LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法（共2篇）
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法 篇1
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测
LDH释放检测
方法：
a.根据细胞的大小和生长速度将适量细胞接种到96孔细胞培养板中，使待检测时细胞密度不超过80-90%满。
b.吸去培养液，用PBS液洗涤一次。换新鲜培养液(推荐使用含1%血清的低血清培养液或适当的无血清培养液)，将各培养孔分成如下几组：包括无细胞的培养液孔(背景空白对照孔)，未经药物处理的对照细胞孔(样品对照孔)，未经药物处理的用于后续裂解的细胞孔(样品最大酶活性对照孔)，以及药物处理的细胞孔(药物处理样品孔)，并做好标记。按照实验需要给予适当药物处理(如加入0-10μl左右特定的药物刺激，可设置不同浓度，不同处理时间，对照孔中需加入适当的药物溶剂对照)，继续按常规培养。到预定的检测时间点前1小时，从细胞培养箱里取出细胞培养板，在“样品最大酶活性对照孔”中加入试剂盒提供的LDH释放试剂，加入量为原有培养液体积的10%。加入LDH释放试剂后，反复吹打数次混匀，然后继续在细胞培养箱中孵育。
c.到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，随即进行样品测定。
准备工作：
a.INT溶液(1X)的配置：根据所需的INT溶液(1X)的量，取适量INT溶液(10X)用INT稀释液稀释至1X。例如，取20μl INT溶液(10X)，加入180μl INT稀释液，混匀后即配置为200μl INT溶液(1X)。INT溶液(1X)宜现配现用，配置后4℃保存可于当天使用，不宜配置后冻存。
b.LDH检测工作液的配制: 根据待测定的样品数(含对照)，参考下表在临检测前新鲜配制适量的检测工作液。注意：LDH检测工作液必须现配现用，配制和使用过程中均要注意适当避光。样品测定:
a.各孔分别加入60μl LDH检测工作液。
b.混匀，室温(约25℃)避光孵育30min(可用铝箔包裹后置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动)。然后在490nm处测定吸光度。使用600nm或大于600nm的任一波长作为参考波长进行双波长测定。c.计算(测得的各组吸光度均应减去背景空白对照孔吸光度)
细胞毒性或死亡率(%)=(处理样品吸光度－样品对照孔吸光度)/(细胞最大酶活性的吸光度－样品对照孔吸光度)×100
d.可绘制细胞毒性曲线：纵座标为实际吸光度，横坐标为药物浓度；据此可计算该药物作用特定时间的半致死剂量LD50。
LDH乳酸脱氢酶细胞毒性检测实验方法 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取我院2012年10月至2015年10月收治的巨幼细胞性贫血患者32例为MA组, 同期入院治疗的骨髓异常增生综合征 (MDS) 患者22例为MDS组, 均符合相关诊断标准[2]。其中MA组患者中男18例, 女14例, 年龄19~75岁, 平均 (48.32±3.31) 岁。MDS组中男12例, 女10例, 年龄18~80岁, 平均 (48.15±4.06) 岁。另选取同期来我院接受体检的健康人员24例为对照组, 其中男13例, 女11例, 年龄18~76岁, 平均 (46.53±3.67) 岁。三组人员一般资料比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 具有可比性。
1.2 检测方法
各组人员均空腹采集3 m L肘静脉血, 离心并分离血清后于3 h内测定白细胞计数 (white blood count, WBC) 、血红蛋白 (hemoglobin, Hb) 、血小板 (blood platelet, PLT) 、红细胞平均体积 (mean corpuscular volume, MCV) 、LDH、TBIL、直接胆红素 (direct bilirubin, DBIL) 、IBIL和Hcy水平。WBC采用白细胞计数稀释液将白细胞稀释后滴入庆数盘中, 显微镜下进行计数;Hb采用比色法测定;PLT采用比浊法检测;MCV采用血液分析仪进行测定, TBIL、DBIL和IBIL采用胆红素氧化酶法测定;LDH采用LDH检测试剂盒进行检测;Hcy采用酶联免疫吸附法进行检测。本次研究所选用仪器为全自动血细胞分析仪 (Sysmex, XE5000) 、全自动生化仪 (日立, 7600) 和电化学发光仪 (罗氏公司, cobase411) , 使用前上述仪器均经校准。检验时均按照使用说明进行, 选用配套试剂, 由2名检验人员完成检验, 以确保其准确性。
1.3 阳性判断标准
LDH升高的阳性判断标准[3]为:LDH>245 U/L。
1.4 统计学方法
采用SPSS13.0软件对数据进行统计分析, 计数资料采用n/%表示, 采用χ2检验, 计量资料用±s表示, 采用t检验, P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 三组组间各指标检测结果比较
MA组患者的LDH水平、TBIL、DBIL、IBIL和Hcy水平均明显高于与MDS组和对照组, 均有显著差异 (P<0.01) ;MDS组患者的LDH水平明显高于对照组 (P<0.05) , 但其他指标与对照组比较无明显差异 (P>0.05) , 见表1。
注:与MA组比较, *P<0.01;与对照组比较, #P<0.05。
2.2 MA组和MDS组LDH升高的阳性率比较
MA组患者LDH均升高, 阳性率为100%;MDS组患者LDH升高10例, 占45.45%, 组间比较差异有显著统计学意义 (P<0.01) 。
3 讨论
LDH是一种广泛存在于心、肝、肾、骨髓、肌肉和红细胞等人体组织器官中的糖酵解酶, 其中血清中的LDH水平可反映富含该糖酵解酶的细胞增殖与代谢的生物学性状[4,5]。正常情况下人体血清中的LDH水平远低于细胞组织中的其他, 当细胞破坏或存在组织坏死时, 其释放入血可导致血液中的LDH水平明显升高。MA是由多种因素所致的一组良性贫血, 其特点主要有红细胞核发育不良、骨髓内幼稚红细胞数量增多、粒系与巨核细胞出现巨幼样变, 常伴有白细胞 (WBC) 、血小板 (PLT) 减少。有研究显示, MA患者的病情越严重时 (主要指贫血症状) , 其WBC、PLT水平下降也越明显。但MDS等疾病同样可引起巨幼样变, MA表现为外周血三系减少时易误诊为该病[6,7]。
MDS是一组造血干细胞克隆性疾病, 其较易发生细胞基因突变, 存在转化为白血病的风险, 患者以贫血为主要症状, 且骨髓出现病态造血现象, 血象多表现为全血细胞减少或一系、二系血细胞减少等。如伴有原始细胞增多, 则对MA与MDS较易鉴别诊断;反之, 对于不伴有原始细胞增多、无遗传学异常、无明显病态造血的MDS患者, 仅从细胞形态学上通常难以准确区分以上两种疾病。因此, 探求一种简单易行且无需昂贵费用的检测指标已成为当务之急。
本研究结果显示, MA组患者和MDS组患者的LDH水平均显著高于正常对照组, 且MA组患者的LDH水平也显著高于MDS组 (P<0.01) , 与有关文献报道结果相符[8]。此外, MA组患者LDH阳性率高达100%, 而MDS组阳性率仅为45.45%, 两组比较有显著差异 (P<0.01) 。提示MA和MDS患者血清LDH水平均处于异常状态, 且都存在成熟红细胞破坏程度增强、幼红细胞溶血等现象, 而LDH水平可作为鉴别MA与MDS患者的辅助鉴别诊断指标。究其原因, 可能与MA和MDS患者血清LDH升高的机制有关。MA是因细胞DNA合成障碍所引发的一种贫血, 其幼红细胞胞质之内的血清LDH水平通常高于正常的成熟红细胞, 同时与正常细胞相比不同阶段的巨幼红细胞及大红细胞的生存期均明显缩短 (其遭受破坏后可导致LDH升高) , 因而原位溶血发生后其LDH水平也明显升高。
本研究还发现, MA患者血清的TBIL、DBIL和IBIL水平均明显高于与MDS组和对照组, 其中TBIL、IBIL水平明显升高可能与此类患者存在原位溶血, 致使无效造血增强、旁路胆红素生成增多, 且以间接胆红素升高为主, 若无肝胆系统疾病则提示存在溶血性黄疸。同时, MA患者Hcy水平明显高于MDS患者, 此结果与国内有关研究一致[1]。Hcy为蛋氨酸中间代谢产物, 其源于蛋氨酸分解代谢, Hcy不能在体内合成, 体内通常含量极低, 但MA患者体内缺乏Hcy再甲基化的辅酶 (主要指FA、Vit B12) , 导致Hcy在患者体内堆积, 引发高Hcy血症, 其浓度升至一定程度时可产生兴奋性毒性和神经毒性, 进而造成神经元细胞结构损伤, 影响其正常功能;此外, Hcy浓度过高时可能损伤血管内皮, 引发冠心病和中风等动脉粥样硬化相关性心脑血管疾病。因此, MA患者须定期检测其血清Hcy水平, 以利于鉴别MA和MDS, 并为疾病治疗、了解预后提供便利。
综上所述, LDH是巨幼细胞性贫血的敏感指标, 虽不能作为临床鉴别诊断MA与MDS的特异性指标, 但可作为诊断MA的常规检验指标之一, 对于鉴别MA与未伴有原始细胞增多的MDS具有重要意义。
摘要：目的 探讨血清乳酸脱氢酶 (LDH) 检测在巨幼细胞性贫血 (MA) 诊断中的意义。方法 选取MA患者32例为MA组, 骨髓异常增生综合征 (MDS) 患者22例为MDS组, 另选取体检的健康人员24例为对照组, 检测其生化指标并进行比较。结果 MA组患者的LDH水平、总胆红素、直接胆红素、间接胆红素和同型半胱氨酸水平与MDS组、对照组比较均有显著差异 (P<0.01) 。MA组LDH升高的阳性率高于MDS组, 差异显著 (P<0.01) 。结论 血清乳酸脱氢酶是巨幼细胞性贫血的敏感指标, 可作为诊断该病的常规检验指标之一, 对于鉴别该病与未伴有原始细胞增多的骨髓异常增生综合征具有重要意义。
关键词：巨幼细胞性贫血,血清乳酸脱氢酶,总胆红素
参考文献
[1]王伟伟, 张夏, 黄传荣, 等.血清LDH, TBIL, IBIL和Hcy水平检测在MA和MDS临床鉴别诊断中的作用研究[J].现代检验医学杂志, 2015, 30 (1) :111-114.
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