抗菌检测（共6篇）
抗菌检测 篇1
海洋是生命的摇篮, 其面积约占地球表面积的71%。目前已知的海洋生物有21万种, 由于海洋环境的特殊性 (高盐、高压、低营养、低温、无光照) , 迫使海洋生物产生一些结构独特并有显著生物活性的代谢产物以适应严酷的环境, 主要活性表现在抗菌、抗病毒、抗凝血、镇痛、抗炎、抗肿瘤和抗心血管疾病等方面。我国海洋资源丰富, 为海洋药物的研究与开发提供了优越的基础[1]。
在我国, 文蛤 (Meretrix meretrix) 是一种天然资源丰富的滩涂贝类, 为沿海主要的滩涂养殖贝类, 是重要的海水增养殖优良品种, 也是主要出口的鲜活水产品之一[2]。其经济价值高、营养丰富、肉质鲜美。文蛤不仅肉质鲜美、营养丰富, 而且具有很高的食疗药用价值。李时珍的《本草纲目》上说, 它能治"疮、疖肿毒, 消积块, 解酒毒"等病。近代研究又表明:文蛤有清热利湿、化痰、散结的功效, 对肝癌有明显的抑制作用, 对哮喘、慢性气管炎、甲状腺肿大、淋巴结核等病也有明显疗效。目前, 国内外学者也开展了文蛤中蛋白质和多糖等活性物质提取和分析的研究工作, 也证实了文蛤中富含肽类等抗肿瘤活性成分。而近年来关于文蛤抗菌肽的研究未见报道。本文以灭活的副溶血弧菌为诱导物进行诱导, 采用大肠杆菌 (Escherichia coli) 作为指示菌, 对文蛤的组织提取物进行抗菌活性测定。可为滩涂贝类抗菌肽基因工程产品 (抗菌药物) 的开发研究提供技术支撑。
1 材料与方法
1.1 材料
试验用文蛤 (Meretrix meretrix) 购于浙江省温州市龙湾区某养殖场, 于沙滤海水中暂养7d后进行诱导试验。副溶血弧菌 (Vibrio parahaemolyticus) , 具有强致病性;大肠杆菌 (Escherichia coli) 为购买的大肠杆菌标准菌株ATCC25922。
1.2 副溶血弧菌诱导物的制备
副溶血弧菌菌株接种于Zobell 2216E斜面, 28℃培养24h, 用0.65%生理盐水洗下菌苔, 加入终浓度为0.3%的甲醛灭活24h后, 用TCBS培养基检测灭活效果。确认彻底灭活后, 用0.65%生理盐水洗3次, 配成终浓度为1×107cfu/ml灭活副溶血弧菌的海水用于诱导。
1.3 诱导
将文蛤浸泡在1×107cfu/ml灭活副溶血弧菌的海水中, 定期采集组织。
1.4 取样
于诱导0、4、8、12和24h后 (分别为对照组、P1、P2、P3和P4组) 取0.50kg的文蛤去壳, 将组织剪碎匀浆, 匀浆液4℃保存。
1.5 抗菌物质的提取
匀浆液中按体积比1:1加入5%乙酸, 4℃搅拌过夜, 次日将混合物于4℃、5000r/min离心30min, 取上清, 4℃保存。将沉淀物用等体积5%乙酸混合, 再次4℃搅拌浸提过夜。重复上述离心过程, 取上清, 合并2次上清液, 调节p H为7.0, 再离心, 弃沉淀, 收集上清液, 即为粗提品, -20℃保存, 部分产物冷冻干燥保存。
1.6 蛋白质含量的测定
采用紫外分光光度法测定蛋白质含量:总蛋白质含量 (mg/ml) =1.45×A280-0.74×A260×稀释倍数。
1.7 硫酸铵沉淀
将冻存的诱导4h制备的粗提物样品取出, 4℃下融化, 滴加等体积饱和硫酸铵溶液使其饱和度达50%, 4℃静置过夜后离心得到沉淀物, 用原1/2体积PBS缓冲液溶解, 并透析除盐。
1.8 抗菌试验
采用微量比浊法[3,4,5], 菌悬液的制备取细菌菌种接于Zobell 2216E液体培养基, 28℃培养16h后, 以Zobell 2216E液基调整菌浓度到104cfu/ml, 备用。取96孔板, 每孔加入10μl抗菌提取物、硫酸铵沉淀产物, 然后每孔中加入90μl菌悬液, 28℃培养12h。同时设置作生长对照和重复。用酶标仪于450nm处, 测定吸光度值。
1.9 Tris-Glycine
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测[6] (1) 制胶:参照宝生物工程 (大连) 有限公司提供的配方, 配制浓缩胶、分离胶的浓度分别为5%和12%, 缓冲体系为Tris-Glycine体系。 (2) 制样:将样品溶于样品缓冲液, 100℃沸水浴5~10min, 5000r/min离心5min, 取上清用微量加样器上样。 (3) 电泳:80V恒压电泳, 当溴酚蓝指示带达到分离胶时, 加大电压至140V。 (4) 染色:取出凝胶, 放入考马斯亮蓝R-250染色液中, 染色1~2h。 (5) 脱色:倾去染色液, 以脱色液覆盖凝胶, 缓慢摇动直至获得蓝色条带及干净的背景。
1.1 0 Sephadex G-50凝胶过滤层析
试验采用Sephadex G-50凝胶柱, 用PBS缓冲液进行平衡。取500μl盐析产物上样, 在280nm紫外下监测洗脱情况。
2 结果
2.1 总蛋白质含量
乙酸抽提所得的粗提品颜色均为淡黄色、透明溶液, 其总蛋白质含量在诱导呈先升高后降低的趋势。
2.2 抗菌活性试验
采用微量比浊法, 以大肠杆菌作指示菌, 根据吸光度值计算生长抑制率IR (%) , IR (%) = (1-A/A0) ×100%, 其中A为实验组的吸光度值, A0为生长对照组的吸光度值。
由表2看出, 文蛤经副溶血弧菌诱导后, 产生的抗菌物质在短时间内达到高峰, 随后逐渐下降, 大约在4 h时抑制率最高。
由表3得知, 文蛤粗提品经硫酸铵沉淀后所得产物均具有抗菌活性, 且其抑制率有不同程度的提高, 说明盐析产物中抗菌物质含量相较粗提品有所升高, 为进一步纯化奠定基础。
2.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果
通过SDS-PAGE电泳图谱1、2比较可知, 粗提品蛋白条带比较多, 经过硫酸铵沉淀后得到的产物条带相对比较清晰, 但仍有杂蛋白存在, 还需要通过其他方法来进一步提纯, 如离子交换、凝胶层析、亲和层析等。
2.4 Sephadex G-50凝胶过滤层析
凝胶过滤层析效果受多种因素影响[7], 采用经4h诱导后制备的盐析组分为上样液比较洗脱流速与样品浓度对Sephadex G-50分离文蛤抗菌蛋白效果的影响。 (1) 不同洗脱流速对Sephadex G-50分离文蛤抗菌蛋白效果的影响。其它层析条件不变的情况下, 本试验选择了4个不同洗脱流速, 0.1ml/min、0.2ml/min、1.0ml/min的分离曲线。当流速为1.0ml/min时, 由于流速过快, 出峰相对较快, 一些小峰不能分开;流速为0.1ml/min时, 虽能到达最好的分离效果, 但由于低流速导致工作效率降低。因此选择0.2ml/min作为最佳洗脱流速。 (2) 不同样品浓度对Sephadex G-50分离文蛤抗菌蛋白效果的影响。在其他层析条件固定的情况下, 选择了1.0mg/ml与3.0mg/ml 2个不同的样品浓度进行分离。样品浓度过低, 如1.0mg/ml, 使洗脱出来的分离组分吸光度降低, 即浓度降低, 影响分离的效率, 并给以后的样品出来带来不便。因此选择3.0mg/ml作为最佳样品浓度。
3 讨论
在贝类的免疫系统中, 除了以通过吞噬作用完成的细胞免疫外, 血淋巴中的溶酶体酶、凝集素、非特异性抗菌肽等体液因子也发挥了重要的防御作用[8,9]。近年来, 双壳贝类的抗菌物质成为研究的一个热点。郭道森等[10]从毛蚶 (Scapharca subcrenata) 血浆中分离的抗菌蛋白对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、四连微球菌具有较强的抑菌活性, 且该抗菌蛋白具有很好的热稳定性, 对胰蛋白酶和蛋白酶K不敏感;Maurice等[11]从贻贝 (Mytilus Edulis) 血液中分离出一类富含半胱氨酸的防御素Mytilin A, 具有抗革兰氏阴性和阳性菌活性, 且能杀灭部分真菌;洪旭光[4]从栉孔扇贝 (Chlamys farreri) 血液纯化出一种全新的抗菌肽 (其分子量为2000Da) , 不仅有抗真菌活性, 还有潜在的抑制肿瘤的作用;Jung-Kil Seo[12]从美国耗 (Crassostrea virginica) 鳃组织中纯化得到cv H2B., 其氨基酸序列被认定为与组蛋白H2B相似, 够抑制包括副溶血弧菌和创伤弧菌在内的革兰氏阴性菌。双壳贝类抗菌物质的研究对利用其以治疗外界微生物入侵引起的疾病有重大的作用。
文蛤生活在滩涂中, 且饲养环境也不是无菌, 故在养殖期间内不可避免有一定的细菌生长, 这可能导致对照与诱导4h时的抗菌物质对大肠杆菌生长的抑制作用无显著差异。至于该抗菌物质是否为饲养环境中的细菌进入文蛤体内后刺激机体免疫系统所产生, 还需要进一步研究。粗提品对大肠杆菌有一定的抑制作用, 副溶血弧菌诱导后大约在4h达到高峰, 随后抑制率逐渐降低;经硫酸铵沉淀后, 通过两次SDS-PAGE电泳对比发现, 纯度有所提高, 也可由两次的抗菌活性试验推断得知。但盐析产物SDS-PAGE电泳显示仍有较多蛋白条带, 还需进一步纯化。
本研究选用了Sephadex G-50Fine, 其分子量分级范围为:球蛋白1500~30000, 初步探讨了洗脱流速和样品浓度对Sephadex G-50分离文蛤抗菌物质效果的影响, 洗脱流速过快无法分开一些小峰样品, 但流速过慢导致工作效率降低;浓度过低易影响分离的效率, 且对后续的样品处理造成不便。另外, 凝胶层析分离效果还与葡聚糖凝胶类型、样品的粘度[7]等有关。本研究工作的开展为后续进行文蛤的活性跟踪, 确定其抗菌活性成分, 发现新的抗菌物质提供了一定的线索。
参考文献
[1]管华诗, 耿美玉, 王长云.21世纪中国海洋药物[J].中国海洋药物, 2000 (4) :44-47.
[2]王如才, 王昭萍.海水贝类养殖学[M].青岛:青岛海洋大学, 1993.
[3]Tommy Baumann, Urs K?mpfer, Stefan Schürch, et al.Ctenidins:antimicrobial glycine-rich peptides from the hemocytes of the spider Cupiennius salei[J].Cell.Mol.Life Sci., 2010, 67 (16) :2787-2798.
[4]洪旭光.皱纹盘鲍和栉孔扇贝抗菌肽的研究[D].青岛:中国海洋大学, 2008.
[5]张铂, 吴梧桐.抗肿瘤文蛤糖肽 (MGP0405) 的分离纯化及性质研究[J].中国天然药物, 2006, 4 (3) :230-233.
[6]郭尧君.蛋白质电泳实验技术[M].北京:科学出版社, 1999.
[7]安春菊, 李德森, 赵素然等.凝胶过滤层析参数对家蝇蛋白粗提液分离效果的影响[J].昆虫学报, 2005, 48 (1) :139-142.
[8]J.Andy Tincu, Steven W.Taylor.Antimicrobial Peptides from Marine Invertebrates[J].Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 2004, 48 (10) :3645-3654.
[9]Mitta G., Hubert F., Vandenbulcke F.Noel T., et al.Myticin, a novel cysteine-rich antimicrobial peptide isolated from haemocytes and plasma of the mussel Mytilus galloprovincialis[J].Eur.J.Biochem., 1999, 265:71-78.
[10]郭道森, 魏玉西, 李丽等.毛蚶血浆中抗菌蛋白的纯化及抗菌活性研究[J].海洋科学, 2005, 29 (3) :25-29.
[11]Maurice Charlet, Serguey Chernysh, HervéPhilippe, et al.Isolation Of Several Cysteine-Rich Antimicrobial Peptides From The Blood Of a Mollusc, Mytilus Edulis[J].The Journal of Biological Chemstry, 1996, 271 (36) :21808-21813.
[12]Jung-Kil Seo, Jeanna Stephenson, J.Myron Crawford, et al.American Oyster, Crassostrea virginica, Expresses a Potent Antibacterial Histone H2B Protein[J].Mar Biotechnol, 2010, 12:543-551.
抗菌检测 篇2
关键词：纳米氧化锌 抗菌性能 抗菌机制
中图分类号：TQ325 文献标识码：A 文章编号：1672-3791（2014）08（a）-0087-01
纳米ZnO是一种宽禁带Ⅱ～Ⅵ化合物半导体材料，是一种新型高功能精细无机材料，粒径在1～100 nm之间，具有规整的六角形纤锌矿结构，本身为白色，稳定性好，高温下不变色，不分解。并且因其特有的表面效应、小尺寸效应和宏观量子隧道效应等，使得纳米ZnO在磁、光、电、敏感等方面具有一般ZnO晶体无法比拟的特殊性能和新用途，在中性环境中无需光照即表现出显著的抗菌性，由于ZnO原料来源丰富，价格低廉，同时锌还是一种人体所必需的矿物元素，纳米ZnO已成为无机抗菌剂研究的热点之一。
1 纳米氧化锌的抗菌性能
段月琴等[1]在单一纳米技术的基础上，将用直接沉淀法制备的纳米ZnO和用其他方法制备的银系抗菌剂等其他材料用不同方法组合后，均匀涂到普通面料上，与普通面料相比，经过纳米复合技术处理的面料对金黄色葡萄球菌、致病性大肠杆菌具有一定的抑制效果。周希萌等[2]采用菌落计数法及纸片扩散法对甲、乙、丙、丁4种纳米ZnO晶须、ZnO复合抗菌材料进行抗菌性能比较。表明4种纳米ZnO晶须复合抗菌材料都具有良好的抗菌性能，并且有一定的抗菌效果，而丙药物的抑菌效果最好，100 ppm丙药物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、巨大芽胞杆菌、枯草杆菌、四联球菌基本达到了100%的抑制效果，并且在体外对病菌也有一定的抑制效果，并随作用时间延长抑制效果也增强。王春阳等[3]将配置好的不同浓度的纳米ZnO抗菌溶液分别在荧光照射、日光照射和无光照射条件下进行杀菌实验，结果表明，在不同光照射下条件下，纳米ZnO均有较强的抗菌性能，在阳光照射下效果更好，且浓度越高，抗菌性越强。另外国内外许多报道称经紫外线照射后，水溶液中的ZnO光催化剂可以产生羟自由基、过氧化氢和超氧化物等物质，这使得ZnO纳米粒子在一些有机物的降解以及对突变的细胞（如肿瘤细胞）产生细胞毒性等方面有潜在的应用。
2 纳米ZnO的抗菌机制
目前关于纳米氧化锌抗菌剂的抗菌机理主要有以下两种观点：一种是光催化抗菌机理；另一种是接触式杀菌机理。
2.1 光催化抗菌机理
由于纳米氧化锌具有较强的光催化能力，经紫外照射的纳米ZnO具有强大的氧化能力，并能降解多种有机化合物。光催化抗菌原理认为，在紫外光照射下，纳米ZnO价带中的电子会激发到导带，形成自由移动的带负电的电子和带正电的空穴，这种空穴与吸附在材料表面的氧气、羟基和水等反应产生氢氧根、氧负离子和过氧化氢等具有还原作用的羟基自由基及活性氧离子。可以激发空气和水中的氧变为活性氧，活性氧具有极强的氧化活性，它们能与多种微生物中的有机物（例如：羟基等）发生反应，破坏细菌细胞的增殖能力，而抑制或杀灭细菌。同时，纳米氧化锌粒径越小，越容易使其周围产生活性氧，而具有较强的抑菌杀菌性能。
2.2 接触式杀菌机理
由于纳米粒子特有的表面效应，容易与所接触的细菌产生亲和力，而具有杀菌能力。接触式杀菌机理也叫金属离子溶出机理认为：ZnO在含水介质中缓慢释放锌离子，锌离子逐渐地游离出来，由于锌离子的氧化还原性，当它和细菌细胞膜相结合时，与其中的有机物发生反应，破坏了膜蛋白的结构，使其失去活性，达到杀菌目的。同时，纳米ZnO表面的空穴会产生电子，直接参与反应，空穴数量越多就会产生更多的电子，其杀菌能力就增加。接触式杀菌机理，首要条件是锌离子与细菌的直接接触，不需要紫外照射，而且当细菌被杀死后，锌离子又会从菌体中游离出来，再与其他细菌接触，完成新的杀菌任务，所以显出很强的杀菌活性。
另外，曲敏丽等[4]利用自制的两种纳米ZnO和普通ZnO对纯棉织物进行抗菌整理和研究，发现纳米ZnO的抗菌机制是光催化和金属离子溶出共同作用的结果，即纳米ZnO的抗菌效果在光照条件下是纳米氧化锌的光催化作用和锌离子溶出两种共同作用的结果，而在无光照条件下时是由于溶出的锌离子发生氧化反应而产生的抗菌效果。
3 结语
总之，纳米ZnO作为一种新型无机功能材料，随着纳米技术的不断成熟，纳米ZnO抗菌剂将由于其热稳定性好、价格低廉、高抗菌性能，将在医疗保健、食品卫生、洗涤剂、化妆品等方面得到广泛的应用。但是对纳米ZnO的抗菌性能产生机理的研究至今仍不成熟，没有统一的定论，需要人们更加努力在提高纳米ZnO的利用率和杀菌率方面的研究。相信随着研究的不断深入，纳米ZnO将有更多的优异性能被发现，并在细菌的抑制或更广阔的领域得到充分的利用，对改善人类生活环境，减少疾病，提高全民生活质量将产生十分重要的作用。
参考文献
[1]段月琴，孙永昌，王玉红，等.纳米复合抗菌面料的研制及其抗菌性能[J].天津冶金，2005（1）：44-45.
[2] 周希萌，张桂贤，艾鑫，等.纳米氧化锌晶须ZnOw抗菌与抗病毒效果的初步研究[J].上海畜牧兽医通讯，2006（2）：16-17.
[3] 王春阳，金珑.纳米ZnO抗菌性能的研究[J].山东农业大学学报：自然科学版，2006，37（1）：39-42.
抗菌检测 篇3
关键词：细菌耐药,抗菌药物,合理应用
我国是世界上滥用抗生素最为严重的国家之一, 耐药菌引起的医院感染人数已占到住院感染患者总人数的30%左右。笔者2009年1月-2011年12月对本院开展感染监测, 旨在了解患者医院感染细菌特点及耐药情况, 为临床合理应用抗生素提供依据。
1对象与方法
1.1 对象
院内细菌耐药监测采集各种空气、物表、医务人员等, 使用的消毒液、灭菌机械等标本2954份, 院内耐药菌收集医院内感染者痰、血、尿、浆液等标本1592份。
1.2 检测方法
1.2.1 细菌培养:
标本按《全国临床检验操作规程》要求常规方法培养鉴定。
1.2.2 药敏实验:
采用自制或外购药敏试纸, 严格按照《全国临床检验操作规程》 (第3版) 进行常规鉴定。以抑菌圈直径大小作为判定敏感度高低的标准, ≥10mm为敏感、<10mm为不敏感[1]。
2结果
2011年共检出2142株细菌, 革兰阳性菌893株, 革兰阴性菌1249株。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的分离率为70.7%, 并发现了耐万古霉素的金黄色葡萄球菌、溶血性葡萄球菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌和屎肠球菌。大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌中超广谱β-内酰胺酶 (ESBLs) 的检出率分别为49.4%、26.9%。产ESBLs株的耐药率明显高于非产ESBLs株。检出对亚胺硫霉素耐药的产ESBLs为大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌。非发酵菌分离率排前3位的是铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、嗜麦芽窄食单胞菌。鲍曼不动杆菌的多重耐药率和泛耐药率达到30.8%。
3讨论
细菌耐药性 (antimicrobial resistance) 又称抗药性, 一般是指病原体对药物反应降低的一种状态, 微生物对抗微生物药物的相对抗性。抗菌药是微生物产生的次级代谢产物, 人类将微生物产生的这种抗菌物质分离提纯或人工仿制制成抗菌药用以杀灭引起感染的微生物, 因此细菌耐药性的产生是微生物的一种天然抗生现象, 只要使用抗菌药, 细菌对这种抗菌药出现耐药就不可避免[2]。
3.1 抗生素滥用的现状 随着现代医学的飞速发展, 抗生素、免疫抑制剂和激素的大量使用, 医院感染呈上升趋势, 据卫生部监测统计, 目前中国的医院感染率在5%左右[3]。临床分离的一些细菌如大肠埃希菌对环丙沙星耐药已居世界首位。有专家预言, 我国可能率先进入“后抗生素时代”。抗生素的不合理使用表现在诸多方面:无指征的预防用药;治疗用药时, 抗菌药物品种、剂量的选择错误、给药途径、给药次数及疗程不合理等。
3.2 抗生素滥用的原因 世界卫生组织调查显示, 我国抗菌药物的使用存在无指征的预防用药;治疗用药时, 抗菌药物品种、剂量的选择错误, 给药途径、给药次数及疗程不合理等。用药率高, 住院患者抗菌药物使用率高达80%, 其中使用广谱抗菌药和联合使用率占58%, 高于30%的国际水平。用药起点高, 无指征使用高档抗菌药物现象严重。抗生素质量检验不完善, 质检中不考虑DNA的含量, 从而导致耐药基因随抗生素的使用而扩散。个体药店和对抗生素管理不严, 非处方药随时随地可以购买, 广大群众对抗生素的使用半知不解, 自取自用现象十分普遍。
从采集标本到得出临床结果一般需2～3d, 有时更长。而这时患者病情已发生变化, 其对患者已失去应有的价值。如未对标本质量进行控制, 检验的是一份不合格标本, 更谈不上病原学检验的临床指导价值, 甚至误导临床进行抗菌治疗, 导致抗生素滥用。
3.3 抗生素滥用的严重后果 滥用耳毒性抗生素 (如:庆大霉素、丁胺卡那霉素、新霉素) 对耳蜗神经造成伤害, 产生听力下降。长期应用抗生素, 会抑制肠内有助于消化的非病源性菌如双歧杆菌的繁殖, 从而导致消化不良、腹泻等。长期大量使用广谱抗菌药物或多种抗菌药物合用易诱发二重感染。二重感染的病原菌主要有真菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、变形杆菌和肺炎杆菌等, 易引起临床尿路感染、肺部感染和消化道感染等, 这些感染菌对抗生素耐药。
3.3 合理使用抗生素的原则
3.3.1 根据指南用药:医院应加强抗生素使用规范化管理, 提高临床医师合理用药的观念, 根据药物指南指导抗生素的使用, 而药物指南应包括本地区或能反映本地区细菌耐药性特性、抗生素剂量、供应情况和临床实际疗效等内容。必须在使用抗生素前, 对感染标本及时进行细菌培养和药敏试验, 在可能情况下应尽量选择窄谱抗生素。敏感的窄谱抗生素既能把病原菌杀灭, 又能把体内有益的微生物保存下来, 以使体内常居菌维持平衡。
理想的抗感染治疗方针应以彻底消除病原菌为目标, 药代动力学 (PK) 和药效动力学 (PD) 通常作为预测病原菌清除和确定及选择抗生素的最好方法[4]。因此, 必须注意最有效的抗生素并非单指那些价格昂贵的广谱抗生素。其负作用是: (1) 对患者无明显疗效, 还具有产生不良反应的危险性; (2) 给患者带来不必要的药物负担及治疗不良反应; (3) 加重感染的危险性; (4) 增加细菌耐药性发展和传播的潜在危险。
3.3.2 根据感染部位、患者的基础疾病和免疫状态选药:各种药物在体内的吸收、分布有各自的特点, 例如:青霉素、头孢菌素、氨基糖苷类在尿液中浓度甚高, 对敏感菌所致的尿路感染, 只要用低剂量就有效。但氨基糖苷类、大环内脂类等不易透过血脑屏障, 则只能用于中枢以外的感染。有青霉素过敏史的患者在用青霉素时必需考虑其免疫状态等。
参考文献
[1]周惠平, 王金良.临床微生物学标本采取和处理的规范化要求[J].中华检验医学杂志, 2000, 23 (5) :312-314.
[2]郑明节.我国细菌耐药性的分布与控制策略研究[D].华中科技大学, 2007:18.
[3]戈瑶.重症监护室医院感染细菌耐药检测与分析[J].中国当代医药, 2010, 17 (26) :72.
抗菌检测 篇4
“千里之行,始于足下”,鞋类是人们必不可少的生活必需品,其作为满足人体生理活动的产品,在人们的日常生活中的重要性是不言而喻的。它不仅可以保护足部免受伤害、便于行走和御寒防冻,更与人体的健康息息相关。
随着科技的发展、人们生活水平的提高和健康意识的增强,对鞋类类产品的功能性等要求也越来越高。
人们对鞋类的需求也逐渐从基本的耐穿到柔软舒适、吸湿透气等要求,现发展到具有防霉抗菌、健康、安全保健等方面。
1 鞋类抗菌性能检测方法和评价体系建立背景
1.1 抗菌性能是鞋类的功能性要求
2011年3月15日至16日,全国制鞋类标准化技术委员会(SAC/TC305)在京召开国际研讨会[1],针对鞋类舒适性,给出的定义为:鞋类舒适性是人们在穿着过程中对鞋类的心理和生理感受的综合评价,是指鞋类符合人足形态结构和功能要求的程度。
鞋类舒适性评价内容主要包括:合脚性、功能性、鞋内环境等。其中鞋类环境明确指出了鞋类的抗菌性能是鞋类舒适性的重要影响因素。
随着人们对鞋类产品需求的变化和提高,以及足部由于菌类引发异味和疾病的日益增多,抗菌鞋和鞋垫等产品应运而生的,这就给鞋类抗菌性能检测方法和评价提出了新的要求。
1.2 鞋类内腔环境特殊,适宜细菌、真菌生长
在人体上的细菌和真菌数量之多令人咂舌,而脚上细菌和真菌的数量在人体中所占比例最大,脚在鞋中环境容易滋生致病细菌和真菌的生长。
这是因为相对于身体其他部位的服装,鞋腔的密闭性最大且空间狭小、鞋材种类较多,结构复杂,不少鞋材的透气性较差,以及足部的大量活动,使得鞋腔内温度经常处于32℃左右。
此外,足部是人体汗腺高度集中的部位,排汗量极大,人脚部拥有超过250000个汗腺,这些汗腺每天都分泌大量的汗液,使得鞋类腔内形成了高湿度的环境。
尤其是在夏天和大量运动后,汗液分泌量剧增,加之如果鞋帮和鞋底材料吸湿透气性差而不能和外界空气进行良好的交换,鞋腔环境就会处于高湿度和高温度。
脚部产生的汗液(无机盐)、皮脂、皮屑、死皮和角质层,这些新陈代谢的废物和鞋类腔环境中的天然鞋材含有的蛋白质纤维和纤维素纤维,正好为细菌真菌的生长繁殖提供了营养。
由于脚所处的鞋腔内环境(温度、湿度和营养)非常有利于微生物如细菌、真菌的繁殖滋生和良好寄居,成为引发足部疾病的重要传播源。这些由微生物引起的足部疾病彻底治愈难,复发率高。
另一方面,鞋子一经穿用,很容易成为细菌和真菌的传播媒介。据调查,公共场所如商场中的衣帽间及保龄球馆、桑拿室提供的鞋类,霉菌污染较为严重。
足部健康直接影响着人们的身心健康。随着人们健康意识的加强,对鞋类的卫生性、舒适性要求越来越高,具有抗菌防霉功能的鞋类产品不仅能满足现代人对舒适性和卫生性的需要,同时也提高了鞋类产品的附加值,拓展了制鞋业的发展空间。
因此,鞋类产品使用抗菌材料尤其是抗真菌材料,已经成为一个新的亮点。
抗菌鞋类产品为缓解足部感染提供了一个可行的途径。现在很多企业也抓住消费者的需求,研究抗菌鞋材用抗菌剂,以期保护人体足部皮肤的健康。
1.3 抗菌功能鞋类及鞋材的研究
目前,许多科研机构、高等院校及企业的研发部门纷纷致力于抗菌材料的研究开发,抗菌剂在鞋靴类产品中的应用已初具规模,市场上抗菌功能鞋类产品也纷纷涌现,具有抗菌功能的鞋类材和鞋类产品近几年来在消费者的追捧下,取得了迅速的发展。
然而,市场上夸大其词等现象也随之而来,目前的抗菌功能鞋类市场非常混乱,众多产品名目不一而足,产品质量良莠不齐。
一些不具有抗真菌功能的鞋类产品也堂而皇之的贴上了抗菌的标签。
导致这种混乱现象的原因在于,鞋类产品抗菌防霉材料是多种多样,抗细菌性能与抗真菌性能混为一谈。
事实上,市面上很多声称抗菌功能鞋类或鞋垫等产品只有单一的抗细菌性,对引起脚气的真菌无抵抗能力。这也是消费者反映穿着抗菌功能鞋效果不明显的原因。
在抗真菌方面,即使鞋类产品声明抗真菌,由于缺乏统一的鞋类抗真菌性能的检测方法,基本上是沿用抗细菌的检测手段,缺乏统一的评价方法与评价标准。
2 鞋类抗菌性能检测和评价体系需求分析
对于抗细菌检测方法,在国际标准中,有ISO 16187《鞋类和鞋类部件抗细菌性能评估试验方法》[2],在国内标准中,有行业标准QB/T 2881《鞋类和鞋类部件抗细菌性能技术条件》[3]。
在抗菌性能方面的研究中,抗细菌的标准研究较早,但关于鞋类抗真菌检测方法及鞋材抗真菌性能评价的现行有效标准却是零。
对于新研发的抗真菌鞋材,其抗真菌性能评价,也仅仅是借用其他行业的抗真菌试验方法,在检测方法和手段上不统一,既影响到新型抗真菌剂和材料的研究开发,又很难对行业的发展助力护航。
目前,抗真菌鞋类市场鱼目混珠,但由于缺少针对性标准,监管部门无法对其进行查处,导致消费者常因无法辨别真假抗真菌制品而受骗,严重的损害了消费者的权益,阻碍了抗真菌鞋类市场的正常发展。
因此,抗真菌性能检测是评价抗菌鞋类材抗菌效果和引领抗菌行业发展的关键因素。
3 鞋类抗菌性能检测方法和评价体系研究进展
3.1 标准体系尚待完善
我国抗细菌检测方法较为完备,但我国及国际抗真菌检测方法及评价体系则需要完善,以适应行业发展。
目前,抗真菌定量评估试验方法已由中国在国际上立项,具体工作由中国皮革和制鞋工业研究院牵头开展,标准编号为ISO/NP2 0 1 5 0[4],同时,国内也会尽快将抗真菌国际标准等同转化为我国标准。
该标准的制定将与已发布实施的QB/T 2881《鞋类和鞋类部件抗细菌性能技术条件》、ISO 16187《鞋类和鞋类部件抗细菌性能评估试验方法》一起,初步建立鞋类类在微生物领域的标准体系。
此外,在未来的鞋类抗菌性能标准体系中,会根据行业需要以及消费者的需求,逐步完成定性抗真菌试验方法评估,与ISO/NP 20150衔接配套。
3.2 抗菌机理研究有待深入
在研究抗菌检测方法和抗菌剂安全评价体系的同时,抗菌(细菌、真菌)机理的研究也是必不可少的,通过先进的检测手段,深入研究抗菌剂对菌的破坏机理,以及对人体正常菌群和细胞的影响,不仅能辅助抗菌材料安全性能评价体系的健全,而且能指导相关行业正确选择和研发抗菌剂。
3.3 抗菌剂安全使用有待规范
这点是体系完善时需要考虑的另外一个方面,抗菌剂使用不当也可能给人体和环境带来一些潜在的安全性隐患。
对于人体而言,不安全的抗菌剂与人脚部接触,会打破皮肤微生态平衡,甚至引发危害。因此,为了保障消费者权益,应对有害抗菌剂的使用加以限制。
抗菌剂安全使用还体现在其对环境的影响上,即抗菌功能鞋类和鞋类部件在丢弃时,不应对环境产生影响,这点也是在探讨抗菌剂安全使用时需要重视的方面。
目前,我国在纺织鞋服等工业产品中使用的防腐剂、抗菌剂,还没有建立统一的监管法规。
欧盟相继出台多部如REACH、BPR等法规,规范生物灭杀剂的使用。
2014年,法国向欧洲委员会施压,要求就禁止多种导致内分泌紊乱的物质发布标准。这些物质包括主要用于皮鞋、衣服及电子产品的抗菌剂。
近期,美国也公开宣布限制纺织品使用抗菌纳米银,逐步开始将抗菌剂的规范使用,纳入鞋类抗菌产品安全技术条件等标准的制定,以保护消费者人身安全[5]。
欧盟BPR法规的实施,将使得活性物质许可和生物杀灭剂产品授权费用变得极其昂贵,不仅会给中国部分出口生物杀灭剂活性成分的化工企业增加额外负担,而且其影响范围将扩大到我国在纺织鞋服数十类产品中使用抗菌剂和防腐剂的出口企业。
所以,建立鞋类抗菌剂安全使用规范(人体和环境),也是鞋类抗菌性能检测方法和抗菌剂安全评价体系应纳入的一个方面。
3.4 评价体系有待持续改进
建立鞋类抗菌性能检测方法和评价体系后,应对其进行定期复审和修订。原因在于制鞋材料发展迅猛,现有的抗菌性能检测评价方法有可能不适合新兴材料的检测。
所以,持续改进是今后完善鞋类抗菌性能检测方法和评价体系的一个工作重点。
4 鞋类抗菌性能检测方法和评价体系框架图
鞋类抗菌性能检测方法和抗菌剂安全评价体系框架图初步构想如图1。
5 结语
抗菌检测 篇5
随着人们生活水平的不断提高,预防疾病的意识也不断的增强,这就引导着各种具有防菌、抗菌性能的材料和商品应运而生。而在日用消费品中占有一定地位的皮革制品(特别是鞋类),其抗菌抑菌性能也逐渐受到关注。由于消费者在皮革制品的穿着和使用当中几乎很少进行专门的清洗,尤其是鞋类产品,使得皮革制品表面污垢的累积和微生物的繁殖问题变得相当严重。所以,在人们追求安全、清洁的高品质生活的今天,抗菌皮革也成为人们逐渐关注的对象[1]。皮革是经脱毛和鞣制等物理、化学加工所得到的已经变性不易腐烂的动物皮,其主要成分是交联蛋白质。在制革过程中所使用的原辅材料许多都包含有蛋白质、糖类、脂肪等营养物质,因此皮革及其制品中含有丰富的能被微生物利用的营养物质,是微生物良好的寄生地。如果外界温度、湿度等条件适宜,微生物就会生长繁殖,严重影响皮革及其制品的质量[2]。因此,抑制和消灭有害微生物的生长繁殖,与人类的健康密切相关。
目前,抑制微生物效果的检测方法很多[3,4,5,6]。但是针对皮革及其制品抗菌性能的评定,国内外都没有制定出确切的评价标准。在皮革工业中,除辜海彬等[7]应用奎因法测定鞋衬里革的抑霉菌性能,以及邓云霞等[8]比较了悬挂法、平板培养基法、籽粒琼脂平板培养基法来评价皮革的抗霉菌效果外,关于皮革及其制品的抗菌效果的检测方法报道较少。
选取合理的方法检测和评价样品的抗菌抑菌性能,既有利于生产厂家和管理部门对产品的监管,也可以为消费者提供较好的保障,且可为开发环保、安全、高效、稳定、广谱的抗菌剂和抗菌产品提供很大的帮助。本文主要参考纺织品及塑料的抗菌性能评价标准,并进行总体评价及评述比较,并针对可溶性产品和不可溶性产品提出了不同的测试方法,以便于选用合适的方法对皮革及其制品的抗菌抑菌性能进行评价。
1抗(抑)菌性能测试方法评述及其在皮革行业中的应用现状
抗菌产品(特别是抗菌纺织品)抗菌抑菌性能的测试方法在国内外研究较早,尤其是美国和日本,并经过多年的研究和发展进行了逐步完善,典型的标准有AATCC 90[9]、AATCC100[10]、AATCC 147[11]、JIS L1902[12]等。西欧发达国家也提出了一些测试方法,但与美国和日本的测试方法大同小异。
多年来,国内的一些研究工作者经过大量探索,卫生部门制定了GB15979-2002《一次性使用卫生用品卫生标准》及《消毒技术规范》,相继又制订了GB/T 21510-2008《纳米无机材料抗菌性能检测方法》、QB/T 2591-2003《抗菌塑料-抗菌性能试验方法和抗菌效果》。而对皮革及其制品相关的抗(抑)菌性能测试方法有QB/T 2881-2007《鞋类衬里和内垫材料抗菌技术条件》。但这远远不能满足我国抗菌产业发展的需要,尤其是皮革行业。
目前,国内外关于抗(抑)菌性能测试的方法虽多,但细加分析,基本上是沿着2条研究思路得出的:一是针对溶出性抗菌产品,因其不与产品化学结合,所以能通过与水接触而被带走,其在培养基上可在样品周围扩散并形成抑菌圈,在抑菌圈内的微生物均会被杀灭并且不再生长[13]。主要方法有GB/T 20944.1-2007(抗菌性能的评价第1部分:琼脂平皿扩散法)、FZ/T 73023-2006(抗菌针织品附录D-抗菌织物测试方法:吸收法;附录E-抗菌物质的溶出性测试方法:晕圈法)、消毒技术规范第二部分(消毒产品检验技术规范-抗菌试验:抑菌环试验、最小抑菌浓度测试试验(营养肉汤稀释法)、浸渍试验)、GB 15979-2002(一次性使用卫生用品卫生标准附录C:溶出性抗菌产品抑菌性能试验方法)等。二是针对非溶出性抗菌产品,其能与样品以化学键结合,耐穿和反复洗涤,且具有缓释性,在其周围不易形成抑菌圈,但是与样品接触的微生物均会被杀灭,微生物在样品上无法存活、繁殖[13]。主要方法有FZ/T 73023-2006(抗菌针织品附录D-抗菌织物测试方法:振荡法)、消毒技术规范第二部分(消毒产品检验技术规范-抗菌试验:最小抑菌浓度测定试验(琼脂稀释法)、振荡烧瓶试验、奎因试验)、GB 15979-2002(一次性使用卫生用品卫生标准附录C:非溶出性抗菌产品抑菌性能试验方法)等。
1.1 溶出性抗菌产品抗(抑)菌性能测试方法及其在皮革行业中的应用现状
1.1.1琼脂平皿扩散法[14]
该方法被邓云霞等[8]用来测试皮革材料及其制品的抗霉菌效果,又被称为籽粒琼脂平板培养法,本试验是测定抗菌产品抗菌抑菌性能的定性试验和评价方法。琼脂平皿扩散法的原理是在平皿内注入2层琼脂培养基,下层为无菌培养基,上层为接种培养基。试样放在2层培养基上,培养一定时间后,根据微生物繁殖与否和抑菌带的宽度,按表1评价每个试样的抗菌效果。
当所有的试样均满足表中“效果好”的要求时,则认为该样品具有抗菌效果。该方法的主要缺陷是:接种菌液中营养过于丰富,与实际的穿着情况不符。
1.1.2晕圈法[15]
晕圈法又称HALO法,AATCC 90试验法的典型代表。邓云霞等[8]用该方法来测试皮革材料及其制品的抗霉菌效果;李慧等[16]用该方法来评价儿童抗菌鞋垫的抗菌性能;王利等[17]用该方法来评价经过抗菌防霉处理的鞋衬里革对细菌的抑菌性能;辜海彬等[7]用该方法评价革制品用抗菌纸的抗菌效果。该方法同琼脂平皿扩散法相类似,区别在于培养基中没有加入一定浓度的菌液,而是将菌液用无菌棉蘸取接种菌液后,直接涂抹在已冷却的琼脂培养基表面,或者吸取0.2mL菌悬液在琼脂培养基上,用无菌涂布器均匀地涂开,使菌液均匀地分布在培养基表面。然后再将试样平贴在培养基上,培养一定时间后,观察菌类繁殖情况和试样周围无菌区的晕圈大小,与对照的试样情况比较。此法一次能处理大量试样,操作较为简单,时间短,适用于溶出性抗菌产品。该方法因其简单快速的优点,在皮革及其制品抗菌抑菌试验中备受人们的喜爱,此法是用于筛选抗菌剂抗菌效力的快速定性的方法。
皮革抗(抑)菌性能测试中,对于溶出性抗菌剂及其产品来说,实验室使用较多的测试方法是晕圈法和琼脂平皿扩散法,相比于其他的方法,这些方法一次能处理大量试样,操作较为简单,时间短。
1.1.3吸收法[18]
本方法参照日本标准JIS L1902及美国纺织化学家和染色家协会标准AATCC 100中的定量试验方法,并做出适当改进,适用于溶出型抗菌产品。将接种菌液接种到放在培养管型瓶中的试样上,培养一定时间后,用冰冷的生理盐水洗下。将洗脱液做适当稀释后,浇注在无菌培养皿内,再加入营养琼脂培养基,摇匀后培养一定时间,用标准平板计数法做活菌培养计数。通过试验样和空白样的活菌数的差别,按下式定量评价试样的抑菌率。
该方法中,用冰冷的生理盐水洗涤试样,在此温度下微生物不活动,既省却了麻烦的中间程序,又能定量评价试样的杀菌性。用经抗菌整理后样品中细菌数量减少的百分率来表示抗菌活性的相对结果,易于理解,也是现在抗菌测试中用得较多的检测标准之一。但由于菌液是用几何级数的方式稀释的,抗菌活性用百分率表示会使样品的抗菌性能高低与最终计算出的百分率不成平行的正比关系[13]。并且由于没有规定评价的基准,所得数据只有在百分比较高(>90或极低时(接近0))才有较好的重现性。
对于溶出性抗菌剂及其产品来说,如需定量测定样品的抗菌性能,以及在消费过程中产生汗液等水分的抗菌加工产品的抗菌性试验,吸收法则是不错的选择。
1.1.4浸渍试验[19]
将试样和对照样品分别放于三角瓶中,用1mL含有肉汤培养基的试验菌悬液接种于试样和对照样品上,经培养后,用100mL缓冲液分别将培养前后试样上的细菌洗下,测定细菌的数量,可计算出试样上细菌减少的百分率。
抑菌率
其中A:试验组试样上的细菌数;
B:“0”接触时间试样上的细菌数;
C:“0”接触时间对照试样上的细菌数。
如果“B”和“C”差别较大时,取较大值;如果“B”和“C”差别不大时,取平均值。当各次试验的抑菌率均≥50%时,即可认定该样品具有抗菌作用。
1.1.5平行条纹法[20]
平行条纹法是对抗菌样品抗菌效力的半定量试验方法,可相对快速和方便地定性测试经抗菌整理的产品的抗菌性能,可用来确定具有可扩散抗菌剂的样品的抗菌能力。该方法是将样品剪成5条条纹,然后将样品垂直平行放于均匀涂有菌液的营养琼脂平板上,并轻轻挤压,使其与琼脂表面紧密接触,在一定温度下培养一段时间。评价标准为:样品条纹的剪断外缘会有一明显抑制区,通过计算抑制区平均宽度评价抗(抑)菌性能。虽然此方法规定了用抑菌区的宽度评价抗菌效果,但是抑制区环域的大小不能作为抗菌活性的定量评价依据。抑菌区域的宽度不能代表抗菌性能的强弱,与抗菌剂的扩散性有关,扩散性强,抑菌区宽,扩散性弱,抑菌区窄。该方法的原理与晕圈法类似,但实际操作却比晕圈法复杂,所以实验室很少采用。
1.2不溶出性抗菌产品抗(抑)菌性能测试方法及其在皮革行业中的应用现状
1.2.1振荡法[21]
本方法参考美国标准ASTME 2149所示震荡烧瓶法,并做出适当改进,其对于试样的吸水性要求不高,粉末状、凹凸不平等任意形状的试样都能应用。
抗菌检测 篇6
目前,由于我国对各类抗菌剂抗菌性能的测定方法与抗菌效果评价标准还不够全面、统一,不能满足国内生产和对外需求,因此,本文从无机、有机、天然三方面,对国内外现有的较权威的抗菌测定方法及评价指标进行系统地对比、研究与总结,以便为更多新型抗菌剂在抗菌测定方法及评价标准的使用提供指导作用。
1 抗菌剂的分类及特点
抗菌剂能够在一定时间内,使微生物的生长或繁殖保持在一定水平之下,可起到抑菌作用。抗菌剂主要分为无机、有机和天然三大类别,其类型与特点见表l。
2 抗菌剂的性能测定
2.1 无机系抗菌剂的抗菌性能测定
2.1.1 定性测定方法
定性测定 方法主要 有国外的AATCC TestMethod90《Halo Test,琼脂平皿 法》、AATCC-30《抗菌剂材料抗霉菌和抗腐烂性能的评定》、JISZ2911-1981《抗微生物性实验法》以及国内的GB/T20944.1-2007《抗菌性能的评价:琼脂扩散法》等[5]。定性测定方法就是简单地在抗菌剂上接种供试菌,一段时间后观察其生长状况。优点是成本低,耗时短;缺点只局限于定性测定,且测定结果也不精确。
2.1.1.1 国外定性测定法
AATCC-90测定法是根据抑菌范围幅度来定性抗菌活性的方法。原理是用含抗菌剂的样品紧贴已接种供试菌的培养基,培养后与对照组比较抑菌圈的大小。此法优点是处理量大,操作简便快速,周期短;不足是无法判定供试菌液浓度,也不能定量评定抗菌活性[6]。
对AATCC-90测定法的改良有AATCC-90喷雾法和AATCC-90比色法。但是这两种方法不适用于无琥珀酸脱氢酶的试验菌。
无机抗菌剂抗菌性能定性测定法还有欧洲的EN ISO 20645-2004《抗菌活性的测定琼脂扩散木片试验》、EN ISO 20743-2007《纺织材料抗菌成品抗菌活性的测定》、EN 14119-2003《织物检验微真菌作用的评价》等。
此外,对含抗菌剂材料抗霉菌和抗腐烂性能的评定方法有JISZ 2911抗霉菌测定法和AATCC-30测定法。JISZ 2911抗霉菌测定法是依据霉菌的长势来判定抗菌剂的抗霉菌性能。AATCC-30是根据抗菌剂对霉菌的耐受度,来评定抗菌剂抗菌性能的有效性[7]。
2.1.1.2 国内定性测定法
GB/T 20944.1-2007《抗菌性能的评价第1部分:琼脂扩散法》,是国内制定的定性测定无机抗菌剂的一种方法。培养皿内下层为无菌培养基,上层为接种培养基,加试样培养,根据细菌繁殖的程度,定性评定试样的抗菌性能[8]。
2.1.2 半定量测定法
无机抗菌剂抗菌性能半定量测定法中应用较多的是平行划线法,可相对快速、方便精确地定性测试抗菌剂的抗菌性能,取代了复杂、耗时的AATCC-100。AATCC-147可半定量分析抗菌剂的抗菌性,事先用供试菌接种液在琼脂平板培养皿中划线,然后将抗菌剂试样滴加于培养皿划线处,用划线周围抑菌区的宽度来表征抗菌剂的抗菌能力。
2.1.3 定量测定法
定量测定 的标准主 要有美国AATCCTestMethod 100《菌数测定法》、ASTME 2149 -2001《固着性抗菌剂抗菌性的动态测试法》,日本JISL19028(1998)《定量测试法》,我国FZ/T 02021-1992《改良的奎因 (Quinn) 测试法》、GB/T 20944.2-2007《抗菌性能的评价第2部分:吸收法》等。定量测定方法较定性法更加科学、准确,不足是周期长、成本高。
2.1.3.1 国外定量测定法
AATCC Test Method 100测定法,能对抗菌剂的抑菌、杀菌效力进行定量地测试。原理是将供试菌分别接种于待测样和对照样,离心并分离出活菌,用平板培养计数法测菌浓度,计算出待测样上菌的减少量[9]。该法的优点是适用于大多数无机抗菌剂试样的性能评价。缺点是处理量小、时间长,菌液营养过于丰富,实验条件苛刻,容器太大,不易操作[10]。
ASTME 2149-2001是一种振荡测试法,在一定液体中接种细菌,对于含抗菌剂试样的吸水性要求不高,对非溶出型和溶出型抗菌材料的测试都非常适用[11]。
日本标准制定研究中心在美国AATCC Test Method 100的基础上,对JISL1902-1990测定法加以改进并完善,提出了JISL1902-8(1998) 测定法[12]。
2.1.3.2 国内定量测定法
FZT 01021-1992( 简称FZ/T法 ) 抗菌剂抗菌性能测定方法,是我国推出的定量测定标准,通过对比待测样菌液前后的变化,来计算菌的减少量。
改良的奎因 (Quine) 测定法,在含抗菌剂的待测物上滴加供试菌液,观察比较菌落变化情况,判断其抗菌性大小[13]。
GB/T 20944.2-2007《抗菌性能评价第2部分:吸收法》是国内制定的一种定量测定方法。将供试菌接种于待测样与对照样,依次淋洗,对洗脱液中的细菌计数并算出其减少率,来评价抗菌能力[14]。
2.2 有机系抗菌剂的抗菌性能测定
2.2.1 有机抗菌剂抗菌性能评价方法
有机抗菌剂抗菌性的评价指标有直接计数法、抑菌率和抑菌圈法。抑菌率和抑菌圈法是常用的评价指标,其中抑菌率是定量指标,公式R/%=(A-B)/A×100%,R为抑菌率;A为对照样品上的平均菌落数;B为抗菌试样平均菌落数。
2.2.2 有机抗菌剂抗菌性能测定方法
2.2.2.1 抑菌圈法
抑菌圈法[15]是检测有机抗菌剂抗菌性的定性方法,抑菌圈的大小可表征抗菌效果的显著。该法是将抗菌剂涂布于特定供试菌的琼脂培养基内成立体状扩散,抗菌剂抑制供试菌繁殖,就会在其周围出现透明圈,通过抑菌圈大小可评价抗菌剂抑菌活性大小。该方法操作简单,但重现性差、准确性不高。
2.2.2.2 贴膜接触抑菌法
该法是测定有机抗菌剂抑菌性的定量方法,能够说明有机抗菌剂的接触抑菌机制和抗菌功能。将待测样与对照样溶于平板培养基,分别滴加供试菌液并覆盖灭菌薄膜,培养一定时间后洗脱菌液,测菌浓度来评价抗菌性能。
此外还有浸渍培养法,适用于表面粗糙的纤维制品和树脂成品中抗菌剂的抗菌性能测定。接触法或包埋法,适合于抗菌材料抗菌性的进一步探究,但不能作为定量检测,且测定时间较长。
2.2.3 抗真 ( 霉 ) 菌的测试方法
2.2.3.1 接触法
与贴膜接 触抑菌法 一致,国际上ISO 846、BS1982Pt.3-90、ASTMG21-96、JISA2911-81、DIN53793等标准都采用此方法。
2.2.3.2 暴露法
是把试样暴露于霉菌生长的场所过后再测试样长霉的情况。国家标准GB 242316-1991、GB/T4768-1995等采用此方法。
2.3 天然生物系抗菌的剂抗菌性能测定
生物抗菌剂抑菌活性测定方法有琼脂扩散法和连续稀释法。琼脂扩散法包括滤纸片扩散法、管碟法、挖沟法和打洞法,其中滤纸片扩散法中抗菌剂在纸片上的装载量小,管碟法和挖沟法对仪器要求较高,打洞法抗菌剂的装载量过大,扩散效果不容易控制,灵敏度较低[16]。一般对天然抗菌剂活性的研究建议采用灵敏度较高的管碟法或挖沟法。
2.3.1 管碟法
管碟法作为法定的生物抗菌剂检定方法,已被各国药典广泛采用。管碟法就是利用有一定体积的不锈钢制的小管(牛津杯),将生物抗菌剂溶液装满小杯,一定时间后,可产生透明抑菌圈。抑菌圈的大小衡量抗菌剂抗菌性能,将已知的抗菌剂标准液先制成标准曲线,比较标准液与待测抗菌剂的抑菌圈大小,就可算出待测抗菌剂的抗菌性能[17]。
2.3.2 平板打洞法
将抗菌剂配成不同浓度的溶液,过滤除菌备用。在无菌条件下,在灭菌过的培养皿内注入相应菌种的固体培养基,制成平板,吸取供试菌悬液到培养平板上。用打孔器在培养基上打出一定直径的孔,每孔加入适量的抗菌剂溶液,以无菌蒸馏水作空白对照。抗菌剂溶液扩散,使其周围的测试菌生长受到抑制而形成透明的抑菌圈[18]。
2.3.3 试管法
将平板打洞方法中刚刚出现阳性效果(有抑菌圈)的抗菌剂,在液体培养基中设置多个浓度梯度;取一定量各菌悬液,分别加入到含有各抗菌剂的液体培养基中,摇匀培养。培养结束后,进行平板的涂抹培养,测其最低抑菌浓度(MIC),判断抑菌能力[19]。
此外还有梯度稀释 - 活菌计数法[20]和滴下法[21]。梯度稀释 - 活菌计数法是将待测样品制成均匀的系列浓度梯度稀释液,再分别加入到抗菌剂药物中,一定时间后,取样进行活菌数计数,从存活的细菌数量计算出抗菌剂对试验菌的致死率,从而判断抗菌剂的杀菌能力。滴下法用于具有吸水性的抗菌剂食品检测。
3 前景与展望
本文从无机、有机、天然三方面,对目前世界上使用较多的抗菌测试方法及评价标准进行了系统的对比、归类与总结,这将对更多新型抗菌剂的研究和开发提供一定的理论基础,在实验方法、评价方法、测试标准等的使用过程中都能给予一定的指导作用。