表面抗菌（共4篇）
表面抗菌 篇1
ZnO作为传统的无机抗菌材料之一,在与细菌接触时,锌离子缓慢释放,能与有机物的羧基和羟基反应,破坏其结构,达到杀菌目的。以银离子为主要添加物质的抗菌剂称为载银无机抗菌剂或银系无机抗菌剂,它的加入使材料抗菌性能有了很大提高,但是银离子化学性质较活波,对光和热较敏感,存在一定程度的变色问题,限制了其在抗菌制品中的应用范围[1]。为了克服变色问题,可以采用进行表面改性的方法,同时还可以改善其在非水介质中的分散性。
1 实验部分
1.1 试剂和仪器
纳米ZnO(贵州)、硝酸银(分析纯),重庆化学试剂总厂;DZKW型电子恒温水浴锅、JJ-1电动搅拌器、SHZ-D(III)水循环式真空泵、ZK-82BB型电热真空干燥箱、超声波分散仪、箱式电阻炉、pHS-25数显pH计、X'Pert HighScoreX射线衍射仪、JEM-100CXⅡ透射电子显微镜、Minolta Co.Ltd.Japan色差仪。
1.2 试样制备
按不同摩尔比称量ZnO与AgNO3,用超声波将纳米ZnO粉体分散在去离子水中,然后边搅拌边加入AgNO3,在温度为40～100℃,pH值为2～6范围内恒温搅拌反应3～5h,用蒸馏水滤洗掉多余的硝酸根离子,在120～150℃下干燥1～2h,放入箱式电阻炉于一定温度下焙烧4h,取出研磨制成复合粉体试样。
1.3 Ag/ZnO复合粉体表面改性
本方法中月桂酸钠的用量为10%～15%,浓度为0.1mol·L-1,pH=5,温度为40℃,反应时间为60min。
1.4 最小抑菌浓度实验
在培养液(MHB或其它)中加入试验粉体,采用2倍稀释法配成不同浓度的悬浊液,在容积为10mL的各悬浊液中接种0.1mL细菌浓度为1.5×105CFU/mL的混合菌液后,在36℃下振荡培养24h,以不含抗菌剂的菌液作参比液,用麦氏比浊管测定参比液与处理液各自的浊度,观察添加抗菌粉体后处理液的浊度变化情况。处理液浊度和参比液浊度相等的体系中,抗菌剂的最小浓度即为最小抑制浓度(MIC)[2]。MIC值越小,表明材料的抗菌性能越好。
1.5 试样色差测试
为了分析载银抗菌材料在使用和加工过程中因见光或加热而引起的变色问题,将其放在125W的高压汞灯下照射1h,采用Minolta Co.Ltd.Japan色差仪来测其色差。
1.6 试样亲油化度测试
将表面改性的Ag/ZnO复合粉体置于50mL水中,加入甲醇,当漂浮于水面上的粉体完全润湿时,记录甲醇的加入量为amL,则亲油化度undefined。
1.7 试样XRD和XPS表征
采用X′Pert HighScore X射线衍射仪,选用Cu Ka辐射,采用定时阶梯扫描方式收集衍射峰型,步宽0.02°,扫描速度0.2°/min。
XPS设备为英国Kratos公司生产的XSAM800多功能表面分析系统,采用ALKα(1486.6eV),X光枪工作在12kV×15mV功率下,分析器采用高倍固定减速比,高分辨模式,谱仪用Au(BEAu4f=84.0eV)和Ag(BEAg3d=368.3eV)标样校正。DS300数据系统被用来收集并处理数据,分析室本底真空6.7×10-7Pa,结合能值用污染碳Cls(BE=284.6eV)校正。
2 结果讨论
2.1 MIC实验结果
各试样对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的MIC值见表1。
从测试结果看出,无论是对金黄色葡萄球菌还是大肠埃希氏菌,Ag/ZnO复合粉体的MIC值都显著小于纳米ZnO的MIC值;但是经过表面改性后,复合粉体的MIC值又会增大。原因是:银离子掺杂可能使纳米ZnO产生晶格缺陷和杂质能级,提高氧化还原能力,同时由于银离子本身具有很强的杀菌能力,在杀菌过程中银离子的缓慢释放会使试样的抗菌性能提高。当进行表面改性后,复合粉体的表面包覆了一层有机物,杀菌过程中银离子不易释放出来,相应地抗菌性能就会下降,而且下降的幅度较大,这更说明了银离子在杀菌过程中起重要作用。由此可见,制备高效银系抗菌材料的关键是要能形成Ag+的有效缓释并尽量暴露于材料表面,本方法Ag/ZnO复合试样中银含量为1.7%。
2.2 表面改性结果和亲油化度结果
改性前后Ag/ZnO复合粉体的色差值见表2。
从测试结果可以看出,用月桂酸钠进行表面改性后,Ag/ZnO复合粉体的色差值显著减小,说明有一部分月桂酸钠包覆在复合粉体表面,改善了由于Ag的掺杂引起的变色问题。
改性前后Ag/ZnO复合粉体的亲油化度测试结果见表3。
从表3可以看出,改性后的Ag/ZnO复合粉体亲油化度有了明显提高,改善了其在非水介质中的分散性。
2.3 XRD结果分析
纳米ZnO和Ag/ZnO粉体的XRD分析见图1。
从XRD测试结果(图1)可以看出,和ZnO白样对比,掺杂后的ZnO还是六方晶系,Ag/ZnO复合粉体试样中并没有出现新的衍射峰,说明Ag含量比较低,它可能在Zn2+的位置上进行了有效掺杂,形成了以ZnO为基质的固溶体。掺杂离子替代晶格离子都会引起晶格畸变,并积累一定的应变能。但分析X射线衍射图谱和数据可知,掺杂银的ZnO纳米粒子的XRD衍射峰位与纯的ZnO纳米粒子基本上是一致的,未掺杂试样的晶胞参数a=3.250,c=5.207;掺杂后试样的晶胞参数为a=3.242,c=5.197,和前者比较稍有减少,这说明Ag+并没有到ZnO晶格中并替代Zn2+形成稳定的固溶体,而可能主要以Ag2O化学态存在。但在相应的XRD图中,并未发现与银对应的氧化物物相,这可能说明了Ag2O以小团簇形式比较均匀地分散在ZnO纳米粒子中,后面会用XPS继续确定Ag/ZnO复合粉体表面银元素的存在化学态。由谢乐公式[4]:d=0.89λ/(βcosθ),式中0.89为谢乐常数,β表示衍射峰半宽高,CuKa的λ为0.154nm,纳米ZnO(100)布拉格角为15.8°,半宽高为0.6215°,计算得平均粒径d100=13nm,同理得d002=12nm。对于Ag/ZnO复合粉体d100=18nm,d002=17nm,可见纳米ZnO和Ag/ZnO复合粉体沿c轴方向和垂直于c轴方向粒径大小几乎相等,说明粒径呈球状,两者的粒径都比较小,具有一定的量子化效应。掺杂Ag后粉体粒径稍有增大,这对提高抗菌性能是不利的,因为粒径越大,表面积越小,表面能也越小,同时也不利于银离子的缓释溶出。但从MIC结果看出,掺杂银后抗菌性能有所提高,这也说明了银的缓释杀菌在Ag/ZnO复合粉体的杀菌过程中起主要作用。图2是改性后的Ag/ZnO复合粉体的XRD图谱,可以看出,在2θ角为20.919°和23.248°时,有新的物相出现,分析可能是一种有机物,说明月桂酸钠在复合粉体表面确实进行了有效包覆。
2.4 XPS结果分析
通过银元素的XPS图谱进一步确定改性前后复合粉体表面银的存在状态,从图3和图4可以看出,改性Ag/ZnO复合粉体表面上银元素的Ag3d5/2的结合能实测值为367.945eV,与未改性试样银元素的Ag3d5/2的结合能367.906eV相比,仅发生了0.039eV的化学位移,在仪器的误差范围内,所以改性前后银元素的存在形式是相同的,从XPS、XAES数据库[5]可知,银元素以一价形式存在,因为Ag2O的结合能为367.8eV,因此推断银以Ag2O的化学态存在于复合粉体表面。同时从测试图片面积以及结果上还可以看出,未改性试样表面银元素含量大于改性以后的银含量,说明月桂酸钠对Ag/ZnO复合试样进行了有效包覆。
3 结 论
(1)采用浸渍法制备了Ag/ZnO纳米复合粉体,并在复合粉体表面包覆一层月桂酸钠来改性Ag/ZnO复合粉体。
(2)通过XRD和XPS对试样进行表征,得出银以Ag2O小团簇形式比较均匀地分散在ZnO纳米粒子中,同时通过改性前后复合粉体表面银含量也说明了月桂酸钠对Ag/ZnO进行了有效包覆。
(3)通过MIC、色差、亲油化度等检测,说明银掺杂后显著提高了抗菌性能,对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的最小抑菌浓度均为75mg·L-1;月桂酸钠改性后对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌的MIC均为400mg·L-1,但色差仅为0.88,和未改性的复合粉体的色差9.85比较,有了很大改善。改性后的亲油化度为54.5%。改性前后的Ag/ZnO复合粉体各有优缺点,我们可以根据不同的使用要求来选择不同的粉体。
参考文献
[1]王维清,冯启明,董发勤.银系抗菌材料及其研究应用现状[J].应用化工,2004,33(4):1-3.
[2]季君晖,史维明.抗菌材料[M].北京:化学工业出版社,2003,19,75-78.
[3]王国宏,李定或.纳米ZnO的表面改性研究[J].湖北师范学院学报,2004,24(1):10-14.
[4]刘粤惠,刘平安.X射线衍射分析原理与应用[M].北京:化学工业出版社,2003,211-213.
[5]Perkin-Elner Corporation.PHI5300Instrument Manual.U.S.A.
表面抗菌 篇2
本研究采用自制的两系列8种含氟阳离子表面活性剂与CTAB、青霉素钠和头孢唑啉钠在4种细菌上进行对照,测试它们的最小抑制浓度,讨论氟碳与碳氢表面活性剂的性能优劣,找出结构与抑菌性能的关系并对机理进行讨论。
1 实验部分
1.1 试剂及仪器
六氟丙烯二聚体(D-2)纯度≥ 99 %,石家庄诚和信化工有限公司;无水碳酸钠、石油醚(60 ℃ ～ 90 ℃)、乙醚、无水乙醇均为国产分析纯;2-二甲氨基乙胺、3-二乙氨基丙胺、溴乙烷、溴代正丁烷、溴代正己烷、溴代正辛烷纯度均> 98%,购自上海阿拉丁试剂有限公司;十六烷基三甲基溴化铵(CTAB),分析纯,济宁化工研究院;注射用青霉素钠、头孢唑啉钠来自于哈药集团制药总厂。
金黄色葡萄球菌、乳酸链球菌、大肠杆菌变形杆菌、枯草芽孢杆菌(实验菌株来自于陕西科技大学生命科学与工程学院)。培养基为牛肉膏0.3 %(质量分数,下同)、蛋白质1.0 %、氯化钠0.5 %,pH 7.0～7.2、其余为蒸馏水。
恒温磁力搅拌器(85-1型),常州国华电器有限公司;循环水真空泵(SHB-C型),郑州杜甫仪器厂;真空干燥箱(DZ-2BC型),天津市泰斯特仪器有限公司;超净工作台(ZHJH-C1109B型),上海智诚分析仪器有限公司;HZQ-Q全温振荡器,哈尔滨东联电子技术开发有限公司;高压灭菌锅LB-50L,江苏江阴市滨江医疗设备厂;电热恒温培养箱,上海国光医化仪器厂;细菌药敏测试板(Corning Incorporated)、MK3型酶标仪,上海热电有限公司。
1.2 表面活性剂的合成
向装有回流冷凝管、恒压滴液漏斗和搅拌磁子的三口瓶中加入无水碳酸钠、无水乙醚、分别加入2-二甲氨基乙胺和3-二乙氨基丙胺,然后缓慢滴加六氟丙烯二聚体(D-2),室温反应一段时间,升温回流。减压蒸馏除去乙醚,用无水乙醇溶解产物,抽滤除去碳酸钠,减压蒸馏除去乙醇,用石油醚反复洗涤产物,真空干燥得到两种红棕色粘稠状化合物,即为N,N-二甲基-N′-(2-三氟甲基-5-五氟乙基)全氟丙烯基乙二胺和N,N-二乙基-N′-(2-三氟甲基-5-五氟乙基)全氟丙烯基丙二胺。然后分别与4种溴代烷烃进行季氨化反应得到两系列8种产物,经石油醚、水洗涤后真空干燥得到产物,结构如图1。
产物分别命名为溴化[N,N-二甲基-N′-乙基-(2-三氟甲基-5-五氟乙基)全氟丙烯基胺乙基]铵(PFDAET)、溴化[N,N-二甲基-N′-正丁基-(2-三氟甲基-5-五氟乙基)全氟丙烯基胺乙基]铵(PFDABU)、溴化[N,N-二甲基-N′-正己基-(2-三氟甲基-5-五氟乙基)全氟丙烯基胺乙基]铵(PFDAHE)、溴化[N,N-二甲基-N′-正辛基-(2-三氟甲基-5-五氟乙基)全氟丙烯基胺乙基]铵(PFDACO),结构如图2。
产物分别命名为溴化[N,N-二乙基-N′-乙基-(2-三氟甲基-5-五氟乙基)全氟丙烯基胺丙基]铵(PFTRET)、溴化[N,N-二乙基-N′-正丁基-(2-三氟甲基-5-五氟乙基)全氟丙烯基胺丙基]铵(PFTRBU)、溴化[N,N-二乙基-N′-正己基-(2-三氟甲基-5-五氟乙基)全氟丙烯基胺丙基]铵(PFTRHE)、溴化[N,N-二乙基-N′-正辛基-(2-三氟甲基-5-五氟乙基)全氟丙烯基胺丙基]铵(PFTRCO)。
1.3 最小抑制浓度测试
1.3.1 抗菌活性实验样品和菌悬液的制备
采用液体培养基稀释法[7]:在细菌药敏测试板上纵向第1孔加入培养液200 μL,横向后9孔加入100 μL培养液。在第1孔加入稀释好的化合物原液2 μL(100 μg/mL)然后混匀吸取100 μL于第2孔,混匀再吸取100 μL于第3孔依次如此稀释至第10孔,剩余100 μL液体弃去。使各管化合物浓度依次为原液浓度的 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512。第2管至第10管化合物浓度依次为50 μg/mL、25 μg/mL、12.5 μg/mL、6.25 μg/mL、3.13 μg/mL、1.56 μg/mL、0.78 μg/mL、0.39 μg/mL、0.20 μg/mL培养液。
把各个测试菌菌种用营养琼脂活化,挑取少许放入5 mL无菌水中,混合均匀配成含菌106个/mL的各种菌悬液。以CTAB、青霉素钠和头孢唑啉钠作为阳性对照CK1、CK2和CK3。
1.3.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定
参照文献[8]把以上制备的各种测试菌菌悬液吸取100 μL,分别加入到含各浓度梯度的化合物培养液孔中,混匀,接种完毕后,细菌药敏测试板加盖,置恒温培养箱中。37 ℃培养24h观察实验结果。试验重复2次。结果通过以下两种方式得到:(1)肉眼观察:在有黑色背景的光源下观察结果,有菌生长的试管呈弥漫型混浊或者底部有沉淀,无菌生长的孔就是该样品的最低抑菌浓度MIC。(2)酶标仪比浊法:用酶标仪(测试波长470 nm ,对照波长690 nm) 分别于接种细菌后24 h测试药敏板各孔A值,比较各含抗菌药物孔A上升值(A药与生长对照孔A上升值(ΔA长) ,若ΔA药/ΔA长比值< 25 % ,表明该孔浓度的抗菌药物已明显抑制细菌生长。比值< 25 %的所有孔中,抗菌药物浓度最低的孔所对应的浓度即为MIC[9]。
2 结果与讨论
2.1 合成产率
第一步反应六氟丙烯二聚体(D-2)分别和2-二甲氨基乙胺、3-二乙氨基丙胺反应,产率分别为54.91 %、56.83 % 。接着与过量的溴代烷烃反应,利用兴士堡实验确定季铵化完全,经纯化后用铁氰化钾法[10]检测产物的产率,季铵化产率均大于97.24 % 。
2.2 最小抑制浓度测试结果
对8种化合物进行最小抑制浓度测定,结果见表1。
2.3 讨论
氟表面活性剂就是以氟碳链替代碳氢链。氟碳链既憎水又憎油且氟原子具有较小的原子半径和较大的电负性,使得碳氟键的键长较短、键能较高,所以氟表面活性剂也有着更好的表面活性、热稳定性和化学稳定性,简而言之就是具有“三高、两憎”的特性[11] 。氟表面活性剂较碳氢表面活性剂有更优异的表面活性,所以仅从更好的表面性能可以推测相类似结构中含氟阳离子表面活性剂较碳氢表面活性剂有更好的抗菌性能。
除PFDACO外PFDA系列对4种常见菌的抑制作用并不强烈。其原因在于季铵盐与N上所连接的烷基链长有关,对于单纯碳氢链来讲C < 10或者C > 16这样的结构对金黄色葡萄球菌的杀灭性能不佳,C=14时效果抗菌性能最好[12]。而PFDACO中N上连接有一个C8H17这样相对较长的碳氢链,并且还连接有C8F11NH5这样较长的碳氟链,故杀菌性能优于其他三种同系季铵盐,有着更低的MIC。
PFTR系列对4种常见菌的抑制作用明显增强,由前述理论可知链长的增加为抗菌性增强的主要因素。但是PFTR主链只比PFDA多出一个C即可使抗菌性明显增强由此现象可以推测C8F11NH5与C9F11NH7是一个分界,超过C8F11NH5这个链长即可使抗菌性明显增强。
通过PFTR组与3个对照组对比发现,PFTR组的抗菌性虽然不如青霉素钠和头孢唑林但却优于类似物CTAB。特别是PFTRHE和PFTRCO,由于这两个物质包含的链长更长所以抗菌性能更优。而CTAB包含较长的链长是一个十六烷基,PFTR系列包含的是一个C8的混杂链,从这里也可以看出,虽然含氟阳离子表面活性剂的抗菌性遵从碳链增加抗菌性能提高的规律,但它并不是在C=10～16之间才存在很好的抗菌性能。也就是说碳氟键的存在会使得抗菌性增强,所以有更低的MIC。
以往季铵盐的抗菌机理有如下结论:Kawabata[13]认为阳离子杀菌剂通过阳离子端所带电荷吸附在细菌表面,通过渗入细胞壁改变细胞壁通透性使细胞破裂,细菌的内容物释放而导致死亡。另外,Cloete[14]报道杀菌剂吸附到菌体表面后,疏水基与亲水基分别深入菌体细胞的类脂层与蛋白质层,导致酶失去活性和蛋白质变性。由于这两种作用的联合效应,使得阳离子表面活性剂有较强的杀菌能力。本研究中,表面活性剂包含一个较长的碳氢链和一个既疏水又疏油的氟碳链,可以看出氟碳链的加入更有效的阻碍细胞膜的半渗透作用使得这类含氟物质更为有效。
3 结论
本研究合成了两系列8种含氟阳离子表面活性剂,以其为原料对四种常见菌进行了最小抑制浓度的测试。与青霉素钠、头孢唑啉钠和十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)进行对照,发现有5种化合物有较好的抗菌活性,其中两种全面优于CTAB。通过分析发现两系列化合物间性能差异同结构的关系,同时还发现氟碳链的加入对抗菌性的提高产生积极作用。为今后新型阳离子表面活性剂的开发提供了参考。
摘要：以六氟丙烯二聚体和2-二甲氨基乙胺、3-二乙氨基丙胺为主要原料合成两系列8种新型含氟阳离子表面活性剂,并对4种常见细菌进行最小抑制浓度(MIC)测试,与十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、青霉素钠、头孢唑啉钠进行对照实验。结果发现其中5种阳离子表面活性剂有较好的抗菌性能,其中两种化合物抑菌性能均优于CTAB.结果表明氟碳链的加入对抗菌性能的提高产生促进作用。
表面抗菌 篇3
氧化锆陶瓷由于具有优良的力学性能和良好的生物相容性,近年来在口腔生物材料领域应用广泛,现已逐渐成为固定义齿修复的主流材料,并且其在口腔种植体和愈合基台等方面的应用逐渐增加[1,2]。由于口腔与外界直接相通,所处的环境复杂,容易受口腔内多种致病菌的影响,而细菌的感染很大程度上决定最终修复的成败。目前许多口腔生物材料通过相关处理,已经具有抗菌或抑菌性能,如软衬基托、抗菌托槽[3]等。然而,关于氧化锆陶瓷抗菌性的研究则鲜有报道。Ou S F等[4]将5%(质量分数)纳米银粉掺入氧化锆陶瓷,虽然起到抗菌作用,但这种方法仅有材料表面的Ag离子释放出来起到抗菌作用,且材料内部银的掺杂对氧化锆的力学性能有一定的影响。因此有必要研究在不破坏氧化锆力学性能的前提下,制备具有抗菌性能的氧化锆陶瓷。
在材料表面涂覆载银二氧化钛薄膜是目前常用的制备抗菌材料的方法。目前二氧化钛薄膜的研究主要是将二氧化钛涂覆于玻璃表面[5],仅有小部分研究将二氧化钛涂覆于钛合金、不锈钢等表面[6,7],未见氧化锆陶瓷表面载银二氧化钛抗菌薄膜制备的报道。
本实验采用溶胶-凝胶(Sol-gel)工艺制备银掺杂二氧化钛溶胶,采用浸渍提拉法在氧化锆表面涂覆载银二氧化钛薄膜,通过SEM和XRD等手段测试其基本特征,并采用抗菌实验和细胞毒性实验表征其抗菌性和细胞毒性,为临床抗菌氧化锆陶瓷的应用提供理论依据和实验支持。
1 实验
1.1 主要原料和试剂
3%(摩尔分数)氧化钇稳定四方氧化锆(3Y-TZP)造粒粉(东方锆业);大肠杆菌(南昌大学第一附属医院检验科提供);固体LB培养基(胰蛋白胨1%、NaCl 1%、酵母提取物0.5%、琼脂1.5%~2%);小鼠成纤维细胞株L-929(中国科学院细胞库);DMEM培养基(Gibico,美国);胎牛血清(全式金,中国);MTT(Sigma,美国);96孔细胞培养板(Corning,美国);二甲基亚砜(DMSO,Sigma)。
1.2 试件制备
将3Y-TZP造粒粉在模具内压成直径15mm、厚3mm的圆柱形试件,经200 MPa冷等静压后于1450 ℃常压烧结保温2h,然后依次用去离子水、无水乙醇超声清洗15min,烘干备用。
取20mL钛酸丁酯,加入5mL冰醋酸及10mL乙醇,磁力搅拌30min,得到溶液A。将5%硝酸银(按银元素占钛酸丁酯的原子百分比计算)溶于6mL去离子水,依次加入柠檬酸钠、3mL HNO3、80mL无水乙醇磁力搅拌15min得溶液B。最后,在连续搅拌下将溶液B缓慢滴加至溶液A中,继续搅拌2h得到载银二氧化钛溶胶。未添加Ag的溶胶制备除B溶液不加硝酸银和柠檬酸钠外,其他步骤相同。采用浸渍提拉法,将氧化锆试件垂直浸入溶胶中静置1 min,以2mm/s的速度浸渍提拉,在空气中自然晾干。将上述试件在管式炉中以2 ℃/min升温至500 ℃,保温2h,随炉冷却。
1.3 性能测试
1.3.1 样品表征
采用扫描电子显微镜(Quanta 200F,FEI公司,荷兰)观察薄膜的表面形貌。采用X射线衍射仪(Advance D8,Bru-ker,德国)分析银掺杂二氧化钛的晶相结构,用铜靶Kα线,广角连续扫描,2θ 为10~90°,步长0.02°,扫描速率4(°)/min。
1.3.2 光催化实验
按照文献[8]报道的方法,将3个相同试件浸入到40mL质量浓度为5mg/L的亚甲基蓝水溶液中,然后在太阳光下照射2h。在不同时间段取部分溶液,由分光光度计测定不同时间段亚甲基蓝溶液在λ=668nm处的吸光度。样品的光催化降解率通过公式η=(A0-A)/A0(A0和A分别为样品的初始吸光峰值和降解后吸光峰值)来计算。
1.3.3 抗菌实验
采用抑菌圈实验比较掺Ag和未掺Ag试件的抗菌性能。将一定浓度大肠杆菌接种至固体LB培养基平板上,将两试件贴附于同一个固体培养基表面,孵箱内37 ℃培养24h。通过测量试件周围抑菌圈的距离评价其抗菌性能。
1.3.4 细胞毒性试验
采用四氮唑盐比色法(MTT法)评价细胞毒性。将涂覆Ag-TiO2薄膜的氧化锆试件和纯氧化锆试件超声清洗,常规消毒。按浸提液体积与试样表面积之比为1mL/cm3的比例加入DMEM培养基,置于37 ℃培养箱中浸提72h,得到材料浸提液。L-929细胞于96孔板24h贴壁生长后,弃培养液,加入材料浸提液,继续培养3天,每天更换浸提液。3天后将细胞置于倒置显微镜下观察细胞形态并拍照,然后向各孔中加入20μL新鲜配制的MTT溶液(5mg/mL),放入培养箱中继续培养4h后终止培养,吸出上清液后用PBS清洗2遍,然后每孔加入150μL DMEM,置于摇床上低速振荡10min,使紫色结晶物充分溶解,在酶联免疫检测仪上于490nm处测量各孔的吸光度值(A值),并通过A值计算细胞相对增殖度(RGR)。
2 结果与讨论
2.1 薄膜形貌分析
图1为3Y-TZP陶瓷、TiO2薄膜和Ag-TiO2薄膜表面的SEM图。图1(b)、(c)显示涂覆TiO2和Ag-TiO2的氧化锆陶瓷表面可见一层均匀分布的薄膜,有少量凹坑状缺陷;由图1(a)可知,由于氧化锆试件未经抛光,表面有少量缺陷,造成薄膜出现凹坑状缺陷。与TiO2薄膜不同,Ag-TiO2薄膜表面可见散在分布的点状白色颗粒。Sun S Q等[9]在抛光瓷砖表面制备Ag-TiO2薄膜,证实表面点状颗粒为嵌入TiO2薄膜的Ag,本实验结果与之相同。Ag-TiO2薄膜的EDS结果(图2)显示只能测到Zr、Ti、O三种元素,经计算TiO2的摩尔分数仅为6.9%,电镜显示表面均匀附着一层薄膜,可见薄膜的厚度较薄,大部分电子束穿透薄膜探测到Zr元素,未见Ag元素出现,可能是银的量相对较少,相应的峰太弱。
2.2 X衍射分析
图3为TiO2和Ag-TiO2溶胶粉末在500 ℃ 煅烧后的XRD谱图。两种样品均在2θ为25.3°、37.8°、47.8°、53.9°和55.3°处出现了较强的衍射峰,与标准卡片对照可确定为锐钛矿TiO2。采用Scherrer公式计算得到TiO2和Ag-TiO2粉末平均晶粒尺寸分别为15.4nm和13.4nm。掺杂后TiO2的粒径减小,且Ag-TiO2的衍射峰强较弱,结晶不完善,可见Ag的掺杂对TiO2晶粒长大有抑制作用[10]。Ag-TiO2的衍射图谱中未见Ag元素的衍射峰,可能是由于银的掺杂量较少,或Ag进入TiO2的晶格,均匀地分散在TiO2晶格中与之形成固溶体[11]。
2.3 可见光催化性能研究
TiO2和Ag-TiO2薄膜在太阳光照射下对亚甲基蓝在不同时间段的降解率如图4所示。由图4可见,随着光照时间的延长,TiO2和Ag-TiO2薄膜都使亚甲基蓝有不同程度的降解。与未掺杂Ag相比,Ag-TiO2薄膜对亚甲基蓝具有更强的降解效果,在光照2h后降解率达到(43.6±1.2)%。这是由于银离子的掺入有利于形成中间能级,可供较低能量的跃迁电子停留,从而利用波长较长的光线,或者银以单质形式负载在TiO2的表面形成肖特基结,使其在可见光下也具有较好的光催化性能[12,13]。
2.4 抗菌性研究
图5为TiO2和Ag-TiO2薄膜抑菌圈实验结果。目前陶瓷常用的抗菌性能的检测方法是贴膜法,然而贴膜法需将各个试件单独测试,实验过程中混合均匀度、稀释倍数等人为因素影响较多。抑菌圈法可避免上述缺点,将各试件在相同条件下测试抗菌性能,可直观地比较抗菌性能。结果显示,单一TiO2基本上不具有抗菌性能,这是因为抗菌测试在黑暗的培养箱内进行,全部过程没有外界光源,不能发挥催化杀菌的作用。Ag-TiO2试件周围可见圆形抑菌圈,抑菌距离约为4.5mm,这说明掺入薄膜中的银以Ag+的形式缓慢释放出来起到杀菌的作用[14]。
2.5 细胞毒性分析
图6为氧化锆陶瓷和涂覆Ag-TiO2薄膜的氧化锆陶瓷的浸提液培养L-929细胞的倒置显微镜照片。由图6可见,Ag-TiO2薄膜组细胞生长良好,形态正常,呈梭形或不规则多角形,排列密集规则,可见较多分裂像,未见细胞碎片或细胞浓缩等死亡迹象。通过吸光度值(A值)计算Ag-TiO2薄膜的细胞相对增殖率为(87.3±1.6)%,细胞毒性为Ⅰ级,符合口腔生物材料应用标准。
3 结论
(1)采用Sol-gel法制备载银二氧化钛溶胶,采用浸渍提拉法可在氧化锆表面制备一层均匀的Ag-TiO2薄膜,薄膜表面可见散在分布的Ag颗粒。
(2)经500 ℃煅烧后溶胶颗粒为锐钛矿TiO2,平均晶粒尺寸为13.4nm,Ag的掺杂可抑制TiO2的晶粒生长。
(3)Ag掺杂增加了TiO2薄膜的光催化活性,在太阳光下2h后亚甲基蓝降解率达到(43.6±1.2)%。
(4)Ag-TiO2薄膜在无光照条件下具有良好的抗菌性能,抑菌距离达到4.5 mm;细胞相对增殖率为(87.3±1.6)%,细胞毒性为Ⅰ级,符合口腔生物材料应用标准。
摘要：采用Sol-Gel法制备5%(原子分数)银掺杂二氧化钛溶胶,并采用浸渍提拉法将其涂覆于氧化锆表面。利用X射线衍射(XRD)、扫描电镜(SEM)等研究手段测试薄膜性能,采用抑菌圈实验和MTT实验评价其抗菌性和细胞毒性。结果表明:采用浸渍提拉法可在氧化锆表面制备一层均匀的Ag-TiO2薄膜,薄膜表面可见散在分布的Ag颗粒;经500℃煅烧后为锐钛矿TiO2,Ag掺杂可抑制TiO2晶粒的生长,并增加了TiO2薄膜的光催化活性;该薄膜在无光照条件下具有良好的抗菌性能,抑菌距离达到4.5mm左右;细胞毒性为Ⅰ级,符合口腔生物材料的应用标准。
表面抗菌 篇4
钛合金虽然具有良好的生物相容性,但其自身并不具有抗菌性,将其植入口腔后会导致细菌生长[2],而植入体的感染不仅会造成植入失败,还会给病人造成极大的痛苦与不幸[3]。鉴于此,作为牙科植入体的钛基材料其表面应既具有抗菌活性又具有良好的生物相容性。本实验通过使用电化学方法在不同电解质溶液中对纯钛表面进行改性,研究了改性后纯钛表面的抗菌活性及生物相容性。
1 实验
1.1 纯钛电化学表面改性处理
采用如图1所示的装置对纯钛进行电化学表面改性处理。电解液分别为一定浓度的氯化钠、氯化钾、氯化镁、乙酸钾和硫酸镁溶液。以5mm×10mm×1mm的不锈钢为阴极,10mm×10mm×1mm的JIS2级钛板(日本)经细致抛光和蒸馏水超声波彻底洗净干燥后作为阳极。直流电源输出电流为1A,处理时间为10s。采用昭和大学齿科部齿科理工学教研室最新制作的氯放电处理装置,钛钢样本会炽热放电(Glow discharge)[4],同时与电解质发生化学反应。
采用日立S-2360N 扫描电镜对电化学处理后的试样表面进行观察,采用日本SHIMADZU 600 X射线衍射仪鉴定试样的相结构。
1.2 电化学表面处理后试样的抗菌性
将Mc Farland 实验细菌5μL置于玻片上,再盖上聚丙烯薄膜,于37℃分别培养0h、1h、3h、5h,然后使用Todd Hewitt 培养基,在10% H2+10% CO2+80% N2于37℃条件下孵化48～72h。实验细菌包括所有的口腔细菌,如变形链球菌、唾液链球菌、表兄链球菌、粘性放线菌、伴放线放线杆菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans)、黄褐二氧化碳嗜纤维菌、牙龈卟啉菌等。
试样的抗菌活性主要通过观察未经电化学改性处理(对照组)与经过改性处理(实验组)的钛板孵化后S突变体(S.mutans)的量、菌落形成及抗菌时限来评价。
1.3 电化学表面处理后试样的生物相容性
生物相容性检验是在试样表面培养造骨细胞(MC3T3-E1,日本理研细胞库)和纤维母细胞(L929,日本理研细胞库),用细胞计数器(日本 Dojindo)观察细胞附着、繁殖和计算细胞数,并用异硫氰酸荧光素(FITC)标记观察细胞结合蛋白吸收来评价钛样本的生物相容性。
2 结果与分析
2.1 纯钛经电化学表面处理后的表征
图2为纯钛在NaCl电解液中经电化学表面改性后的SEM照片。由图2可知,试样表面变得更加粗糙,并且出现了许多白色的反应产物。
图3为纯钛在NaCl电解液中经电化学表面改性后试样的XRD图谱,图中出现了TiO、TiO2、TiCl3和Ti等相。
2.2 试样的抗菌活性
图4为纯钛在NaCl电解液中电化学表面改性前后经3h培养后的抗菌活性。由图4可知,改性后(图4(a))的培养皿中无菌落生长,试样表现出良好的抗菌活性。纯钛经KCl和MgCl2电化学改性后细菌培养的结果与图4(a)类似。未改性纯钛(图4(b))的培养皿中细菌菌落满视野,且有大量细菌变种出现。纯钛经Na2SO4、CH3COOK或MgSO4电化学改性处理后细菌培养的结果与图4(b)类似。
图5为纯钛在不同浓度的NaCl电解液中电化学表面改性后经不同时间培养后的抗菌活性。由图5可知,经不同浓度的NaCl电解液处理后,试样的细菌数均明显减少,且经1.0mol/L NaCl电解液处理过的试样具有最好的抗菌活性。
2.3 试样的生物相容性
图6为纯钛在NaCl电解液中经电化学表面改性后进行细胞培养的结果。与对照组相比,造骨细胞和纤维母细胞在经改性处理后的纯钛表面上培养1周后的细胞数均比未经改性处理过的对照样本多。
图7为纯钛在NaCl电解液中经电化学表面改性后用荧光素标记观察到的细胞结合蛋白吸收照片,与对照组相比,造骨细胞(MC3T3-E1)和纤维母细胞(L929)黏附在试样表面并在表面扩展,局部形成牢固的黏着斑。图7(c)显示经电化学处理Ti表面有更多的蛋白吸收,而对照组试样则无应力纤维生成,细胞黏附也较松散。
3 讨论
将作为牙科种植体的纯钛及其合金植入口腔后,种植体不仅会与骨组织接触,同时还会与软组织接触。为保证种植成功,要求种植体表面具有良好的抗菌活性和细胞兼容性。而种植体表面抗菌活性的高低和细胞兼容性的好坏又与植入体的表面状况密切相关,即植入体的表面状况对植入部位的创伤愈合具有重要影响[5]。
纯钛在含有氯化物的电解液中经电化学表面改性后,其表面变得凹凸不平,更加粗糙,而植入体表面的粗糙度与其在骨组织内的骨整合有关[6,7,8,9,10]。这种粗糙的结构比光滑的表面更有利于细胞在其表面粘附,促进骨整合。
纯钛在含有氯化物的电解液中经电化学表面改性后,其表面生成了TiO、TiO2以及TiCl3。细菌、细胞培养实验表明,含有TiO、TiO2和TiCl3的表面较对照组具有更好的抗菌活性和细胞兼容性,说明TiO、TiO2和TiCl3的存在对于提高试样表面的抗菌活性以及细胞相容性起到了重要作用。而纯钛在不含氯化物的电解液(如Na2SO4、CH3COOK和MgSO4)中虽然也进行了电化学表面改性处理,但所得试样的抗菌活性却较差,说明TiCl3的存在对试样表面的抗菌活性可能具有特别的作用。文献[11]的研究证实钛板在含卤素的溶液(如NaCl、NaF和KI)中经电化学氧化处理后均具有一定的抗菌活性,尤以经NaCl处理后的试样的抗菌作用最强,进一步表明Ti-Cl化合物的存在对试样的抗菌活性具有重要作用。
4 结论
纯钛在含有氯化物的电解液中经电化学表面改性处理后,其表面变得更加粗糙,并且有TiO、TiO2和TiCl3等相生成。粗糙的表面结构有利于细胞的粘附,可促进骨整合。TiO、TiO2和TiCl3等的存在对提高试样的抗菌活性以及细胞相容性具有重要作用,尤其是TiCl3对抗菌活性具有明显的促进作用。
摘要：在含不同电解质的电解液中利用电化学方法对纯钛进行表面改性,并将改性后的纯钛试样进行抗菌性和生物相容性实验。结果表明,纯钛在含氯化物的电解液中经表面改性后具有良好的抗菌活性和生物相容性,而在非氯化物的电解液中经表面改性后其抗菌活性和生物相容性则较差。
关键词：纯钛,电化学,表面改性,抗菌活性,生物相容性
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