增殖活性（通用6篇）
增殖活性 篇1
摘要：研究了独角莲、山豆根、半枝莲、打不死草醇提物体外对乳腺癌细胞MCF-7增殖活性的影响。Cell Counting Kit-8法(CCK-8法)检测不同浓度(200 mg/m L、100 mg/m L、50 mg/m L、25 mg/m L、12.5 mg/m L、6.25 mg/m L、3.12 mg/m L、1.56 mg/m L、0.78 mg/m L)的独角莲、山豆根、半枝莲、打不死草醇提物对MCF-7的增殖活性的影响。结果表明:独角莲根茎醇提物对MCF-7的增殖有较强抑制活性,IC50为2.08 mg/m L;半枝莲及山豆根醇提物对MCF-7有一定增殖抑制活性,IC50分别为30.5 mg/m L、80.15 mg/m L。
关键词：独角莲,抗肿瘤活性
乳腺癌是全球第二高发的恶性肿瘤,特别是在欧美发达国家,为女性中发病率最高的癌症。我国近年来乳腺癌发病率也呈现快速上升趋势。目前临床上治疗手段是以手术和化疗为主。化疗在乳腺癌治疗中占有很重要的地位,但仍存在一定的不良反应和多药耐药性。随着医学水平的不断提高,中药已经成为当今治疗肿瘤的重要手段,其优势在于中药不仅对肿瘤具有抑制作用,不易产生耐药性,而且对机体的损伤和副作用也较小,因而研究中药抗肿瘤作用及其分子机制是我国科学工作者的重要课题之一［1 － 5］。贵州拥有丰富的天然药用资源,本文选取四种具有代表性的药用资源,分别为独角莲、山豆根、半枝莲、打不死草,分别研究其对乳腺癌MCF - 7体外增殖活性的影响,为药用资源用于乳腺癌的治疗提供新的思路。
独角莲( Typhonium giganteum Engl. ) 是佛焰苞目( Spathiflorae) 天南星科( Araceae) 多年生草本植物,其根茎呈倒卵形、卵球形或卵状椭圆形,具有抗肿瘤、免疫调节、抗炎、 祛痰、镇静、抗惊厥、抗破伤风毒素等作用。已有研究证明, 独角莲对K562、SMMC - 7721、Hela、SH - SY5Y有一定的抑制作用。山豆根( 拉丁学名: Euchresta japonica) ,别名: 三小叶山豆根、胡豆莲,豆科、山豆根属植物,藤状灌木,几不分枝,茎上常生不定根。产广西、广东、四川、湖南、江西、浙江; 亦分布于日本。功效清热解毒,利咽消肿。其主要成分为生物碱,对苦参碱、氧化苦参碱的药理研究报道较多,主要是心血管系统的药理作用、抗肿瘤作用。半枝莲( 学名: Scutellaria barbata D. Don) ,别称: 半支莲( 植物学大辞典) 、 松叶牡丹、龙须牡丹、金丝杜鹃、洋马齿苋、太阳花、午时花,是马唇形科黄芩属多年生草本植物。半支莲全草入药,具有清热解毒、活血祛瘀、消肿止痛、抗癌等功能。性寒味酸, 全草含多种维生素、微量元素及氨基酸等成分。有凉血解毒, 散瘀止痛,消肿和清热利湿之功效。打不死草,生山涧中。细叶软枝,根肥而白,上有须。气味甘,性微寒。无毒。主治骨碎筋断,瘀血不散,跌打损伤,以酒为使［7 － 11］。
1材料
1. 1中药材
独角莲、山豆根、半枝莲、打不死草,购于贵阳中药材市场。
1. 2细胞株
人乳腺癌细胞( MCF - 7) ,由南开大学药学院提供。
1. 3实验器材及试剂
实验器材: CO2培养箱,美国Thermo Formo公司; 超净工作台,苏州苏洁净化设备公司; 超纯水系统,美国Millipore公司; CK × 41倒置显微镜,奥林巴斯。
试剂: 供试RPMI - 1640培养液、胎牛血清,均购自Hyclone公司; Cell Counting Kit - 8试剂盒,购自日本同仁化学研究所。
2方法
2. 1样品处理
分别将独角莲、山豆根、半枝莲、打不死草粉碎,加95% 的乙醇1000 m L,热回流提取2 h,定性滤纸过滤提取液,浓缩蒸干。称取20 mg的醇提物,溶于20 m L的蒸馏水中,初始浓度为1 mg/m L。将溶液过0. 22 μM的滤膜,除去细菌,放置4 ℃ 冰箱备用。
2. 2CCK - 8法检测独角莲醇提物对各肿瘤细胞生长的抑制作用
取对数生长期的细胞,用胰蛋白酶进行消化处理,离心,收集细胞,用培养液配成细胞悬液,细胞计数,把细胞稀释成4 × 104个/m L接种于96孔板中,每孔加入100 μL细胞悬液,每孔含细胞4000/8000个,将96孔板置37 ℃,5% CO2培养箱内培养24 h。加药,2倍梯度稀释形成9个药物浓度,最终药物的浓度为: 200 mg / m L、100 mg / m L、50 mg / m L、25 mg / m L、12. 5 mg / m L、 6. 25 mg / m L、3. 12 mg / m L、1. 56 mg / m L、0. 78 mg / m L,每个浓度设置3个平行孔,以10 μL灭菌的双蒸水不含药培养液作阴性对照组,无细胞含药培养液作为调零组。将96孔板置37 ℃ , 5% 的CO2饱和湿度的培养箱继续培养48 h。药物作用48 h后, 96孔板中每孔加入CCK - 8试剂20 μL,置37℃ 培养箱中孵育4 h,于酶标仪450 nm下读取OD值,按以下公式计算各药材醇提物对肿瘤细胞增殖抑制率( Inhibitory Rate,IR) :
2. 3统计学方法
本组实验数据以± s表示,采用Origin8. 6统计软件进行统计学处理及IC50( the half maximal inhibitory concentration) 的计算。
3独角莲醇提物对癌细胞增殖活性的影响
从图1可以看出,独角莲醇提物对MCF -7细胞的生长具有较强的抑制作用,药物与细胞作用48 h后,IC50为2. 08 mg/m L。 半枝莲醇提物、山豆根醇提物、打不死草醇提物对MCF - 7细胞的IC50分别为30. 5 mg/m L、80. 15 mg/m L、190. 22 mg/m L。
4结论
我国近年来乳腺癌发病率也呈现快速上升趋势。目前临床上治疗手段是以手术和化疗为主。化疗在乳腺癌治疗中占有很重要的地位,但仍存在一定的不良反应和多药耐药性。我国传统的中草药具有资源丰富、对机体毒副作用小等优点,已逐渐成为国内外瞩目的热点。肿瘤细胞的增殖与凋亡在机体的内环境中起重要作用,它与肿瘤的发生、发展、消退有着密切的关系。诱导肿瘤细胞的分化、促进肿瘤细胞凋亡是治疗肿瘤、降低肿瘤恶性程度和抑制转移的主要措施之一。本文选取了4个有代表性的中草药,研究其体外对乳腺癌细胞增殖活性的影响,实验结果表明独角莲醇提物对MCF - 7增殖有明显抑制作用,并呈现时间- 剂量- 效果相关性,这与文献报道独角莲具有诱导多种肿瘤细胞株凋亡的作用,并具有时间及剂量依赖性一致。也有研究结果提示凋亡的剂量依赖性有其一定范围,大剂量造成细胞的急性坏死,使诱导凋亡的作用不明显; 而过低剂量可能仅仅引起微小的、可复性的损伤。因此研究诱导凋亡药物使用的最佳剂量在临床工作中具有重要意义。祖国医学认为,肿瘤多属本虚标实之证。本虚以阴虚、气阴两虚为主; 标实则多以热毒、痰凝、血瘀为主。治法多取益气养阴,清热解毒,化痰消瘀为治则。独角莲味辛甘,性大热,归胃肝二经, 可以祛风痰,止痛,治疗瘰疬,破伤风,以及毒蛇咬伤。独角莲在中医药治疗多种恶性肿瘤中有广泛的应用,并取得了较好的临床疗效。另两种中药材半枝莲及山豆根醇提物对MCF - 7有一定增殖抑制活性,与相关文献报道一致,为植物药的开发和利用提供一定的研究思路［11 － 14］。
增殖活性 篇2
1 材料和方法
1.1 主要试剂和仪器
低糖DMEM培养液(Hyclone公司,美国);胎牛血清、Ⅰ型胶原酶、0.25%胰蛋白酶、双抗(Gibco,美国);地塞米松(Sigma,美国);还原型谷胱甘肽(GSH)(Amersco,美国);中性蛋白酶Ⅱ(Roche,瑞士);MTS细胞增殖测定试剂盒(Promega,美国);HC- A离体肾保存液(上海长征医院);HBSS液(杭州吉诺公司);CO2恒温培养箱(Thermo,美国);酶标仪(Biocell,美国)。
1.2 人PDLCs的体外培养及鉴定
选取11～18岁因正畸拔除的前磨牙根中1/3的牙周膜组织,采用酶消化加组织块法消化进行人PDLCs原代培养[4]。使用含200 ml/L胎牛血清以及青霉素、链霉素各100 U/ml的DMEM培养液,在37 ℃、50 ml/L CO2饱和湿度的细胞培养箱内培养。当原代人PDLCs长至约80%汇合时进行传代培养,培养的第4代细胞用于实验,并用ABC法行抗角蛋白、波形丝蛋白免疫组织化学染色鉴定人PDLCs的组织来源。
1.3 改良HBSS液(Hank's液)的配制
在HBSS液中添加青霉素、链霉素各100 U/ml,无水酒精溶解地塞米松后加入HBSS液中使其终浓度为8 mg/L。将上述HBSS液充分混匀后分成3 等份,分别添加GSH使其终浓度分别为1、3和5 mmol/L,然后用NaOH调节pH值在7.2～7.4之间,最后过滤消毒待用。
1.4 MTS增殖试验
取生长良好的第4代人PDLCs,消化,计数,用含100 ml/L胎牛血清的DMEM培养液制成细胞浓度为5×104/ml的悬液,以100 μl/孔铺于96 孔板,置于培养箱内培养24 h,细胞贴壁后换用含20 ml/L胎牛血清的DMEM培养24 h使细胞同步化。弃去原培养液,分别加入上述3 种改良HBSS液、HBSS液、HC- A液及蒸馏水各100 μl/孔,每种保存液设5 个复孔,同时设空白对照孔。96 孔板在室温(25 ℃)下置放0.5、1、2、6、12、24、48 h,达到上述时间后每孔加入20 μl MTS试剂,于37 ℃、50 ml/L CO2培养箱内孵育1 h,然后在酶标仪上于490 nm测量A值,实验重复3 次。
1.5 统计学分析
实验结果数据均以undefined表示,用SPSS 13.0软件采用单因素方差分析法,组间比较采用LSD法,检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 细胞原代培养情况
人PDLCs原代培养第5天可见细胞从组织块游出,细胞呈长梭形或星形(图 1)。原代培养12 d细胞达到80%汇合,可传代,细胞传代5 d后长满瓶底。因传至第7代时细胞生长明显减慢,故将第4代PDLCs用于实验。
2.2 细胞鉴定结果及生长曲线
第4代人PDLCs抗波形丝蛋白染色阳性(图 2A),胞质内有褐色阳性颗粒均匀分布;而抗角蛋白染色阴性(图 2B),胞质内未见阳性颗粒,符合间叶来源细胞特征,且无上皮细胞污染。MTS法测得的人PDLCs生长曲线(图 3)显示接种第3天细胞进入对数生长期,第7天进入平台期。
2.3 MTS增殖试验结果
从人PDLCs增殖活性测定结果看,HBSS液组和改良HBSS液组在0.5～48 h内显著高于HC- A液组和蒸馏水组(P<0.05)(后两者之间没有显著差异,P>0.05);含3 mmol/L和5 mmol/L GSH的改良HBSS液组在2～12 h显著高于HBSS液组(P<0.05);含1 mmol/L GSH的改良HBSS液组在2～6 h显著高于HBSS液组(P<0.05),其中,含5 mmol/L GSH改良HBSS液组在2～12 h显著高于含GSH的其它浓度组(P<0.05)。但含1 mmol/L GSH的改良HBSS液组在12 h时与HBSS液组无显著差异(P>0.05);另外,改良HBSS液组与HBSS组在24～48 h均无显著差异(P>0.05),但显著高于HC- A液组和蒸馏水组(P<0.05)(图 4)。
3 讨论
牙齿完全脱位时牙周膜受伤撕裂,残留在牙根面上的PDLCs就会失去原有的生理环境并很快发生坏死而不利于再植后的愈合。Cvek等[5]的调查研究显示牙脱位后干燥放置15 min、20～40 min和超过60 min的牙齿再植后分别有13%、40%和100%发生了置换性吸收。因此牙脱位后因多种原因不能即刻再植时,选择合适的介质进行保存就显得尤为重要。
HBSS液含有细胞生存必需的营养物质,且pH为7.2±0.2,渗透压320 mOsm/kg,是美国牙髓医师学会推荐的最佳牙齿保存液,其中美国市场上出售的一种名为Save- A- Tooth®牙齿保存液就是HBSS液[6]。关于HBSS液的研究报道,有的结果显示它是最合适的脱位牙保存液,也有研究认为它的效果没有牛奶好[2,3],这些不同的结果可能与实验方法、实验条件等不同有关。器官保存液研究的“金标准” UW液(university of Wisconsin solution,商品名ViaSpan®)是目前应用最广泛、效果明确的多器官保存液。Trope等[7,8,9]报道在ViaSpan®中保存过的犬牙再植后炎症性吸收发生率低;唇成纤维细胞在ViaSpan®中保存168 h仍有37.6%细胞存活,在HBSS中保存120 h已无活细胞存留;UW液中除了含维持渗透压的非渗透性物质、细胞供能物质外,还有一种重要的添加物—GSH[10](表 1)。还原型GSH是一种广泛存在于正常细胞中的生理活性物质,是细胞内氧化还原状态的一个主要决定因子。此外,有的器官保存液中还添加了少量的地塞米松,据报道地塞米松能保护细胞膜的完整性,还有辅助清除氧自由基的作用[11]。
本实验在HBSS液(存放6 个月)中添加了双抗、地塞米松与不同浓度的GSH配成改良HBSS液,结果发现改良HBSS液在2～12 h内保存人PDLCs增殖活性的效果明显好于HBSS液,而且这种效果随GSH浓度(在1～5 mmol/L 范围内)的升高而显著增强,提示在HBSS液中添加一定浓度的GSH会在短时间内(12 h)提高其保存PDLCs增殖活性的效果。但是,当保存时间超过24 h,改良HBSS液组与HBSS液组之间的效果差异则不太明显(图 4)。作者分析这可能与保存液中的代谢物质累积、营养物质消耗殆尽,进而影响到细胞线粒体酶的活性有关,此时已添加的GSH也很难发挥其抗氧化物破坏作用的效果。Buttke等[1]研究也证实犬脱位牙在添加了100 U/ml过氧化氢酶的HBSS液中保存45 min,其再植后的根面吸收率显著低于未添加过氧化氢酶组,但当保存时间延长到5 h时其根面吸收率显著增高。Souza等[12]的研究发现新鲜配制的HBSS液保存人PDLCs的效果显著高于存放6 个月和12 个月的HBSS液。本实验选择使用存放6 个月的HBSS液,主要是考虑到将来研究开发的脱位牙保存液应该是保存待用的液体,放置一定时间(保质期内)使用比较符合脱位牙保存的实际情况。
此外,本实验还发现国产肾保存液—HC- A与蒸馏水的作用相似,不适合保存人PDLC的增殖活性,这可能与HC- A液成分较UW液简单,不含谷胱甘肽、地塞米松等,且渗透压为380 mOsm/kg(这种高渗环境不利于人PDLC的存活)等[13]有关。
综上所述,本实验与HBSS液等比较观察了改良HBSS液对人PDLC增殖活性的影响,结果发现添加一定浓度GSH和地塞米松的改良HBSS液具有较好的保存人PDLC增殖活性的作用,但是,人PDLC在该改良液保存后细胞存活情况如何、能否增殖形成正常的细胞克隆,以及脱位牙在此液内保存后再植能否形成牙周膜愈合等问题目前还不清楚,今后作者将针对上述问题展开进一步的研究。
摘要：目的:观察改良HBSS液对体外培养人牙周膜细胞(PDLCs)增殖活性的影响。方法:在添加青霉素、链霉素各100U/ml、地塞米松8 mg/L的HBSS液中分别加入1、3和5 mmol/L的还原型谷胱甘肽(GSH)制成改良HBSS液,并与HBSS液、HC-A离体肾保存液及蒸馏水比较,用MTS法测定培养第4代PDLCs在上述溶液中保存不同时间后的增殖活性。结果:HBSS液组和改良HBSS液组在0.5～48h的PDLCs增殖活性显著高于HC-A液组和蒸馏水组(后两者之间没有显著差异),而改良HBSS液含3 mmol/L GSH组和5 mmol/L GSH组在2～12 h显著高于HBSS液组,1 mmol/L GSH组在2～6 h显著高于HBSS液组,5 mmol/L GSH组在2～12 h显著高于含GSH的其它浓度组。结论:改良HBSS液保存人PDLCs增殖活性的效果好于HBSS液,其中含5 mmol/L GSH的改良液在12 h内的效果最好。
增殖活性 篇3
关键词：大豆异黄酮,成骨细胞,骨钙素
随着老龄化时代的到来, 绝经后骨质疏松症患病率逐年增高。雌激素治疗虽能减少绝经后妇女的骨丢失及骨折发生率[1], 但同时也增加了患乳腺癌和子宫内膜癌的风险[2,3]。近年来, 植物雌激素以其在女性健康中的潜在作用而成为研究的热点, 为防治绝经后骨质疏松提供了一条新思路。
大豆异黄酮类 (isoflavones) 主要是糖苷结合形式的染料木苷和黄豆苷, 在体内细菌作用下, 释放出具有生物活性的物质被吸收。近年研究表明, 大豆异黄酮在动物试验和人群调查中对骨骼代谢、预防骨质疏松有重要作用, 但在细胞水平, 一直尚少有报道。本实验结合血清药理学方法采用体外细胞培养, 目的在于从胞内信号转导水平探索成骨细胞骨钙素 (BGP) 的基因表达变化, 研究大豆异黄酮防治骨质疏松症的作用机制。
1 材料与方法
1.1 试剂
低糖DMEM培养液、HEPES、胎牛血清 (联星生物有限公司) 、MTT (南京建成生物有限公司) 。RNA试剂盒 (美国GIBCO) , 逆转录酶为Roche公司。大豆异黄酮购自天津市康宁生物化学工程有限公司, 总含量为50.27%。
1.2 原代成骨细胞的培养
将新生SD大鼠 (中国医科大学实验动物中心) 放入75%酒精中浸泡消毒15 min, 无菌操作下取出颅盖骨。除去附着的血管及结缔组织, 用PBS溶液清洗3次。剪成l mm×l mm大小的碎块。加入0.25%胰蛋白酶, 于37℃消化30 min, 弃去消化液, PBS溶液清洗干净后, 加入0.02%Ⅱ型胶原酶, 于37℃消化5次, 每次20 min, 弃除前两次消化液, 取最后3次消化液, 1000 r, 离心10 min。弃上清液, 所得白色沉淀物即为制得的成骨细胞样细胞团。用含10%胎牛血清 (FBS) 的DMEM培养液重悬细胞至2×104/m L的细胞悬液, 吹打均匀后。接种到100 m L培养瓶。置入37℃, 含5%CO2饱和湿度的培养箱内进行培养, 24 h换液。弃去悬浮细胞.每隔2 d换液1次。
1.3 细胞增殖MTT测定方法
取培养至第3代的成骨细胞以1×105个/m L密度接种于96孔培养板, 每孔300μL, 24 h细胞贴壁后, 弃培养液, 分别加入含有大豆异黄酮 (20、40、60、80μg/μL) 浓度培养液, 另设加DMEM培养液作为阴性对照, 每组8孔。继续培养48 h后, 每组分别收集50μL上清液。每孔加入MTT溶液20μL, 37℃孵育4 h, 终止培养, 小心吸弃上清;每孔加入DMSO溶液150μL, 振荡10 min, 立即测定吸光度值 (波长490 nm) 。比较各组OD值的大小。
1.4 大豆异黄酮对成骨细胞BGP基因表达的影响
1.4.1 细胞总RNA提取
培养细胞经消化后, 弃消化液, PBS洗涤2次;加入TRIZOL细胞裂解液。刮下细胞, 连同裂解液一起转移至新的1.5 m L, Ep管中, 室温放置5 min。加氯仿0.2 m L, 剧烈震荡振荡15 s, 室温静置3 min, 4℃离心, 12000 r, 15 min, 小心吸取上层水相, 移至另一1.5 m L Ep管中。加等体积异丙醇, 室温放置10 min, 4℃离心, 12000 r, 10 min。弃上清, 加预冷75%乙醇1 m L, 旋涡振荡充分洗涤总RNA沉淀, 4℃离心, 12000 r, 5 min。弃上清, 快速离心5 s, 将管底残余乙醇用移液器小心吸去, 室温下晾干沉淀20 min。加20μL无RNA酶水, 溶解总RNA沉淀, 用分光光度计测定其在260、280 nm处OD值, 以确定核酸的纯度及浓度, 并按照公式[m RNA] (μg/μL) =OD260×40×稀释倍数/1000。
1.4.2 RT-PCR
取3μg总RNA用Ta Ka Ra RNA PCR Kit (AMV) Ver试剂盒逆转录合成c DNA。再用9700型PCR扩增仪 (PE公司) 进行PCR。BGP引物利用primer3软件设计, BGP上游:5'-GCA GGA GGG CAA TAA GGT-3';BGP下游:5'-CGT AGA TGC GTT TGT AGGC-3'。用于扩增BGP基因c DNA, 片段大小为164 bp。扩增条件为94℃5 min, 94℃15 s, 55℃30 s, 68℃20 s, 共30个循环。β-actin引物序列, 上游:5'-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3';下游:5'-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AACA-3', 扩增片段:300 bp。扩增条件为94℃5 min, 94℃15 s, 55℃30 s, 68℃20 s, 共30个循环。
1.4.3 PCR产物半定量分析
取5µLPCR产物经1.5%琼脂糖凝胶 (含0.5μg/m L EB) , 120 V恒压, 40 min, 紫外透射仪上观察结果, 凝胶分析软件对电泳谱带进行半定量分析, 用任意单位 (AU) 表示凝胶谱带的面积×荧光强度值, BGP与β-actin的AU比值代表各自的m RNA相对表达水平。
1.5 统计学处理
用SPSS13.0统计软件进行统计学分析。数据用 (±s) 表示, 各组均数的比较行单因素方差分析 (ANOVA) 。P<0.05为有显著性差异。
2 结果
2.1 不同浓度的大豆异黄酮对成骨细胞增殖活性MTT结果显示:
随大豆异黄酮浓度的上升, 成骨细胞增殖活性呈上升趋势。其中, 60、80μg/μL与对照组相比, 差异有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
注:*P<0.05 vs control group
2.2 RT-PCR半定量结果显示
与对照组 (0.5386±0.028) 相比, 20μg/μL (0.5620±0.020) 和40μg/μL (0.6228±0.012) 组BGP m RNA表达没有统计学意义 (P>0.05) ;60μg/μL (0.7813±0.010) 和80μg/μL (0.8121±0.013) 组BGP m RNA表达增强, 有统计学意义 (P<0.01) (图1, 图2) 。
3 讨论
骨组织中存在的细胞主要有3种:骨细胞、成骨细胞、破骨细胞。其中成骨细胞是骨组织中最活跃的细胞。成骨细胞存在于骨的表面以及骨间隙的孔隙内。其主要功能是合成、分泌骨基质并促进基质矿化形成骨组织[4,5,6]。骨钙素是成骨细胞合成分泌的一种非胶原蛋白, 是反映成骨细胞分化成熟的指标, 能准确表示成骨细胞的活性。当骨形成和骨吸收耦联时, 骨钙素的主要生理作用是反映骨转换的指标;当骨形成和骨吸收解耦联时, 骨钙素是反映骨形成的特异指标;它能准确反映成骨细胞的成骨功能[7,8]。
大豆异黄酮是植物雌激素的一种, 主要包括大豆苷原、染料木黄酮和黄豆黄素, 它们的结构与雌激素相似。本实验通过不同浓度的大豆异黄酮对体外培养的成骨细胞的增殖活性和BGP基因表达影响, 结果表明, 大豆异黄酮可以增加细胞水平的成骨细胞的增殖活性, 并随浓度的增大呈上升趋势。在基因水平上, 大豆异黄酮可促进大鼠成骨细胞BGP基因的表达, 亦表现出明显的剂量依赖关系。由此可以推测, 大豆异黄酮对骨骼代谢、预防骨质疏松的作用, 可能是促进成骨细胞的增殖活性和增加细胞中BGP基因表达而介导, 并表现出明显的剂量依赖关系。细胞培养研究表明, 大豆异黄酮对成骨细胞增殖、大鼠骨代谢有促进作用, 但其机制仍需进一步研究。成骨细胞增殖、分化的过程是一个受多种因素调节的复杂过程, 其可能受到多种因素的影响。
参考文献
[1]ConnellD, RobertsonJ, HenryD, et al.A systemic review of the sekeletal effects of estrogen therapy in postmenopausal women.ⅡAn assessment of treatment effects[J].Climacteric, 1998, 1 (2) :112-123.
[2]Writing Group for the Womens Health Initiative Investigations.Risk and Benefits of estrogens plus progestin in healthy postmenopausal women:principal results from the Womens Health Initiativ controlled trial[J].JAMA, 2002, 288 (3) :321-333.
[3]Lacey JV Jr, Mink P J, Lubin JH, et al.Menopausal hormon replacement therapy and the risk of ovarian cancer[J].JAMA, 2002, 288 (3) :334-341.
[4]Bielby R C, Boccaccini A R, Polak JM, et al.In vitro differentiation and in vivo mineralization of osteogenic cells derived from human embryonic stem cells[J].Tissue Eng, 2004, 10 (9/10) :1518-1525.
[5]胡立桉, 陈卫民, 毛靖.持续压力对大鼠成骨细胞碱性磷酸酶分泌活性的影响[J].临床口腔医学杂志, 2003, 2 (19) :79-81.
[6]李月白, 胡新永, 王义生.辛伐他汀与地塞米松对成骨细胞内皮细胞型一氧化氮合酶基因表达及增殖的影响[J].中华骨科杂志, 2006, 26 (9) :614-617.
[7]Dost P, Ten Cate WJ, Wiemann M.Osteoblast like cell cultures from human stapes[J].Acta Otolaryngol, 2002, 122 (8) :836-840.
增殖活性 篇4
1 材料和方法
1.1 材料
收集2004年7月~2005年9月手术切除胃癌40例,其中低分化腺癌25例,中分化腺癌5例、高分化腺癌2例、印戒细胞癌3例、黏液腺癌3例,未分化腺癌2例。术前均未行化疗和放疗,全部病例经二位高年资历医生评定。
1.2 方法
1.2.1 主要试剂
PBS缓冲液:Na2HPO45.75克,KH2PO41克,Na Cl 1克,KCl 1克,加水至500 m L,室温下存放。
1.2.2 主要仪器设备
离心机:北京医用离心机下生产的LD4-2型。流式细胞仪:Beckman Coulter公司生产的Coulter Epics Altra型。
1.2.3 D N A检测样本的制定
当从人体内移除标本30 min后,分别从标本上取癌组织(避开癌中心坏死区),癌旁组织3 cm、5 cm、7 cm、最远断端处各一标本。用生理盐水冲洗标本除去黏液,加入1 m L PBS液于培养皿中,将样本放入培养皿中,在培养皿中用眼科剪将样本剪成碎末状,200 um铜网过滤,加入PBS液后离心8 min,每分钟1 500转,留沉淀1 m L,将沉淀1 m L加入到2 m L 70%酒精中固定,20℃冰箱保留18 h以上。
1.2.4 D N A含量的检测
单细胞悬液与DNA荧光染料结合,取单细胞悬液0.1 m L,加入DNA试剂A溶液250 u L,混匀室温孵育10 min,加入B溶液200uL,混匀室温孵育10 min,加入C溶液200 uL,混匀孵育10 min上机检测。用戊二醛固定鸡红细胞,调节仪器的变异系数在3℅以下,15 mw、480 nm的氩离子激光激发细细胞核结合的荧光染料,产生特异性荧光,经荧光测量系统收集,输入计算机处理分析,测定细胞中PI的荧光强度。
1.2.5 D N A含量分析方法
以DNA指数(DNA Index,DI)表示DNA含量,依据DI值判断DNA倍体DI=0.9~1.10为二倍体,DI<0.9或DI>1.10为异倍体,DI值计算公式=样品(G0/G1期)细胞峰均道值/正常二倍体细胞(G0/G1期)细胞峰均道值。
1.2.6 细胞增殖活性的分析方法
应用DNA细胞周期分布软件,计算出DNA组方图各时相的分布百分比,以增殖指数(PI)表示细胞的增殖活性,PI值越大,细胞的增殖活性越强。PI值计算公式为PI(%)=[(S+G2/M)÷(G0/G1+S+G2/M)]×100%,其中G0/G1,S,G2/M分代表细胞各时项DNA分布的百分比。
1.3 统计分析
所有的数据采用SPSS10.0数据库软件进行统计分析。统计学采用χ2检验,以P<0.05判定差异的显著性。
2 结果
第一峰代表凋亡(Apo),第二峰代表G0/G1,第三峰代表S期,第四峰代表G2/M。从图可见随着离癌组织越远,凋亡峰逐渐上升,与增殖峰达到平衡。
胃癌、癌旁组织3 cm、5 cm、7 cm、最远端断端胃粘膜的DNA含量(DI值),倍体,PI值结果分析,从中可见,癌组织、癌旁组织3 cm中DI值显著高于癌旁组织5㎝、7㎝和最远端断端处(1.35±0.10、1.20±0.08比1.05±0.05,1.01±0.03或0.96±0.01.),而癌旁组织5 cm、7 cm、最远端断端处DI值相差甚微(1.05±0.05,1.01±0.03与0.96±0.01相比);从异倍体来看,癌组织、癌旁组织3厘米处异倍体数目最多,远远大于癌旁组织5 cm、7 cm和最远端断端处,从增殖活性(PI值)来看,癌组织和癌旁组织3 cm处最高,见图6~8。
胃癌病理学或临床特征与DNA异倍体、PI值之间的关系结果显示,DNA异倍体与胃癌患者的年龄与肿瘤大小无关,而与胃癌的分化程度、浸润深度、淋巴结转移、手术断端有癌残留及TNM分期相关。而年龄、肿瘤大小越大,分化程度低,浸润越深,手术断端有癌残留,伴有淋巴结转移、PI值越高。
A:癌组织;B:癌旁组织3cm;C:癌旁组织5cm;D:癌旁组织7cm;E:最远端屡断端处
A:癌组织;B:癌旁组织3cm;C:癌旁组织5cm;D:癌旁组织7cm;E:最远端屡断端处
A:癌组织;B:癌旁组织3cm;C:癌旁组织5cm;D:癌旁组织7cm;E:最远端屡断端处
3 讨论
人体正常的体细胞均有较恒定的DNA二倍体含量(除肝脏、心肌、男性生殖细胞外),而细胞癌变过程中DNA含量和(或)染色体结构异常是较普遍的。当人体正常体细胞受到致癌因素作用时,在其遗传物质DNA的不断损伤和修复过程中,细胞基因发生突变,这时作为细胞遗传物质载体的细胞核染色体必将发生变化,出现染色体畸形或断裂,这种在细胞分裂过程中出现DNA蛋白质与量的异常。基因排列顺序发生改变,使原有的细胞生物学特征发生改变,成为DNA含量异常(增多或减少)的肿瘤细胞,即DNA非整倍体细胞,也称异倍体细胞[2]。
近年来,DNA含量技术迅速发展,已广泛应用于肿瘤的临床及基础理论研究的一门新型检测技术、流式细胞技术(FCM)是一种快速定量分析细胞核DNA含量的技术,在推测肿瘤细胞的发生、发展及预后上具有重要的价值[3]。
本研究中DI值、异倍体率、PI值在癌旁组织5cm、7 cm、最远断端处无显著差异。癌组织与癌旁组织3 cm处无显著性差异,但后两组与前三组癌旁组织DI、异倍体率、PI值比较有显著性差异,胃癌组DI值、异倍体率、PI值最高。全国胃癌协作组1399例胃癌,癌旁伴有肠上皮化生者共970例,其中重度617例(44.1%);伴有萎缩性胃炎801例,其中,中、重度者497例(35.5%),肠上皮化生和萎缩性胃炎都是癌前病变[1]。从研究的数据和全国胃癌协作组的数据表明,癌旁组织3 cm与癌组织异倍体率、PI值无显著差异,说明癌旁组织3 cm处可能为癌组织浸润或癌前病变,有些学者认为,癌前病变的不典型增生程度越高,出现DNA异倍体的几率越大,不典型增生程度越高,癌变的发生率就越大[4]。从异倍体率与PI值来看,远端切缘组织、癌旁组织7 cm、5cm、3 cm,癌组织值是呈递增的,呈现出一个从量变到质变的过程,因此癌旁组织3 cm具有恶性肿瘤的特征。
表2表示切端癌残留与异倍体、细胞增殖活性相关(P<0.05)。为了避免切端癌残留,目前术中取切缘行冰冻病理切片作为一种检测手段。但是病理学检测手段存在着主观因素,尤其是对那些极微量的肿瘤细胞或微小的转移灶缺乏一定的灵敏度。TEDORI等[5]对20例萎缩性胃炎病人进行了FCM(flowcytometry)对DNA倍体的检测,发现9例为DNA非整倍体,其中5例随访半年后被病理诊断为胃癌。因此有学者认为组织形态确定为恶性病变前2年即可检测到DNA异倍体。肿瘤细胞具有无限分裂增殖的特性,表现为DNA不断复制,因而会出现DNA含量及增殖活性的改变,故DNA异倍体是肿瘤的特征之一,同时它往往出现在组织病理学改变之前,可作为预测癌前病变恶性倾向的指标[6]。HAMADA[7]等指出,如果重度异型增生的结直肠病变中出现异倍体,则预示着黏膜内癌存在。本实验结果显示,癌组织及癌旁组织3 cm DNA异倍体、PI值显著高于癌旁组织5 cm、7 cm,而癌旁组织3 cm与癌组织无差异,说明癌旁组织3 cm等同于癌组织或癌前病变,具有恶性肿瘤特征性改变。为了避免术后吻合口肿瘤复发,切除范围上下离肿瘤至少大于3 cm才能达到根治目的。
对胃癌不同组织学分型分析表明随着胃癌组织学分化程度的降低,细胞增殖活性增加,这说明肿瘤细胞分化越差,肿瘤细胞的无限增殖,表现在细胞周期中DNA合成期细胞的大量增加,增殖与凋亡失去平衡,上图1~2显示凋亡峰低平,增殖峰尖而高,增殖峰与凋亡峰不平衡且通过PI值便可反映细胞增殖活性。因此认为PI是判断肿瘤侵袭活性的重要指标。PI值越高,细胞增殖功能越活跃,肿瘤恶性程度越高。
临床上胃癌浆膜是否受浸润、淋巴结是否转移是判断病期或恶性程度的重要指标,受浸润者、淋巴结转移预后明显不佳。通常以异倍体多少来衡量。ARETXABALA等[8]研究37例胃癌标本发现,侵犯到浆膜或浆膜下肿瘤非整倍体检出率较未侵犯浆膜的肿瘤为高。SUGIHARA等[9]对45例早期及进展期印戒细胞胃癌进行研究,认为非整倍体细胞较二倍体细胞易侵犯至黏膜下。本文结果表明当肿瘤浸润程度达到肌层或浆膜层时,异倍体检出率为93.9%,黏膜下层为28.6%,P<0.05有统计学意义,浸润越深,异倍体越多。淋巴结转移阳性者异倍体率为88.6%,而没有淋巴结转移的异倍体率低。XIN等[10]认为DNA倍体类型与胃癌转移途径有一定关系,即仅有淋巴结转移者(不伴血行转移)多为DNA二倍体,一旦发生血行转移如肝、肾上腺转移,则绝大多数为DNA异倍体。YONEMURA等[11]发现120例早期胃癌中,非整倍体肿瘤患者淋巴结受累率明显高于二倍体肿瘤患者。WU等[12]认为异倍体癌易发生淋巴结转移,并且异倍体癌、淋巴结多数转移,转移距离超过N2站。因此,异倍体可以作为胃癌的临床分期,判断预后和指导胃癌根治术制定合理的淋巴结清扫提供一种行之有效的手段,并可用于指导术后患者的随访观察,以便发现亚临床转移的早期血行转移。
参考文献
[1]刘倩,王文奇,毛海婷主编.胃癌[M].北京:人民卫生出版社,2004,12(1):6.[1]LIU Q,WANG WQ,MAO HT.Gastric cancer[M].Beijing:ThePeople's Medical Publishing House,2004:6.Chinese
[2]夏潮涌.图象分析仪在测定肿瘤细胞DNA含量、倍体中若干问题[J].中华病理学杂志,1999,28(4):307-308.[2]XIA,CY.Many questions about tumor cell DNA content andploidy in image analyzer[J].Chinese Journal of Pathology,1999,28(4):307-308.Chinese
[3]李正生,郁宝铭,王瑞年.恶性肿瘤流式细胞测量术国际统一新标准[J].国外医学肿瘤学分册,1994,21(4):209.[3]LI ZS,YU BM,WANG RN.The new international standardsabout flow dytometry measure in tumor cell[J].Journal ofInternational Oncology,1994,21(4):209.Chinese
[4]FURUYA T,UCHIYAMA T,MURAKAMI T.Relationshipbetween chromosomal in stability and intratumoral regional DNAploidy heterogeneity in primary gastric cancers[J].Clin CancerRes,2000,6:2815-2820.
[5]TEODORI L,CAPURSO L,CORDELLI E,et al.Cytometricallydetermine relation DNA content as an indicator of neoplasia ingastric lesion[J].Cytometry,1984,54:63.
[6]BARLOIE B,DREWINKO B,SCHUMANU J,et al.CellularDNA content as a marker of neoplasia in man[J].Ann J Med,1980,69:195-197.
[7]HARMADA S.DNA distribution of the so-called severe dysplasiaand small carcinoma of the colon and rectum and its possiblesignificance in the tumor progression[J].Cancer,1988,61:1555-1557.
[8]ARETXABALA X,et al.Gastric cancer heterogeneity[J].Cancer,1989,63:791.
[9]SUGIHARA H.et al.Regional ploidy variations in signet ringcell carcinomas of the gastric carcinoma[J].Cancer,1990,65:122.
[10]XIN Y,ZHAO FK,XU L,et al.A study on DNA ploidy,mutant p53 gene product expression and relationship withmetastasis in stomach cancer[J].Journal of China MedicalUniversity,1997,26(1):8-11.
[11]YONEMURA Y,et al.Correlation of DNA ploidy and clinicaloutcome in early gastric cancers[J].Oncology,1990,47:49.
增殖活性 篇5
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摘要：研究胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、肝细胞生长因子(HGF)、转化生长因子β1(TGF-β1)、干扰素-γ(IFN-γ)对奶牛乳腺上皮细胞体外增殖的调节作用。应用组织块培养和差速消化法获取原代奶牛乳腺上皮细胞,免疫荧光鉴定正确后MTT法评价不同浓度的4种细胞因子对奶牛乳腺上皮细胞体外增殖的影响。IGF-I、HGF分别在10~200 ng/m L,0.1~100 ng/m L浓度范围内对乳腺上皮细胞的增殖呈正相关。而TGF-β1(2.5~100 ng/m L)、IFN-γ(5~160 ng/m L)则剂量依赖性地抑制乳腺上皮细胞增殖。IGF-I、HGF均能促进奶牛乳腺上皮细胞的体外增殖,该作用在一定浓度范围内有剂量依赖性;TGF-β1、IFN-γ对乳腺上皮细胞的增殖作用出现剂量抑制效应。该研究为下一步深入探讨细胞因子对奶牛泌乳机制的研究奠定基础。
关键词：细胞因子,乳腺上皮细胞,原代培养,细胞增殖
增殖活性 篇6
1 材料与方法
1.1 实验动物
SPF级新生SD乳大鼠,1日龄,购自南方医科大学动物实验中心,动物许可证号:SYXK(粤)2010-0106。
1.2 药品与试剂
阿魏酸:中国药品生物制品检定所。DMEM培养基:Gibco公司;胎牛血清:杭州四季青生物公司;Ⅱ型胶原酶、胰蛋白酶:Sigma公司;四甲基偶氮唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO):南京建成生物工程研究所;碱性磷酸酶试剂盒:南京建成生物工程研究所;RT反转录试剂盒、Taq DNA聚合酶、总RNA提取试剂盒:MBI公司产品;骨活素(OA)mRNA聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)试剂:富酶泰斯生物技术有限公司产品;骨保护素(OPG)逆转录聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)试剂盒:Fermentas公司。
1.3 实验仪器
超净工作台:北京半导体设备厂;BB16BB5060型CO2培养箱:德国Heraus公司;倒置显微镜:日本Olympus;96孔培养板:美国Costar公司;3K30高速冷冻离心机:Sigma公司;紫外分光光度计:德国Eppendorf公司产品;DYY-III-7B稳压稳流型电泳仪:北京六一仪器厂;定量PCR仪:美国ABI公司;BIO-RAD 680伯乐酶标仪:美国伯乐公司。
1.4 方法
1.4.1 成骨细胞的原代培养
取24 h内新生SD大鼠,75%乙醇浸泡消毒5 min。无菌取出颅骨,置于PBS液中,彻底清除结缔组织和血管,PBS清洗2次,再将骨块剪碎至肉糜状。用0.25%胰蛋白酶37℃预消化15~20 min,去除消化液以清除成纤维细胞,再用10倍体积的0.1%Ⅱ型胶原酶和0.1%透明质酸酶37℃恒温振荡消化,每次30 min,取第3、4、5、6次消化的细胞悬液,300 r/min离心10 min,弃上清,沉淀的细胞用不含血清的DMEM培养液洗涤离心1次,最后用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬,吹打均匀后以1×105·m L-1接种到培养瓶中,培养瓶置37℃5%CO2培养箱培养,隔日换液,以后每3 d换液1次,细胞融合后,用0.25%胰蛋白酶消化,传代倒置显微镜下观察成骨细胞形态。
1.4.2 阿魏酸对体外培养成骨细胞增殖的影响
取第3次代细胞,以5×104·m L-1细胞接种于96孔培养板中,随机分为组空白组(0μg/L)、阿魏酸高剂量组(200μg/L)、阿魏酸中剂量组(20μg/L)、阿魏酸低剂量组(2μg/L),24孔每组,每d更换新的含药培养基1次,分别在加药后第1、2、3、4、5、6 d每组各取4个复孔,加入5 g/L 20μL的MTT,37℃孵育4 h,将孔中液体吸弃然后加入150μL二甲基亚砜(DMSO),置震荡器上震荡10 min,酶标仪570 nm波长处检测吸光度(OD)值。
1.4.3 阿魏酸对体外培养细胞上清液ALP活性、OPG和OA mRNA表达的影响
取第3次代细胞,以5×104·m L-1细胞接种于48孔培养板中,随机分为空白组(0μg/L)、阿魏酸高剂量组(200μg/L)、阿魏酸中剂量组(20μg/L)、阿魏酸低剂量组(2μg/L),每组24孔,然后每瓶分别加入不同浓度0(空白对照)、2、20、200μg/L阿魏酸的条件培养液,每浓度8孔。每d更换新培养基1次,分别在加药第6 d每组各取16个复孔,取上清液ELISA法测定ALP活性。剩余细胞提取总RNA后RT-PCR测定成骨细胞OPG mRNA和OA mRNA的表达,扩增产物凝胶电泳后摄片,然后进行光密度扫描,并以吸光度的比值表示。
1.4.4 统计学方法
计量资料以均值±标准差(±s)表示,多组间均数的比较采用单因素方差分析,若方差齐,组间均值两两比较采用SNK法,若方差不齐,组间均值两两比较采用Dunnett T3法,均由SPSS15.0进行统计;α=0.05。
2 结果
2.1 阿魏酸对大鼠成骨细胞体外增殖的影响
见表1。
由表1可知,体外培养的大鼠成骨细胞1~6 d内呈“S”型曲线增殖,阿魏酸高、中、低3个剂量组均可明显促进成骨细胞的增殖。与空白组相比,除阿魏酸低剂量组给药后第1d细胞吸光度均值与空白组无显著性差异(P>0.05)外,中、高剂量组药后第1 d细胞吸光度均显著增加(P<0.05,0.01),阿魏酸高、中、低剂量组药后2~6 d细胞吸光度均有显著性增加(P<0.01)。
与空白组比较*P<0.05,**P<0.01
2.2 阿魏酸对成骨细胞碱性磷酸酶活性、OPG和OAmRNA表达的影响
见表2。
由表2可知,与空白组比较,阿魏酸高、中、低3剂量组均可不同程度增强体外培养大鼠成骨细胞的ALP活性,促进OPG和OA mRNA的表达(P<0.05)。
与空白组比较*P<0.05,**P<0.01
3 讨论
成骨细胞位于骨组织表面,由间叶质干细胞分化而来,是骨新生以及损伤后修复重建过程中骨生成的唯一效应细胞,可产生胶原、非胶原性骨基质蛋白(如骨钙素等)和细胞因子如骨形成蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)等,还可以通过线粒体将钙和敷料运送到钙化部位,促进钙化发生,是参与骨代谢的主要细胞[4]。ALP是主要分布于细胞膜的钙结合转运蛋白,可促进细胞成熟、钙化[5],是成骨细胞早期和中期分化的标志物。成骨细胞不仅参与骨形成,而且通过产生核因子κB受体激动剂配体(ligand of receptor-activator of nuclear factor-kappa B,RANKL)、骨保护素(OPG)等多种信号分子,其中OPG通过与RANKL结合,竞争性抑制了RANKL与破骨前体细胞膜上核因子κB受体活化因子(receptor-activator of nuclear factor-kappa B,RANK)分子的结合,抑制破骨细胞的分化、成熟,阻止骨吸收[6],骨细胞树突表达的膜结合的RANKL和破骨前体细胞表达的RANK的直接接触被认为是破骨细胞分化所需要的[7]。骨活素(OA)mRNA和蛋白表达于成骨细胞[8],是成骨细胞的分化所必需,可诱导成骨细胞生长及破骨细胞分化[9],OA表达增加可促进颅骨缺损模型大鼠的骨再生[10]和骨折愈合[11],OA下调则可降低成骨细胞分化和功能[12]。体外培养成骨细胞在骨代谢研究中的作用非常重要,常用于研究骨代谢机制及药物筛选[13]。
阿魏酸钠是我国自行研发的一类新的啡肽类内皮素受体拮抗剂,普遍存在于当归、川芎、蜂胶、酸枣仁等中药中[14]。本研究证实阿魏酸可促进体外培养大鼠成骨细胞的增殖,增强成骨细胞ALP活性,并诱导OPG mRNA和OAmRNA的表达,提示阿魏酸能通过促进成骨细胞增殖与分化,并刺激成骨细胞骨代谢,促进骨蛋白质合成和钙沉积,促进骨形成。这与阿魏酸钠关节腔注射可促进关节炎模型大鼠退变软骨修复[15],以及与成骨诱导剂合用促进骨髓基质干细胞的成骨分化与增殖、提高骨髓基质干细胞ALP活性和细胞内骨钙素含量[16]的结果相符,也有研究证实阿魏酸可作用于成骨细胞和破骨细胞的骨吸收阶段,增加去卵巢骨质疏松大鼠的骨密度和ALP活性,促进骨生成和骨重塑[17]。