生长增殖（精选7篇）
生长增殖 篇1
0 引言
凝集素(phytohemagglutinin,PHA)是一种非免疫原性蛋白质,广泛存在于动植物及微生物中。豆类植物种子的PHA含量尤为丰富,由2或4个单体组成,一个糖结合位点[1]。于敏等提取和比较8种豆类PHA凝集作用的研究发现芸豆PHA的凝集血细胞的效果最强,说明芸豆中PHA含量较高[2]。
多种动物的许多类细胞膜上可检测到具有糖结合专一性的蛋白质,且在其它生物体包括病毒、细菌、粘菌、真菌等的细胞膜上也存在具有糖结合专一性的蛋白质[1]。这使得PHA与多种细胞发生作用成为可能。研究表明,PHA除具有凝集血细胞、淋巴细胞、纤维细胞、精子等的作用,且具有抗癌及抑制病毒的作用[3,4,5]。作者实验室研究发现,芸豆PHA可有效抑制小鼠受精、胚胎着床,终止早、中晚期妊娠小鼠的胚胎发育[6,7]。张丽芬等人研究可知低浓度芸豆PHA可加快小鼠胚胎发育速度[8]。Wei-Ting Kuo等[9]发现PHA对肺癌细胞存在剂量依赖性抑制作用且随剂量增加肺癌细胞的凋亡现象越明显。棉花PHA对根际促生细菌菌株的胞外多糖具有凝集作用[10]。王军等的琼脂纸片扩散法抗真菌活性测定实验发现WKBLD对真菌呈现出一定的抑制作用[11]。
而PHA对细菌和真菌的具体作用效果及对剂量依赖性尚未有明确的说明。因此本实验主要以细菌乳酸菌(Lactobacillus)及真菌盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)为研究对象,分别采用纸片扩展法及液体振荡培养法探究芸豆PHA对细胞生长增殖的影响及剂量效应关系,以期从多个成面阐述芸豆PHA对不同种类生物细胞生长及增殖的作用,确定剂量效应关系。为了解相关的信号转导、调控机制及其药用价值的研究和开发提供理论和实验依据。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
芸豆PHA:从云南丽江产白芸豆中提取,双缩尿法测蛋白质含量,Sigma公司标准检测凝集效价为1 /256,即4 μg/mL。提取液经0.22 μm滤膜过滤后4 ℃存放待用[8]。
乳酸菌(Lactobacillus):昆明雪兰牛奶有限责任公司生产的原味酸奶中分离纯化得保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)。
盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum):野生型AX2细胞,美国加州大学(UC Davis)再生医学实验室赵敏教授惠赠。
1.1.2 试剂
蛋白胨(Proteose Peptone)、酵母粉(YEAST EXTRACT)、牛肉浸膏 均为分子生化级(BR),Oxoid公司;硫酸链霉素(医药注射产品批号:120109,山东鲁抗医药股份有限公司);
KH2PO4、K2HPO4、MgSO4 、MnSO4 、葡萄糖、(NH4)2COOH、Tween-80、Na2HPO4·7H2O均为分析纯,天津市化学试剂三厂;琼脂(食品级,石狮市狮头琼脂有限公司)。
1.1.3 仪器
Motic倒置显微镜(型号:AE2000 麦克奥迪公司产地:厦门);YPW-I全温度摇瓶柜(型号:SF11025AT 上海通特电讯设备厂)PN:11025B2H。血球计数板、玻璃培养皿、24孔培养板、锥形瓶。
1.1.4 培养基
MRS固体培养基[12]和HL-5液体培养基[13]。
1.2 方法
1.2.1 纸片扩展法观察芸豆PHA对乳酸菌增殖的影响
将芸豆PHA配成0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0 mg/mL 7个浓度实验组和1个生理盐水对照组。以纸片扩展法将含不同浓度芸豆PHA滤纸片(d=9 mm)贴到已涂布乳酸菌的MRS固体培养基中,每个浓度4个平行,37 ℃恒温培养箱中培养。每12 h观察一次乳酸菌增殖情况并拍照记录,培养72 h结束。重复实验3次。分析芸豆PHA对乳酸菌增殖的影响。
1.2.2 不同浓度芸豆PHA对盘基网柄菌增殖的影响
配制含芸豆PHA分别为0.1、0.25、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 mg/mL 7个浓度梯度的HL-5液体培养基备用,对照组为纯培养基。
1)振荡液体培养法检测芸豆PHA对盘基网柄菌增殖的影响:
以2.2×105 个·mL-1细胞密度接种于含不同浓度芸豆PHA培养基中,每个浓度3个平行样,于22 ℃、180 r/min振荡培养。血球计数板计数法每12 h记录一次细胞密度,培养108 h结束。重复实验5次,计算各时段细胞密度比。
细胞密度比=各实验组细胞密度/对照组细胞密度
2)贴壁培养观察芸豆PHA对盘基网柄菌生长的影响:
在24孔板中每孔铺1.1×105个细胞,以含不同浓度芸豆PHA的HL-5培养基室温(20℃左右)贴壁培养,每个浓度3孔。12 h后观察盘基网柄菌生长情况,连续拍照并通过imageJ图像处理软件处理照片观察盘基网柄菌的生长状态及运动情况。实验重复5次。
2 结果与分析
2.1 不同浓度PHA对乳酸菌生长的影响
纸片扩展法实验观察结果知:1.0 mg/mL组培养12 h滤纸片周围有少量大菌落形成,对照组及其余各组滤纸片周围无大菌落出现(图1);继续培养,各实验组滤纸片周围均出现生长圈,对照组则无(图2)。结果分析表明:1.0 mg/mL组12h时最先对乳酸菌表现促进作用;增加培养时间各实验组与对照组比均表现出对乳酸菌增殖的促进作用,各剂量组差异不明显。
2.2 不同浓度芸豆PHA对盘基网柄菌增殖的影响
2.2.1 振荡液体培养结果
由图3可知,培养早期小于等于2.5 mg/mL各组的细胞密度明显高于对照组,24h时比值达到最大,其中1mg/ml组达2.25。继续培养低剂量各组均比对照组细胞密度增加快,而5.0、10.0 mg/mL组细胞密度不随时间的变化而改变。结果表明:低浓度芸豆PHA可加快盘基网柄的分裂增殖具有促进作用,高浓度的芸豆PHA对盘基网柄菌增殖具有抑制作用。
2.2.2 贴壁培养盘基网柄菌12 h结果
如图4所示,采用imageJ软件对各组连续拍摄照片进行处理发现,和对照组比含0.1~2.5 mg/mL芸豆PHA组盘基网柄菌生长和运动均正常,差异不明显。5.0、10.0 mg/mL高剂量组中细胞无运动现象,细胞体发黑表现为死亡状态。
3 讨论
在人体内乳酸菌是一种益生菌,其正常的生长繁殖对人类的健康具有重要意义。例如细菌性阴道病(BV)是由于阴道微生态平衡失调,厌氧菌和阴道加德纳菌生长过盛,兼性厌氧性乳酸杆菌受抑制所引起的育龄期妇女常见的一种无阴道黏膜炎症表现的感染性疾病[14,15]。因此,提高阴道乳酸菌数量,维持正常的阴道微生态平衡就成为治疗细菌性阴道病的关键。并且乳酸菌还具有良好的保健和医疗效果,具有阻止致病菌的定植,刺激肠道粘膜免疫功能,降低胆固醇水平,维持肠道菌群平衡等功能[16]。我们的实验结果显示芸豆PHA对乳酸菌增殖具有明显的促进作用,这与付弘贇[17]等乳酸菌为降解PHA的优势菌的结论是相呼应的。
近年来,条件致病性真菌感染的发病率和死亡逐渐增多,而感染的发生和病原体的致病力、宿主的防御力密切相关[18]。盘基网柄菌作为一种简单的真核微生物,当食物供给已经耗尽或食物暴露时,盘基网柄菌便会形成和释放孢子细胞而执行无性繁殖的功能,使其能适应不利的环境条件而存活。实验在液体振荡及贴壁培养盘基网柄菌中发现高浓度芸豆PHA可有效抑制并杀死盘基网柄菌。这与王军[11]等的结论不完全相同,可能由实验菌种的选着及方法差异造成的,但本文方法更加准确直观地反映芸豆PHA对盘基网柄菌的作用效果接下来可对多种真菌进行实验,探讨芸豆PHA对真菌增殖影响的普遍意义。张丽芬等在小鼠胚胎的体外培养中发现,芸豆PHA在50~100 μg/mL的浓度时可促进胚胎的发育,在1~2 mg/mL时会导致胚胎细胞出现副凋亡(Paraptosis);而浓度提高到2 mg以上会导致细胞膜破裂[8]。
从目前的相关研究结果来看,芸豆PHA的确具有广泛的调节作用,表现为:第一,对不同种类的生物都具有影响,从低等生物到高等动物都可产生影响;第二,具体的影响或调节结果存在剂量-效应的密切相关作用。因此其信号转导通路应该是一种存在时间很早的共同调节通路,对不同种类的生物具有广泛的影响作用,作为药物来说,也使得其应用范围具有广泛性。在哺乳动物,凝集素信号途径作为补体激活的三条途径之一发挥作用[19]。真菌细胞壁广泛存在β-葡聚糖和α-甘露糖,而Dectin-1和2可分别识别β-葡聚糖和α-甘露糖,从而在真菌免疫中发挥重要作用[20]。
PHA同时具有受精抑制、早中晚期妊娠抑制、结合病原体以及可有效提高机体的免疫水平的作用,综上所述,芸豆PHA作为一种蛋白质类物质在一定剂量范围内不仅具有具有很好的避孕效果、促进阴道有益菌乳酸菌生长、防止性传播疾病的作用,也同时可能具有治疗真菌感染和调节抗真菌免疫的作用也有助于对其信号通路的认识和深入研究。
生长增殖 篇2
尚未对2005和2006年增殖放流的日本对虾进行过系统的研究,只进行了生产回捕统计,回捕率分别为3.50%和1.69%,增殖效果不太稳定,因此,对放流虾的生长进行研究就显得十分必要。目前,已有学者对复洲湾和黄海北部放流日本对虾的生长特性进行了研究[1,2]。但是不同的放流时间和放流规格会对增殖效果产生显著影响[2],为了进一步确定合理的开捕日期,合理利用资源,以及对今后放流日本对虾的生产和管理提供科学的依据,笔者对2007年古镇口湾放流虾群体的生长进行了研究。
1 材料与方法
在古镇口湾海区放流日本对虾后,于2007年8月3日～10月26日,用渔船进行跟踪回捕调查。根据放流地点,在古镇口湾设置4个调查断面,每个断面设2个取样站位,共8个采样站位(图1),B1、B2为放流站位,A1～A8为调查取样站位,每隔2周调查取样1次,共进行了7次调查,调查采用底拖网,根据日本对虾晚上活动觅食,白天潜沙的生活习性[3],拖网调查在晚上20时至早晨6时进行,每网的拖网时间为0.5 h,并对所取得的样品进行了体长、体重等生物学测定。
按雌、雄分别分析放流日本对虾体长与体重的关系。根据各批日本对虾的平均体长和体重,应用STATISTICA 6.0以von Bertalanffy生长方程拟合雌雄个体体长、体重与日龄的函数关系,并研究分析放流日本对虾的生长特性。
2 结果
2.1 体重与体长的函数关系
古镇口湾放流日本对虾体重与体长呈幂函数关系。
雄性:W=4.7948×10-5L2.6940 (R=0.9985)
雌性:W=1.7925×10-5L2.9030 (R=0.9988)
由图2可以看出,同体长的雌雄日本对虾个体体重相差不大。
2.2 一般生长型
2.2.1 生长方程
用直尺和天平测定各批对虾体长和体重,各批体长和体重的平均值见表1。
将数据代入von Bertalanffy方程中,应用统计软件STATISTICA 6.0拟合求得古镇口湾放流日本对虾的体长、体重生长曲线方程。
古镇口湾放流日本对虾体长生长曲线见图3,是一条无拐点且随时间增加而递增的渐近线。体重生长曲线见图4,体重生长与体长生长不属于同一类型,其曲线是一条呈不对称的S型且有拐点的渐近线。
2.2.2 生长速度
研究鱼虾类的生长速度,对于合理利用鱼虾类资源有着重要的意义。当知道某种鱼虾各个阶段的生长速度以后,可以选择其快速生长以后转入缓慢生长的时期加以利用,以达到合理利用资源的目的[2]。放流日本对虾生长速度方程为,雄性:dLt/dt=0.0151×169.0e-0.0151×(t-11.4)
图5是放流日本对虾的体长生长速度曲线,由图可见,雌虾和雄虾的体长生长速度都随时间的增加而递减并趋向于零。图6是体重生长速度曲线,其体重生长速度呈不对称倒二次曲线型,都有一个极大值。极值点对应时间为体重生长加速度为零的时间,即拐点时间,令d2Wt/d2t=0,则得拐点日龄式为tr=lnb/k+t0,代入b、k、t0值,得雌性拐点tr=90.9 d,雄性tr=77.0 d。由这2条曲线说明,体长生长由快逐渐减慢,而体重生长由慢逐渐增快,转而又逐渐减慢,反映了对虾体长生长先于体重生长的一个特点。
3 讨论
以往对虾类生长特性的研究[4,5,6,7,8,9,10],均采用Excel进行数据处理和作图,过程比较繁琐,此文采用STATISTICA 6.0以von Bertalanffy方程对日本对虾的生长进行了拟合,数据处理相对简单,可以直接由拟合所得方程生成相应图像,且方程拟合结果很好,此文的生长方程拟合度都在99.8%上,理论计算值与实测值十分接近。
从体重生长和生长速度曲线可知,古镇口湾放流日本对虾的体重增长速度呈不对称倒二次曲线型,雌性雄性拐点不同,雌虾在9月4日(拐点tr=90.9 d)前后,雄虾在8月21日(tr=77.0 d)前后,拐点前后,雌雄体重日增长最大,分别为0.43和0.33 g。雌雄个体生长差异较大,雄性比雌性k值大,以较快速度接近渐近值,但雌性个体较大。
此文研究古镇口湾放流日本对虾体长与体重生长方程的参数,♂:L∞=169.0 mm,k=0.0151,t0=11.4;♀:L∞=184.1 mm,k=0.0143,t0=16.4。苏振明等[2]对黄海增殖日本对虾生长特性研究,拟合出体长与体重生长方程的参数,♂:L∞=153.1 mm,k=0.0319,t0=47.0;♀:L∞=172.8 mm,k=0.0221,t0=42.8。梁毅峰等[1]研究复洲湾移植放流日本对虾所得的生长参数,♂:L∞=14.8 cm,k=0.03,t0=42.6;♀:L∞=16.78 cm,k=0.0278,t0=48.3。这些生长参数有一定的差异,反映出不同的环境条件、放流时间、放流规格均可能影响到放流日本对虾的生长。
通过7次跟踪与回捕调查和生产船回捕记录可以看出,8月初至9月中旬,绝大多数日本对虾都采自于A1和A5站位,其它站位只采到少量日本对虾,放流虾群主要集中分布于5 m等深线以内泥沙底质海区,这主要是受海水温度的影响,浅水区底层水温较高,适宜于日本对虾的生长。9月下旬至10月下旬,主要在A2、A4、A6、A7和A8站位捕获日本对虾,随着气温的下降,深水区底层水温相对较高,日本对虾开始向深水迁移[11],主要分布于水深大于5 m的海区。
由研究结果可知,日本对虾雌、雄个体生长最迅速时间在7、8月份,而青岛放流日本对虾的开捕时间为8月20日,此时日本对虾尚处在生长较迅速阶段,因此,应适当延迟对虾开捕日期至9月中旬。
日本对虾适温范围较广,为10～32℃,生长最适温度范围是20～30℃[3]。6月初古镇口湾的平均水温为17℃左右,已适宜日本对虾栖息,因此,在海况条件允许的情况下,可把放流时间提至6月初,以达到更好的增殖效果。由于日本对虾不作大范围的移动,到开捕时不会洄游出湾,即便后期部分洄游出湾,也在古镇口湾近海。
摘要：对青岛市古镇口湾放流日本对虾Penaeus japonicus的生长特性进行了研究。结果表明,雄虾生长较快,而雌虾能达到更大的个体,雌虾体重生长拐点在91d前后,雄虾为77d,合理开捕日期为9月中旬,可适当把放流日期提至6月初。9月中旬前放流日本对虾生长期主要集中分布于5m等深线以内泥沙底质海区。
关键词：日本对虾,古镇口湾,放流,生长
参考文献
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生长增殖 篇3
我们现探讨肝细胞生长因子 (HGF) 对人肺癌细胞系95D增殖和侵袭的影响及其可能机制, 旨在进一步了解HGF在肺癌侵袭转移中的作用, 并为肺癌的诊断及治疗提供新的理论基础。
1 材料和方法
1.1 细胞系和主要试剂
人肺癌95D细胞系购于中国科学院细胞库;rh HGF购于R&D Systems公司;Transwell趋化小室 (孔径8.0μm) 购于Costar公司;基质胶Matrigel购于BD Biosciences公司;PRMI-1640培养基、胎牛血清和胰蛋白酶为Gibco公司产品。MTT液和二甲基亚砜 (DMSO) 购于Sigma公司。引物由Invitrogene公司合成。RNA裂解液购于Gibco公司;Taq DNA聚合酶、逆转录试剂盒、d NTP均购于Takara公司。
1.2 细胞培养
人肺癌细胞系95D生长于含10%胎牛血清的RMPI-1640培养基中, 内加100 U/m L青霉素、100μg/m L链霉素, 置于37℃、5%CO2、饱和湿度条件下培养, 2~3 d传代一次。细胞呈贴壁生长。
1.3 细胞增殖测定实验
采用MTT法, 取对数生长期的95D细胞, 调整悬液浓度为1×105/m L, 每孔200μL接种于无菌的96孔培养板。实验组分别加入10、30、50μg/L的rh HGF, 对照组不加药, 另设空白对照孔。每组设3个平行孔。继续培养, 48 h后加入MTT (5 g/L) 20μL, 放置孵箱内4 h后弃上清加入150μL的二甲基亚砜 (DMSO) , 震荡15 min, 用全自动酶标仪检测490 nm处的吸光光度值。以rh HGF量为横坐标, 相对增殖细胞数为纵坐标绘制细胞增殖曲线。
1.4 过河实验
生长旺盛的95D细胞以0.25%胰酶消化、培养液洗涤终止消化后, 用含10%胎牛血清培养液配制1×106/m L的95D细胞悬液, 按每孔2 m L加人6孔板, 37℃、5%CO2培养24 h, 使细胞贴壁。吸弃孔中液体, PBS液冲洗1遍;用10μL枪头在孔中划一直线后, 用PBS液再冲洗2次;加入含不同浓度 (10, 30, 50μg/L) rh HGF的含10%小牛血清培养液 (2 m L/孔) , 以等量无药培养液为对照, 37℃、5%CO2继续培养每2 h观察1次, 直至划痕被细胞填满。同样的实验重复3次。
1.5 侵袭实验
在24孔细胞培养板放入Transwell小室, 将10.4mg/m L的Matrigel胶用4℃培养液稀释 (1∶3) , 在上室的聚碳酸酯膜上加入稀释后的Matrigel 60 ul, 置于37℃30 min使Matrigel聚合成凝胶。制备单细胞悬液, 在上室中每室加入4×105个细胞 (200μL) , 下室中加入500μL含20%FBS的细胞培养液;每实验组设3个复孔, 37℃、5%CO2恒温培养24 h后, 用棉签擦去基质胶和上层膜面细胞, 穿过基底膜的细胞黏附于膜下层, 无水乙醇固定30 min, 结晶紫染色5min, 用蘸水棉签擦净上室, 手术刀片小心裁下膜, 以附有细胞的一面贴附于载玻片, 膜干燥后滴加中性树胶封片镜检。200倍光镜下计数穿膜细胞, 每膜计算5个视野, 取均值。实验重复3次。
1.6 逆转录聚合酶链反应 (RT-P CR)
分别收集rh HGF处理48 h后的细胞及对照组, Trizol一步法提取细胞总RNA, 取1μg总RNA用AMV逆转录酶进行逆转录, PCR扩增MMP-9, 同时扩增β-actin作为内参照。检测MMP-9的上游引物序列:5'-TCG AAC TTT GAC AGC GAC AAG AA-3', 下游5'-TCA GGG CGA GGA CCA TAG AGG-3', 产物长度为246 bp。β-actin上游序列5'-GAT TGC CTC AGG ACA TTT CTG-3', 下游:5'-GAT TGC TCA GGA CAT TTC TG-3', 产物长度为690 bp。PCR引物由invitrogen公司合成。循环条件:预变性94℃3 min, 变性94℃40 s, 退火51.2℃1 min, 延伸72℃1 min。循环35次;72℃延伸5 min。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分离, 紫外灯下观察并拍照。存入成像分析系统 (SYNGENE, 美国) , 进行半定量分析。
1.7 统计学分析
用SPSS 13.0统计包进行统计学分析, 数据以均数±标准差表示, 组间比较采用单因素方差分析, 当P<0.05时认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 不同浓度rh HGF对肺癌95D细胞的增殖作用
随着浓度增加, 增殖作用逐渐增强, 呈剂量效应关系, 见图1。
2.2 rh HGF对肺癌95D细胞迁移运动能力的影响
经rh HGF处理后各组细胞过河时间明显缩短。对照组过河时间为 (41.0±0.58) h, 10μg/L组 (29.6±1.45) h, 30μg/L组 (28.3±0.88) h, 50μg/L组 (23.7±0.88) h。结果表明rh HGF可明显增强95D细胞迁移运动能力, 差异具有显著性意义 (P<0.05) 。
2.3 rh HGF对肺癌95D细胞侵袭能力的影响
与对照组比较, 经rh HGF处理后各组细胞侵袭能力明显增强, 差异具有显著性意义 (P<0.05) 。见图2。
2.4 rh HGF对肺癌95D细胞MMP-9表达的影响
MMP-9表达随rh HGF浓度的增加而增强, 并依次测定其灰度值与对照组较, 差异有统计学意义。见图3。
3 讨论
众所周知, 侵袭转移是恶性肿瘤患者死亡的主要原因。大约90%的恶性肿瘤患者死于肿瘤转移[2]。转移的发生过程中细胞间粘连的改变, 运动侵袭性的获得是其中非常重要的因素[3,4]。研究表明, HGF能刺激多种类型细胞分化、增殖、运动、迁移及形态发生, 是一种多功能的细胞因子, 许多肿瘤常可测得HGF的过度表达[5]。ROYAL[6]等对MDCK上皮细胞的研究发现, HGF可以影响上皮细胞与间质细胞的相互作用, 导致上皮细胞的分离和扩散, 这在肿瘤的侵袭转移过程中极为重要。有些肿瘤还可通过自分泌途径, 同时表达HGF及其受体c-Met, 促进肿瘤的生长[7]。本研究应用不同浓度的rh HGF, 对促进95D细胞系的增殖、生长及增强侵袭力的作用及机理进行了实验探讨。研究表明, rh HGF对95D细胞增殖生长有明显促进作用, 随浓度升高其作用增强, 呈剂量效应关系;并且rh HGF能增强95D细胞运动及侵袭能力。rh HGF对肺癌95D细胞的生长增殖及侵袭能力具有直接促进作用。
肿瘤细胞的基底膜和细胞外基质 (ECM) 是肿瘤的天然组织学屏障, 其降解是肿瘤侵袭转移的关键环节。基质金属蛋白酶 (MMPs) 是一组锌离子依赖性蛋白水解酶家族, 其中MMP-9是ECM降解和重构的主要直接作用者, 与肿瘤侵袭和转移关系尤为密切[8]。本研究发现与对照组相比, 随着rh HGF浓度的增加MMP-9 m RNA表达量也增加, 提示HGF可以上调MMP-9活性, 可使肿瘤细胞破坏周围基底膜能力增强而容易形成转移。进一步表明, HGF可能通过诱导MMP-9的表达来促进肺癌细胞侵袭及转移能力。
本研究结果证实了HGF对肺癌细胞的生长、侵袭及转移有重要促进作用, 其机制可能与诱导MMP-9表达增加有关, 同时干预这两个因素, 能为肺癌的临床治疗提供新的思路。
摘要：目的探讨人类重组肝细胞生长因子 (rhHGF) 对人肺癌95D细胞系侵袭、增殖的影响及其机制。方法应用细胞培养技术培养95D细胞, 分别用10, 30, 50μg/L不同浓度rhHGF作用95D细胞48h, 以MTT法检测rhHGF对95D细胞增殖的影响;以过河实验、Transwell方法及RT-PCR方法检测rhHGF对95D细胞的运动侵袭能力和对MMP-9基因表达的影响。结果rhHGF可明显增加95D细胞的增殖和生长, 且随浓度提高作用增强, 呈剂量效应关系。过河实验、Transwell方法显示rhHGF能增强95D细胞的体外侵袭和运动能力, 随浓度提高, 过河时间缩短, 细胞侵袭力增加 (P<0.05) ;RT-PCR测定显示rhHGF作用48h后, 95D细胞中MMP-9基因表达上升。结论rhHGF可促进人肺癌95D细胞的生长和增加其体外侵袭能力, 其机制与直接增加95D细胞迁移运动, 及MMP-9表达增加有关。
关键词：肺癌,肝细胞生长因子,增殖,侵袭
参考文献
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生长增殖 篇4
1 材料与方法
1.1 材料
人结肠癌细胞系Lo Vo细胞由武汉大学消化与肝病研究所冻存, 阿司匹林购于Sigma公司, Annexin V/PI试剂盒购于BENDER公司, 胎牛血清、DEPC购于杭州四季青生物材料研究所, Caspase-3活性检测试剂盒购于南京凯基生物科技发展有限公司, RUNX-3单克隆抗体购自Cell Signaling Technology公司, 辣根酶标记兔抗山羊Ig G购自武汉博士德生物科技有限公司。
1.2 方法
1.2.1 细胞培养
Lo Vo细胞培养于含10%小牛血清的RPMI 1640培养液中, 置于37℃、饱和湿度、5%CO2培养箱内培养, 根据生长情况3~5 d传代1次, 取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2 MTT实验检测细胞增殖抑制率
取对数生长期的Lo Vo细胞, 以1×104个/m L的浓度接种于96孔板, 每孔200μL, 待细胞贴壁后分组:阿司匹林组加入阿司匹林终浓度为1、2、4、6和8 mmol/L的培养液, 对照组加入等量的培养液, 并设立调零孔。每组设5个复孔, 分别培养24、48和72 h, 实验终止前4 h每孔加入MTT试剂20μL, 孵育4 h, 小心弃掉上清液, 每孔加150μL DMSO, 振荡10 min, 使结晶完全溶解, 酶标仪测定570 nm处的吸光值 (A值) , 抑制率=﹝1- (实验组平均A值-调零孔A值) / (对照组平均A值-调零孔A值) ﹞×100%。
1.2.3 显微镜下观察细胞形态
取对数生长期Lo Vo细胞消化传代并培养24 h后, 换阿司匹林终浓度为1、2、4、6和8 mmol/L的培养液连续培养24、48和72 h后置于倒置显微镜下观察细胞生长情况。
1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡
取对数生长期的Lo Vo细胞, 以1×106个/m L浓度接种于6孔培养板中, 贴壁后分为实验组和对照组, 实验组分别加入阿司匹林终浓度为1、4和8 mmol/L的培养液, 对照组加入等量培养液, 培养48 h后, 收集细胞, 离洗固定后加入Annexin V-FITC和PI染色。筛网过滤送流式细胞仪检测细胞凋亡率。
1.2.5 分光光度法检测Caspase-3酶活性变化
细胞接种及分组同上, 培养48 h后, 收集细胞, 分别加入50μL冷裂解缓冲液, 冰浴裂解15 min后, 4℃、1 200 r/min离心15 min, 将上清移至预冷的离心管中, 置于冰上, 按试剂盒使用说明书操作, 酶标仪上405 nm测定Caspase-3的酶活性, OD405为样品中Caspase-3酶活化后催化产生p NA (p-nitroaniline) 产生的吸光度, 可反映细胞裂解液中总的Caspase-3活性强弱。
1.2.6 RT-PCR法检测RUNX-3 m RNA表达变化
细胞接种及分组同上, 培养48 h后, 收集细胞, 按Trizol试剂说明书一步法提取总RNA, 计算出RNA浓度, 按RT试剂盒说明书合成c DNA, 并进行聚合酶链反应 (PCR) 。PCR反应条件:94℃4 min, 94℃30 s, 51℃30 s, 72℃25 s, 30个循环, 72℃4 min。取5μL PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳, 紫外光下观察并拍照。RT-PCR采用的β-actin及RUNX3引物由南京金瑞斯合成, RUNX3上游引物为5'-CAGA AGCTGGAGGACCAGAC-3', 下游引物为5'-TCGGA GAATGGGTTCAGTTC-3';β-actin上游引物为5'-C ACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3', 下游引物为5'-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3'。扩增片段长度分别为179 bp和240 bp, β-actin为内参。
1.2.7 Western blot检测RUNX-3蛋白表达变化
细胞接种及分组同上, 收集细胞, 用PBS漂洗, 参照细胞浆蛋白抽提试剂盒说明书进行操作, 提取细胞总蛋白, 并测定蛋白浓度, 蛋白样品加入1/5体积的5×上样缓冲液, 沸水煮沸5 min后离心, 以每孔20μg/孔上样, 行10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳, 然后电转至PVDF膜上, 用5%脱脂奶粉室温封闭1 h, 加入1︰1 000稀释的兔抗人人类相关转录因子3 (human runt-related transcription factor 3, RUNX-3) 蛋白, 4℃过夜, β-actin作为内参, TBST洗膜3次, 加入1︰1 000稀释的辣根酶标记的兔抗山羊Ig G, 室温孵育2 h, 同样洗膜3次, ECL显色, 观察各条带深浅变化。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据处理, 计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 两样本间参数比较用独立样本t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 阿司匹林对Lo Vo细胞增殖的影响
MTT法检测发现, 阿司匹林能显著抑制Lo Vo细胞增殖, 且随着阿司匹林浓度的增加和作用时间的延长, 其抑制作用逐渐增强, 呈明显的浓度和时间依赖效应 (见附表) 。与对照组比较, 各浓度和时间点阿司匹林对Lo Vo细胞增殖抑制作用差异有统计学意义 (P<0.01) 。
2.2 细胞形态观察
倒置显微镜下可见对照组Lo Vo细胞生长旺盛, 折光率较高, 胞体大, 形态成梭形或多边形, 胞质均匀透明, 随培养时间的延长形态无明显变化。阿司匹林处理的细胞增殖减慢, 且随着阿司匹林浓度的升高和作用时间的延长, 细胞逐渐变小、变圆, 折光率减弱, 核浓缩等, 部分脱落漂浮于培养瓶中, 但细胞膜完整, 最后裂解。阿司匹林浓度越高, 作用时间越长, 上述表现越明显, 漂浮细胞越多。
2.3 阿司匹林对细胞凋亡的影响
流式细胞仪检测结果显示, 阿司匹林 (浓度分别为1、4和8 mmol/L) 处理Lo Vo细胞48 h后, 细胞凋亡率分别为12.4%、23.4%和35.4%, 而对照组凋亡率仅为3.3%, 表明阿司匹林能诱导Lo Vo细胞凋亡 (见图1) 。
2.4 阿司匹林对Caspase-3活性的影响
对照组Lo Vo细胞Caspase-3相对活性为 (0.91±0.06) , 阿司匹林 (浓度分别为1、4和8 mmol/L) 处理Lo Vo细胞48 h后, Lo Vo细胞Caspase-3相对活性分别为 (1.31±0.07) 、 (1.84±0.08) 和 (2.46±0.07) 。与对照组比较, 阿司匹林组Caspase-3相对活性升高, 差异有统计学意义 (P<0.05) (见图2) 。
2.5 阿司匹林对RNUX-3 m RNA表达的影响
琼脂糖凝胶电泳结果显示, RUNX-3基因的扩增产物条带为179 bp, 内参β-actin条带为240 bp, 与所设计的片段大小一致, 阿司匹林处理人结肠癌Lo Vo细胞48 h后, RUNX-3基因表达上调, 且随药物浓度升高, Lo Vo细胞RUNX-3基因的表达量亦升高, 呈明显剂量依赖效应。见图3。
A:对照组;B:1 mmol/L组;C:4 mmol/L组;D:8 mmol/L组
注:覮与对照组比较, P<0.05
1:对照组;2:1 mmol/L;3:4 mmol/L;4:8 mmol/L;5:DL 2 000;A:β-actin;B:homo RUNX3
2.6 阿司匹林对RUNX-3蛋白表达的影响
阿司匹林处理Lo Vo细胞48 h后, 结果显示随着阿司匹林浓度的升高, RUNX-3蛋白表达量也逐渐升高, 见图4。
3 讨论
细胞凋亡是维持多细胞机体平衡的一个重要生理机制[6], 细胞凋亡不足是结肠癌发生、发展的一个重要机制[7], 通过诱导细胞凋亡已经成为抗肿瘤研究的热点。本研究发现, 1~8 mmol/L浓度范围内的阿司匹林对人结肠癌Lo Vo细胞的增殖均有抑制作用, 且随着药物浓度的增加和作用时间的延长, 抑制作用亦增强, 呈明显的浓度及时间效应关系。阿司匹林处理人结肠癌Lo Vo细胞后, 在倒置显微镜下可见到凋亡细胞的形态;流式细胞仪检测其细胞凋亡率随着浓度的增加而升高, 阿司匹林处理后细胞凋亡率明显增加, 且呈浓度依赖效应。在细胞凋亡过程中, Caspase家族的激活起着关键作用, 被认为是引起凋亡的直接效应物。已发现的Caspase家族有10余种, 其中Caspase-3是该家族的重要成员, 是细胞凋亡过程中的关键酶。本研究发现, 阿司匹林呈浓度依赖性增加Lo Vo细胞Caspase-3相对活性, 表明阿司匹林能抑制细胞增殖, 并可能通过增强细胞Caspase-3活性从而促进细胞凋亡。
此外, 本研究还发现, 阿司匹林能上调Lo Vo细胞中RUNX3基因表达, 呈明显浓度效应。大量研究[8,9]证明, 转录生长因子β (transforming growth factor, TGF-β) 和Wnt信号通路在肿瘤的发生、发展过程中发挥着重要作用。RUNX3参与TGF-β信号通路诱导生长抑制的过程[10]。研究证实, RUNX3基因在多种肿瘤如乳腺癌、胃癌、大肠癌、肝癌及肺癌等肿瘤中表达下调甚至缺失, 在肿瘤的发生、发展中起重要作用[11]。有证据表明, 恢复RUNX3基因的表达能通过诱导细胞凋亡、调节细胞周期及下调Cyclin D1的表达而显著抑制肿瘤细胞增殖及转移[12]。本研究发现, 阿司匹林能抑制肿瘤细胞向G1期行进和G1/S转换[13]。并且RUNX3基因表达上调趋势与细胞Caspase-3相对活性增加趋势及细胞凋亡率升高趋势是一致的。因此, 笔者推测阿司匹林能通过上调RUNX3基因表达影响细胞周期、激活Caspase-3活性抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡, 进而发挥抗肿瘤作用。
生长增殖 篇5
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
TGF-β1(Cytokine,美国);NGF(Cytokine,美国);低糖DMEM培养液,胰蛋白酶(Sigma,美国);胎牛血清(FBS,浙江金华清湖犊牛利用研究所),用时加入100 mg/L链霉素和106 U/L青霉素;人牙周膜细胞(hPDLCs,山西口腔医院);噻唑盐(MTT,Sigma,美国);二甲基亚砜(DMSO,西安化学试剂厂)。自动CO2孵箱(美国Forma Scientific公司);DG3022A型酶联免疫检测仪(华东电子管厂);UV-265FW型紫外可见分光光度计(日本Shimadzu公司)。
1.2 PDLC的传代培养和来源鉴定
将储存于液氮中的PDLC取出后立即放在37℃水浴箱中加热,不时摇动,使其急速融化,30 s~1 min后,等到完全溶解后移入离心管低速离心后,移入25 ml培养瓶中,加入5~8 ml含10%小牛血清的双抗DMEM培养液,混合均匀后移入温度为37℃、压力为950 ml/L且含5%CO2的恒温空气的标准孵箱中孵育,当培养液由红转黄后换液,直至细胞长满瓶底80%左右时,用25%的胰蛋白酶消化,在倒置显微镜下观察PDLC的生长状态、细胞形态以及细胞形态变化。显微镜下见大部分PDLC突起收缩,细胞变圆时,迅速用含10%FBS的DMEM终止消化,轻轻吹打后,移入离心管低速离心后分装为2瓶,等传代到第6代时,利用免疫组化法进行细胞来源鉴定,波形丝蛋白染色阳性,细胞角蛋白染色阴性。
1.3 TGF-β1和NGF对人PDLC增殖生物学作用的浓度效应比较
取生长良好的第6代人PDLC,胰酶消化,细胞计数,调整细胞浓度为2×104/ml,接种于96孔板,每孔200μl,在37℃、5%CO2孵箱中培养,加入含10%FBS的双抗DMEM培养液,培养24 h后,弃去孔内培养液和未贴壁的细胞,换用含无血清的DMEM培养液培养24 h,使细胞相对同步化。对照组用含2%FBS的DMEM培养液,实验组采用含2%FBS的DMEM培养液,加入不同浓度的TGF-β1,终浓度为0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 ng/ml;加入不同浓度的NGF,终浓度为0.1、1.0、10.0、50.0、100.0 ng/ml,每浓度组4孔,于标准环境的孵箱中培养3 d后,每孔加入MTT 20μl,培养4 h后,吸去孔内培养液,每孔加入150μl二甲基亚砜,于振荡仪上充分振荡10 min,用酶联免疫检测仪在490 nm波长下测定各孔的A值,取平均值进行统计学处理。
1.4 TGF-β1和NGF联合作用对人PDLC增殖的生物学作用
把已经测得最佳效应浓度的TGF-β1、NGF和TGF-β1+NGF按照上述方法加入96孔板,细胞浓度同“1.3”,每孔液量为200μl,加因子后第3天用MTT法检测细胞增殖,测定A值,进行组间及对照组比较。
1.5 统计学方法
数据以均数±标准差表示,采用SPSS 11.0进行分析,不同浓度的TGF-β1与NGF及两者的联用效果对人PDLC增殖的生物学作用的比较采用方差分析,P<0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 TGF-β1对人PDLC增殖的生物学作用的浓度效应
见表1。
与对照组比较,#P<0.05,△P<0.01
与对照组比较,浓度为0.1~100.0 ng/ml的TGF-β1单独应用均具有促进人PDLC增殖的生物学作用,但是促进增殖的效果不同,其中浓度为10 ng/ml的TGF-β1为最佳效应浓度。
2.2 NGF对人PDLC增殖的生物学作用的浓度效应
见表2。
与对照组比较,#P<0.05,△P<0.01
与对照组比较,浓度为1.0、10.0、100.0μg/ml的NGF单独应用具有促进人PDLC增殖的生物学作用,其中浓度为10.0μg/ml的NGF为最佳效应浓度。
2.2 TGF-β1和NGF联合应用对人PDLC增殖的生物学作用
最佳TGF-β1浓度与最佳NGF浓度以及两者联用时对人PDLC增殖的生物学作用见表3。两者联合应用所测得的A值为(0.602±0.004),TGF-β1单独应用时所测得的A值为(0.522±0.060),NGF单独应用测得的A值为(0.304±0.020),比其他两组高,说明联合应用具有协同作用。
与对照组比较,#P<0.05,△P<0.01
3 讨论
PDLC是一类具有各种不同功能和分化潜力的细胞[3],是牙周组织再生修复的主要细胞群,其生物学特征包括:合成和分泌大量的胶原和非胶原蛋白,表达较高的ALPase活性[4,5,6]。现今牙周病治疗研究的主要问题是如何促进牙周膜来源的细胞转化为新的牙糟骨、牙周膜及牙骨质,恢复牙周组织原有的结构和功能。TGF-β1是一种多肽调节因子,能调节起源于间充质细胞,特别是成纤维细胞和成骨细胞的增殖功能,是组织损伤修复的主要调节因子[7,8,9]。NGF不仅对神经细胞的生长发育、分化、再生发挥调节作用,还参与调控牙齿的发育和损伤后的痛觉过敏及修复。研究发现,一定浓度的NGF可显著促进体外培养的人牙乳头间充质细胞DNA合成,刺激DNA合成前期的细胞向DNA合成期转变,促进体外培养的人牙乳头间充质细胞增殖。研究证实,NGF可显著促进人牙髓细胞及牙周膜细胞的增殖。Oates等[10]研究认为,生长因子的联合应用对细胞的增殖效应高于一种因子本身的作用,故TGF-β1和NGF的联合应用效应显著高于单独应用。本研究采用MTT比色法观察不同浓度的TGF-β1和NGF对PDLC的增殖作用,MTT被活细胞线粒体内的琥珀酸脱氢酶还原为不溶于水的蓝紫色物质,在二甲基亚砜的溶解下成蓝紫色液体,再用酶标仪测定A值,反应活细胞的数量。MTT法简单快速、准确,可重复性好,是目前被广泛采用的检测细胞增殖的方法[2]。本实验结果显示,10.0 ng/ml TGF-β1和10.0μg/ml NGF联用可显著促进PDLC的增殖,具有协同作用。
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生长增殖 篇6
关键词：碱性成纤维生长因子,牙龈间充质干细胞,间充质干细胞,细胞增殖
Zhang等[1]2009年从牙龈组织来源细胞中分离得到干细胞，并开始使用牙龈间充质干细胞(gingiva-derived mesenchymal stem cells,GMSCs)这个概念。牙龈间充质干细胞具有自我更新能力，体外可向成骨、成脂及成软骨方向分化。GMSCs易于分离，来源广泛，具有同质性，比骨髓间充质干细胞增殖迅速。另外，GM-SCs在细胞多次传代后，GMSCs仍能保持正常的染色体核型和端粒酶活性，且没有致瘤性，在再生医学领域及治疗全身系统性疾病方面有很广阔的应用前景[2]。
碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,b FGF)属于肝素结合生长因子家族，在人体内广泛分布。已有实验证实bFGF可诱导和促进脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞增殖、迁移和分化[3,4,5]。b F-GF对人GMSCs增殖作用的研究，目前还未有报道。本实验旨在从牙龈组织中分离培养出GMSCs，探讨不同浓度的b-FGF对GMSCs生长增殖能力的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料和设备
细胞Alpha MEM培养基(Gibco，美国)、FBS(Hyclone公司)、CCK8试剂盒(日本同仁);茜素红、油红O(Sigma公司，美国);人bFGF(美国PeproTech)、IgG鼠抗人单克隆抗体(eBioscience，美国);STRO-1鼠抗人单克隆抗体、CD105鼠抗人单克隆抗体、流式细胞仪(BD，美国);CD90鼠抗人单克隆抗体、CD34鼠抗人单克隆抗体(eBioscience，美国);超净工作台，恒温孵箱，倒置显微镜(Leica，德国)。
1.2 细胞培养
取自临床冠延长手术切取的牙龈用于细胞培养。将收集的牙龈组织立即在含有双抗的D-hanks液中浸泡冲洗3次，转移至60 mm培养皿，加入1 ml的3mg/mlⅠ型胶原酶和4 mg/ml Dispase酶，去除牙龈组织的上皮组织，再充分剪碎，置于15 ml离心管，37℃震荡消化45 min，加入等体积培养基中止消化，1 200r/min离心5 min，去上清，1 ml培养基重悬，接种于60 mm培养皿，细胞培养基为10%胎牛血清、1%双抗和Alpha MEM培养基。于37℃、5%(体积分数)CO2孵箱中培养，每隔2～3 d换液1次，待细胞生长汇合，消化收集细胞，传代培养。
1.3 细胞的纯化
采用有限稀释法对人GMSCs进行克隆筛选。将第1代GMSCs密度稀释至2～3个/ml后接种于96孔板，显微镜观察保证孔内部不多于1个细胞，常规培养，待细胞克隆明显，并使孔底覆盖1/2时，将细胞转种于24孔板进行扩大培养。生长至汇合后，逐渐移至大孔板中扩增培养以便用于后续研究。
1.4 GMSCs鉴定
1.4.1 GMSCs的多向分化能力
成骨分化:P4代细胞以5×104/孔密度接种于6孔板，培养至80%汇合后，成骨诱导组更换成骨诱导培养液进行培养，对照组继续加入细胞培养液，每3 d换液，3周后终止培养。成骨诱导结束后细胞用4%多聚甲醛固定20 min,PBS漂洗3次，2%茜素红染色15 min,PBS漂洗3次，肉眼及镜下观察。
成脂分化:P4代细胞以5×104/孔密度接种于6孔板，培养至80%汇合后，成脂诱导组更换成脂诱导培养液进行培养，对照组继续加入细胞培养液，每3 d换液，4周后终止培养。成脂诱导结束后细胞用4%多聚甲醛固定20 min,PBS漂洗3次，加入PBS稀释的0.3%油红O溶液，室温染色10 min,PBS洗去浮色，肉眼及镜下观察。
1.4.2 流式细胞术检测表面标志物
取P4代细胞，常规消化、计数、离心，细胞用冷的Stain Buffer重悬，按测试每种抗体需要106个细胞的要求，将细胞分装至4个1.5 ml离心管中，4℃低温离心，用冷Stain buffer洗涤2次，分别与PE标记Stro-1、CD90、CD105、CD34单克隆抗体避光冰上孵育20 min，冷Stain buffer洗涤2次，加入二抗IgG，避光冰上孵育20 min，将细胞悬液过滤至流式细胞仪检测专用试管中，重悬后采用流式细胞仪进行细胞表面标志物鉴定。
1.5 不同浓度bFGF对GMSCs增殖能力的作用
实验分为6个组，实验组分别为含有0.5、1、5、10、20 ng/ml bFGF的培养液组，对照组为不含b FGF的培养液组，每组6个复孔。将P4代细胞以5×103个/孔密度接种于96孔板，于37℃、5%CO2培养。分别于1、3、5、7 d更换条件培养基，避光加入10μl CCK-8,37℃孵箱孵育3 h后将96孔板置于酶标仪内测定各孔吸光度值(A值)，检测各组细胞的增殖能力。终点时间为第9天
1.6 bFGF对GMSCs生长曲线的影响
实验分为2组，实验组为含有10 ng/ml浓度的bFGF培养液组，对照组为正常培养液。将对数生长期细胞经消化、计数后，按5×104个/孔的密度接种于6孔板中，37℃、5%CO2孵箱内培养，每3 d天换液1次。每天取3孔，计数各孔中细胞数。连续计数7 d。以培养天数为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。
1.7 统计分析
相同实验条件重复3次，实验数据以表示，应用SPSS 19.0软件进行统计分析，同一时间点组间均数的比较以及同一组内部各时间点的比较采用单因素方差分析，多重比较采用LSD方法，显著性取α=0.05,P<0.05有统计学差异。
2 结果
2.1 GMSCs的分离培养鉴定结果
经酶消化法获得的人GMSCs呈典型的成纤维细胞状态，可稳定传代，传至5～6代形态均未明显改变。GMSCs具有克隆形成能力，经成骨及成脂诱导分化后，可形成矿化结节和脂滴(图1)。
流式细胞仪进行细胞表面标志物鉴定，结果显示STRO-1、CD105、CD90、CD34表达率分别为10.4%、99.8%、99.7%、1.3%(图2)。
2.2 b FGF对人GMSCs增殖能力的影响
CCK-8法检测结果显示，不同浓度bFGF均可促进GMSCs的增殖能力，尤其在第5、7、9天，各实验组GMSCs的A值均高于对照组(P<0.05，具有统计学差异)，其中浓度为10 ng/ml b FGF促进GMSCs的增殖能力作用最强(图3)。
A:克隆生长的GMSCs(×40);B:GMSCs成骨诱导后茜素红染色(×40);C:GMSCs成脂诱导后油红O染色(×100)
A:Clone of GMSCs(×40);B:ARS staining afer osteogenic induction for 3 weeks(×40);C:Oil red O staining after adipogenic induction for 4 weeks(×100)
2.3 b FGF对GMSCs生长曲线的影响
细胞生长曲线结果显示GMSCs在对数生长期增生活跃，加有10 ng/ml bFGF实验组的细胞比正常对照组的细胞提前进入平台期，细胞提前长满培养皿，生长停滞(图4)。
3 讨论
间充质干细胞具有自我更新以及多向分化潜能，在组织器官的发育以及损伤修复过程中发挥着重要的作用。GMSCs具有典型的间充质干细胞特性，有研究证实GMSCs可促进大鼠下颌骨缺损和颅骨缺损的骨组织再生[6]。除此之外，GMSCs具有显著的免疫调节和抗炎作用[1,7]。GMSCs自首次分离以来，因其来源广泛，取材方便，在再生医学领域有着广阔的应用前景，成为干细胞新的研究热点。而对于bFGF的研究则开始更早，且研究的更深[8]。选择合适的干细胞和生长因子，并确保后者对前者产生最佳的调控效果是再生医学研究的关键[9]。
本实验成功分离培养出了GMSCs。经鉴定GM-SCs具有成骨、成脂等多向分化能力，表达间充质干细胞特异性表面标记物CD105,CD90和STRO-1，不表达造血干细胞表面标志物CD34。
bFGF是含155个氨基酸的促有丝分裂的阳离子多肽，bFGF经证实可促进细胞增殖、趋化、成血管，有助于有丝分裂，并且对细胞的分化也起到重要作用。有研究表明，bFGF与牙髓干细胞、人根尖牙乳头细胞培养后，能促进间充质干细胞的增殖[10,11]。除此之外，bFGF已经发现作为分裂源和化学引诱物，不仅能促进脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞的增殖，在多向分化过程中，能促进血管生成、细胞迁移以及成脂分化。本实验主要研究bFGF对GMSCs增殖能力的影响，从结果可以看出，不同浓度的bFGF均能促进GM-SCs的增殖，在第5、7和9天时，浓度为10 ng/ml bF-GF对细胞的增殖能力最强，不依赖浓度的升高而增强。
综上所述，b FGF作为一种重要的细胞因子，其对细胞的作用是广泛而复杂的。本实验只是从一个方面来研究bFGF对GMSCs的影响，结果表明不同浓度的bFGF均能促进GMSCs的增殖。这将为GMSCs与细胞因子结合应用于组织再生提供了一定的研究基础。在今后的实验中还将从细胞分化、蛋白水平以及体内实验等方面进行更加深入细致的研究。
参考文献
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生长增殖 篇7
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
TGF-β1冻干粉剂,TGF-β1ELISA试剂盒(Pepro Tech公司,美国);明胶粉剂及span-80(Sigma公司,美国);25%戊二醛、丙酮、无水乙醇、液体石蜡均为分析纯;DMEM培养液、胰蛋白酶(Gibeco公司,美国);MTT(Sigma公司,美国);胎牛血清(FBS)(杭州四季青生物公司);二甲基亚砜(DMSO)(天津市红岩化学试剂厂);无菌工作台,GB-Ⅱ型(北京市新技术应用研究所);冷冻干燥机FD-1型(北京博医康技术公司);扫描电镜(SEM)(日本Hitach公司)。
1.2 空白明胶微球的制备及外形、粒径的观察
将液体石蜡置于三口瓶中,55℃450 r/min条件下搅拌,10 ml 250 ml/L明胶溶液中加入适量span-80充分混匀后逐滴加入石蜡中,搅拌10 min后迅速降温至0℃,继续搅拌10 min,使其完全固化;加入250 g/L戊二醛0.1 ml,搅拌下预固化2 h,4℃固化24 h,用适量丙酮、异丙醇、乙醚洗涤,挥去乙醚,真空干燥,得白色粉末状微球。继续用双蒸水洗涤,至有机溶剂洗净,冻干。将少量空白明胶微球浸泡于生理盐水中,取少量涂片置于图像分析仪下,观察其外形、分散度及粒径大小,并进行粒径分析。扫描电镜观察微球外形及显微结构。
1.3 TGF-β1缓释明胶微球的制备及其载药量和体外释药曲线的测定
精密称取100 mg空白微球以后60Co照射灭菌,每毫克干燥微球中加入5μl 200 ng/ml TGF-β1溶液(p H=7.4),4℃条件下充分浸润,24 h后离心收集微球,无菌条件下冻干,封存。依据TGF-β1ELISA试剂盒说明书,用酶联免疫仪于490 nm处测定吸光度值,绘制标准曲线。离心后上清液用PBS定容至100 ml,取10μl另加90μl共100μl作为待测样品,计算载药量及包封率。
载药量=[(投药量-上清液中药量)/微球重量]×100%
包封率=[(投药量-上清液中药量)/投药量]×100%
精密称取4份载药微球,各10 mg,分别置于离心管中。模拟体内条件,以PBS缓冲液为释药介质,定容至5 ml,充分混匀。置于37℃水浴摇床上振荡,分别于1、2、3、4、5、6、7 d离心5 min(1 500 r/min),取上清100μl,于490 nm处测定吸光度值,结合TGF-β1标准曲线,测定不同时间点的样品上清中TGF-β1的含量,并绘制体外累积释放曲线。
1.4 牙周膜细胞的培养及实验分组
利用组织块培养法培养人牙周膜成纤维细胞,并以1∶2传代。抽取细胞样本,广谱角蛋白、波形丝蛋白按常规ABC法鉴定细胞起源,结果角蛋白阴性,波形丝蛋白阳性,证实为牙周膜细胞。取第6代细胞用于实验。以2×104/ml浓度的细胞接种4块96孔板,每孔100μl,在37℃5%CO2培养箱中培养,培养24 h后,弃孔内液体和未贴壁细胞,分三个实验组(将TGF-β1明胶微球以含10%FBS的DMEM稀释为1、5、10 mg/ml)和一个对照组(含10%FBS的DMEM培养液)。每组16孔,继续在37℃5%CO2培养箱中培养。
1.5 MTT法检测细胞增殖情况
各浓度组取4孔,分别于培养的1、3、5、7 d每孔加入MTT20μl,标准环境下孵育4 h后弃上清,每孔加入150μl DMSO,每个时相点设置4个重复测量孔,充分振荡10 min,于490 nm波长处测定各孔吸光度值。实验重复5次。
1.6 统计学处理
数据以均数±标准差(±s)表示,采用SPSS 17.0软件包进行统计学分析,四组均数间比较采用t检验,多组均数间比较采用单向方差分析。P<0.05为有显著性差异,P<0.01为有非常显著性差异。
2 结果
2.1 TGF-β1明胶微球
由扫描电镜照片可见,明胶微球分散度良好,球体表面光滑,粒径均匀,经冰冻处理后的微球(图1)在高倍镜下观察,外形呈现典型的三维网络结构。图像分析仪下计算500个微球直径,显示平均直径为(10.28±2.24)μm,药物包封率为78.5%,微球中TGF-β1载药量为785 ng/g。载药微球体外释放试验结果(图2)显示,明胶微球具有良好的缓释性能,微球在释放初期具有“突释”效应,释放速度较快,3 d后释放速度减慢,比较平稳,7 d后累积释放94%。
2.2 缓释TGF-β1明胶微球对h PDLCs增殖的影响
镜下观察见h PDLCs与TGF-β1微球共同生长良好。细胞贴壁生长,长梭形,胞体丰满,呈放射状、漩涡状生长。
2.3 缓释TGF-β1明胶微球对h PDLCs的增殖作用
各组人牙周膜成纤维细胞A值的检测结果见表1。
培养1 d后,实验组TGF-β1与对照组相比,无显著性差异。培养3 d后,TGF-β1依次为D组>C组>B组>A组,且C、D组与A组相比,TGF-β1有显著性差异(P<0.05);B组与A组相比,无显著性差异(P>0.05)。培养第5天,TGF-β1依次为D组>C组>B组>A组,且各实验组TGF-β1与对照组相比,有非常显著性显著(P<0.01)。培养第7天,各浓度组TGF-β1无显著性差异(P>0.05)。培养第3天与第1天相比、第5天与第3天相比,各实验组TGF-β1变化均有非常显著性差异(P<0.01);第7天与第5天相比,TGF-β1无显著性差异(P>0.05)。
3 讨论
在牙周组织的修复和重建过程中,具有再生能力的牙周膜细胞起关键作用。研究表明,r PDLCs是一组具有多向分化潜能的异质性多能干细胞[3]。生长因子是指通过细胞间信号传递影响细胞活动的一类多肽因子,直接或间接地参与组织损伤修复的全过程。其中,TGF-β是一种多肽,具有对骨组织、结缔组织及免疫系统等的细胞调节功能,是损伤反应过程中的重要生物介质,TGF-β1是TGF-β的重要亚型之一,具有促进软骨细胞增殖和成熟的作用[4]。
在牙周膜的发育过程中,TGF-β1及其受体在成骨细胞、成纤维细胞内均有较强的表达,提示TGF-β1能够调节牙周膜组织的发生和成熟[5]。但是单纯将TGF-β1植入体内,其半衰期短,稳定性差,易被蛋白酶水解[6],局部及全身应用效果均不能令人满意。如何发明一种能够促进生长因子缓释的药物就成了一个亟待解决的问题。国内外均有大量学者进行缓释系统的研究,壳聚糖、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)以及它们的共聚物(PLGA)、聚乙烯醇(PEG)、明胶,均有用作生长因子缓释系统的报道[7]。
明胶属于天然高分子生物材料,通常从动物胶原中经水解提炼,机体内组织相容性好。明胶在未吸水前耐高温,可高温消毒。此外,明胶还具有价廉易得、无抗原性、摩擦系数低、在体内可自然降解等优点[8]。丁红等[9]用乳化化学交联法制备阿霉素明胶微球,对其粒径及分布、体外释放药物进行了研究,证明明胶微球具有良好的缓释性能。因此,本实验选择明胶微球作为载体,制备TGF-β1的缓释剂型。
本实验采用改良的复乳包囊法,其主要优点是溶剂挥发时,聚合物层夹在两水相之间,阻碍内水相中药物的渗透,因此,所制备的微球较以同一材料采用其他方法制备具有更高的载药量和包封率[10]。另外,空白明胶微球制备完成后,用双蒸水洗涤,后冰冻干燥所得的干燥球是一个具有大量孔道的三维网状结构,更利于药物的载入[11]。同时也有助于降低突释效应,使微球能在一定时间内缓慢释放TGF-β1,起到缓释效应。在本实验中,80%的明胶微球直径介于8~20μm之间,可以作为现代牙周组织工程中的用药。药物包封率为78.5%,微球中TGF-β1载药量为785 ng/g,7 d后大约累积释放94%。该结论表明,明胶微球大小均匀,分散度好,载药量较大。释药量在第1天为37%,小于40%。后期基本可以平稳释放一定量的药物,缓释效果良好。
有研究表明,单纯TGF-β1可促进牙周膜细胞的增殖,且呈时间、剂量依赖性[12]。本实验通过MTT法检测细胞增殖情况。实验结果证明,培养第1天,各浓度实验组和对照组细胞数量变化不明显;第3~5天,实验组细胞数量明显高于对照组,且呈浓度依赖性。培养第7天与第5天相比,细胞数量的变化无显著性差异,结合TGF-β1释放曲线分析,第5天后大部分细胞因子已经释放,释放速度减慢,浓度降低,而最初释放的因子部分生物活性已经被破坏。