抗菌活性成分（共7篇）
抗菌活性成分 篇1
野艾属于菊科蒿属草本植物, 俗名苦艾、野艾蒿等, 是我国的传统中药。艾草性味苦、辛、温, 入脾、肝、 肾。 《本草纲目》记载:艾以叶入药, 性温、味苦、无毒、 纯阳之性、通十二经、具回阳、理气血、逐湿寒、止血安胎等功效, 亦常用于针灸。故又被称为“医草”, 现在台湾正流行的“药草浴”, 大多就是选用艾草。 关于艾叶的性能, 《本草》载:“艾叶能灸百病。 ”《本草从新》说: “艾叶苦辛, 生温, 熟热, 纯阳之性, 能回垂绝之阳, 通十二经, 走三阴, 理气血, 逐寒湿, 暖子宫, ……以之灸火, 能透诸经而除百病。 ”说明用艾叶作施灸材料, 有通经活络、祛除阴寒、消肿散结、回阳救逆等作用。 现代药理发现, 艾叶挥发油含量多, 1, 8-桉叶素 (占50% 以上) , 其他有 α-侧柏酮、倍半萜烯醇及其酯。 风干叶含矿物质10.13%, 脂肪2.59%, 蛋白质25.85%, 以及维生素A、B1、B2、C等。 灸用艾叶, 一般以越陈越好, 故有“七年之病, 求三年之艾” (《孟子》) 的说法。 全草有调经止血﹑安胎止崩﹑散寒除湿之效。 治月经不调﹑经痛腹痛﹑流产﹑子宫出血, 根治风湿性关节炎﹑头风﹑月内风等。因它可削冰令圆, 又可炙百病, 为医家最常用之药。 现代实验研究证明, 艾叶具有抗菌及抗病毒作用;平喘、镇咳及祛痰作用;止血及抗凝血作用;镇静及抗过敏作用;护肝利胆作用等。艾草可作“艾叶茶”、 “艾叶汤”、“艾叶粥”等食谱, 以增强人体对疾病的抵抗能力。 艾草具有一种特殊的香味, 这特殊的香味具有驱蚊虫的功效, 所以, 古人常在门前挂艾草, 一来用于避邪, 二来用于赶走蚊虫, 因此, 对于野艾成分的研究尤其必要。 本研究对野艾的挥发油进行提取分离、 成分鉴定, 并研究其对微生物的杀灭抑制作用。
1材料与方法
1.1材料
原材料野艾购于深圳市福田区中医院, 产地广东, 超临界萃取装置、气相色谱-质谱联用仪等均为国内研发制作。试验所用蒸馏水均采用自动双重纯水蒸馏器制作。 菌株均来自武汉大学的菌种保藏中心, 实验采用牛肉汁蛋白胨培养基 (酵母浸膏1 g, 牛肉浸膏4 g, 蛋白胨10 g, 葡萄糖10 g, 琼脂15 g, 水1 L, pH= 7.0, 121℃灭菌30 min) 培养。
1.2方法
1.2.1挥发油提取
采用超临界CO2萃取法进行挥发油提取[1,2]:①将收集的野艾地上部分洗净阴干切碎, 称重为8.9 kg, 装入萃取装置;②萃取装置温度设置为35℃, 通入CO2, 排出装置中的空气;③打开压缩机, 调节仪器内部压强保持在16 MPa, 调节CO2出口阀, 保存20 kg/h;持续80 min, 打开分离器, 取出萃取物;④关闭萃取装置, 放空CO2, 取出挥发油粗制提取物, 然后放入2倍的无水乙醇, 搅拌均匀, 静止24 h;⑤真空抽滤, 再除去蜡质沉淀物, 最后将滤液在30°回收乙醇, 得到精制野艾挥发油。
1.2.2抑菌圈测定
试验对野艾挥发油的抑菌效果测定使用的是滤纸片琼脂平板扩散法[3]。 首先, 在三个固体平板均匀涂上牛肉汁蛋白胨培养液;其次, 取已灭菌的滤纸片 (7 mm) 粘取约15 μL已稀释好的挥发油样品置于平板上, 每个菌种取6个平行组;最后, 放入培养箱中培养, 细菌组温度为36℃, 24 h, 真菌组温度为27℃, 48 h, 测算菌落直径3次求取平均值, 并以左旋氧氟沙星为对照。
1.2.3最低杀菌浓度 (MIC) 和最低抑菌浓度 (MBC) 的测定
采用稀释法对MCI和MBC进行测定[4]。 在96孔的平板上涂上液体培养基、接种菌落、再加入已稀释好的各浓度挥发油样品。 放入培养箱中培养, 细菌组温度为36℃, 24 h, 真菌组温度为27℃, 48 h, 后观察, 每个菌种的每个挥发油样品相同稀释度的实验各三组, 重复两次。 MIC的确定标准[5]:肉眼无法观察到培养基内培养物浑浊的样品为最低抑菌浓度。 MBC的确定标准:首先是取出培养后无浑浊的平板再培养, 以再培养后平板无菌落生成为最低样品的抑制浓度。 并以左旋氧氟沙星为对照。
1.2.4使用质谱联用仪对野艾挥发油进行化学成分分离鉴定
首先, 将挥发油样品以1∶5的比例溶于乙酸乙酯, 摇匀, 分流进样。 鉴定分以下两个部分:
1.2.4.1色谱条件色谱柱 (25 m×0.25 mm) , 柱温:前两分钟保持45℃, 再以5℃每分钟的速度提高至100℃, 保持2 min, 再以10℃每分钟提高到220℃, 进样量:0.5 μL, 流速:1 mL/min, 载气:He, 分流比:30。 采用归一化法计算其相对的百分比含量。
1.2.4.2质谱条件进物口温度220℃, EL电离方式, 电离电压为70 EV, 离子源温度为330℃, 扫描范围为35~350 amu, 各组成成分分子式通过NIST进行检索。
1.3统计学方法
采用统计软件SPSS 15.0对实验数据进行分析, 计量资料数据以均数±标准差 (x±s) 表示, 采用t检验。 计数资料以率表示, 采用 χ2检验。 以P < 0.05为差异有统计学意义。
2结果
2.1野艾挥发油结果和化学成分GC-MS分析
经气相色谱分离出挥发油中的39种成分, 再经质谱图NIST检索确认, 再用面积归一化法, 分析出其各自的相对含量, 其余成分因各种原因未能确认。 表1结果显示, 野艾挥发油主要的五种成分分别是蒿酮 (15.52% ) 、 蒿醇 (9.63% ) 、 顺式丁香烯 (8.71% ) 、 艾醇 (7.37%) 和桉叶素 (6.47%) 等。
2.2野艾挥发油对三类菌的抗菌效果
对革兰阳性菌的抗菌效果相对较好, 对真菌的效果一般, 对革兰阴性菌无效。 具体见表2。
3讨论
试验对野艾挥发油的化学成分研究采用了气-质联用的分析方法, 首先通过使用超临界CO2萃取法对野艾挥发油进行分类提纯鉴定[6], 其次再使用气相色谱对挥发油进行成分分离鉴定, 查出挥发油中所含有的各化学成分组成, 再利用归一法测算挥发油中各化学成分的相对百分含量, 最后再通过质谱联用仪进行确定, 采用NIST计算机分子库进行自动检索, 确定挥发油中的各种化学成分及其含量[7]。
注:DD:抑菌圈直径;MIC:最低杀菌浓度;MBC:最低抑菌浓度
试验中对于野艾的杀菌抑菌研究也表明野艾挥发油对测试菌种有较强的抑制和杀灭作用, 尤其是对革兰阳性菌的杀菌活性很强[8]。 在过往的研究中也曾有过类似的报道[9,10,11], 蒿酮、蒿醇和桉叶素对革兰阳性菌有很强的的杀灭作用, 对部分真菌和革兰阴性菌也有抑制作用, 在这种也可以看出这三种物质是野艾抗菌的物质基础, 野艾挥发油对几种细菌的生长抑制作用会随着挥发油浓度的提高而加强[12,13,14,15]。
本文对挥发油抗菌活性的研究还利用了挥发油中芳香类化合物包括柠檬烯、 蒎烯等的抗菌作用, 尤其是萜类的化合物。 有数据显示[4], 芳香族化合物 (例如柠檬烯) 的特点是:其一, 具有较强的香气;其二, 具有较好的抗菌效果;其三, 具有较高的药物成分;其四, 具有较大的生物活性。 因此可将其作为制作生态抗病毒杀菌剂的合理材料。
摘要：目的 对中药野艾的药用价值进行研究, 主要对其挥发物进行抑菌活性研究及化学成分进行分离鉴定, 进而为野艾的药用价值寻找依据。方法 ①采用超临界二氧化碳 (CO2) 萃取法提取野艾的挥发油, 然后测定挥发油对于革兰阳性菌、革兰阴性菌和真菌的杀菌抑制作用;②使用气相色谱-质谱联用仪对挥发油进行化学成分分离鉴定。结果 ①挥发油对革兰阳性菌杀菌效果较好, 对真菌的效果一般, 对3种革兰阴性菌无杀菌活性;②分离鉴定出39种成分, 野艾挥发油主要成分是蒿酮 (15.47%) 、蒿醇 (9.55%) 、顺式丁香烯 (8.85%) 、艾醇 (7.28%) 和桉叶素 (6.78%) 等。结论 挥发油对所测试的菌落有很好抑制作用, 对革兰阳性菌有很好的杀菌作用。
关键词：野艾,挥发油,化学成分,抗菌活性
抗菌活性成分 篇2
中药是中华民族的瑰宝,我国劳动人民几千年智慧的结晶。中药复方包括古代流传下来的有确切疗效的传统方剂,也包括现代临床使用的疗效明确的一些新复方。几千年来所积累的方剂数量多达数十万,明代的《普济方》所收载的方剂达61 739首,近年来我国科研人员对流传下来的方剂更是费尽心血整理研究,仅1997年出版的《中医方剂大辞典》中选收的方剂就达96 592首。各少数民族也积累了大量的药方,常见的如藏药有400多种,蒙药500多种,维药310种,壮药70多种,彝药324种,白药151种,苗药163种,等等。中药是我国的传统优势资源,其价格低廉、效果确实。因此,寻找能够治疗浅表皮真菌感染的中药并对其进行深入研究,寻找其活性部位或者单体,探明其物质基础,提高药物疗效有着十分重要的意义和广阔的市场前景。近年来,中药现代化的研究遇到了一些难题和理论上的瓶颈,中药往往由很多味中药组成,包含的化学成分有成千上万,有些复方往往由很多种化学成分共同作用,因此,中药作用的化学成分和作用机理很难阐述清楚,对药物的质量控制也造成了一定困难。而在国际上,上市药物必须确定作用成分和作用机理,这就对中药进一步研究、走向世界造成了很大的困难。一部分科研工作者试图完全用西医的理论体系来研究并寻找中药中起作用的化学单体,但往往发现中药化学成分是一个整体作用,在经过成分拆分后往往分开几部分都没有作用,这就要求我们要以创新的方法进行研究,尽快攻克中药现代化中存在的难题[5,6]。
珊瑚藓净是一种治疗足癣的民间药,经临床证明对足癣有很好的疗效,目前还没有对其有效成分和药理学的相关研究。足癣病多由浅部或者深部真菌感染而生。引起足癣的真菌很多,主要有白色念珠菌、红色毛藓菌、须子样毛藓菌(石膏样毛癣菌)等[7,8,9]。本研究拟以抗菌活性为指导分离珊瑚藓净的活性成分并初步研究珊瑚藓净的药理作用。试验采用琼脂扩散法、微量稀释法对珊瑚藓净药敏活性进行测定[10],并以珊瑚藓净抗白色念珠菌活性为指导,对珊瑚藓净进行分离纯化,寻找其抗菌活性成分,探明其作用的物质基础。通过扫描电镜观察给药前后白色念珠菌外部形态的变化,初步了解其对白色念珠菌作用机理。
1 材料与方法
1.1 供试菌种
红色毛藓菌(T.rubrum)ATCC294;
石膏样毛藓菌(Richophytion mentagrophytes)LZY8905;
白色念珠菌(Canidia Albicans)ATCC10231。
(以上菌种由中科院微生物保藏中心提供)。
1.2 试剂
正己烷、氯仿(分析纯,北京化工厂);
SH1珊瑚藓净水煎剂提取物(自制);
L1 两性霉素B(sigma公司)。
1.3 仪器
高效液相色谱仪:Aglient 1200,Aglient Shimadzu LC-20高效液相色谱仪,
Waters HPLC2695-2487 ;
核磁共振仪:Bruker Avance 500MHz,Bruker Avance Ⅲ 400MHz,TMS为内标,
2D-NMR标准软件—XWIN-NMR,version 2.6 software;
旋转蒸发仪:RE-52A型,上海亚荣科技有限公司;
酶标以仪:TECNAⅡ-SAFIRE2酶标仪,瑞士TECAN集团公司;
真空冻干机:FD-1E-80,深圳三利试验仪器公司;
扫描电镜:日立S-3400N扫描电镜。
1.4 培养基
LB培养基:胰蛋白胨10g,酵母粉5g,NaCl10g,纯净水补齐1 000mL,121℃高压20min。
土豆培养基:马铃薯200g沸水煮5min左右,葡萄糖20g,琼脂16g,纯净水补齐1 000mL,121℃高压灭菌20min。
沙氏培养基:葡萄糖20g,蛋白胨10g,琼脂粉18g(固体),纯净水补齐1 000mL,121℃高压灭菌20min。
2 试验方法
2.1 珊瑚藓净有效成分的初步分离
将珊瑚藓净用8～10倍体积用氯仿反复提取,合并提取浓缩得浸膏4.729g,将所得样品用硅胶柱层析,洗脱液为正己烷—氯仿的梯度混合溶液 (体积比10∶0～4∶6),结合薄层层析检测结果,合并相似成分。将得到组分用旋转蒸发仪浓缩成浸膏并称量。
2.2 微量稀释法测定珊瑚藓净抗菌活性
将硅胶柱色谱分离得到的Fra1、Fra2、Fra3、Fra4四个组分用真空冻干机冻干至粉状蒸干,并用沙氏培养基溶解至浓度为1 280μg/mL.并在96孔聚苯乙烯板中倍比稀释,并分别接种白色念珠菌、红色毛癣菌、须子样毛癣菌悬液,使每孔终体积为100μL,48h后用肉眼直接观察结果,小孔内完全抑制细菌生长的最小浓度为MIC值。
2.3 高效液相色谱(HPLC)分离Fra2主要成分
将fra2在真空冻干机冻干,用80% 甲醇溶解。溶液进行离心(12 000r/min,15min),取上清,用HPLC分离并收集其中主要组分。
2.4 微量稀释法测定Z1、Z2、Z3三种化合物抗白色念珠菌活性
将得到的化合物用微量稀释法测定对白色念珠菌的抑菌效果(试验方法同2.2)。
2.5 核磁共振仪鉴定化合物Z2结构
用核磁共振仪检测单体化合物Z2(溶剂DMSO),通过氢谱(1H-NMR),碳谱(13C-NMR),DEPC-NMR,HSQC-NMR,HMBC-NMR分析Z2的化学结构。
2.6 扫描电镜观察Z2对白色念珠菌细胞膜形态影响[11,12,13,14]
药物在细胞膜内与脂醇(Ergosterol)结合而造成细胞膜通透性的改变,导致真菌细胞内的成分,钾离子及其他成分如氨基酸、蛋白质等泄漏到膜外,破坏真菌正常代谢及抑制生长,细胞产生裂解而造成细胞死亡[11,12,13]。因此,拟采用本试验观察珊瑚藓净对白色念珠菌细胞膜的影响。将Z2在灭菌后的24孔聚苯乙烯板中倍比稀释,并接种白色念珠菌菌悬液使每孔终体积为200μL,将载玻片放入24孔板所示各孔孵育48h后取出并在电镜下观察结果[14,15,16]。
3 试验结果
3.1 珊瑚藓净有效成分的初步分离结果
将珊瑚藓净氯仿提取物用正己烷-氯仿体系进行梯度分离,得到Fra1、 Fra2、 Fra3、 Fra4四个流分,重量分别为0.35g、1.23g、0.58g、0.89g。
3.2 微量稀释法测定Fra1、Fra2、Fra3、Fra4四种组分抗真菌药敏试验结果
试验结果表明,Fra1、 Fra2、Fra3 、Fra4对红色毛藓菌、石膏样毛藓菌均无明显抗菌效果。而Fra2对白色念珠菌有明显抑制效果,最小抑菌浓度(MIC)达到40ug/mL(见表1),而珊瑚藓净氯仿粗提物最小抑菌浓度(MIC)为640ug/mL,因此Fra2为珊瑚藓净的活性成分。
3.3 高效液相色谱(HPLC)分离Fra2主要成分结果
由图1可知,高效液相色谱在Fra2中共分离到三种主要化合物(图中标示为1、2、3),收集化合物,记做Z1、Z2、Z3,称重得到重量分别为85mg,121mg,32mg。
3.4 微量稀释法测定Z1、Z2、Z3三种化合物抗白色念珠菌药敏试验结果
由表2可知,化合物Z2的最小抑菌浓度(MIC)为10μg/mL,Z1、Z2均没有明显的抑菌效果,因此Z2是Fra2中的主要抑菌成分 。
3.5 核磁共振法(NMR)鉴定化合物Z2结构
经过NMR图谱结果分析,Z2结构为:
命名为1,3,4,6-4氨基己烷(1,3,4,6-4 amino hexane)
3.6 扫面电镜观察Fra2对白色念珠菌细胞膜的影响结果
在药物浓度为320μg/mL时(图7),白色念珠菌基本死亡,电镜下几乎看不到白色念珠菌细胞,只能看到少量没有生长到一定体积细胞就发生破裂的白色念珠菌细胞。能看到少量散落的菌丝,细胞壁有明显的褶皱。在药物浓度为80μg/mL(图8)时,在电镜下能观察到已经破裂的白色念珠菌细胞和菌丝体,细胞壁有明显褶皱,与阳性对照两性霉素B药物浓度10μg/mL(图12)下观察到的结果相似。在药物浓度为10μg/mL时(图9),在电镜下未能观察到已经破裂的白色念珠菌细胞,正常存活的细胞细胞壁有明显褶皱。在药物浓度为5μg/m(图10)时,在电镜下未观察到破裂的白色念珠菌细胞,正常存活的细胞细胞壁未出现褶皱,菌体表面光滑,生长状态正常,与阴性对照(图11)观察到的结果相似。从扫描电镜结果可以看出,珊瑚藓净有效部位Fra2对白色念珠菌有明显的抑制效果并呈现出对药物的剂量依赖效应。
4 讨论
抗菌活性成分 篇3
研究表明,滨海白首乌(耳叶牛皮消)有效部分和生理成分具有多种保健功效,如提高特异以及非特异性免疫效果、降低胆固醇含量、清除人体内自由基、抑制肿瘤生长扩散,有效降低心肌耗氧量等作用。近年来,随着对耳叶牛皮消开发利用的不断深入,耳叶牛皮消和耳叶牛皮消制品的需求量呈猛增趋势。
1 滨海白首乌的活性成分
1.1 多糖类
滨海白首乌(耳叶牛皮消)中含有双糖Methylgaucobioside和Wilforibiose。并含3种杂多糖AC-A,AC-B,AC-C,该3种杂多糖均由葡萄糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖6种单糖构成[1]。
1.2 苯酮类
滨海白首乌(耳叶牛皮消)存在苯酮类物质,主要为白首乌二苯酮。苯酮类物质主要存在于戟叶牛皮消、隔山消和耳叶牛皮消根中,前者中存在Bunge-iside A、B、C、D,4﹣羟基苯乙酮、2,4-二羟基苯乙酮[2],后两者均存在白首乌二苯酮[3,4],而隔山消中还存在Cynanchone A、Cynandione A。
1.3 C21甾体酯苷化合物
研究表明,C21甾体苷类化合物具备抗多种肿瘤功效,治疗肿瘤有效,该化合物制剂已成为用于治疗多种肿瘤的临床药物。研究C21甾体苷类化合物的药理作用、分离及作用机制成为热点。
C21甾体酯苷是目前从滨海白首乌中发现的量最多、最主要的活性成分。印敏等分别从新鲜药材、块根、黑鳗藤藤茎中分离出C21甾体苷类化合物。从白首乌新鲜药材中分离并鉴定化合物7类,其中C21甾体苷类化合物3类,占42.86%,从块根中分离出新C21甾体苷类化合物4个,从黑鳗藤藤茎中分离C21甾体苷类化合物3个[5,6,7]。
白首乌分子内含孕甾烯衍生物,主要存在于C21甾体类骨架内,而目前未发现变型孕甾烷骨架,可推测白首乌分子结构中不含有与之相关的衍生物。在白首乌分子内,C3位β-羟基易结合4类糖合成苷,糖之间以1→4相连[8],如2-去氧洋地黄糖、2,6-去氧糖、夹竹桃糖、葡萄糖、磁麻糖。C12、C20位β-羟基可结合有机酸生成C21羟基成酯。
1.4 磷脂类
滨海白首乌(耳叶牛皮消)含有磷脂类物质,采用钼蓝比色法测定耳叶牛皮消中的磷脂类成分,含量为0.030%[9]。从耳叶牛皮消中提取总磷脂,通过鉴定,证明有5种磷脂:磷脂酰甘油(PG)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、双磷脂酰甘油(DPG)[10]。
2 滨海白首乌药理活性
2.1 抗肿瘤
研究表明,滨海白首乌中含有的独特的白首乌甾体总苷,具有广泛的抗肿瘤效果,对常见的4种实体瘤细胞如大肠癌细胞、前列腺癌细胞、宫颈癌细胞、肺癌细胞均有明显的抑制作用,且与单位时间内的高浓度有关,呈现出浓度依赖性。研究表明,滨海白首乌(耳叶牛皮消)含有白首乌总苷,可明显抑制S180瘤株在体内的发,抑制作用效果与给药途径和药物剂量密切相关[11]。滨海白首乌(耳叶牛皮消)中的白首乌总苷抗肿瘤作用机制主要是2种,一是直接杀伤癌细胞的,二是诱导肿瘤细胞凋亡。
2.1.1 直接杀伤癌细胞。
滨海白首乌(耳叶牛皮消)中含有的甾体酯苷,其分子结构较为特殊,既含有甾核,具有亲脂性;又含有基团,具有亲水性。将甾体酯苷药物作用于癌细胞膜表面,竞争K+的结合部位,抑制Na+/K+泵,引起癌细胞膜表性质变,可初步判定与白首乌甾体酯苷亲脂基团和亲水基团有关[12]。经FCM快速测定细胞DNA的相对含量,部分癌细胞膜存在破裂现象[13],说明甾体酯苷对癌细胞S期有阻滞作用,在形态学上支持白首乌甾体酯苷的直接杀伤作用。
2.1.2 诱导肿瘤细胞凋亡。
研究结果表明,应用MTT法可证实白首乌苷(AK)对KB细胞(口腔表皮样癌细胞)有杀伤作用,其机理可能与诱导肿瘤细胞凋亡有关。白首乌苷(AK)是从白首乌总苷(CA)分离纯化获得的单体,MTT法主要是将白首乌苷(AK)作用于KB细胞(口腔表皮样癌细胞),使用50μg/m L浓度的白首乌苷(AK)作用于KB细胞(口腔表皮样癌细胞)72 h,可诱导核缩等早期调亡。经流式细胞仪测定,白首乌苷(AK)作用72 h可出现核缩调亡高峰,达41.9%,还可将KB细胞(口腔表皮样癌细胞)周期阻滞于G0/G1期[14]。
研究表明,白首乌C21甾体苷类化合物抗癌作用热点明显,一是对肝癌细胞有诱导凋亡作用;二是化合物的浓度与抑制率相关,即可能具有量—效关系;三是C21甾体类化合物对肿瘤细胞抑制具有选择性。
王冬艳等[14]研究发现,不同浓度的C21甾体苷类化合物对小鼠移植性Heps具有抑制作用,10 mg/kg剂量组的抑制肿瘤率为34.79%,20 mg/kg剂量组的抑制肿瘤率为47.08%,40 mg/kg剂量组的抑制肿瘤率为50.23%。
林红梅等[15]通过9种C21甾体苷类化合物作用,对SMMC-7721人肝癌细胞系和A549肺腺癌细胞株的抑制作用有程度上的差异,单株细胞增殖的抑制率伴随与化合物浓度呈正相关。郑威等[16]发现,通过丫啶橙染色法染色荧光显微镜,白首乌中甾体苷诱导PC-3(前列腺癌细胞)产生的提取物,可诱发显著的核断裂和核固缩,形成凋亡小体。同时,还发现PC-3(前列腺癌细胞)凋亡进程与C21甾体苷类化合物存在量—效关系,可提高细胞阻滞在G2/M期比例,呈显著浓度依赖性。
另外,纯化C21甾体类化合物作用于BGC-823、BEL-7402、KB和PC-3、SGC-7901细胞株,发现纯化C21甾体类化合物对三者未表现明显抗肿瘤作用,而对后二者抗肿瘤作用明显,这表明C21甾体苷类化合物对于肿瘤细胞抑制作用具有选择性[16]。
2.2 免疫调节
曾郁敏等[17]研究表明,白首乌总苷对机体具有显著的调节免疫功能。顾立刚等[18]认为,白首乌总甙的不同浓度对于某些细胞的作用不同。高浓度白首乌总甙对小鼠脾脏Ti淋巴细胞增殖反应有抑制作用,对于白细胞介素-2(IL-2)的活性也产生抑制效应,而在低浓度白首乌总甙对于上述试验对象促进效应明显。宋俊梅等[19]认为,白首乌总甙能激活小鼠腹腔M5,提高M5抗原的能力,增强吞噬消化,从而提升小鼠机体的特异性免疫功能[19]。
研究表明,C21甾苷可降低移植性肝癌实体瘤后异常增高的脾指数,提升胸腺指数,巨噬细胞吞噬能力增强,T、B淋巴细胞增殖反应明显增强。脾细胞显著提高分泌白细胞介素-2(IL-2),腹腔巨噬细胞分泌TNF-α能力明显提高[20]。高丽君用家兔、小鼠做样本,采用白首乌中的白首乌多糖类进行靶击,发现后者能增强小鼠迟发型超敏反应,显著提高家兔T淋巴细胞的增殖能力,从而提高机体的免疫效应[21]。
白首乌还可通过影响淋巴细胞在形态和数量上提升机体免疫。在形态上,白首乌提取物促进动物T淋巴细胞的依赖区大范围增生,促使B淋巴细胞依赖区增大[22]。在数量上,白首乌总磷脂可显著提高外周血ANAE(+)淋巴细胞比值和绝对数,防止倒置现象,为T细胞比值保持正常打下基础[23]。
3 结语
蜜蜂幼虫抗菌活性的初步研究 篇4
鉴于此, 本研究拟选用中华蜜蜂 (Apis cerana cerana) 工蜂幼虫为材料, 分离、纯化出中华蜜蜂幼虫中的抗菌肽, 并研究其性质和抑菌特性, 为进一步研究中华蜜蜂幼虫抗菌肽的产生及应用提供试验依据。
1 材料
1.1 蜜蜂
蜂群来自宜春市袁州区彭氏蜂场, 选取2日龄的中华蜜蜂幼虫作为试验材料。对蜂群中蜂王采取限制产卵的方式, 获取同日龄的幼虫。
1.2 供试菌株
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌、氨苄敏感型转质粒大肠杆菌、面包霉、根霉和酵母, 均由宜春学院江西省高校应用化学与化学生物学重点实验室提供, 以上菌株均于-30 ℃低温保存, 用前活化。
1.3 培养基和主要试剂
培养基:NA培养基 (用于培养细菌) 、PDA培养基 (用于培养酵母和霉菌) , 均由宜春学院江西省高校应用化学与化学生物学重点实验室自制。试剂:80%甲醇、100 μg/mL 氨苄西林 (Amp) 溶液、2 mol/L NaCl溶液、1 mol/L NaOH溶液、1 mol/L HCl溶液, 均为国产分析纯。
2 方法
2.1 抗菌物质的诱导
采取饲喂诱导的方法, 选取2日龄幼虫, 幼虫王浆中加入10 μL大肠杆菌 (1×107个/mL) , 继续培养幼虫48 h。
2.2 抗菌物质的粗提取
用75%乙醇消毒诱导的虫体后以无菌水冲洗, 再用无菌滤纸吸干并剪破幼虫;然后用毛细管收集幼虫体液, 并将体液集中到冰浴上的离心管中;加入缓冲液, 随后将收集好的体液置于100 ℃恒温水浴箱中水浴;取出后立即以4 ℃、10 000×g离心30 min, 取上清液置于冰箱保存, 备用。
2.3 抑菌试验
2.3.1 含菌平板的制备
将各种待试菌活化, 挑取单个菌落至5 mL相应液体培养基中;细菌置于37 ℃、醇母和霉菌置于28 ℃以120 r/min摇床培养12 h;取100 μL, 稀释10倍后取100 μL菌悬液至固体培养基平板上, 并涂匀。
2.3.2 无菌滤纸片的制备
将滤纸用打孔机打成直径为6 mm的圆片, 121 ℃高压蒸气灭菌30 min, 烘干保存;将滤纸片分别在抗菌物质的粗提液、100 μg/mL氨苄西林溶液、纯化水中浸置10 min (100 μg/mL氨苄西林溶液和纯化水为对照组) ;之后用无菌镊子取出, 风干后贴在含菌平板上;每皿4片, 每种菌重复做6次;将细菌置于37 ℃、醇母和霉菌置于28 ℃条件下培养12 h, 测定滤纸片的抑菌圈大小。
2.4 抗菌物质的酸、碱、盐处理
盐处理:加浓度为2 mol/L NaCl溶液20 μL于100 μL抗菌物质粗提液中, 混匀。碱处理:加浓度为1 mol/L NaOH溶液10 μL于100 μL抗菌物质粗提液中, 混匀。酸处理:加浓度为1 mol/L HCl溶液10 μL于100 μL抗菌物质粗提液中, 混匀。
2.5 数据统计
采用Duncan’s法对样品抑菌效果进行多重比较。
3 结果与分析
3.1 蜜蜂幼虫抗菌物质的抗菌效果
3.1.1 对细菌的抑制
通过抑菌圈试验法研究蜜蜂幼虫粗提液、纯化水、100 μg/mL氨苄西林溶液在各细菌培养基上的抑菌效果, 结果见图1和图2。
1.诱导后的4日龄幼虫粗提液;2.1日龄幼虫粗提液;3.纯化水;4.100 μg/mL氨苄西林溶液。
1.诱导后的4日龄幼虫粗提液;2.1日龄幼虫粗提液;3.纯化水;4.100 μg/mL氨苄西林溶液。
由图1、图2可知, 诱导后的4日龄幼虫粗提液和100 μg/mL氨苄西林溶液有界面清晰的抑菌圈, 而1日龄幼虫粗提液则没有出现抑菌圈, 这可能是由于1日龄幼虫粗提液中抗菌物质浓度太低。
利用4种指示菌, 比较蜜蜂幼虫粗提液与100 μg/mL氨苄西林溶液对细菌的抗菌活性, 记录每个抑菌圈半径, 具体结果见表1、表2。
由表1可知, 诱导后的4日龄蜜蜂幼虫粗提液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和藤黄八叠球菌都有较强的抑制作用。大肠杆菌和枯草芽孢杆菌分别是革兰阴性菌和革兰阳性菌的典型代表。由此可反映出, 蜜蜂幼虫粗提液可能是革兰阴性菌和革兰阳性菌的良好抑制剂, 具广谱抗菌能力, 但稍逊于氨苄西林溶液。
由表2可知, 诱导后的4日龄蜜蜂幼虫粗提液对大肠杆菌的抑菌活性最强, 而对其他3种细菌的抑制作用则差异不显著。
3.1.2 对转氨苄西林抗性质粒大肠杆菌的抑制作用
氨苄敏感型转质粒大肠杆菌摇床培养12 h后, 取100 μL菌悬液至牛肉膏蛋白胨培养基平板上, 涂匀, 进行抑菌圈试验, 37 ℃温箱培养24 h后, 抑菌圈半径为0.70 cm。可见蜜蜂幼虫粗提液中的抗菌物质对氨苄敏感型转质粒大肠杆菌也有较强的抑菌活性, 能抑制氨苄西林所不能抑制的细菌。
3.1.3 对酵母和霉菌的作用
在酵母和霉菌平板上都没出现明显的抑菌圈。酵母是单细胞真核生物的模式生物, 说明蜜蜂幼虫粗提液不会对真核生物产生明显抑制作用, 提示用蜜蜂幼虫粗提液有可能开发出一种安全的抗菌物质而应用到食品和医药中。
3.2 酸碱盐对蜜蜂幼虫抗菌物质的影响 (见图3、图4和表3)
1.正常条件;2.加1 mol/L NaOH溶液。
1.正常条件;2.加2 mol/L NaCl溶液;3.加1 mol/L HCl溶液。
由图3和图4可见, 在酸性、碱性、高盐条件下, 蜜蜂幼虫粗提液在含有大肠杆菌、金黄色葡萄球菌的培养基上都能产生抑菌圈。
由表3可知, 在分别含有大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养基上, 蜜蜂幼虫粗提液在酸性、碱性、高盐浓度下产生的抑菌圈半径与正常条件下差异不显著。说明蜜蜂幼虫粗提液具有耐酸碱性、耐盐性。
4 讨论
蜜蜂幼虫粗提液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、藤黄八叠球菌和氨苄敏感型转质粒大肠杆菌都具有抑制作用;而对面包霉、根霉、青霉、黑曲霉和酵母无抑制作用。诱导产生的蜜蜂幼虫粗提液中的抗菌活性物质具有广谱抗菌能力, 是革兰阳性菌和革兰阴性菌的良好抑制剂, 而对酵母和一些霉菌无明显抑菌活性, 并且该抗菌活性物质耐热、耐盐、耐酸碱性。
抗菌肽在昆虫先天免疫中扮演着极其重要的角色, 不同种类的昆虫抗菌肽可以抵御不同的细菌、真菌、病毒及一些肿瘤细胞等。随着科学技术的不断发展, 抗菌肽类物质在医疗、农业、食品等许多方面都凸显出它的优越性, 并且已经成为社会发展的必然趋势。目前, 已从昆虫如天蚕蛹、黄粉虫、果蝇、麻蝇, 动物如牛白细胞、猪小肠及人的白细胞等中分离到多种抗菌肽, 而蜜蜂幼虫抗菌肽的开发、利用还处于起步阶段, 本试验的结果还只是初步研究, 建议从以下几方面系统研究蜜蜂幼虫抗菌物质的作用。首先, 对其抗菌谱进行广泛研究, 弄清楚蜜蜂幼虫抗菌物质到底对哪些种类微生物有抑制作用, 对原虫、病毒是否有同样的效果;其次, 应对蜜蜂幼虫粗提液进一步提纯, 并对抗菌成分进行分析, 测定其分子质量、氨基酸序列, 研究抗菌机理, 分析其基因结构。
参考文献
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明党参的活性成分分析 篇5
1 仪器与试剂
仪器:菲力浦SP-300型红外分光光度计, HPWZZ-1型自动旋光仪, Nicolet R 3m/E x-衍射仪, HP6890GC—5973MSD气相色谱—质谱—计算机等。药材:新鲜明党参 (江苏句容产) , 取其新鲜根部。试剂:乙醚、正丁醇、吸附树脂等, 均为分析纯, 由北京华大生物仪器有限公司生产。
2 提取方法
取明党参300g, 置于一下端具磨口塞, 上端开口的500m L球形瓶中, 塞紧瓶口, 下端依次连接预装有大孔吸附树脂的层析柱和抽滤瓶以及真空抽气泵。加沸水至明党参全部淹没, 加热回流提取2~3次 (2h/次) , 合并提取液, 依次用乙酸乙酯、石油醚、正丁醇减压浓缩萃取;所得成分混适量硅胶, 用热乙醇溶液溶解, 经石油醚—醋酸乙酯硅胶色谱梯度分离洗脱, 收集得到5个流分的粗成分;以上各流分经硅胶柱再次色谱分离纯化, 所得样品置冰箱结晶析出。
3 结果
3.1 成分鉴定
我们采用钠溶法、凝胶柱层析、旋光、IR、UV、酸水解产物纸层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳、气相色谱等技术分析馏分结晶的元素、分子量、比旋光度、纯度、键结合构型等, 主要鉴定出下列物质[3,4,5]: (1) 通过能量色散X-射线光谱和等离子体发射光谱技术鉴定出明党参含钾、铜、铬、锂、镁、锰、钼、镍、磷、硒、钙、钻、铁、锗、钠、矾、锌等人体必需或有益元素, 其中钾的含量最为丰富; (2) 明党参磷脂主要成分为卵磷脂类, 棕榈酸为其组成磷脂的脂肪酸主要成分, 而据文献报道, 明党参生品卵磷脂含量低主要以磷脂酸的形式存在, 提示煮制加热可阻止磷脂分解, 抑制卵磷脂酶活性; (3) 通过高速氨基酸自动分析技术鉴定明党参含20种常见氨基酸, 如丙氨酸、精氨酸、谷氨酸, 其中天门冬酰胺含量最为丰富; (4) α-型糖苷键明党参多糖 (CSP) , 具有845nm红外吸收峰, 分子量52 000, 由6种单糖:葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、鼠李糖组成, 摩尔比为11.95∶1.57∶1.03∶0.18∶0.26∶0.08, 主要成分为葡萄糖, 具体结构尚待确定; (5) 通过气相色谱—质谱从挥发油鉴定出β-蒎烯、6, 9-十八碳二炔酸甲酯、乙酸十四烷醇、豆甾醇、β-2谷甾醇、单棕榈酸甘油酯、香草酸、胡萝卜苷等。
3.2 药理学实验
设置实验组和对照组小鼠, 两组小鼠均给予酚红、氨水喷雾, 氯化乙酰胆碱和磷酸组织胺混合物刺激, 实验组小鼠灌服明党参天门冬酰胺结晶水溶液, 对照组灌服同容量的生理盐水。2h后, 与对照组比较, 实验组小鼠气管酚红排泄量显著增加 (P<0.05) , 对氨水刺激引起的咳嗽以及对氯化乙酰胆碱和磷酸组织胺引起的哮喘均表现出显著的抑制作用 (P<0.05) 。由此可见, 明党参天门冬酰胺对止咳、平喘、祛痰具有显著疗效。实验组小鼠口服明党参多糖水溶液, 能显著提高在高温、常压以及氰化钾所致的化学性缺氧等条件下的存活时间, 并且对二硝基氯苯 (DNCB) 所致的小鼠迟发型Ⅳ型变态反应显示出极显著的抑制作用, 提示明党参多糖能提高正常状态下小鼠的耐受能力, 并对各种极端条件所致的变态反应表现出一定的适应能力。实验组小鼠给予腹腔注射明党参多糖水溶液, 小鼠脾细胞NK活性、巨噬细胞受体激活活力和数量, 胸腺指数、脾指数、外周血细胞数、淋巴细胞数等均显著增高。提示明党参多糖对小鼠NK活性具有促进作用, 可促进机体免疫功能以及网状内皮系统的吞噬功能, 增强机体防癌、抗感染能力。
4 讨论
天门冬酰胺作为明党参质量控制的重要指标, 对评定不同产地的明党参具有重要作用。传统的电位滴定法、微量滴定法等用于测定门冬酰胺的含量, 由于中药成分复杂, 效果并不理想。我们采用以高效液相色谱为主的分析技术, 将天门冬酰胺与其它结构相近的成分较为准确地分离出来, 从而为探讨其纯化物药理奠定了基础。但由于技术本身的局限性, 以及操作的主观性, 实验条件控制的不确定性, 虽然我们成功分离出了天门冬酰胺和部分其它文献已经报道过的成分, 仍有一些成分不能准确分离。另外, 对有些已经分离出来的成分的化学结构, 以及不同成分的相互作用及药效发挥机制, 仍需要进一步的研究。据文献报道, 除了传统的止咳、平喘、祛痰等药效外, 明党参还具有降血脂、抗凝血、抗血栓形成、抑制血小板聚集、增强机体免疫力、提高机体适应力等作用。明党参还有活血化瘀、降低全血粘度、改善微循环和血液流变的作用, 能显著抑制小鼠血栓的形成, 减少小鼠体外颈总动脉—颈外静脉血流旁路法形成的血栓重量。另外明党参还能促进机体自由基的清除, 增强超氧化歧化酶 (SOD) , 从而抑制环磷酰胺诱发的微核频率以及环磷酰胺诱发的姐妹染色单体互换频率, 降低体细胞遗传物质的突变。此外关于明党参帮助消化、降逆止呕、改善肠胃等功能也有报道, 但由于实验条件所限, 我们仅对此做了部分药理学动物实验, 结果显示明党参除了具有传统的止咳、平喘功效外, 确实具有增强机体免疫力, 提高机体适应力的功效。当然, 关于其具体机理, 以及文献报道过的其它功效, 有待进一步深入研究。
摘要：目的:探讨明党参活性成分的药理学性质以及分离鉴定方法。方法:采用以高效液相色谱法为主的分析技术进行成分分离和鉴定, 并用鉴定出来的活性成分进行药理学实验。结果:分离出天门冬酰胺等一批活性物质。动物实验证实, 明党参活性成分具有止咳平喘、增强机体免疫力和适应力等功效。结论:明党参具有多种功效, 但其活性成分的具体作用机制, 还有待进一步深入研究。
关键词：明党参,活性成分,高效液相色谱法
参考文献
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壳聚糖抗菌活性研究进展 篇6
1 壳聚糖抗菌性能的影响因素
壳聚糖的抗菌性能与其自身的性质以及环境因素有关。壳聚糖溶液浓度、壳聚糖分子量、壳聚糖的脱乙酰度、金属离子浓度以及环境中的p H值等都会影响壳聚糖的抗菌性能。
1.1 壳聚糖浓度
壳聚糖的浓度直接影响着抗菌效果。对于不同的菌种, 壳聚糖的最小抑菌浓度表现出一定的差异性;对同一菌种, 不同分子量的壳聚糖也有着不同的最小抑菌浓度。在一定范围内, 壳聚糖的抗菌性能随着壳聚糖浓度的增加, 其抗菌效果也在提高[2]。
1.2 壳聚糖分子量
壳聚糖分子量是影响壳聚糖抗菌活性的重要因素。分子量的大小对壳聚糖抗菌活性的影响目前还没有统一的结论。郑连英等的研究表明, 对于革兰氏阳性菌, 随着壳聚糖的分子量的增大, 抗菌效果逐渐增强;而对于对革兰氏阴性菌, 随着壳聚糖的分子量减小, 抗菌作用逐渐增强[3]。而宋献周的研究表明, 无论是革兰氏阳性菌, 还是革兰氏阴性菌, 低分子量的壳聚糖的抗菌效果均优于高分子量的壳聚糖[4]。吴小勇、冯小强等人的研究验证了郑连英的观点, 大分子量的壳聚糖对金黄色葡萄球菌有较强的抗菌效用, 而低分子量的壳聚糖对大肠杆菌有较好的抗菌效果[5,6,7,8]。有研究表明, 羧甲基的抗菌活性及低聚壳聚糖的抗真菌活性随分子量的增加而减弱[8,9]。
1.3 壳聚糖脱乙酰度
壳聚糖的脱乙酰度的定义为壳聚糖分子中脱除乙酰基的糖残基数占壳聚糖分子中总的糖残基数的百分数, 它是反映壳聚糖分子链上自由氨基的含量的指标。壳聚糖脱乙酰度越高, 其分子链中的自由氨基的含量就越高。壳聚糖中的氨基 (-NH2) 是目前大家比较认可的消毒因子。等浓度、近分子量壳聚糖溶液, 脱乙酰度高的壳聚糖含有更多的消毒因子, 其抗菌活性也越高。许多研究结果都表明, 壳聚糖的抗菌活性随着脱乙酰度的提高而增强[10,11,12]。
1.4 环境p H
壳聚糖一般只有在弱酸的条件下才能表现出其较好的抗菌活性[7,10,11]。这是因为在较高的p H会使壳聚糖溶解度变差, 而在较低的p H介质中, 溶液中的大量H+会与杀毒因子-NH3+在细菌表面产生竞争性吸附, 导致抗菌活性的下降[10]。
1.5 金属离子
壳聚糖的分子链上含有多个-NH2活性官能团, N上含有孤对电子对, 这使得壳聚糖具有良好螯合能力, 能与多种金属离子螯合。壳聚糖的抗菌活性随着金属离子的增大而减弱, 高浓度金属离子甚至能使壳聚糖的完全失去抗菌活性[12,13,14]。此外, 壳聚糖对金属离子的螯合能力会影响到壳聚糖的抗菌效果。吴俊等的研究表明, 壳聚糖对某种金属离子的螯合能力越强则其抗菌效果就越差, 金属离子对壳聚糖抗菌效果的影响程度由大到小依次为:Zn2+>Mn2+>Ca2+>Mg2+[13]。而氯化钠能增大溶液中的离子浓度, 从而增大壳聚糖的溶解度, 达到提高壳聚糖的抗菌效果。
2 壳聚糖的抗菌机理
壳聚糖作为抗菌剂已被科研工作者研究多年, 虽然到目前为止具体的抗菌机理尚未清楚, 但学者们提出了不少较为合理的抗菌机制。郑连英等认为壳聚糖的抗菌作用主要有以下两种机理:一种是壳聚糖吸附在细胞表面, 形成一层高分子膜, 阻止了营养物质向细胞内的运输, 从而起到抑菌杀菌作用;另外一种机理是壳聚糖通过渗透进入细胞体内, 吸附细胞体内带有阴离子的细胞质, 并发生絮凝作用, 扰乱细胞正常的生理活动, 从而杀灭细菌[3]。壳聚糖分子量的不同, 菌种种属的不同, 其抗菌机理也有所不同。革兰氏阳性菌的细胞壁较厚, 结构紧密, 且细胞壁含有丰富的磷壁酸使细胞壁形成一个负电荷环境, 所以, 高分子量的壳聚糖对金黄色葡萄球菌的抑杀作用可能以第一种机理为主。而革兰氏阴性菌细胞的壁薄, 交联松散[15]。低分子量壳聚糖对大肠杆菌的杀菌作用可能归因于第二种机理。但是, 宋献周的研究表明, 壳聚糖的抗菌作用主要是通过某种途径进入菌体细胞内并扰乱其生理代谢实现的, 因此低分子量的壳聚糖的抗菌效果均优于高分子量的壳聚糖[4]。现有的研究表明, 壳聚糖的抗菌主要是通过在表面成膜和进入菌体两种方式实现的。
2.1 表面成膜
壳聚糖是自然界唯一的天然碱性阳离子多糖, 在溶液中带正电荷, 易吸附在带负电荷的细胞壁上形成一层高分子膜。这层高分子膜能改变细胞膜的选择透过性, 阻止营养物质运输, 致使细胞质流失, 发生质壁分离, 从而起到抑菌杀菌效果[11]。高分子量的壳聚糖较低分子量的壳聚糖具有更好的成膜性, 从而表现出更好的抗菌效果。
一些研究学者通过观察细菌形态特征的变化或检测胞内物质的流出, 从而证明了壳聚糖是通过表面成膜来达到抗菌效果的。杨冬芝等用扫描电镜观察分子量为27万的壳聚糖对大肠杆菌的作用, 发现壳聚糖使菌体凹陷变形, 并伴有自溶现象[10]。吴迪等运用电子显微镜观察了壳聚糖、壳聚糖季铵盐处理前后细菌超微结构的变化, 结果表明, 经壳聚糖作用后细菌的细胞壁发生了明显的缺失, 这表明壳聚糖对细菌的细胞壁有不可逆的破坏作用[16,17,18]。冯小强等[19]对菌悬液的分析结果表明菌悬液含乳酸脱氢酶和谷氨酰转移酶的内酶活性, 证明了壳聚糖的加入引起了胞内物质的泄漏。李淑荣等[20]采用紫外-分光光度法测定了细菌细胞膜完整性, 结果表明, 壳聚糖处理过的实验组在260 nm处具有较高的吸光值, 表明有DNA和RNA流出。
若将壳聚糖的氨基加以保护, 从而使壳聚糖不能吸附在带负电荷的细胞壁上形成一层高分子膜, 那么壳聚糖的抑菌性能将会降低或消失, 这样就可以间接证明的壳聚糖是通过表面成膜来达到抗菌的。冯小强等[21]利用壳聚糖的席夫碱反应将壳聚糖的氨基加以保护, 结果发现, 经席夫碱反应的壳聚糖失去了原有的抑菌活性。滕丽菊等[9]将壳聚糖纳米粒子的氨基保护起来后也无抑菌性。这表明壳聚糖抑菌作用与氨基的质子化和吸附表面成膜有很大的关系。
2.2 进入菌体
壳聚糖可以进入菌体内部, 通过干扰微生物细胞内的正常代谢, 影响其生长繁殖, 从而达到抗菌的目的。杨冬芝等[10]通过激光共焦显微镜对异硫氰酸荧光素 (FITC) 标记的壳聚糖齐聚物 (Mw=8000) 与大肠杆菌作用的观察, 发现壳聚糖进入了菌体内部。李松晔[22]通过观察DNA结构研究表明, 壳聚糖及其衍生物的抗菌作用是通过对DNA复制、基因表达和蛋白质的影响来实现的。
3 壳聚糖衍生物的抗菌性
壳聚糖不溶于水和碱溶液, 只能溶于弱酸, 这使其应用场合受到了较大的限制。对壳聚糖进行改性, 不仅能很好的改善壳聚糖的水溶性, 还能增强它的抗菌性, 这将扩宽壳聚糖的应用范围。目前, 对壳聚糖进行改性的方法主要有将壳聚糖降解为低分子量壳聚糖, 对壳聚糖进行季铵盐化和羧甲基化处理等。
3.1 低分子量壳聚糖
低分子量壳聚糖, 又名壳寡糖, 是壳聚糖的降解产物, 其水溶性好, 其制备方法主要有化学法、酶解法和物理法等。壳寡糖糖分子量越小, 越易进入菌体细胞并干扰其生理代谢。严钦和张筠等研究表明, 壳寡糖对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用[24,25,26], 并随分子量的减小而增强[27,28]。壳寡糖分子内的氨基和羟基能与很多金属离子形成稳定的配合物。潘素娟和王长青等研究表明, 壳聚糖/镨配合物和壳聚糖/钕配合物具有较强的抗菌性能[29,30]。而且, 宋庆平的研究表明, 壳聚糖/银配合物具有比单一壳聚糖更强的抗菌性能[31]。
3.2 壳聚糖季铵盐
壳聚糖季铵盐具有很好的水溶性, 对细菌和真菌均具有良好的抗菌性能, 尤其是在中性或弱碱性环境条件下显示出更好的抗菌性能[32]。雷万学等[33]制备的季铵盐型壳聚糖对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和白色念珠菌也具有很强的杀效果, 杀菌率高达99%以上。程国君等通过γ射线将壳聚糖进行辐射降解所得到的低分子量壳聚糖保持了壳聚糖原有的分子结构, 该低分子量壳聚糖制得的壳聚糖季铵盐具有更高的季铵盐取代度, 对细菌的抗菌效果也更好[34]。杨俊玲的研究表明壳聚糖季铵盐的抗菌性能随着季铵化程度的增加而增强[35], 但是李明春等合成的N-长烷基壳聚糖季铵盐在碱性及中性条件下, 产物的抗菌活性随着季铵化度的提高而提高, 而在酸性条件下抗菌活性则随着季铵化度提高而降低[36]。
3.3 羧甲基壳聚糖
羧甲基壳聚糖具有更好的水溶性, 其抗菌性能与羧甲基取代的位置有密切的关系。O-羧甲基壳聚糖具有更好的抗菌性[37,38], N, O-羧甲基壳聚糖的抑菌活性下降, 且随取代度的增大而下降[39]。吴迪等[40]研究表明, O-羧甲基壳聚糖的抑菌效果优于N, O-羧甲基壳聚糖和N-羧甲基壳聚糖。
4 结语
灵芝活性成分的研究进展 篇7
1 灵芝多糖
1.1 组成与结构
灵芝多糖是由肽多糖、葡萄糖、杂多糖等多糖均一体组成的混合物, 含有少量D-阿拉伯糖、D-木糖、D-半乳糖、D-甘露糖、L-岩藻糖、L-鼠李糖和L-阿拉伯糖等单糖。目前已分离到的灵芝多糖有200多种, 是灵芝的最有效成分之一, 其中大部分为β-型的葡聚糖, 少数为α-型的葡聚糖。灵芝多糖以一种蛋白多糖的形式存在, 其中多糖的含量为30%~60%, 由甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖和岩藻糖等组成, 其中蛋白含量为20%~30%。灵芝多糖蛋白中的糖链与肽链上丝氨酸或苏氨酸通过α-糖苷键连接。多糖和多糖蛋白的分子量为2.0×103~5.8×105 Da, 其单糖主要由D-葡萄糖为主的杂多糖构成。单糖之间主链以β- (1→3) 、β- (1→4) 糖苷键连接, 支链以β- (1→6) 糖苷键连接。
江艳[3]等从灵芝孢子粉中分离出Lzps-1多糖, 其平均分子量为8×103 Da, 纯度97.25%。Zhang[4]等采用热提取法和凝胶过滤Superdex-G200洗脱法分析黑芝子实体的灵芝多糖, 单糖种类有β- (1→3) 、 (1→6) -葡萄糖、α- (1→4) -半乳糖和α- (1→2) 或α- (1→4) -甘露糖, 相对分子质量为1.01×106。Han[5]等从紫芝中得到GSP-4多糖蛋白, 从中进一步检测到3种多糖, 单糖种类及各组分摩尔比为甘露糖∶葡萄糖∶半乳糖等于4.7∶27.1∶1.0。
1.2 生物活性
1.2.1 抗肿瘤
Han[5]等研究发现, 紫芝GSP-4多糖蛋白能显著刺激产生有免疫标记的肿瘤坏死因子 (TNF-α) , 白细胞介素 (IL) -1β和IL-12, 以及外周血单核细胞中的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。Zhang[6]等研究了黑芝多糖 (PSG-1) 对CT26肿瘤小鼠的免疫调节作用, 结果表明PSG-1并没有直接杀死CT26细胞, 但是通过腹腔巨噬细胞抑制CT26的活化增殖。在体内, PSG-1显著抑制CT26肿瘤小鼠的肿瘤生长, 并且显著增加免疫器官指数和巨噬细胞的吞噬功能。
1.2.2 抗氧化
游育红[7]等研究了灵芝多糖对ECV304氧化损伤的保护作用, 结果表明灵芝多糖可以减少氧自由基对细胞器的损伤, 对细胞凋亡、细胞坏死也有很好的抑制作用, 使细胞存活率升高, 证明了灵芝多糖具有保护细胞及抗氧化的作用。Shi[8]等研究表明, 4种不同赤芝 (G.lucidum) 多糖均具有抗氧化活性, 并呈浓度依赖性。其中, GLP-III、GLP-IV与GLP-1、GLP-II相比, 对羟自由基、ABTS自由基和DPPH自由基有较强的清除作用, 以及较高的还原能力和SOD活性, 从而减少自由基对机体的损伤。
1.2.3 降血糖
Meng[9]等通过对血糖、胰岛素、血脂和抗氧化物酶活性等指标的测定, 研究灵芝多糖对高脂饮食或STZ诱导的糖尿病小鼠心肌胶原交联的影响, 并探讨晚期AGEs和抗氧化物酶在此过程中所起的作用。研究表明, 灵芝多糖能降低糖尿病小鼠的血糖和血脂, 使胰岛素升高。
1.2.4降血脂
吴锋[10]等在研究灵芝多糖对血脂的作用时, 发现使用灵芝多糖的小鼠血脂中的胆固醇 (TG) 和甘油三酯 (TC) 都明显降低, 而对于高密度脂蛋白 (HDL) 没有明显的效果, 低密度脂蛋白 (LDL) 和脂蛋白 (LPa) 有非常明显的降低。
1.2.5 抑菌作用
赵成萍[11]等采用分光光度法研究灵芝多糖对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌的抑制作用, 结果表明, 灵芝粗多糖对4种菌均有抑制效果。
此外, 灵芝多糖还具有增强机体耐缺氧能力、调节免疫力、抗疲劳、抗辐射、增加记忆力等作用。
2 灵芝三萜类化合物
2.1 组成与结构
三萜类化合物是灵芝的另一类重要化学成分。灵芝三萜类成分的种类繁多。1982年, Kutoda首次从灵芝中分离出灵芝酸A、B, 截至目前, 仅从赤芝中发现的灵芝三萜类成分总数就达135种。灵芝中的三萜类成分主要分布在子实体的外周部分, 随子实体成熟度的提高而递增, 有些三萜类化合物很苦, 有些则无苦味, 因品种、培养条件和不同生育阶段其含量有所区别, 苦味的灵芝其三萜类化合物含量一般较高。
灵芝三萜化合物依据分子中所含的碳原子数不同, 可分为C30、C27和C24三大类。灵芝三萜类化合物的侧链有长有短, 有2~10个碳不等, 其类型可划分为24类。灵芝三萜化合物依据结构、官能团不同, 又可以分为灵芝酸 (Ganoderic acid) 、灵芝酸甲酯 (Methyl ganoderate) 、灵芝孢子酸 (Ganosporeric acid) 、赤芝孢子内酯 (Anodsporelactone) 、赤灵酸 (Ganoderenic acid) 、灵赤酸 (Ganolucidic acid) 、灵赤酸甲酯 (Methyl ganolucidate) 、灵芝醇 (Ganoderiol) 、灵芝醛 (Ganoderal) 、赤芝酸 (Epoxyganoderiol、Ganoderol、Lucidenic acid) 、赤芝酸甲酯 (Methyl lucidenate) 、赤芝酮 (Lucidone) 、灵芝内酯 (Ganolactone) 、赤芝醛 (Lucidumol、Lucialdehyde) 等10余种。灵芝三萜类成分的分子量一般为400~600, 化学结构较复杂, 为高度氧化的羊毛甾烷衍生物。Fatmawati[12]等研究表明, C11位的官能团对其药理作用的影响较大, 并且C3、C7和C15位所连接的羟基取代基对醛糖还原酶的抑制作用很重要。
2.2 生物活性
2.2.1 抗肿瘤
灵芝三萜对多种肿瘤细胞的生长和转移都有抑制作用。Tang[13]等研究表明, 赤芝中的灵芝酸T对各种人类癌细胞系呈剂量依赖性的细胞毒性, 而对正常细胞系的毒性低。动物体内实验也表明, 灵芝酸T可以抑制裸鼠人实体肿瘤的生长, 通过诱导细胞凋亡和细胞周期阻滞在G1期, 进而抑制高转移性肺癌细胞增殖。Liu[14]等从灵芝发酵菌丝中分离得到一对位置异构体:灵芝酸Mf和灵芝酸S, 二者介导线粒体细胞凋亡途径。MTT实验结果表明, 二者能够明显的减少人体的多种癌细胞株。
2.2.2 免疫调节
周昌艳[15]等研究表明, 灵芝酸能促使带lewis肺癌的Guinea猪体内IL-2的含量上升, 并提高NK细胞的免疫活性, 具有免疫促进功能。洪介民和黎庆梅[16]研究表明, 灵芝三萜通过促使CD3、CD4亚群细胞表达CD69和HLA-DR, 来促进T淋巴细胞 (CD3细胞) 的活化。
2.2.3 抗炎作用
Ko[17]等从赤芝和松杉灵芝中共分离获得12种三萜类和甾醇类化合物, 其中化合物10通过fMLP/细胞松弛素B (CB) 的刺激, 对大鼠中性粒细胞甲酰基β-葡萄糖醛酸酶的释放有明显的抑制作用。此外, 化合物9还可以保护人类角质形成细胞对紫外线B (UV-B) 的光损伤, 从而可以保护细胞免受光损伤。
2.2.4 抑菌和抗病毒作用
Li[18]等通过液-质联用从黑芝分离获得8种灵芝酸。体外抑菌试验显示, 8种灵芝酸对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和变形杆菌均有明显的抑制作用, 在抗菌制剂应用方面有潜在的药用价值。
3 灵芝蛋白类化合物
3.1 种类和结构
灵芝蛋白质是一类重要的活性物质, 主要包括真菌免疫调节蛋白 (Fungal Immunomodulatory Protein, FIP) 、凝集素、糖蛋白和多肽类等, 它不仅是灵芝生命活动的重要物质, 而且具有的独特免疫原性使其在免疫调节和抗肿瘤等方面具显著效果。
3.1.1 免疫调节蛋白
1989年, Kino等首次从赤芝子实体中分离得到了FIP, 并命名为Ling Zhi-8 (LZ-8或FIP-glu) 。到目前为止, 已分别从赤芝、松杉灵芝 (G.tsugae) 、紫芝 (G.japoncium和G.sinensis) 、小孢灵芝 (G.microsporum) 、金针菇 (Flammulina velutipes) 及草菇 (Volvariella volvacea) 中得到了7种FIPs, 分别为LZ-8 (FIP-glu) 、FIP-gts、FIP-gja (AY987805) 、FIP-gmi、FIP-gsi、FIP-fve和FIP-vvo, 形成了一个新的蛋白质家族———FIPs。到目前为止, 分离出的天然FIPs的分子量约12~13kDa, 110~114个氨基酸残基。
柳永[19]等通过对LZ-8基因cDNA的分子克隆发现, LZ-8基因的转录起始位点上游有两个CCAAT-Box和一个TATA-Box;另外还有一个61bp的内含子。FIPs由110~114个氨基酸组成, 富含天冬氨酸和缬氨酸, 但是没有组氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸, 这一点与很多真菌凝集素很相似。在研究灵芝FIPs氨基酸组成和一级结构的同时, 研究人员也在探究其二级结构和高级结构的特点。Lin[20]等利用酵母双杂交和定点突变的方法发现, 天然有活性的真菌FIPs为非共价结合的同源二聚体, 其N端大约10个氨基酸形成α-螺旋, 该结构对二聚体的形成以及FIPs识别靶细胞表面受体并行使生物学活性至关重要。对松杉灵芝FIP进行研究, 推测其二级结构中富含β结构, 其中包括2个α-螺旋、7个β-折叠和1个β-转角。虽然关于FIPs的基因克隆和结构功能, 国内外学者做了很多相关研究, 但是大多数仍处于实验室研究水平, 尚未见到将FIPs进行临床实验或者实际治疗应用的报道, 因此, FIPs的研究具有广阔的开发空间和更大的挖掘潜力。
3.1.2 灵芝凝集素
迄今在灵芝中分离到的凝集素有5种, 分别为GLL-M、GLL-F、GHA、GAL和G.capense lectin。Peng和Zhang[21]从灵芝G.lucidum菌丝体分离获得凝集素GHA, 分子量126kDa, 含量达97.44%。Ngai和Ng[22]从薄树灵芝 (G.capense) 中发现的凝集素, 其N端的序列与其它凝集素和真菌免疫调节蛋白有着微小的相似。分子量为18kDa, 带有一个亚基, 不含中性糖。张春玉[23]等从树舌灵芝 (G.applanatum) 中分离出了一种新的凝集素GAL (G.ap-planatumlectin) , 其分子量为58kDa左右, 带有4个亚基, 中性糖含量约11.2%。
3.1.3 灵芝糖蛋白
何云庆[24]等从灵芝子实体热水提取物中分离出两种肽多糖, 肽含量分别占26.3%和12.3%, 分子量分别为12.8kDa和14.1kDa。Zhang[25]等从灵芝 (G.lucidum) 子实体中分离出了一种蛋白多糖GLIS, 其碳水化合物与蛋白质摩尔比为11.5∶1.0。
3.2 生物活性
3.2.1 抗肿瘤
Lin[26]等经MTT实验和流式细胞仪检测, 在毕赤酵母中表达的FIP-glu可以通过诱导细胞凋亡抑制人类白血病NB4的表达水平 (32μg·mL-1 FIP-glu可诱导约35%的人类白血病NB4细胞凋亡) , 具有一定的抗癌症活性。Lin[27]等在毕赤酵母中表达的小孢灵芝 (G.microsporum) 免疫调节蛋白GMI在人类肺癌A549细胞中表现出抗肿瘤活性。
3.2.2 免疫调节
Wang[28]等研究表明, FIP-fve表现出促使人外周血淋巴细胞由G1/G0期向S期过渡的促有丝分裂的作用。林忠[29]等研究表明, FIPs的生物活性主要体现在促进小鼠脾淋巴细胞增殖与激活人外周血淋巴细胞, 不同FIPs对不同种源的实验样品起作用, 而且其作用结果有剂量依赖性。
3.2.3 抗氧化
Du[30]等从赤芝中分离获得富硒蛋白 (Se-GL-P) , 其分子量为36.6kDa, 含碳水化合物19.8%。Se-GL-P对羟基自由基与超氧化物阴离子自由基的IC50 (50%inhibition concentration) 分别为10和8.9μmol·L-1。当Se-GL-P达到24.5μmol·L-1时, 两种自由基被完全清除, 而且Se-GL-P对超氧化物阴离子自由基有较高的清除活性。
3.2.4 抑菌和抗病毒作用
Liu[31]等从赤芝菌丝体中分离获得蛋白多糖GLPG, 通过细胞培养检测GLPG对HSV-1和HSV-2的拮抗效果, 结果表明GLPG对滤过性病原体有较好的拮抗性。Wang[32]等从赤芝的子实体中分离出的抗真菌蛋白Ganodermin, 分子量为15kDa, 对尖孢镰刀菌、苹果轮纹病菌和番茄灰霉病菌均具有抗真菌的活性。
4 灵芝其它活性成分
灵芝除了含有多糖、三萜类和蛋白类化学成分以外, 还含有核苷类、甾醇类、生物碱类、微量元素、氢醌类、脑苷类和呋喃衍生物等化学成分。
4.1 核苷类化合物
灵芝中含有嘧啶 (Uracil) 、尿嘧啶核苷 (Uridine) 、腺嘧啶 (Adenine) 、腺嘌呤核苷 (Adenosine) 、灵芝嘌呤 (Ganodepurine) 、腺苷和尿苷等成分。张圣龙[33]等采用Dikma C18HPLC考察尿嘧啶、尿苷、腺嘌呤以及鸟苷等在不同品种灵芝中的含量差异。结果表明, 不同品种的灵芝中4种核苷类成分的含量存在显著差异。
4.2 甾醇类
甾醇类物质是灵芝的主要化学成分之一, 已知从灵芝中分离出的甾醇有近20种, 主要包括灵芝甾酮、麦角甾醇及其衍生物、羊毛甾醇类化合物、胆甾醇类化合物、β-谷甾醇等。甾醇是从灵芝脂溶性分离物中提取的活性物质, 含量比较高, 仅麦角甾醇含量就达3‰左右。Liu[34]等采用HPLC分析发现紫芝含有与赤芝相似的甾醇类, 但不含三萜类, 结果显示赤芝和紫芝都有抗肿瘤增殖作用, 且抗肿瘤作用机制不同, 提示紫芝表现的抗肿瘤作用可能与甾醇类的存在有关, 因此迫切需要研究甾醇类抗肿瘤作用。
4.3 生物碱类
灵芝中生物碱 (Alkaloid) 类主要有胆碱 (Choline) , 甜菜碱 (Betaine) 及其盐酸盐γ-三甲胺基丁酸、硫组胺酸甲基胺盐、灵芝碱甲 (Ganoine) 、灵芝碱乙 (Ganodine) 和烟酸 (Nicotinieacid) 等化合物。灵芝中生物碱含量较低, 但有些具有重要的生理活性。生物碱能降低胆固醇和改善冠状动脉血流量、降低心肌耐氧量、增强心肌和肌体对缺氧的耐受性, 对心脑血管疾病、高血压、高血脂、肝炎和肌无力等有一定的治疗作用。
4.4 微量元素
灵芝中含有多种微量元素, 有锰、镁、钙、铜、锗、锶、锌、铁、铍、硼、铬、镍、钒和钛等。1971年, 日本学者浅井一彦发现灵芝锗含量为800~2 000mg·kg-1, 且具有广谱活性, 开启了合成有机锗化合物研究的热潮。灵芝中的天然有机锗含量高达0.2%左右, 其有机锗的含量是人参的4~6倍, 是枸杞的100倍, 是目前已知天然植物中锗含量最高的。有机锗可用于抗肿瘤、降血压、预防及治疗动脉硬化、降低血液黏稠度、治疗老年痴呆、增强免疫功能、延缓衰老、调节内分泌、抗类风湿关节炎、止痛消炎、治疗骨质疏松和慢性肝炎。
何晋浙[35]等采用电感耦合等离子发射光谱 (ICP-AES) 法, 进行灵芝及其类似品中微量元素的测定, 结果表明, 灵芝及其类似品中含有丰富的矿物元素, 其中具有较高的K、Ca、P、Mg含量和低Na含量, 并含有丰富的微量元素Fe、Zn、Cu、Mn、Ni、Co、Cr元素, 但微量营养元素Se、Ge、Mo和重金属元素Hg含量很低, 灵芝及其类似品中存在的微量As元素应包括无机As和有机As, 微量的As元素对抑制肿瘤可能是有利的。灵芝及其类似品中, 微量元素分布趋势基本相同, 其中黑芝、紫芝、菌种赤芝、1号赤芝表现出更优的营养元素含量分布特征。
此外灵芝中还含有灵芝维生素、纤维素、呋喃类衍生物、脂肪酸类、溶菌酶、油脂类化合物、长链烷烃、香豆精、胡萝卜素、碳水化合物、酸性蛋白酶、虫漆异酶、甘露醇、海藻糖、烟酸和多种矿物质。其中灵芝纤维素具有降胆固醇、预防动脉粥样硬化的作用, 对便秘、糖尿病、高血压、脑血栓等疾病也有一定的治疗效果。
5 展望