乳酸乳球菌（共4篇）
乳酸乳球菌 篇1
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis,L.lactis)是乳球菌属中最典型的一个种,是乳酸菌的重要模式菌(model LAB)。L.lactis归属于硬壁菌门,杆菌纲,乳杆菌目,链球菌科,乳球菌属,细胞呈球形或卵圆形,革兰氏阳性,兼性厌氧,不产荚膜和芽孢,营养要求复杂,最适宜生长温度为30℃。L.lactis广泛存在于乳制品和植物产品中,在食品工业中应用广泛,对人和动物无致病性,是被公认安全的食品级微生物(generally regards as safe,GRAS)。与大肠杆菌、酵母菌相比,L.lactis的分子遗传学方面的研究起步较晚,从20世纪80年代开始,研究者致力于对其生物学性质和分子机制的研究。近年来,L.lactis分子生物学及作用机制的研究取得了重大发展,一系列具有不同用途的L.lactis基因表达系统已逐步建立,并成功地表达了许多外源蛋白[1],加之L.lactis的完整基因组已经测序完成,因此,构建重组乳酸乳球菌已成为食品工业、生物制药和疫苗研究的热点,被广泛应用于上述领域内。
1 重组L.lactis应用于黏膜免疫疫苗
黏膜是许多病原菌进入肌体的主要通道,在黏膜表面接种以抵御病原体的入侵,不仅是合理的,在某种程度上也是唯一的途径,例如在黏膜表面防御寄生虫和病毒的感染远比感染后再消除这些病原体容易[2]。因此,预防感染的最佳途径就是激发作为肌体第一道屏障的黏膜免疫,阻止病原微生物的入侵。Besrdeka于1919年首先提出了黏膜局部免疫防御系统的概念,黏膜免疫的组织结构基础是由位于胃肠道的孤立淋巴结和集合淋巴结为代表的肠道相关性淋巴组织(Gut associated lymphoid tissue,GALT)、鼻黏膜相关淋巴组织(Nasal assoeiated lymphoid tissue,NALT)、上呼吸道的支气管淋巴组织(Bronehus-assoeiated lymphoid tissue,BALT)、泌尿生殖道黏膜下的淋巴组织和眼部的淋巴组织组成。通过黏膜输送疫苗抗原能够刺激GALT产生局部黏膜和全身系统免疫反应,局部黏膜分泌型IgA抗体(sIgA),能够阻止病毒的感染、细菌的定植及中和细菌毒素的活性[3,4,5,6]。因此,通过鼻黏膜、消化道黏膜或妇女阴道黏膜接种疫苗是一种极其有效的免疫途径。
理想的黏膜免疫活载体疫苗应该是安全、稳定的,能促使抗原和免疫系统之间的有效接触,并能刺激体液和细胞免疫反应,单剂量接种后产生长期的保护。近年来发展了一些新型的抗原递呈载体,如细菌、病毒、惰性颗粒及黏膜上皮黏附因子等。将重组细菌作为抗原递呈载体是近年来基因工程主要的发展方向,目前研究最多的是致弱病原菌载体,如分枝杆菌(mycobacteria)[7]、沙门氏菌(salmonlla)[8]。但因其仍可能保持侵袭性和毒性,对儿童、老人及部分免疫缺陷者有潜在的危险,而且过强的免疫应答会降低后继疫苗的效力,因此,在应用上受到了限制。利用乳酸乳球菌作为抗原递呈载体是近年来新兴的疫苗研制策略,能够克服上述缺陷。乳酸乳球菌被公认为安全级微生物,在疫苗研发方面具有天然的优势,它不在人和动物肠道内定居,具有很小的免疫原性,不会造成免疫麻痹,可重复用作抗原递呈载体;携有多种免疫辅助成分起到免疫修饰作用,如脂多糖、磷脂A及肽聚糖等,可以作为佐剂激活宿主的免疫系统,促进细胞分裂、体液及细胞免疫[9];乳酸乳球菌分泌蛋白较少,且不分泌细胞外蛋白酶,使得其表达的外源性分泌蛋白易于被检测且不易发生细胞外降解;易于驯化,其遗传学方面的研究及相关技术日臻成熟。因此,乳酸乳球菌是一种理想的黏膜免疫疫苗活载体。
目前,以乳酸乳球菌作为载体来输送疫苗抗原以激发黏膜免疫的研究比较深入,已有多种细菌、病毒的抗原在乳酸乳球菌中表达并用于口服或鼻黏膜接种研究[10,11,12,13,14],相关的免疫原性也给予了阐述。K.Robinson等[15]在乳酸乳球菌中表达破伤风毒素片段C(TTFC),并以黏膜免疫的方式免疫小鼠,发现在小鼠肠道中产生特异性IgA抗体和T细胞免疫反应,而且血清中也出现特异性IgG抗体;ZHANG ZH等[16]给小鼠口服表达疟原虫MSP-1(19)蛋白的乳酸乳球菌,小鼠能够产生针对疟疾的保护力;Ribeiro等[17]也在乳酸乳球菌中实现了布鲁氏菌L7/L12抗原的表达。以上试验结果都表明,乳酸乳球菌可有效地将抗原递呈于黏膜免疫系统并诱导特异性免疫应答,证明其具有诱导黏膜免疫应答的能力。目前为止,已有多种细菌及病毒的抗原在乳酸乳球菌中得到有效表达,如表1所示。
2 重组L.lactis表达、传递功能性蛋白及细胞因子
采用重组微生物表达功能性蛋白可以较好地解决传统药理学制备技术存在的药物产量低、成本昂贵、蛋白质易变性等不足。L.lactis是一种理想的外源蛋白表达宿主菌,其表达的外源蛋白在细胞的定位有胞内、胞壁结合和分泌等形式。分泌性表达具有极其显著的优势,可以持续培养,及时将合成的外源蛋白输送到胞外上清中,避免被胞内蛋白酶降解;L.lactis不产生任何细胞外蛋白酶,有利于保持外源蛋白的完整性和功能性;可避免如大肠杆菌表达形成包涵体,无须复性处理,表达蛋白能够正确折叠,保持良好的生物学活性;分泌性表达的蛋白或酶可以直接与作用对象或肠道黏膜接触,无须下游的蛋白纯化操作,且乳酸乳球菌为肠道益生菌,可在肠道中持续表达。目前,乳酸乳球菌已成为重组治疗蛋白及细胞因子表达载体的研究热点,已有多种细胞因子在乳酸乳球菌中表达[18,19],如表2所示。
IL-10是近年来发现的具有抗炎作用的细胞因子,也称之为细胞因子合成抑制因子,是一种多功能负性调节因子,主要由Th2细胞、活化的B细胞、单核细胞、巨噬细胞产生。它参与免疫细胞、炎症细胞、肿瘤细胞等多种细胞的生物调节,在自身免疫性疾病、严重感染性疾病、肿瘤及移植免疫等多种疾病中发挥重要作用。IL-10在炎症性肠病中是重要的抑炎细胞因子,常用给药方法是口服或注射,但均有一定的局限性。口服给药会因胃肠道中的蛋白酶以及胃液的酸性环境等因素,给细胞因子的传递造成不利的影响;注射给药会引起一定的副作用并可导致炎症因子的诱发。研究者对如何将功能性蛋白及细胞因子有效地传递到病灶展开了研究。Steidler,L等[20]给鼠口服表达分泌型IL-10的乳酸乳球菌,研究发现,DSS(右旋糖酐硫酸酯钠)模型鼠的大肠炎发病率减少了50%;Vandenbroucke,K等[21]亦研究发现分泌型表达三叶因子(TFF)的乳酸乳球菌可有效防治急性鼠源大肠炎。以上研究结果均表明,以重组乳酸乳球菌作为功能性蛋白及细胞因子的表达、传递载体是完全可行的。
3 结 语
乳酸乳球菌是一种长期应用于食品工业的有益微生物,近年来乳酸乳球菌分子生物学研究进展迅速,一系列基因表达载体和受体系统逐步建立,已构建了多种重组乳酸乳球菌。重组乳酸乳球菌及其表达产物可直接制成口服制剂,避免了一般基因工程菌复杂、高成本的后期提取工艺,因此,重组乳酸乳球菌在功能食品、医疗保健及微生态制剂、人工口服疫苗等领域具有广阔的应用前景和巨大的商业价值。
乳酸乳球菌 篇2
乳链菌肽前体基因(nisZ)在乳酸乳球菌中的克隆和表达
用PCR技术从克隆有完整乳链菌肽生物合成基因簇(来自于乳链菌肽高产菌株L.LactisAL2)的重组噬菌体λHJ-3中扩增了编码乳链菌肽的前体基因，与pMG36e连接得到重组质粒pHJ201，用电击转化法将pHJ201转化到L.Lactis NZ9800中，经活性测定和Tricine-SDS-AGE电泳证实乳链菌肽前体基因获得了功能表达。DNA序列分析表明乳链菌肽高产菌株L.lactis AL2产生的`是NisinZ。发现pHJ201在L.lactis NZ9800中有良好的稳定性。
作 者：陈秀珠 胡海菁 杨巍 还连栋 作者单位：中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室，北京 100080刊 名：遗传学报 ISTIC SCI PKU英文刊名：ACTA GENETICA SINICA年，卷(期)：28(3)分类号：Q933关键词：乳酸乳球菌 乳链菌肽前体基因 基因克隆 表达
乳酸乳球菌 篇3
关键词：乳酸乳球菌,培养基,生物量,营养条件,优化
乳酸乳球菌( Lactococcus lactis) 是一种革兰阳性乳酸菌,兼性厌氧,是乳酸菌的一个重要菌属,被广泛应用于食品发酵工业。乳酸乳球菌在代谢过程中合成一种具有较强抑菌作用的多肽类细菌素乳链球菌肽( Nisin)[1]。Nisin能抑制与其亲缘关系较近的革兰阳性菌,如动物胃肠道中的金黄色葡萄球菌,对调节机体菌群平衡起重要作用。乳酸乳球菌的营养要求高,对营养物质的需求较复杂[2],最适生长温度为25 ~ 30 ℃ ,但能在10 ℃ 的低温条件下生长,而在45 ℃ 和0. 5% Na Cl存在的极 端条件下 不能生长[3,4]。乳酸乳球菌的最适生长p H值接近中性,但在发酵过程中伴随着乳酸的大量产生,p H值很快下降,这对菌体的生长十分不利[5]。因此,营养物质及培养条件对提高乳酸乳球菌的生物量具有重要的作用。为了提高乳酸乳球菌L239的生物量,降低生产成本,试验选用较廉价的糖蜜和豆粕替换MRS培养基中的部分葡萄糖和有机氮源,最终确定最佳营养条件组合,现报道如下。
1材料
1.1试验菌株
乳酸乳球菌( Lactococcus lactis) L239,吉农博瑞奶牛研发中心分离、保藏。
1.2培养基
种子培养基、MRS液体培养 基[6]、M17培养基[7]、CM培养基[8]等,自制。
1.3碳源、氮源与磷源
葡萄糖、碳酸铵、七水合硫酸镁,北京化工厂产品; 糖蜜,河北昌盛糖蜜批发公司产品; 豆粕,九三粮油工业集团有限公司产品; 无水磷酸氢二钠,天津市双船化学试剂厂产品; 柠檬酸氢铵、吐温,天津市华东试剂厂产品; 无水乙酸钠、一水合硫酸锰,西陇化工股份有限公司产品。
1.4仪器
p HS - 2C型数字式酸度计,上海SANXIN公司产品; 岛津UV - 1201分光光度计,日本岛津公司产品; YP1200型电子天平,上海精科实业有限公司产品; SPX - 150型生化培养箱,上海跃进医疗器械有限公司产品; SW - CJ - IF型洁净工作台,苏净集团苏州安泰空气技术有限公司产品。
2方法
2.1菌种的活化
将乳酸乳球菌L239从冻存管中取出,以2% 的接种量接种于经过121 ℃、15 min灭菌的种子培养基中,30 ℃培养,连续活化3代[9]。
2.2种子液的制备
取活化后的菌种,接到种子培养基中30 ℃ 培养12 h。
2.3菌体生物量的测定
用紫外可见分光光度计在600 nm波长下测定吸光度值,即OD600值。
2.4L239菌株生长曲线的测定
将种子液以2% 的接种量分别接种到MRS液体培养基、CM培养基和M17培养基后,30 ℃培养24 h; 每隔2 h取样1次,每次3个重复,以培养基为空白, 测定发酵液的p H值及OD600值; 以发酵时间为横坐标,以p H值和OD值为纵坐标绘制菌株生长曲线,确定刚刚进入稳定期生长的时间进行培养。
2.5培养基的优化
2. 5. 1碳源对L239菌株生物量的影响用单因素试验方法,选择糖蜜与葡萄糖混合碳源,按糖蜜与葡萄糖浓度比1∶5、1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1, 以2% 的碳源浓度替换MRS液体培养基中的葡萄糖。按2% 的接种量接入L239菌株,每组5个重复, 30 ℃ 下静止培养16 h,利用可见分光光度计测定OD600值,确定L239菌株生长的最适糖蜜与葡萄糖浓度比。
2. 5. 2氮源对L239菌株生物量的影响氮源分为有机氮源和无机氮源,为保持菌种的正常生长,在选用的碳源基础上添加豆粕与硫酸铵混合氮源,比例分别为1∶4、1∶3、1∶2、1∶1、3∶2、2∶1、5∶2、3∶1、4∶1。采用单因素试验方法,按0. 4% 的含氮量替换MRS液体培养基中的氮源。按2% 的接种量接入L239菌株,每组5个重复,30 ℃下静止培养16 h,测定OD600值,确定L239菌株生长的最适豆粕与硫酸铵浓度比。
2. 5. 3磷源对L239菌株生物量的影响用单因素试验方法,在碳源和氮源确定的基础上,按2% 的浓度,分别用磷酸二氢钠、无水磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和五氧化二磷替换MRS培养基中的磷源。按2% 的接种量接入L239菌株,每组5个重复,30 ℃ 下静止培养16 h,测定OD600值,确定L239菌株生长的最适磷源。
将最适磷源 按0. 1% 、0. 2% 、0. 3% 、0. 4% 、 0. 5% 的浓度添加到MRS培养基中,按2% 的接种量接种L239菌株,每组5个重复,30 ℃ 下静止培养16 h,测定OD600值,确定L239菌株生长的最适磷源浓度。
2. 5. 4碳源、氮源及磷源的正交试验据单因素试验结果,将碳源、氮源和磷源3个因素各选3个水平 ( 见表1) 进行L9( 33) 正交试验。
2. 5. 5缓冲盐对L239菌株生物量的影响以MRS液体培养基为基础,采用单因素试验方法,在碳源、氮源和磷源 确定的基 础上,分别将柠 檬酸氢铵 按0. 05% 、0. 1% 、0. 3% 、0. 5% 、0. 7% ,无水乙酸钠按0. 1% 、0. 2% 、0. 3% 、0. 5% 、0. 7% ,七水合硫酸镁按0. 01% 、0. 02% 、0. 04% 、0. 06% 、0. 08% ,一水合硫酸锰按0. 002 5% 、0. 005 0% 、0. 010 0% 、0. 020 0% 、 0. 040 0% 加入培养基中,按2% 的接种量接种L239菌株,每组5个重复,30 ℃ 下静止培养16 h,测定OD600值。
根据单因素试验结果,将柠檬酸氢铵、无水乙酸钠、七水合硫酸镁和一水合硫酸锰4个因素各选3个水平,进行L9( 34) 正交试验。
2. 5. 6培养条件的优化根据大量研究经验,将培养温度、初始p H值和接种量3个因素各选3个水平,进行L9( 33) 正交试验。
3结果与分析
3.1L239菌株生物量与pH值之间的关系(见图1)
由图1可见: MRS培养基中L239菌株生物量明显高于M17培养基和CM培养基中的生物量。菌株在4 h进入对数生长期,16 h生物量达到顶峰,之后趋于平稳。p H值随着时间的延长逐渐降低,在16小时时基本稳定。综上所述,选16 h为各发酵试验的发酵终点。
3.2碳源对L239菌株生长的影响(见图2)
糖类是微生物生命活动中主要的碳源和能源物质。一方面,微生物的生长需要糖类; 另一方面,糖也构成了代谢产物中碳架的主体[10]。由图2可见,随着糖蜜与葡萄糖浓度比值的增大,L239菌株生物量逐渐下降,且在糖蜜与葡萄糖浓度比为1∶1和1∶2时L239菌株生长较好。综合考虑,选取糖蜜与葡萄糖浓度比1∶1作为L239菌株生长的最适碳源。
3.3氮源对L239菌株生长的影响(见图3)
能够成为微生物细胞物质或含氮的目的产物中氮素来源的物质,称为氮源。氮是构成微生物细胞蛋白质和核酸的主要元素。由于进化水平和合成能力的差异,微生物对氮素的来源和氮素的需要量差异较大,试验选豆粕与硫酸铵作为混合氮源。由图3可见,随着豆粕与硫酸铵浓度比值的增大,L239菌株生物量逐渐升高,且在豆粕与硫酸铵浓度比为3∶1和4∶1时L239菌株生长较好。综合考虑,选取豆粕与硫酸铵浓度比3∶1作为L239菌株生长的最适氮源。
3.4磷源对L239菌株生长的影响(见图4、图5)
磷是微生物生长的必备元素之一,需要与碳和氮保持平衡,过多过少都会影响微生物的能量合成,即ATP的合成,使得其无法正常生存,导致死亡。
由图4可见,磷酸氢二钠作为磷源时L239菌株生长较好,显著高于其他磷源,故选用磷酸氢二钠为L239菌株生长的最适磷源。
由图5可见,当磷酸氢二钠的浓度由0. 1% 升高到0. 3% 时,L239菌株生物量逐渐升高; 浓度高于0. 3% 时,菌株生物量反而下。因此,选用0. 3% 的磷酸氢二钠作为L239菌株生长的最适磷源浓度。
3.5碳源、氮源及磷源的正交试验结果(见表2)
由表2可见,3个因素的极差( R) 大小顺序为氮源 > 碳源 > 磷源,由此可知,氮源是影响L239菌株生长的最主要营养因子,其次是碳源和磷源。较优组合为A2B3C3,最终确定最佳碳源、氮源及磷源分别为5. 0% 糖蜜与1. 0% 葡萄糖混合碳源、5. 0% 豆粕与0. 38% 硫酸铵混合氮源、0. 4% 无水磷酸氢二钠。
3.6缓冲盐对L239菌株生长的影响(见图6~9)
由图6 ~ 9可见,无水乙酸钠的最适浓度为0. 3% ,柠檬酸氢铵的最适浓度为0. 10% ,硫酸镁的最适浓度为0. 04% ,硫酸锰最适浓度为0. 002 5% 。 每个因素分别选3个水平进行正交试验,结果见表3。
4个因素的极差大小顺序为柠檬酸氢铵 > 无水乙酸钠 > 硫酸镁 > 硫酸锰,由此可知,柠檬酸氢铵是L239菌株生长的最重要缓冲盐,其次是无水乙酸钠、 硫酸镁和硫酸锰。缓冲盐较优组合为A1B1C3D1,确定最佳缓冲盐为0. 1% 无水乙酸钠、0. 05% 柠檬酸氢铵、0. 04% 硫酸镁和0. 002 5% 硫酸锰。正交试验与单因素试验的结果存在一定的出入,根本原因在于单因素试验是在固定其他因素的前提下只考察由某一因素的变化而带来的影响; 而正交试验则是同时考察多个因素的影响,最终得到一组包含有各个因素的最优组合,结果全面,信息量大[11]。
3.7培养条件的正交试验结果(见表4)
由表4可见,3个因素的极差大小顺序为初始p H值 > 接种量 > 培养温度。由此可知,初始p H值是影响L239菌株生长的最主要培养条件,其次是接种量和培养温度,较优组合为A3B3C2,最终确定最佳培养条件为初始p H值为7. 0、接种量为5% 、培养温度为32 ℃。优化后的最终结果与正交表( 表4) 中的第9组结果一致,OD600值达到19. 515 6,比之前的2. 490 5提高了6. 8倍。
4讨论
微生物发酵过程中,培养基的营养物质组成和培养条件起着至关重要的作用。培养基中营养物质比例适中,培养条件适宜,微生物才能更好地生长。本试验选用糖蜜与豆粕作为主要碳源和氮源,来源广泛,价格低廉,既提高了乳酸乳球菌的生物量,又大大降低了培养基的成本,为工业生产乳酸菌提供了理论依据和现实意义。
5结论
乳酸乳球菌 篇4
1 资料与方法
1.1 质粒和表达大鼠HO-1重组乳酸乳球菌的构建
采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)技术从大鼠脾组织分离扩增HO-1基因,经胸腺嘧啶/腺嘌呤(T/A)克隆测序后重组到质粒pSEC中,电穿孔转化乳酸乳球菌,构建能表达HO-1活性的重组质粒,使其在乳酸乳球菌中表达。乳酸乳球菌为本实验室构建。
1.2 重组HO-1乳酸乳球菌灌胃菌液的配制
将Nisin诱导表达3 h后的培养菌离心收获菌液,用磷酸缓冲液(PBS)洗3次后再加入适量的PBS使其浓缩10倍(使活菌数达5×109 CFU/mL),定容为1 mL,以此作为工程菌灌胃悬液。
1.3 实验动物及分组
30只SD大鼠,由徐州医学院实验动物中心提供,体重200～250 g,随机分为内毒素(LPS)组、血红素加氧酶-1(HO)组、锌原卟啉(ZnPP)组,每组10只。
1.4 ALI模型的制备及给药
大鼠腹腔注射3 %戊巴比妥钠50 mg/kg麻醉,尾静脉置管用于给药和补液,注射脂多糖(LPS,055:B5,Sigma公司,美国)6 mg/kg制备大鼠ALI模型。LPS组只给予LPS;HO组在制备ALI模型(给予LPS)前24 h给予含HO-1的乳酸乳球菌灌胃;ZnPP组用含HO-1的乳酸乳球菌灌胃24 h后,于ALI模型制备前1 h腹腔注射锌原卟啉(ZnPP,Sigma公司,美国)10 μmol/kg。实验中持续静脉注生理盐水1.5 mL/kg·h维持补液。LPS给药后4 h,再次腹腔注射戊巴比妥钠麻醉,处死大鼠,采集标本。
1.5 支气管肺泡灌洗液(BALF)中中性粒细胞(PMN)计数和髓过氧化物酶(MPO)活性测定
打开胸腔暴露肺,夹闭右主支气管。自气管灌入RPMI1640培养液,每次5 mL/kg,使培养液在肺内停留0.5 min后,用注射器反复轻轻抽吸,回收灌洗液。共灌洗3次,收集BALF,在4 ℃下500 r/min离心5 min,取上清测定MPO活性(试剂盒由南京建成生物工程研究所提供);将沉淀用培养液悬浮,进行PMN计数。
1.6 肺组织湿干重比测定
开胸取出右肺,称湿重后,置烤箱(70 ℃)烤至恒重,称干重,计算湿干重比(W/D)。
1.7 肺组织MPO活性测定
按照试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行。
1.8 肺组织病理学的观察
取右肺后叶,10 %福尔马林液固定,石蜡包埋,HE染色,光学显微镜观察。
1.9 统计学处理
采用SPSS 12.0软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差(
2 结果
2.1 与HO组比较,LPS组和ZnPP组肺组织W/D、BALF中PMN计数、MPO和肺组织MPO均升高,LPS组与ZnPP相比差异无统计学意义,见表1。
*与LPS组比较P<0.05,▲与ZnPP组相比P<0.05
2.2各组肺组织形态学观察,LPS组和ZnPP组肺泡壁破坏严重,弥漫性充血水肿,肺间质、肺泡间隔增宽,大部分肺泡萎陷,肺内大量PMN浸润,小血管见微血栓形成,见图1、图2;HO组肺泡结构尚可,肺间质及肺泡水肿液及浸润PMN数量较LPS组和ZnPP组明显减少,见图3。
(HE染色,×100)
(HE染色,×100)
(HE染色,×100)(HE染色,×100)
3 讨论
ALI的病理特征为肺泡毛细血管膜通透性增高和肺水肿,肺组织W/D可很好地反映肺泡毛细血管膜通透性和肺水肿的程度,可以用来评估肺损伤的程度。LPS是内毒素的主要成分,具有诱导炎性反应和ALI的作用。本实验中LPS组肺组织W/D明显升高,肺组织病理学结果显示LPS组大鼠肺组织呈现明显肺损伤改变,表明LPS诱导ALI成功,与Liu等[2]结果一致。
PMN在多种ALI中发挥了中心作用,LPS能够激活PMN,针对PMN聚集或功能的治疗策略可以减轻脓毒血症诱导的ALI[3]。肺组织MPO活性与PMN计数有关,BALF中MPO活性是反映PMN脱颗粒和激活的指标,可以用来评估PMN在肺组织中的聚集、激活情况。本研究结果表明,LPS组肺组织MPO活性增强,BALF中MPO活性增强、PMN计数明显增多,提示在LPS刺激下,PMN向肺组织转移,聚集在肺组织并被激活,激活的PMN释放氧自由基、蛋白酶等生物活性物质,从而导致肺组织损伤;而HO组上述3个指标明显低于LPS组,表明用重组HO-1乳酸乳球菌灌胃能够抑制PMN在肺内聚集,并抑制其激活,从而减轻肺损伤。而用HO的抑制剂ZnPP能抑制HO-1对肺组织的保护作用,加重肺组织损伤。
HO是分解血红素的限速酶,将血红素分解为CO、二价的铁离子(Fe2+)和胆绿素(后者在肠道上段还原成胆红素,大部分参与肠肝循环)。HO有HO-1、HO-2和HO-3共3种亚型,其中HO-1是HO家族中最重要的酶,为诱导型血红素加氧酶[4]。HO-1在大多数组织内呈低水平表达,可被多种伤害性刺激诱导产生高水平的表达,诱导因素包括血红素、高氧、缺氧、热休克、内毒素等,其共同特征是可以产生氧化应激。
HO-1通过减轻炎症反应、抑制肺泡上皮细胞和肺血管内皮细胞凋亡对ALI起保护作用[5]。黄新莉等[6]应用八肽胆囊收缩素通过增加LPS诱导的HO-1的产生来发挥抗氧化、抑制PMN聚集等作用,从而减轻LPS诱导的肺损伤。Weiss等[7]用盲肠结扎双穿孔法诱导大鼠脓毒血症后,用猪HO-1的cDNA转染大鼠,使肺大量表达HO-1,可以显著减轻ALI所致肺间质水肿,减少蛋白渗出和中性粒细胞的聚集,48 h死亡率减半。谭泽龙等[8]研究表明HO-1的高表达可明显减轻肺组织损伤,对急性肺损伤大鼠肺组织形态学影响明显。以上实验证明HO-1对多种原因所致的ALI具有一定程度的保护作用。本实验中我们用重组HO-1的乳酸乳球菌灌胃对急性肺损伤大鼠有保护作用,其抑制剂ZnPP能够抑制它对肺组织的保护作用。HO-1是通过分解血红素使其不能参与氧化作用及维持微循环稳定、调节细胞生长周期、抗炎来完成[9]。
本实验采用的乳酸菌表达系统是一种目前国际上高度通用、食品级的NICE系统(nisin cont rolled expression system),被广泛应用于外源性基因在乳酸乳球菌中的表达[10]。本实验证明,合成的携带HO-1基因的乳酸乳球菌给大鼠灌胃后,在应激情况下具有HO-1活性,为药物开发提供一种新的途径和思路。但本实验只观察ALI后4 h的炎症反应,对于延后的反应没有研究,而且灌胃剂量、用药途径及时间选择还有待于进一步研究。
综上所述,将携带HO-1基因的乳酸乳球菌给大鼠灌胃后,在内毒素诱导的急性肺损伤时能发挥HO-1的生物活性,能够较好地保护肺组织,从而减少炎症反应和肺组织损伤。
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