金黄色葡萄球菌肠毒素

金黄色葡萄球菌肠毒素（共3篇）

金黄色葡萄球菌肠毒素 篇1

前不久,一批不合格的水饺又让人们认识了一个新名词:金黄色葡萄球菌。工商部门在水饺中检测到了它的存在,在2011年12月21日前施行的国家标准中,速冻水饺中“不得检出”该细菌,所以这批水饺需要下架召回。厂家承认了水饺中检出金黄色葡萄球菌的事情,不过宣称“按照即将施行的新国标,就是合格产品”。

金黄色葡萄球菌到底是种什么样的细菌?为什么国家标准会“降低”?作为消费者,我们又该如何保护自己呢?

脆弱的细菌产生顽强的毒素

金黄色葡萄球菌是一种球状细菌,在显微镜下看,它们聚集成簇,像葡萄一样。不管有没有氧气的存在,它们都可以生长。在良好的营养环境中,它们会长成黄色的“菌落”。

这种细菌在自然界广泛存在,人和动物是它们的优良居所。在我们身上,鼻子、喉和手是最适合它们生长的地方。此外,如果有伤口,伤口处也容易大量滋生这种细菌。

它们对温度很敏感,在高温下相当脆弱。超过46℃,就有细菌hold不住了;在55℃下,它们中的90%撑不过3分钟;煮饺子的温度,对它们比“秒杀”还要迅速。

不过,它们“作恶”并不是通过自身,而是由生前分泌的毒素来完成。这些胃肠道毒素会引起恶心、呕吐、胃痉挛和腹泻等症状。这种中毒是急性的,一般在1到6小时之内发作,最快的甚至半小时就出现症状。大多数症状不会严重,在两三天内会恢复健康。

虽然它们很脆弱,但是它们的毒素极为顽强,在牛奶中,加热70分钟之后都还会有10%的活性留下。它们的毒性也比较强,1微克就可以引发症状。如果食物中的金黄色葡萄球菌达到每毫升10万个,就能够产生这个水平的毒素。

因为细菌本身很容易杀灭,而真正的罪魁祸首毒素却能够经受酷热考验,所以金黄色葡萄球菌的检测结果高,可以“充分”判定食物受到了污染,但是,检测结果低却不能说明该食物就一定没有问题。比如说,如果一种食物曾经被该细菌大量污染,然后又经过加热,那么检测结果将是“细菌数合格”,但其中同样可能存在足以致病的毒素。

最容易感染金黄色葡萄球菌的食物有:肉类、禽类、蛋类、水产类、奶制品,等等。

国家标准与国际标准的区别

消费者都希望食物“绝对安全”,对于“可能危害健康”的东西“零容忍”。但是这并不现实。就金黄色葡萄球菌来说,因为它在自然界,尤其是人体中广泛存在,要实现“零容忍”将会使生产成本大大提高。生产成本的增加,最终还是要由消费者来埋单。

因为金黄色葡萄球菌产生毒素需要比较多的细菌,像控制沙门氏菌那样追求“零容忍”也没有必要。国际微生物规格委员会制定的《食品微生物限量规定》中,有对各种食物中金黄色葡萄球菌的要求。其中没有速冻水饺,不过有“冷冻面食”和“冷冻禽肉”可以参考。

食品中的微生物往往不是均匀分布,所以取样和检测方法很关键。对于这两种食品,国际微生物规格委员会的规定是:取5个样品分别检测,只要有1个样品的金黄色葡萄球菌超过每克10 000个,就不合格。对于冷冻面食,如果只有1个样品的菌数高于每克100个但是不超过10 000个,那么也算合格;如果有2个或者更多这样的样品,则不合格。而对于冷冻禽肉,则是允许1个样品高于每克1 000个但是不超过10 000个,而其他4个样品都不超过1 000即可。在其他食品中的规定不尽相同,不过也都允许一定量的存在。

现行国家标准中,规定速冻水饺中“不得检出”金黄色葡萄球菌。与国际标准相比,的确是过于严格了。不清楚实际上执行得如何,至少从法规制定的角度来说,是没有必要的。在新国标的征求建议稿中,标准改成了与国际标准中的冷冻禽肉一致,就比较合理了。

六招赶走“脆弱的凶手”

金黄色葡萄球菌的感染,不仅仅会发生在工业食品中,自制食品同样也有感染风险。为了避免金黄色葡萄球菌感染,美国疾控中心提供如下建议:

1.制备食物之前用肥皂和水充分洗手,尤其是指甲内;

2.鼻子或者眼睛感染时不要去制备食物;

3.手或者手腕有伤口时不要制备食物,也不要给其他人端送食物;

4.保持厨房与就餐区域的清洁卫生;

5.如果食物要保存2小时以上,要么在60℃以上保温,要么在4℃以下冷藏;

6.做好的食物装在宽而浅的容器中尽快冷藏。

其实,这些也是避免其他致病细菌污染的有效措施。

金黄色葡萄球菌肠毒素 篇2

1 材料与方法

1.1 菌株来源

84株金葡菌均为我科2008年1月~2009年1月从临床标本中分离的菌株,分别来源于痰液、脓液、血液、分泌物、腹腔引流物、肾囊肿穿刺液、胸腔积液、脓疱液、疱液、导管下段及导管尖端,经美国DADE-BERING公司Walk Away-40全自动微生物分析仪鉴定核实为金葡菌。

1.2 细菌鉴定质控菌株

金葡菌ATCC25923,购于卫生部临床检验中心。

1.3 仪器与试剂

Walk Away-40全自动微生物分析仪(美国DADE-BERING公司产品),PCR仪(美国Eppendorf公司产品),测序仪(美国ABI公司),凝胶成像仪(美国FOTODYNE),电泳仪(瑞典Phermacia公司)。PCR试剂购于上海生工生物工程有限公司。

1.4 引物设计

根据Gen Bank中已发布的基因序列,利用Primer Premier 5.0软件及参考文献[2]设计mec A基因、TSST-1基因、PVL基因引物,扩增产物预期长度分别为892 bp、578 bp和578 bp,由上海生工生物工程有限公司合成。

mec A:P1 5'-GCC GTA GTT GTC GGG TTT GG-3',P25'-GGC GGA TGT GCG ATT GTA TTG C-3'。

PVL:P1 5'-GTG ATG GCG CTG AGG TAG TC-3',P25',-GCT GGG GGT AAT TCA TTG TCT G-3'。

TSST-1:P1 5'-GCT ATC GTA AGC CCT TTG TTG C-3',P2 5'-GCT GGA TCC GTC ATT CAT TGT T-3'。

1.5 细菌DNA的提取

将冰冻保存的84株实验菌株用胰酶大豆肉汤复苏、转种哥伦比亚羊血琼脂培养基。用接种环挑取24 h培养的单个菌落,置于100μl裂解液(1 mol/L Na OH+20 g/L SDS)中,100℃水浴30 min,冷却后用等量的1 mol/L盐酸中和,离心10 min(13 000 r/min)去沉淀,再用乙醇沉淀DNA(加入400μ无水乙醇),混匀后-20℃冰冻30 min,13 000 r/min离心15 min,弃上清。加入70%乙醇200μl,静置5 min,13 000 r/min离心5 min,吸干上清液,完全晾干沉淀后,用30μl双蒸水溶解DNA,作为PCR扩增模板。

1.6 多重PCR扩增体系及反应条件

把3对引物放入同一反应体系建立多重PCR。PCR体系:采用20μl反应体系,模板1μl,起始引物和终末引物各1μl,d NTP 1.5μl,Taq酶0.2μl,10×Buffer 2μl,Mg2+2μl,双蒸水11.3μl。PCR反应条件:94℃预变性4 min,然后进入循环,94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸150 s,共进行35个循环,最后72℃延伸15 min,PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳,然后在溴化乙锭溶液中染色20 min,清水冲洗后用凝胶成像系统观察结果。

1.7 序列测定

将PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序,结果与Gen Bank中的核苷酸序列进行同源性比较。

2 结果

2.1 多重PCR扩增产物的电泳分析

84株金葡菌中检出mec A基因阳性49株,检出率为58.3%;检出PVL基因20株,占临床分离株的23.8%,其中,MRSA为13株(13/49,26.5%),MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因阳性菌株。部分菌株的PVL基因PCR扩增结果见图1。

(1~6、9~11泳道为PVL基因阴性菌株;7、8泳道为PVL基因阳性菌株;M:PCR marker)

2.2 PVL基因阳性金葡菌的分布特点

PVL基因阳性的分离株中,有7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离自血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液。

2.3 测序结果的分析

将测序结果与Gen Bank中的已有序列进行比较,同源性为100%。

3 讨论

最近,国内学者报道葡萄球菌已是医院感染分离率最高的细菌,其中MRSA占较高的比例[3]。近年来,其临床分离率呈明显上升趋势,因具有多重耐药特征和携带多种毒力因子(如PVL、TSST-1、SEC等)已成为临床治疗的难点。笔者对我院金葡菌感染情况分析发现,我院MRSA感染占58.3%,MSSA占41.7%,明显高于马筱玲等[4]报道的MRSA检出率(42%),说明我院MRSA感染率较高,并且多为院内感染,应引起临床重视。MRSA的甲氧西林耐药决定簇(mec A)位于SCCmec盒上,该结构类似于转座子,可以介导mec A基因游离传播,使敏感的金葡菌获得甲氧西林耐药;同时SCCmec盒还可以整合许多其他耐药基因。因此,MRSA菌株常表现为多重耐药。MRSA的产生还与临床上抗生素的不合理应用有密切关系。

PVL是金葡菌产生的一种外毒素,该毒素特异性地吸附并作用于白细胞,改变白细胞的通透性,造成大量白细胞损伤,丧失吞噬能力。同时,由于白细胞的破坏,处理抗原和呈递抗原信息的能力下降,损害了机体的防御屏障和免疫应答,从而不能建立有效的特异性免疫。近年来由产PVL金葡菌所致感染而导致死亡病例逐渐增多,尤其是携带PVL基因的MRSA[5]。本研究结果显示,84株金葡菌中PVL基因阳性的检出率为23.8%,明显高于闫中强等[6]报道的PVL基因检出率(15.7%)。20株PVL阳性菌株中,7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离直血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液,说明不同临床标本中都可能检出PVL阳性的金葡菌,PVL阳性的金葡菌主要造成化脓性感染、肺部感染、血液感染及尿路感染。PVL基因阳性菌株在MRSA中的分离率高于MSSA,PVL基因阳性的MRSA具有多重耐药性且携带PVL,其毒性强,有一定的致死性,将会给患者带来严重的后果。

TSST-1是金葡菌产生的一种产热毒素,作为超抗原,TSST-1与MHC-Ⅱ类分子结合,作用于T细胞受体,使其大量增殖,并产生白细胞介素-1、白细胞介素-2及干扰素等多种细胞因子,是引起中毒性休克的主要原因[7]。本研究对84株金葡菌进行检测,未检出TSST-1基因,可能与感染类型不同、其金葡菌携带的毒素基因不同有关。

摘要：目的:了解金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)耐药基因及所携带致病毒素基因PVL与TSST-1的特点。方法:应用多重PCR法检测mecA基因、TSST-1基因及PVL基因。结果:84株金葡球经多重PCR法对其mecA基因进行检测,检出率为58.3%(49/84)。PVL基因阳性菌株的分离率为23.8%(20/84),PVL阳性的MRSA为13株(13/49,26.5%),PVL阳性的MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因。结论:金葡菌的耐药性呈上升趋势,且金葡菌可产生多种毒素,在分离金葡菌的同时,应加强其耐药基因及毒素基因的检测。

关键词：金黄色葡萄球菌,中毒休克综合征毒素-1基因,杀白细胞毒素基因

参考文献

[1]Becker K,Friedrich AW,Lubritz G,et al.Prevalence of genes encoding pyrogenic toxin superantignes and exfoliative toxins among strains of staphylococcos aureus isolated from blood and nasal soecinens[J].J Clin Microbiol,2003,41(4):1434-1439.

[2]Yamasaki O,Kaneko J,Morizane S,et al.The association between staphylococcos aureus strains carrying panton-valentine leukocidin genes and the development of deep seated follicular infection[J].Clin In-fect Dis,2005,40(3):381-385.

[3]姚春艳,府伟灵.葡萄球菌医院感染的耐药性分析[J].中华医院感染学杂志,2004,14(1):104-106.

[4]马筱玲,孙光明,戴媛媛,等.金黄色葡萄球菌耐药性监测[J].临床输血与检验杂志,2007,9(1):18-20.

[5]Lopez-Aguilar C,Perez-Roth E,Moreno A,et al.Association between the presence of the panton-valentine leukocidin-encoding gene and a lower rate of survival among hospital pulmonary patients with staphylo-coccal disease[J].J Clin Microbiol,2007,45(1):274-276.

[6]闫中强,沈定霞,罗燕萍,等.多重PCR检测临床分离金黄色葡萄球菌Luks/PV基因和mecA基因[J].中国感染与化疗杂志,2008,8(4):255-259.

金黄色葡萄球菌肠毒素 篇3

1 材料与方法

1.1 材料

SEA购自北京诺必信生物工程有限公司,使用前用DMEM高糖液体培养基稀释到所需浓度;肝癌细胞Hep G2购于中科院上海细胞生物研究所;DMEM高糖液体培养基(美国Sigma公司);EDTA(上海华美公司);胎牛血清,PBS缓冲液(杭州四季青公司);血液组织细胞基因组提取试剂盒(DP304),D2000 DNA Marker(MD114)[天根生化科技(北京)有限公司]。Multimage light cabinet(Alphalmager公司);DYC-3C型电泳槽,DYY-6C型电泳仪(北京市六一仪器厂);二氧化碳培养箱(美国Thermo公司);倒置显微镜(CK-32PC,Olympus公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞系及培养

在有双抗(含100 U/ml的青霉素和100 U/ml的链霉素)的DMEM(高糖)培养液中培养,培养液含10%的胎牛血清,在37℃,5%CO2培养箱中培养,取对数生长期细胞,按2∶1,每3 d传代。

1.2.2 琼脂糖凝胶电泳DNA梯度检测

将对数生长期的Hep G2细胞用0.25%胰酶消化,重悬于10%胎牛血清培养液中,置入37℃、5%CO2培养箱中培养过夜,待细胞贴壁后,换液,加入SEA,使其终浓度为0.2μg/ml,培养24 h及48 h后,用0.25%胰酶消化,制成细胞悬液,调整细胞数位107个/ml。然后10 000 r/min离心1 min,倒尽上清,加200μl缓冲液GA,振荡至彻底悬浮;加入20μl Proteinase K溶液,混匀;加入200μl缓冲液GB,充分颠倒混匀,70℃放置10 min,溶液应变清亮,简短离心以去除管盖内壁的水珠;加人200μl无水乙醇,充分振荡混匀15 s,此时可能会出现絮状沉淀,简短离心以去除管盖内壁的水珠。将上一步所得溶液和絮状沉淀都加入一个吸附柱中(吸附柱放入收集管中),12 000 r/min离心30 s;然后依次向吸附柱中加入500μl缓冲液GD;600μl漂洗液PW;重复加入漂洗液PW步骤;将吸附柱转入一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位悬空滴加50~200μl洗脱缓冲液TE,室温放置2~5 min,12 000 r/min离心2 min,将溶液收集到离心管中,即收集到的DNA。取0.2μl DNA样品溴酚蓝染色后于1.5%琼脂糖凝胶电泳(电压150 V,10 min),紫外灯下观察结果。

2 结果

SEA作用于Hep G2细胞24 h及48 h后,可以观察到明显的DNA梯带形成,见图1。

3 讨论

凋亡在多细胞生物的发展、自身稳定和抗癌细胞保护中发挥重要作用。由激素、免疫诱导信号产生凋亡的有效机制,已知其存在于大多数多细胞动物中。然而,它是一种随机的体细胞的突变和调节生长与死亡途径的基因的后天的失活,这些基因在癌症的发展中有重要作用。细胞凋亡是一种在基因控制下的主动死亡过程,是一系列生化级联反应的结果,以形态和生化上出现一定的改变为特征。细胞凋亡最突出的特点是细胞的凋亡起始于细胞核的改变,表现为核染色质的浓缩致密,DNA保存完好的细胞器和/或浓缩的细胞核碎片。凋亡晚期,凋亡细胞和凋亡小体迅速被巨噬细胞或邻近其他细胞吞噬消化。细胞凋亡既有细胞形态学上的变化,也有核DNA的断裂等生物化学反应的发生。核DNA断裂(形成“DNA梯带”)可以作为凋亡的指标[3]。

原发性肝癌是我国临床常见且恶性程度最高的消化系肿瘤之一,原发于肝细胞或肝内胆管上皮细胞,发病率高,手术治愈率低,预后极差,5年生存率只有14%[4]。肝癌具有发病隐匿、进展快、转移迅速等特点,且对放、化疗不够敏感,临床治疗效果不佳,因此探索出一种能有效诱导细胞凋亡的诱导剂,对肝癌的治疗具有重要的临床意义。原发性肝癌的发生、进展的整个过程都与肿瘤细胞增生与细胞凋亡的相互作用密切相关。本研究通过琼脂糖凝胶电泳DNA梯度检测细胞凋亡,可以说明,SEA在体外成功地诱导了人肝癌Hep G2细胞产生凋亡,形态学观察实验结果与细胞凋亡时DNA改变的理论相符合。

本研究表明SEA可以诱导肝癌细胞凋亡,可以作为体外抗肿瘤一种途径,但仍需进一步验证SEA在其他抗肝癌及诱导肝癌凋亡当中的作用及其机制。

参考文献

[1]Matsubara K,Fukaya T,Miwa K.Development of serum Ig M antibodies againstsuperantigens of Staphylococcus aureus and Streptococcus pyogenes in Kawasaki disease[J].Clin Exp Immunol,2006,143(3):427-434.

[2]Ortega E,Abriouel H,Lucas R,et al.Multiple roles of staphylococcus aureusenterotoxins:pathogenicity,superantigenic activity,and correlation to antibioticresistance[J].Toxins,2010,2(8):2117-2131.

[3]熊熙,张馨,李平,等.南蛇藤乙酸乙酯提取物诱导Hep G2细胞凋亡的实验研究[J].中国肝脏病杂志(电子版),2015,7(3):81-84.