,SYBRPremix ExxTaqTM(2×)10μL。实时荧光定量PCR反应条件为:95℃3 min;95℃10 s,60℃20 s,72℃30 s,共39个循环;72℃10 min。内参基因GAPDH以同样方法进行实时荧光定量PCR(Tm=60℃)。

2.4 IMF含量的测定

采用索氏化学抽提法测定背最长肌、股二头肌、臂三头肌中IMF含量,每个样品设3个重复。IMF含量(%)=(x-y)/x×100%。式中:x为未浸提前样品干重,y为浸提后的样品干重。

2.5 数据的统计分析

采用2-ΔΔCt法对数据进行统计分析,ΔCt(目的基因)=Ct(目的基因)-Ct(内参基因),ΔΔCt=ΔCt(样品组)-ΔCt(脂肪组)。用SPSS 18.0进行单因素方差分析和相关分析,结果以“平均值±标准误”表示。

3 结果与分析

3.1 FTO的组织表达

结果见图1。

注:图中大写字母完全不同表示差异极显著(P<0.01),小写字母不同表示差异显著(P<0.05),含相同大写字母表示差异不显著(P>0.05)。

由图1可知,FTO在肝脏、脾脏、肺脏、肾脏中高表达,且脾脏中相对表达量最高(2-ΔΔCt=1.93±0.28),显著高于脂肪组织(P<0.05),极显著高于背最长肌、股二头肌、臂三头肌、心脏(P<0.01)。

3.2 IMF含量的测定及其与FTO相对表达量的相关性分析

结果见表2。

注:同列数据肩标小写字母不同表示差异显著(P<0.05),小写字母相同或无肩标表示差异不显著(P>0.05),*表示差异显著(P<0.05)。

由表2可知:成都麻羊背最长肌IMF含量显著高于股二头肌、臂三头肌(P<0.05);背最长肌、股二头肌中FTO相对表达量与IMF含量呈不显著正相关(P>0.05),臂三头肌中FTO相对表达量与IMF含量呈显著负相关(P<0.05)。

4 讨论

4.1 FTO组织表达分析

FTO自2007年被发现,关于FTO诱导肥胖症及2型糖尿病等相关疾病发生的作用机制已有广泛研究。FTO可能通过控制饮食调节机体能量摄入,进而导致肥胖的发生[13]。T.M.Frayling等[10]、T.Gerken等[14]、R.Fredriksson等[15]研究表明,FTO在人体和小鼠体内均广泛表达。本研究表明,FTO在山羊各组织中均广泛表达,与其研究结果一致。范红旗等[16]在研究FTO过表达对小鼠β胰岛细胞功能的影响以及全基因组表达谱变化研究中发现,FTO过表达的小鼠胰岛细胞中有多达922个基因的表达受到影响,差异表达基因的GO分析提示,差异基因可能主要参与了G蛋白偶联受体的信号通路、NF-κB信号通路和免疫反应等重要生物学功能。脾脏是机体最大的免疫器官,本研究表明,FTO在脾脏中相对表达量最高,说明FTO可能通过影响免疫相关基因的表达间接参与了机体免疫调控。

4.2 肌肉组织IMF含量分析及其与FTO相对表达量的相关性分析

谢恺舟等[17]在研究海门山羊羊肉中肌苷酸与肌内脂肪沉积规律中发现,在海门山羊公羊、海门山羊母羊、波尔山羊×海门山羊F1代公羊3个群体中,均以背最长肌IMF含量最高,与本试验结果相一致,表明背最长肌具有最强的肌内脂肪沉积能力。

羊肉肌内脂肪沉积受多基因调控,如HSL、H-FABP、PPARγ、MC4R等[7,18,19]。目前,关于山羊FTO与肌内脂肪含量之间的相关性研究还很少。试验结果表明,肌肉组织(背最长肌、股二头肌、臂三头肌)中FTO相对表达量与IMF含量均呈一定相关性。范红旗等[16]研究表明,FTO过表达的小鼠胰岛细胞中Arid5b基因和Lpin2基因表达量均显著上调,Ar-id5b基因参与了脂肪细胞的分化和脂垫的形成,Lpin2基因则参与了长链脂肪酸的代谢过程。M.Merkestein等[20]研究表明,FTO能通过增强促脂肪生成因子RUNX1T1的表达来调节脂肪前体细胞的有丝分裂,影响脂肪生成,这在一定程度上揭示了FTO调控脂肪沉积的分子机制。然而,关于FTO相对表达量与IMF含量在背最长肌与股二头肌中呈正相关,而在臂三头肌中呈显著性负相关的作用机制尚不清楚,还需要进一步的研究。

5 结论

试验研究了成都麻羊FTO的组织表达差异,结果表明:在脾脏中相对表达量最高,显著高于脂肪组织(P<0.05),极显著高于背最长肌、股二头肌、臂三头肌、心脏(P<0.01);成都麻羊FTO相对表达量与肌肉组织(背最长肌、股二头肌和臂三头肌)中IMF含量均呈一定相关性。试验结果为进一步探讨山羊FTO在肌内脂肪沉积过程中的作用提供了重要数据。

摘要：为了研究脂肪肥胖相关基因(FTO)在成都麻羊不同组织中的表达水平以及肌肉组织中FTO相对表达量与肌内脂肪(intramuscular fat,IMF)含量的相关性,试验采用实时荧光定量PCR方法检测FTO在成都麻羊各组织中的表达水平,采用索氏化学抽提法测定肌肉组织中IMF含量。结果表明:FTO在各组织中广泛表达,在脾脏中表达量最高,显著高于脂肪组织(P<0.05),极显著高于背最长肌、股二头肌、臂三头肌、心脏(P<0.01)。成都麻羊背最长肌IMF含量显著高于股二头肌、臂三头肌(P<0.05);背最长肌、股二头肌中FTO相对表达量与IMF含量呈不显著正相关(P>0.05),臂三头肌中FTO相对表达量与IMF含量呈显著负相关(P<0.05)。说明FTO可能对山羊肌内脂肪沉积有重要调控作用。