大豆活性肽（精选4篇）
大豆活性肽 篇1
大豆肽, 是指大豆蛋白质经微生物发酵间接处理或蛋白酶直接作用后, 再经过分离和精制等处理得到的低聚肽混合物, 通常由3~6个氨基酸组成, 其中还包括一些游离氨基酸、少量糖类、水分和灰分等。与传统大豆蛋白相比, 大豆肽由于分子量小而具有很高的水溶性, 更易消化吸收, 能够迅速给肌体提供能量, 具有无蛋白变性, 无豆腥味, 易溶于水, 酸性条件下不产生沉淀, 溶液黏度低, 受热不凝固等特性;另外研究还表明, 大豆肽是一种活性肽, 具有独特的生理功能, 如降血压、降胆固醇、抗肥胖、抗氧化和抗疲劳等。
1 大豆肽的营养价值
1.1 易吸收性
传统的蛋白质代谢模型认为, 人体摄入的蛋白质通过消化道中的多种蛋白酶完全水解后, 最终是以氨基酸的形态被机体吸收。随着科学研究的发展, 直到1968年有研究表明, 2~3个氨基酸组成的低肽有比游离氨基酸更佳的吸收性能。这一发现引起人们对低肽营养特性的关注。
在合成肽试验中发现, 二肽和三肽吸收速率比同一组成氨基酸迅速。表明了肽类比氨基酸可以更容易、更快的被机体吸收利用, 具有较高的吸收速度和吸收率。用摘出的老鼠小肠进行反转小肠试验和小肠灌注流试验证实, 存在的肽类可由肠管直接吸收。对比试验与肽类同位素标记活体也证实了小肽的肠管吸收率最高, 大豆肽在人体内大部分也是以肽的形式直接吸收的。郭婕、王爱华等人通过小鼠急性毒性试验、Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠精子畸形试验、大鼠30d喂养试验, 在试验的条件下, 证实了大豆肽为无毒物质, 未显示有遗传毒性和亚急性毒性作用。
因此, 利用大豆肽的易吸收性, 可将其作为肠道营养剂和流态食品给那些不能摄入常规食品的人提供完全或增补的营养或给那些有特殊生理和营养需求的病人提供特殊营养。
1.2 氨基酸均衡
大豆蛋白质是植物蛋白中唯一能符合FAO/WHO/UNU1985年制定的标准中满足2~5岁儿童必须氨基酸需要的优质蛋白质。大豆肽是大豆蛋白的水解产物, 它的氨基酸组成几乎完全与大豆蛋白质一样, 含有8种人体必需氨基酸, 除蛋氨酸为限制氨基酸外, 其他氨基酸均超过或接近世界卫生组织 (WHO) 推荐标准, 因此具有较高营养价值。
2 大豆肽的生理活性功能
2.1 抗疲劳
疲劳是机体复杂的生理生化变化过程, 是人体脑力或体力活动到一定阶段时必然出现的一种正常生理现象, 它标志着机体原有工作能力的暂时下降, 又可能是机体发展到伤病状态的一个先兆。
为了提高人体的抗疲劳能力, 进而开展了有关抗疲劳肽的研究。抗疲劳肽主要是由2~10个氨基酸形成的直链寡肽, 这种小分子活性肽比蛋白质和氨基酸更易被消化吸收, 它以完整的形式直接进入小肠, 被小肠吸收;进入人体循环系统, 将自身营养和能量供给全身, 可以为某些特殊身体状况的人群, 如竞技运动员、脑力劳动者、野外工作者快速补充营养, 因而补充水解蛋白肽可明显提高人体工作能力, 增强运动员的肌肉力量, 抑制或缩短因运动而引起的体内“负氮平衡”的副作用, 维持或促进体内正常蛋白质的合成, 并能够抑制自由基、金属离子等催化的脂类氧化, 减轻或延缓由运动引起的其他生理改变, 从而达到抗疲劳的作用。
另一方面, 机体疲劳时肌细胞受破坏, 血液中肌红蛋白数量增加。若血液中肌红蛋白数量减少, 则意味着疲劳的恢复。日本有研究表明, 让运动员20km竞走后饮服20g大豆肽饮料, 发现饮服大豆肽的运动员其血清中肌红蛋白值减少的速度比未饮服的快。
胡可心、陈光等人通过小鼠负重游泳试验发现, 给有大豆肽的小鼠坚持游泳的时间比没有给大豆肽的长, 并且还与其注射的剂量有关, 高剂量的长于低剂量。结果表明, 大豆肽具有使动物恢复疲劳及提高耐力的作用。
Dragan等人发现大豆水解蛋白可提高耐力运动员的血色素水平, 抑制血清肌酸激酶水平;并且提出, 大豆肽在保护细胞膜、减少肌细胞内肌酸激酶外渗, 以及促进运动后骨骼肌损伤组织的修复方面有一定作用。抗疲劳肽可通过抑制重链肌球蛋白的降解、钙激活蛋白酶介导的蛋白水解, 来防止运动引起的骨骼肌蛋白降解。
有研究表明, 抗疲劳肽的抗疲劳机理是:抗疲劳肽在肌肉组织中氧化脱氨, 一方面生成相应的α-酮酸进入三羧酸循环氧化供能;另一方面, 脱下来的氨基与丙酮酸或谷氨酸偶联, 形成丙氨酸和谷氨酸酰胺, 提供能量。由于肽易于被吸收、迅速利用, 在特殊的应急情况下, 可直接向肌肉供能;尤其是在运动前和运动中添加肽, 可减少肌蛋白降解, 维持体内正常蛋白质合成。因此, 抗疲劳肽可减轻或延缓机体由运动引发的其他生理方面的改变。
2.2 降低血压
高血压病是一种常见的多发病, 由于高血压病是引起冠心病、心肌梗塞、脑萃中和肾功能衰竭的主要原因, 因此已成为一个十分严重的社会公共卫生问题, 引起人们的重视。血压的调节与血管紧张素转换酶 (ACE) 有密切的关系。ACE可以催化血管紧张素I (Ang I) 转换为血管收缩剂血管紧张素II (Ang II) , 同时降解血管扩张剂舒缓激肽, 使之失活, 从而导致血压的升高。
从大豆肽混合物中可分离出Ala-Arg-Pro-Ala-Lys, Leu-Pro-Leu-Arg-Phe-Ala-Val-Pro-Tyr-Pro-Gln-Arg, Tyr-Gly-Leu-Pro-Pro-Arg-Pro-Lys-Ile-Pro-Pro, LeuLys-Tyr几种短肽, 这些肽能够抑制血管紧张素酶ACE的活性, 从而抑制了血管平滑肌的收缩, 抵抗高血压的产生。因此, 大豆肽也具有降低血压的功能。
刘健敏对肽结构与ACE抑制活性关系的研究发现, C末端是Pro、Phe、Tyr或序列中含有疏水性氨基酸是维持高ACE抑制活性所必需的。此外还有研究结果表明, 具有ACE抑制活性的肽主要集中在相对分子质量较小的组分。
Chen J R等人把大豆蛋白的消化产物经过多次色谱分离, 鉴定出4种生物活性肽, 用这些肽以2.0g/kg BW的剂量去喂养SHR大鼠 (自发性高血压大鼠) , 能显著降低SHR大鼠的血压, 但是, 这些肽对血压正常的大鼠没有降压作用。由于有这些优点, 大豆肽可作为一种安全可靠有效的降压保健品, 用于心血管疾病的患者。
2.3 抑制胆固醇
1999年10月26日, 美国药物与食品管理局 (FDA) 对“每日摄取大豆蛋白25g可降低血液中的胆固醇含量, 有效预防心血管病”的保健功能性标志 (Soy Protein Health Claim) 正式认可, 大豆食品中只要含有6.25g大豆蛋白, 就可以标注为“心血管保健品”。
大豆蛋白质具有降低血清胆固醇的作用, 大豆肽是大豆蛋白质的水解产物, 它不仅具有这样的功能, 而且效果更佳。胡可心、陈光对大白鼠进行降血脂试验, 结果表明:高剂量的大豆蛋白消化液对大鼠血清甘油三酯具有明显的降低作用。其作用机制认为是大豆蛋白消化物的疏水性与胆汁酸的结合呈正相关, 大豆蛋白肽能刺激甲状腺激素的分泌增加、促进胆固醇的胆汁酸化, 从而使粪便排泄胆固醇量增加。
Satoshi Nagaoka等人在进行体外试验时, 首次发现SPH (Soyprotein Peptic Hydrolyzate) 能显著降低胆固醇微粒体的溶解性, 且结合胆汁酸的能力较强, 抑制了CaCo-2细胞对胆固醇的吸收。
刘忆梅和陈朝晖通过动物试验, 发现灌胃大豆蛋白肽5~15mg/kg·d时, 能显著降低高血脂症大鼠中血清胆固醇和甘油三酯含量, 与高脂组相比具有显著性差异 (p<0.01) 。大豆蛋白肽降低血清胆固醇的效应, 主要表现在升高高密度脂蛋白胆固醇 (HDL-C) , 而对低密度脂蛋白胆固醇有降低作用。
由此可得, 大豆蛋白肽降低血清胆固醇具有其独特的特点:对于胆固醇正常的人无降低作用;对高胆固醇者有明显的降低作用, 并且是对人体有害的低密度胆固醇值降低, 而对有益的高密度胆固醇值不降低;对于胆固醇正常的人, 当他们在食用高胆固醇含量的蛋、肉和动物内脏时, 也有防止血清胆固醇升高的作用。
2.4 促进脂肪代谢
大豆肽不仅能够阻碍脂肪的吸收, 并且还可以促进脂质代谢。一般的减肥方法主要是通过低能膳食的摄入, 适当增加运动量, 促进贮藏脂肪消耗;这种方法虽可以减肥, 但使许多肌肉组织也同时丧失, 导致减肥者体质下降。食入大豆肽既可减肥又能使体内的氮保持平衡, 不致使减肥者身体受到损害。
小松等人给小儿肥胖患者食用大豆肽后发现, 大豆肽可减少皮下脂肪和增加饮食诱导产热, 并且还与基础代谢的提高有一定的关联。伏木等人给经游泳负荷小白鼠服用5%大豆肽饮用水, 发现比饮用自来水小鼠体内脂肪量明显减小, 而运动能力明显增强。除此之外, 大豆肽还能够激活产生热能的褐色脂肪组织 (BAT) , 提高甲状腺素在血液中的浓度, 从而提高基础代谢水平。
正是由于大豆蛋白肽具有促进脂肪、能量代谢的作用, 并能抑制体内脂肪的储存, 再加上大豆蛋白的降糖效果, 因此长期食用大豆蛋白肽能有效地控制体重的增加, 起到很好的预防肥胖、减肥的作用。
2.5 抗氧化性
大豆蛋白具有抗氧化性, 水解成肽后具有抗氧化作用的基团充分暴露出来, 所以大豆肽具有更好的抗氧化作用, 它可以在人体内能捕捉和消除自由基、甲氧基和氧化物, 且随着含量的提高抗氧化能力有所提高。
有研究结果表明, 大豆肽对脂质体系、非脂质体系、酶系统、非酶系统、体外试验均有显著的抗氧化作用, 推测其可对肝细胞、肝线粒体脂质过氧化和红细胞的自氧化损伤有一定保护作用。更进一步的研究表明, 肽结构与抗氧化性高低有密切关系。周媛媛, 周瑞宝对Protamex蛋白酶水解制得的大豆肽用Rancimat测定其抗氧化活性, 结果发现:相对分子质量6 000以下的大豆肽具有很好的抗氧化活性, 但不同相对分子质量范围的肽其抗氧活性有一定差异, 抗氧化性最好的组分a和组分b的相对分子质量分别约为630和310。
由于肽结构的复杂性, 其抗氧化机理也比氨基酸的抗氧化机理复杂。肽的抗氧化活性一方面与其特定的氨基酸组成有关, 如含组氨酸的肽;另一方面还与其氨基酸序列有密切联系。其抗氧化能力是因氨基酸残基含有组氨酸或酪氨酸, 而组氨酸和酪氨酸则能消除自由基或螯合金属离子。
与化学抗氧化剂相比, 抗氧化肽具有安全、高效等特点, 近年来, 大豆蛋白酶解物的体外抗氧化活性引起了众多学者的关注。
2.6 低过敏性和低抗原性
过敏反应是一种异常病理性免疫应答。大豆是1995年FAO报告中提出引起食物过敏的8大原料之一。大豆蛋白活性肽能与人体中的抗原提示细胞中的免疫遗传因子IQ抗原相互作用, 使T细胞、B细胞被活化, 随即产生球蛋白E, 球蛋白E与过敏素结合, 使过敏素失去作用。通过酶降解, 大豆蛋白抗原成分大为减少;另外, 由于大豆肽分子较小, 这在一定程度上也降低其抗原性。据最近研究, 当蛋白相对分子质量在3 400 Da以下时, 则不会引起过敏反应;而大豆肽相对分子质量在1 000Da左右足以满足要求。用酶免疫测定法研究发现, 大豆肽抗原性比大豆蛋白质降低了0.1%~1%, 提高了食品蛋白质的安全性。因此, 大豆活性肽能为特异性过敏患者提供较为理想的疗效食品。
2.7 其他活性功能
经研究表明, 大豆肽还具有抗血栓、调节免疫、促进矿物质吸收、镇静安神及补脑的作用;另外, 还有一些肽能够抗毒、解毒, 保护表皮细胞, 防止黑色素沉淀, 促进大脑和神经发育, 促进松果腺再生, 降低一些变态反应等。随着科技的日新月异, 大豆活性肽的其他生物功能将被人们逐渐的发现。
3 结论
随着人们对于大豆肽的研究越来越深入, 也越来越发现作为植物蛋白, 大豆肽具有人们无法预料的生理功能。我国大豆资源丰富, 在居民膳食中占有非常重要地位, 因此, 针对大豆肽生理功能方面的研究具有深远的意义。不过, 我国对大豆肽的研究起步较晚, 基础和应用研究都很薄弱, 尚处在初级开发应用阶段。目前, 大豆肽的生理活性研究仅限于体外或动物试验, 体内消化是否还能保持相同的肽片段, 这是一个非常重要的问题。具有生理活性的大豆肽的作用机制仍不完全清楚, 需要更好的理解这些生物活性肽是如何作用和如何被调节的。另外, 和牛奶相比, 大豆源生物活性肽的研究远远不够完善, 仍然具有巨大的潜力可挖掘。总之, 大豆肽是一座宝库, 有待于人类去继续开发。它必将为人类的健康事业做出越来越大的贡献。
摘要：小分子大豆肽是大豆蛋白水解后, 由3～6个氨基酸残基组成的肽混和物, 具有很多优良理化特性和生理功能。该文对大豆肽的生理功能进行了综述。
关键词：大豆肽,生理活性,大豆蛋白
大豆活性肽 篇2
1 前景广阔
近年研究结果表明, 除了游离氨基酸, 动物必需吸收利用一定数量的小肽, 才能达到最佳生产性能。国内外很多实验证明, 在饵料中添加适量的小肽, 可增强鱼类的免疫力, 提高饵料转化率、鱼的蛋白质合成能力和养殖成活率, 促进鱼类的生长。广东微生物研究所工作人员邱孟德告诉《农财宝典》记者, 小肽的吸收方式与途径, 使其有可能将肽的信息传递给宿主, 而表达出与游离氨基酸完全不同的生理作用, 即活性肽。小肽中的某些活性肽 (如表皮生长因子、胰岛素样生长因子等) 具有促进动物幼体小肠提早成熟、促进小肠绒毛的生长、提高机体消化吸收率和增进机体免疫力的作用。
2 市场混乱
玉米活性肽制备最佳工艺条件研究 篇3
玉米活性肽是玉米蛋白经过酶解分离提取而成, 根据分子量不同其活性也有所不同。其中低聚肽混合物由2~6个氨基酸组成, 分子量集中在200~1000, 可以不经肠胃消化而被直接吸收, 完全可以应用在食品中。新近研究发现玉米肽富含支链氨基酸, 具有在肌肉中促进蛋白质合成和抑制蛋白质分解的作用, 可以用于运动员食品和临床营养品;玉米肽含有大量丙氨酸, 可使减缓身体吸收乙醇的速度并促进酒精代谢, 大大减少饮酒引起的急性酒精中毒。此外, 玉米肽还具有降血压、降血脂, 辅助治疗肝病和乳腺癌的生理活性作用。因此, 开发玉米肽已成为玉米综合利用研究的新热点。
制备玉米活性肽, 首先通过连续逆流超声技术提取玉米蛋白粉中的醇溶蛋白, 对提取物进行水解并优化各项工艺参数, 同时采用二级膜分离水解物, 可以得到两种纯度较高的不同分子量玉米活性肽产品。
制备玉米活性肽工艺
1. 材料
玉米蛋白粉 (蛋白质含量60%, 市售) 、蛋白酶Alcalase (诺维信公司) 、Na OH、HCL、甲醛、乙醇。
2. 仪器
恒温水浴锅、分析天平、分光光度计、酸度计、温度计、膜过滤装置, 连续逆流超声提取装置、万用电炉等。
3. 方法
(1) 氨基氮测定方法
采用甲醛滴定法, 在参照G B/T5009.39-2003的基础上略有改动, 操作如下:将水解液在5000r/min下离心10min, 取2m L上清液于三角瓶中, 用0.1mol/L的Na OH溶液滴定到p H值8.2, 加入4m L37%的甲醛溶液 (提前用0.1mol/L的Na OH调到p H=8.2) , 再用0.01mol/L的Na OH溶液滴定到p H=9.2, 记录加入甲醛后把溶液滴定到p H=9.2所消耗碱量, 空白对照用蒸馏水代替样品, 采用p H计测量p H值。
采用以下公式计算氨基氮:
式中h—样品中氨基酸含量;
V1—滴定样品消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积 (m L) ;
V0—滴定空白消耗氢氧化钠标准滴定溶液的体积 (m L) ;
NNaOH—氢氧化钠标准滴定溶液的浓度 (mol/L) 。
(2) 水解度的计算方法
采用以下公式计算水解度
水解度 (DH) = (h1-h0) /htot
式中h1—测得水解液中氨基氮含量 (mg/mL) ;
h0—测得玉米蛋白粉混悬液中氨基氮含量 (mg/mL) ;
htot—每毫升水解液中总氮含量 (mg/mL) 。
4. 工艺流程
工艺流程具体如下所示:
结果与讨论
1.玉米蛋白粉的预处理
本研究首先对玉米蛋白粉进行粉碎, 以有利于目的产物的提取和分离, 然后采用连续逆流超声提取技术提取玉醇溶蛋白的提取率。在玉米蛋白粉过40目筛, 超声波频率40kHz, 温度为40℃的条件下研究乙醇的浓度、乙醇-水溶液pH值、料液比和提取时间这4个因素对玉米醇溶蛋白提取率的影响进行正交试验, 确定最佳提取工艺条件, 实验设计如表1所示。
正交试验结果及分析如表2所示。
由正交试验结果分析表明, 极差R的大小决定因素影响的主次顺序为:RA>RB>RD>RC。此外由k值可知, 最佳组合水平为A1B2C3D2, 经实验得知在此组合下玉米醇溶蛋白提取率为43.96%。因此, 连续逆流超声提取玉米醇溶蛋白的最佳工艺条件为:以p H8.0、浓度75%的乙醇作萃取液, 玉米蛋白粉过40目筛, 料液比1∶6, 在温度40℃、超声频率40k Hz的条件下提取1h, 玉米醇溶蛋白的提取率达到43.9%。
2. 蛋白酶水解玉米醇溶蛋白工艺条件的确定
以底物浓度、酶浓度、酶解时间3个可能影响水解度的因素做单因素优化实验, 确定蛋白酶水解玉米醇溶蛋白的最优工艺条件。
(1) 底物浓度对水解度的影响
在酶浓度3.0%、温度50℃、pH8.5的条件下, 水解1h, 选择不同质量浓度3%、3.5%, 4%、4.5%, 5%、5.5%, 6%的玉米醇溶蛋白, 记录不同底物浓度下水解度的变化, 作底物浓度与水解度的关系曲线。
由图1可以看出, 随着底物浓度的增加, 水解度逐渐上升, 当底物质量浓度达到5%时, 水解度最大;当底物质量浓度大于5%时, 随着底物质量浓度的增加, 水解度反而降低, 其原因可能是底物质量浓度增大后, 蛋白不能充分与酶接触, 影响了酶对蛋白的作用, 因此, 酶解反应的底物浓度以5%为佳。
(2) 酶浓度对水解度的影响在底物浓度5.0%、温度50℃、p H8.5的条件下, 水解1h, 选择酶浓度1%、2%、3%、4%、5%, 6%记录不同酶浓度对水解度的变化, 做出酶浓度与水解度的关系曲线。
由图2可以看出, 酶浓度为3%时, 水解度最大;随着酶浓度的增加, 水解度并非成正比例的增大。因此, 仅增酶浓度来提高水解度效果不显著。由此可以确定酶解反应的最适酶浓度为3%。
(3) 酶解时间对水解度的影响
在底物浓度5.0%、酶浓度3%、温度50℃、pH8.5的条件下, 选择不同的酶解时间0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h, 3h, 3.5h记录不同酶解时间对水解度的变化, 做酶解时间与水解度的关系曲线。
由图3可以看出, 反应开始时, 水解度随着时间的延长而明显升高;但1h以后, 水解度变化不是很明显。由此可以确定最佳水解时间为1h。
综合以上实验结果, 在试验中我们选用碱性蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白的条件为:玉米醇溶蛋白浓度调至5%, 用0.1mol/L的氢氧化钠调至p H8.5, 酶浓度3%, 在50℃条件下保持1h。反应过程中用1mol/L氢氧化钠调p H值, 在此条件下醇溶蛋白水解度可达到41.82%。
3. 精制
将酶解液灭酶离心分离, 提取液用活性炭进行脱色, 然后采用二级膜分离对没解产物进行分离, 首先采用截留分子量为10000~30000Da超滤膜分离提纯, 然后采用纳滤膜分离浓缩。最终得到两种不同分子量范围的玉米活性肽:浓缩液中玉米活性肽分子量在3000~6000Da之间的达到80%以上, 透过液中分子量在1000Da以下的达到90%以上。再经离子交换、浓缩、干燥得到最终的玉米活性肽产品。
图4为先后经过超滤和纳滤后透过液中玉米活性肽的分子量分布图。直接酶解后的产物分子量主要集中在200~10000Da, 这部分约占整个峰面积的90%以上, 其中分子量在200~6000Da约占78%;分子量大于10000Da的约占8%.这部分应该是未被水解的蛋白质;分子量小于200Da的约占2%。经超滤后有效地将分子量在10000Da以上的大分子量物质去除, 酶解液的分子量均在10000Da以下。其中分子量在2000~6000Da约占85%, 200~2000Da的部分约占11%, 分子量小于200Da的约占4%。超滤后透过液再经进一步纳滤, 获得两种不同分子量的活性肽产品。其中透过液中分子量范围在1000Da以内的活性肽含量占到90%以上, 截留液中分子量范围在3000~6000Da的活性肽含量在88%以上, 有效保证了活性肽产品的活性。
总结
本文对制备玉米活性肽的工艺进行了研究, 分别从预处理、酶解、精制3个主要的方面进行了研究, 得到了以下结论:
(1) 确定了以玉米蛋白粉为原料制备玉米活性肽产品的工艺路线。
(2) 利用连续逆流超声提取设备提取玉米醇溶蛋白的最佳工艺条件:以p H8.0、浓度75%的乙醇作萃取液, 玉米蛋白粉过40目筛, 料液比1∶6, 在温度40℃、超声频率40 k Hz的条件下提取1h, 玉米醇溶蛋白的提取率达到43.96%。
(3) 蛋白酶酶解玉米醇溶蛋白的最佳工艺条件为:将玉米醇溶蛋白浓度调至5%, 用0.1mol/L的氢氧化钠调至pH8.5, 酶浓度3%, 在50℃条件下保持1h, 水解度可达到41.82%, 反应过程中用1mol/L氢氧化钠调pH值。
(4) 酶解后产品采用超滤、纳滤分离, 得到两种分子量相对集中的活性肽产品, 一种分子量范围在3000~6000Da之间的玉米活性肽含量达到88%, 另一种分子量范围在1000Da以下的玉米活性肽含量达到90%。
鲢鱼肽抗氧化活性比较研究 篇4
目前比较常用的体外抗氧化活性的检测方法有对DPPH自由基的清除作用, 对羟自由基的清除作用和抑制脂质过氧化等。3种方法的原理各有不同:1, 1-二苯基苦基苯肼 (1, 1-Diphenyl-2-picryl-hydrazyl, DPPH) 是一种稳定的有机自由基, 在乙醇中呈紫色, 于517nm处有强吸收, 加入抗氧化剂后, DPPH中的一个稳定的自由基与抗氧化剂中的一个电子配对结合, 使紫色消失, 因此, 褪色程度反应了抗氧化剂对自由基的清除能力, 即反应其抗氧化活性;羟基自由基 (·OH) 与脱氧核糖反应导致脱氧核糖裂解, 酸性条件下加热后产生二次氧化产物—MDA, 1分子的丙二醛 (MDA) 与2分子的硫代巴比妥酸 (TBA) 作用形成粉红色的色原体, 该有色化合物在532nm处有吸收, 进而测定其清除能力;抑制脂质过氧化采用以亚油酸为氧化底物的亚油酸模型系统, 亚油酸通过吸收空气中的氧进行自动氧化反应, 产生脂肪酸氢过氧化物, 采用硫氰酸铁法检测氢过氧化物的含量, 以氢过氧化物的含量来评估抑制脂质过氧化的效果。
本文通过以上3种检测方法对鲢鱼肽进行抗氧化活性检测, 同时与BHA、大豆肽和大米肽进行比较, 对鲢鱼肽的抗氧化活性进行评价, 为其实际应用提供依据。
1 试验材料与方法
1.1 仪器、试剂与材料
仪器:DF-101S集热式恒温加热磁力搅拌器, 巩义市予华仪器有限责任公司;电热恒温水浴锅, 上海博迅实业有限公司医疗设备厂;T6新世纪紫外可见分光光度计, 北京普析通用仪器有限责任公司;台式离心机, 上海安亭科学仪器厂。
试剂:DPPH、亚油酸和2-脱氧核糖, Sigma公司;BHA, 阿拉丁试剂 (上海) 有限公司;其他为试验室常用试剂, 均为分析纯。
材料:BHA、大豆肽、大米肽和鲢鱼肽 (3 000Da以下、3 000~10 000Da) 。
1.2 试验方法
1.2.1 鲢鱼肽的制备
取新鲜的鲢鱼进行预处理, 采肉, 绞碎混匀, 按鱼肉和水的比例为1∶9混合, 在一定的温度、pH值下, 加入碱性蛋白酶进行水解, 将鲢鱼蛋白水解液进行冷冻干燥, 制备得到鲢鱼肽。
1.2.2 主要检测方法
1.2.2. 1 对DPPH自由基的清除作用
称取19.7mg DPPH用95%的乙醇溶解, 于250mL容量瓶中定容, 取等体积鲢鱼肽溶液及DPPH溶液加人同一试管中, 摇匀。30min后用95%乙醇做参比在517nm下测定其吸光度Ai, 同时测定DPPH溶液与等体积95%乙醇混合液的吸光度Ac, 以及鲢鱼肽溶液与等体积95%乙醇混合液的吸光度Aj。计算清除率:
1.2.2. 2 对羟自由基的清除作用
取0.2mL的10.0mmol/L的FeSO4-EDTA混合液于5mL刻度试管中, 加入0.5mL的10.0mmol/L的2-脱氧核糖溶液和0.6mL鲢鱼肽溶液, 用0.1mol/L的pH值7.4的磷酸缓冲液定容至1.8mL, 再加入0.2mL H2O2 (10.0mmol/L) , 混匀后置于37℃恒温水浴中反应lh。然后加入1.0mL 2.8% (w/w) 的三氯乙酸 (TCA) 溶液, 在4 000r/min下离心20min, 取上清液2.0mL于另一支试管中, 加入1.0mL 1.0% (w/w) 的硫代巴比妥酸 (TBA) 溶液, 混匀后在沸水浴中反应15min, 冷却后稀释5倍, 在532nm处测其吸光度值。清除率用SA (%) 表示:
式中:Ac为不加鲢鱼肽溶液的吸光度;As为加入鲢鱼肽溶液后的吸光度;A0为试剂空白的吸光度。
1.2.2. 3 抑制脂质过氧化 (硫氰酸铁法)
在5mL具塞玻璃管中, 向1.5mL 0.05mol/L的PBS (pH值7) 中加入鲢鱼肽溶液100μL, 再加入100μL20mmol/L的亚油酸的乙醇溶液和25μL 20mmol/L的FeCl2-EDTA溶液, 在漩涡分散器上混匀, 于50℃暗处水浴中保温2h。取另1支试管, 在2mL 75%乙醇中加入100μL上述反应液, 100μL 30%NH4SCN溶液, 以及50μL 20mmol/L的FeCl2溶液, 在漩涡分散器上振荡混匀, 3min后用75%的乙醇作为参比, 在480nm处测定溶液的吸光度。抗氧化活力AA可用公式表示:
式中:A0为不加鲢鱼肽溶液的吸光度;As为加入鲢鱼肽溶液的吸光度。
以大豆肽、大米肽和鲢鱼肽 (3000~10000Da、3000Da以下) 为原料, 分别采用上述体外抗氧化活性检测方法进行测定。
2 结果与分析
2.1 对DPPH自由基的清除作用
图1分别测定不同浓度的鲢鱼肽、大豆肽、大米肽和BHA溶液对DPPH自由基的清除作用, 随溶液浓度的增大, 各溶液的清除率也随之增大。BHA的清除效果最好, 其IC50最低, 约为0.05mg/mL;鲢鱼肽 (3 000~100 00Da) 的清除效果次之, 其IC50相对较低, 为1mg/mL;鲢鱼肽 (3 000Da以下) 的清除效果较好, 其IC50相对较低, 为2.218mg/mL;大米肽的清除效果一般, 其IC50相对较弱, 为3.12mg/mL;大豆肽的清除效果最差, 其IC50相对最高, 约为4.805mg/mL。IC50值越低, 说明抗氧化活性越高。试验结果表明:以清除DPPH自由基能力为指标的5种物质的抗氧化活性大小依次为:BHA﹥鲢鱼肽 (3 000~10 000Da) ﹥鲢鱼肽 (3000Da以下) ﹥大米肽﹥大豆肽。
鲢鱼肽的抗氧化活性高于大豆肽和大米肽, 可能是因为不同种类、不同分子量范围的肽由于氨基酸组成和序列不同, 具有抗氧化性氨基酸端基数量不同, 导致对DPPH自由基的清除能力不同。而分子量在3 000~10 000Da之间的鲢鱼肽要高于分子量在3 000 Da以下的鲢鱼肽, 则是由于多肽体外抗氧化活性可能与其中含有由多个氨基酸组成的中长肽有关, 由较多氨基酸组成的中长肽肽链较长, 反应位点多, 能提供活泼质子, 与自由基结合成稳定的产物, 因而有较强的抗氧化作用。
试验中BHA对DPPH自由基的清除能力要比几种肽类要高, 可能是由于其作用机理不同。
2.2 对羟自由基的清除作用
图2中, 分别测定不同浓度的鲢鱼肽 (3 000 Da以下、3 000~10 000 Da) 、大豆肽、大米肽和BHA溶液对羟自由基的清除作用, 随溶液浓度的增大, 各溶液的清除率也随之增大。BHA的清除效果最好, 其IC50相对最低, 约为0.0425mg/mL;大米肽的清除效果次之, 其IC50相对较低, 为1.237mg/mL;鲢鱼肽 (3 000~10 000Da) 和鲢鱼肽 (3 000Da以下) 的清除效果一般, 其IC50相对较低, 分别为1.705mg/mL和1.724mg/mL;大豆肽的清除效果最差, 其IC50相对最高, 约为3.574mg/mL。
鲢鱼肽对羟自由基的清除效果不佳, 可能是由于肽中的抗氧化性氨基酸端对不同的自由基其作用强度不同。
2.3 抑制脂质过氧化 (硫氰酸铁法)
图3中, 分别测定不同浓度的鲢鱼肽 (3 000Da以下、3 000~10 000Da) 、大豆肽、大米肽和BHA溶液抑制脂质过氧化的能力, 试验结果表明:随溶液浓度的增大, 各溶液的抑制脂质过氧化能力也随之增大。BHA的抑制脂质过氧化能力最好, 其IC50相对最低, 约为0.0243mg/mL;大豆肽、大米肽和鲢鱼肽 (3 000~1 0000Da) 的抑制脂质过氧化能力都较低, 其IC50分别为5.77mg/mL、5.58和5.59mg/mL;鲢鱼肽 (3 000Da以下) 的抑制脂质过氧化能力最低, 其IC50相对最高, 为8.03mg/mL。
亚油酸是不饱和酸, 在空气中极易被氧化而生成过氧化物的性质, 硫氰酸钾法的基本原理就是如此。鲢鱼肽和其他两种肽的抑制脂质过氧化的能力在此检测方法下相对于BHA较低, 可能是因为肽抗氧化作用机理与BHA不同, 对于脂质氧化的直接抑制作用相对较弱。
3 结论
本文采用3种常用的体外抗氧化活性检测方法 (包括对DPPH自由基的清除作用, 对羟自由基的清除作用和抑制脂质过氧化) 测定经过酶解制得的鲢鱼肽, 同时测定抗氧化剂BHA、大豆肽和大米肽等物质与鲢鱼肽进行比较分析, 经过比较得出, 鲢鱼肽在一定浓度下具有一定的抗氧化活性。在鲢鱼的精深加工中, 可以开发具有抗氧化活性的鲢鱼肽相关产品, 提高利用率和附加值, 获得较高的经济效益。
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