黏附作用

黏附作用（共7篇）

黏附作用 篇1

心痛方是治疗胸痹心痛(冠心病心绞痛,心肌梗死)的自拟经验方,经临床研究证实该方治疗冠心病心绞痛疗效确切,能降低不稳定性心绞痛患者血细胞上的PS(P选择素)、PSGL-1(P-选择素糖蛋白酰体1)、PS/PSGL-1、sCD40L(白细胞分化抗原40及配体)的表达,降低血小板-白细胞聚集率,从而干预PLA-WBC相互反应[1]。本研究运用现代分子生物学方法,观察心痛方对急性心肌缺血模型大鼠心肌缺血程度的影响以及黏附分子之细胞间黏附分子-1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)的干预作用,为心痛方治疗缺血性心脏病提供实验依据。

1实验材料

1.1 动物

清洁级健康SD雄性大鼠,体重180～200g,鼠龄8～10周,由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供。

1.2 试剂

ICAM-1抗体、VCAM-1抗体:由武汉博士德生物工程有限公司提供。

1.3 药品

心痛方饮片(柴胡、郁金、九香虫、全瓜蒌、桃仁、白芥子)购于湖南中医药大学第一附属医院中药房,在心血管实验室统一煎制成浓缩汤剂;单硝酸异山梨酯:鲁南贝特制药有限公司生产,批号:0095845。

2实验方法

2.1 分组及给药

清洁级SD雄性大鼠80只,按体重分层,再按随机表随机分组,假手术组、模型组、心痛方组、单硝酸异山梨酯组(阳性对照组),每组20只。均采用灌胃法给药,心痛方组按1.08g/kg剂量灌胃给药,阳性对照组按0.87mg/kg灌胃,模型组和假手术组分别灌服同体积生理盐水,每天1次,连续7天。

2.2 动物模型制作方法

参照文献方法[2,3]。于第7天灌胃30分钟后进行实验,以心脏左室前壁呈紫绀或II导联S-T段弓背向上抬高大于0.1mv并持续0.5小时以上为结扎成功标志(S-T段无改变者淘汰),3小时后处死动物。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 心肌梗死面积测定

心脏切片、NBT染色后,数码相机拍摄心肌切片图像,采用图像分析仪测量心肌梗死面积。

2.3.2 心肌组织ICAM-1、VCAM-1表达的检测

各组心肌组织(取左冠状动脉前降支支配区)切片,采用免疫组化SABC法染色,封片镜检,黄褐色或棕色颗粒为阳性产物。在显微镜下用医学彩色图像分析系统测量阳性反应物的平均光密度(AOD)。

2.4 统计学方法

所有实验数据以均数±标准差undefined表示,多组间均数比较用方差分析,采用SPSS17.0版统计软件进行处理。

3结果

3.1 心痛方对急性心肌缺血大鼠心肌梗死面积的影响

见表1。

与假手术组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较△P<0.05,△△P<0.01

3.2 心痛方对急性心肌缺血大鼠心肌ICAM-1、VCAM-1表达的影响

见表2。

与假手术组比较*P<0.05,**P<0.01;与模型组比较△P<0.05,△△P<0.01

4讨论

本实验成功地建立了急性心肌缺血大鼠模型。依据“心痛治肝”的理论[4],以疏肝理气、豁痰化瘀法组成的心痛方,方中柴胡为君药,遵“木郁达之”之旨,顺肝条达之性,发其郁遏之气,使“肝气通则心气和”; 栝蒌、白芥子、桃仁为臣药,三者并用,不仅能豁痰化瘀、行气止痛,又助柴胡条达肝气;栝蒌性寒,尚可防白芥子辛温伤阴之弊,并防治肝郁化火之势;以郁金为佐药, 既佐君药疏肝解郁,又助臣药行气活血化瘀;九香虫为使,走窜络脉,理气止痛,并能理肝胃之气、行膈脘之滞以助脾胃之健运,绝生痰之源。全方具有理气化瘀、祛痰通络止痛之功效,临证用于冠心病心绞痛治疗有良好疗效。

细胞黏附分子是由细胞合成,可促进细胞黏附的一大类分子的总称,主要包括细胞间黏附分子-1(ICAM-1)、血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)、P-选择素等。ICAM-1和VCAM-1属于免疫球蛋白的超家族,为细胞表面单链糖蛋白,分布于内皮细胞、白细胞、单核细胞、成纤维细胞、巨噬细胞表面,主要介导细胞间、细胞与细胞外基质黏附,参与多细胞生物体各种生理、病理过程,与白细胞表面的相应受体或配体结合,使白细胞通过减速、滚动、紧密黏附、变形和游出到达局部组织中,浸润组织,引起急性炎症反应;并进而通过改变毛细血管通透性和阻塞毛细血管床造成局部组织缺血、水肿、出血、坏死及其它相应病理改变,加重缺血引起的损伤。实验证明ICAM-1、VCAM-1在动脉粥样硬化患者中大量表达是早期的病理变化及斑块进展的潜在机制,并与动脉粥样硬化的严重程度有关[5]。本研究结果表明急性心肌缺血大鼠心肌细胞JCAM-1、VCAM-1表达明显增高,心痛方能缩小急性心肌缺血大鼠心肌梗死面积;抑制心肌黏附分子ICAM-1、VCAM-1在缺血心肌的表达,从而减少免疫效应细胞对心肌的攻击、减轻心肌坏死和炎症细胞浸润,对受损心肌有保护作用。

摘要：目的:探讨心痛方对心肌缺血大鼠心肌梗死面积的影响及黏附分子ICAM-1、VCAM-1表达的干预作用。方法:80只SD大鼠,随机分成假手术组、模型组、心痛方组、欣康对照组,采用结扎法制备心肌缺血模型,NBT染色法测定心肌梗死面积,免疫组化法检测黏附分子在缺血心肌的表达。结果:心痛方和欣康均能缩小心肌梗死面积,心痛方呈现出优于欣康的趋势。与假手术组相比,心痛方组、欣康组、模型组缺血心肌ICAM-1、VCAM-1表达的AOD均明显增高(P<0.01);与模型组相比,心痛方组、欣康组ICAM-1、VCAM-1表达的AOD均明显降低(P<0.01);心痛方与欣康在抑制ICAM-1表达方面作用相近,在抑制VCAM-1表达上较欣康略显优势。结论:心痛方能缩小大鼠心肌梗死面积,抑制缺血心肌ICAM-1、VCAM-1的表达。

关键词：心肌缺血/中医药疗法,@心痛方/治疗应用,黏附分子,大鼠

参考文献

[1]范金茹,刘凤英,黄佳,等.疏肝化瘀豁痰法治疗不稳定型心绞痛疗效及对血小板-白细胞相互作用的干预观察.中国中医急症,2008,17(12):1653.

[2]刘尊齐,崔连群,盖玉生,等.大鼠急性心肌梗死模型的制备.基础医学与临床.2007,27(9):1059.

[3]李开宇,田海,孙露,等,标准化大鼠心肌梗死模型的制作.哈尔滨医科大学学报,2007,41(6):531.

[4]顾勇清,姚祖培.冠心病从肝论治研究进展.中医药导报,2009,15(10):67.

[5]Paessens,LC Singh,SK Fernandes.Vascular cell adhesion mole-cule-1(VCAM-1)and intercellular adhesion molecule-1(ICAM-1)provide co-stimulation in positive selection along with survival of selected thymocytes.Molecular Immunology,2008,45(1):42.

黏附作用 篇2

DONG等[6]在前列腺癌细胞中首次发现了能够抑制前列腺癌转移的新基因, 被称为前列腺癌转移抑制基因———KAI1。JIANG等[7]在对原发性胆囊炎的研究中也发现了KAI1能够在肿瘤的转移、增殖方面发挥显著的作用。当KAI1基因发生突变、蛋白结果发生变化时, 其正常功能被破坏或丧失, 从而导致了肿瘤细胞的增殖能力、黏附力、侵袭性发生变化。其他众多研究还表明, KAI1也可在结直肠癌、非小细胞肺癌、胃癌、鼻咽癌等[8,9,10]多种肿瘤细胞的转移、侵袭过程中发挥作用。但是KAI1在肾透明细胞癌的侵袭及转移中是否发挥作用, 目前尚未见文献报道。

本研究拟将KAI1克隆至慢病毒载体p CMV-VSV-G中, 并使KAI1基因在786-O细胞中稳定表达, 观察慢病毒介导的KAI1基因的表达对人肾透明细胞癌细胞株786-O的侵袭、转移的影响, 为后续肾透明细胞癌的发病机制的研究奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料和实验分组

786-O细胞株购自中国科学院基础所;p CMV-VSV-G慢病毒载体购自上海北诺生物科技有限公司;兔抗人KAI1抗体及羊抗兔辣根过氧化物酶二抗均购自美国Santa Cruz公司;黏附分子CD44抗体购自美国Invitrogen公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;细胞稳定转染试剂G418购自上海前尘生物科技有限公司;RPMI 1640细胞培养基购自美国Hycolone公司。本实验分为3组:KAI1基因稳定表达786-O细胞作为实验组 (p CMV-KAI1) 、转染稳定表达p CMV空载体的786-O细胞作为阴性对照组 (p CMV-NEG) 、未进行处理的786-O细胞作为空白对照组 (CON) 。

1.2 细胞培养及KAI1稳定表达细胞株的建立

将786-O细胞接种于细胞培养瓶中, 用含有20%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养, 置于37℃、5%的二氧化碳CO2的恒温培养箱中培养。每2、3天传代1次, 细胞消化使用胰酶, 之后进行培养, 并取对数生长期的786-O细胞进行培养。选用G418对786-O阳性表达株进行筛选, 具体方法参见应明真等[11]的实验方法, 获得稳定转染的786-O细胞株。

1.3 半定量逆转录聚合酶链反应 (RT-PCR)

为鉴定转染前后KAI1的转录水平变化, 本研究利用半定量RT-PCR进行研究。根据Gene Ban K中收录的KAI1的基因序列 (收录号U207701) , 设计KAI1的扩增引物:上游5'--3';下游5'--3', 扩增长度为798 bp, 反应条件为:94℃50 s, 75℃54 s, 72℃90 s, 共进行30个循环。同时, 以细胞骨架蛋白 (肌球蛋白) β-actin的转录水平作为内对照, 引物设计参见NAKAJIMA等[12]的报道, 扩增长度为776 bp, 特异性引物见表1。本研究中, 对PCR产物进行1.4%的琼脂糖凝胶电泳, 利用带有CCD显示屏和图像分析功能的数码相机, 用delta delta Ct法进行图像分析。每种相关因子的相对转录水平用特异性PCR产物的信号灰度和β-actin的信号灰度比率来表示。

1.4 免疫细胞化学法

免疫细胞化学法使用链霉素亲生物素过氧化物酶链接法 (SP法) 。收集稳定表达KAI1蛋白的786-O细胞涂片, 3︰1的乙醇-冰醋酸固定液固定30min, 利用3%的双氧水浸泡10 min, 胰蛋白酶消化10 min, 加入抗KAI1单克隆抗体作用30 min, PBS洗涤, 继续加入二抗及SP复合物各10 min, DAB显色, 用苏木精进行复染, PBS冲洗后观察。

1.5 细胞黏附实验

参照曾维忠等[13]的方法, 并进行了适当的改进。将3组细胞按照每孔2×104个细胞的密度接种于24孔板, 5%的CO2孵箱、37℃培养8 h, 吸去细胞培养液, 再次接种细胞, 水平摇床摇动30 min, 吸出含有未黏附细胞的培养液, 记录黏附的细胞数, 并计算黏附率。

1.6 细胞侵袭实验

采用Boyden Chamber侵袭实验方法。于上室和下室内加入37℃的血清培养液0.5 m L, 培养箱培养2 h, 移除培养液。加入含10%胎牛血清的培养基0.75 m L于下室, 将小室置于细胞培养板孔内, 并加入0.5 m L细胞悬液 (无血清培养基) 于上室, 置于37℃、5%的CO2孵箱中培养48 h, 去除上室底部未侵袭的细胞, 纯甲醇固定30 min, PBS洗涤2次, 以Wright Giemsa染液染色40 min, 冲洗。取下PET膜, 随机选择5个视野观察并记录总细胞数。

1.7 蛋白免疫印迹反应实验

利用蛋白免疫印迹法检测细胞黏附因子CD44的表达情况, 收集786-O细胞, 应用细胞裂解液对786-O细胞进行裂解, 蛋白质电泳并将蛋白转移至醋酸纤维素膜, 包被CD44抗体、二抗, 最后进行DAB显色、拍照, 具体步骤参见王新等[14]方法。同样方法检测肿瘤转移抑制因子MRP-1/CD9的表达情况。

1.8 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行数据处理, 计量资料用均数±标准差 (±s) 表示, 定量资料使用ANOVA进行方差分析, 样本间的两两比较用LSD-t方法, 以P<0.05差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KAI1稳定表达细胞株KAI1表达情况

由于p CMV慢病毒携带有GFP标签, 因此本研究检测KAI1稳定表达786-O细胞株的表达效率。结果显示, KAI1阳性表达细胞接近100%, 说明KAI1稳定表达细胞株构建成功 (见图1) 。

2.2 稳定表达细胞中KAI1 m RNA转录水平上调

实验组 (p CMV-KAI1) KAI 1 m RNA的灰度明显升高 (见图2) , 与阴性对照组 (p CMV-NEG) 和空白对照组 (CON) 相比, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。见图3。

2.3 KAI1蛋白的表达情况

通过免疫组织 (细胞) 化学分析也显示, KAI1阳性染色细胞数目接近100%, 且显著高于其他两组 (见图4) (P<0.01) , 与2.1的实验结果一致。

2.4 KAI1对786-O细胞黏附的影响

图5、6显示, 在作用8 h后空白对照组和阴性对照组间细胞黏附率差异无统计学意义 (P>0.05) , 实验组 (p CMV-KAI1) 与前两组细胞差异有统计学意义 (P<0.01) 。

2.5 KAI1对786-O细胞迁移的影响

本研究结果显示, 稳定表达KAI1的实验组 (p CMV-KAI1组) 细胞数较阴性对照组 (p CMV-NEG组) 和空白对照组 (CON组) 细胞显著减少 (P<0.01) (见图7及表2) , 表明KAI1基因的稳定表达可降低细胞的侵袭能力。

A:p CMV-KAI1组;B:p CMV-NEG组;C:CON组

A:p CMV-KAI1组;B:p CMV-NEG组;C:CON组

A:p CMV-KAI1;B:p CMV-NEG;C:CON

A:p CMV-KAI1;B:p CMV-NEG;C:CON

A:p CMV-KAI1;B:p CMV-NEG;C:CON

2.6 CD44及MRP-1/CD9分子的表达

为探讨KAI1抑制786-O细胞黏附和细胞侵袭的机制, 本研究检测了黏附分子CD44及肿瘤转移抑制因子MRP-1/CD9的表达水平 (见图8) , 结果证实, KAI1稳定表达细胞CD44的表达水平显著低于p CMV-NEG组和CON组 (见表2 (P<0.05) ;同时, MRP-1/CD9的表达高于其他两组的表达水平, 且差异具有统计学学意义 (见图9) (P<0.01) 。

3 讨论

癌细胞的侵袭和黏附是恶性肿瘤最为重要的生物学特征之一, 近年来的大量研究表明[15]KAI1在肿瘤细胞的侵袭和黏附作用方面发挥着十分重要的作用, 可能是反应肿瘤发展和预后的一个重要标识。但有关KAI1基因与肾透明细胞癌的侵袭、黏附的研究却未见报道, 以往的研究大都是从临床组织病理学角度开展的分析。本研究构建了KAI1慢病毒表达载体, 并通过G418筛选使其在786-O细胞中稳定表达, 通过观察稳定表达细胞株在表达、侵袭、黏附等情况, 试图明确KAI1基因对肾透明细胞癌侵袭转移的影响及可能的发生机制, 为肾透明细胞癌的临床防治提供理论基础。

半定量RT-PCR实验结果表明, KAI1稳定表达株稳定表达KAI1m RAN转录水平显著高于空白对照组和阴性对照组, 同时, 免疫细胞化学分析显示稳定表达KAI1细胞株的KAI1染色阳性率高, 说明本研究构建的稳定表达细胞株稳定、可靠, 可用于后续的侵袭及黏附实验研究。

国内外学者通过相关研究后认为[16,17], 转染正义KAI1基因后肝癌MHCC97-H细胞的线粒体及内质网的数量显著减少, 提示KAI1基因表达的升高, 可能通过抑制肿瘤细胞中某些因子的产生而阻断其转移或侵袭的能力。这与本研究基本相同。

癌细胞从原发病灶或组织脱落后, 与相邻组织结合并黏附时发挥肿瘤转移作用。本研究中, KAI1稳定表达细胞株的细胞黏附能力显著低于其他两组, 提示KAI1基因的表达可能不仅降低了肾癌细胞与原发病灶的黏附性, 同时也降低了肾癌细胞与其他周围组织或远端组织的黏附性, 从而抑制癌细胞向其他组织的转移。肿瘤细胞的侵袭作用是恶性肿瘤的一个重要特征, 本研究结果证实, 通过786-O细胞内稳定表达KAI1基因, 抑制了肾透明细胞癌的迁移和转移能力, 说明KAI1在肾透明细胞癌786-O细胞的浸润和迁移中起到了至关重要的作用。

为探讨KAI1基因的表达诱导细胞黏附能力降低及侵袭能力降低的具体机制, 本研究检测了KAI1表达细胞的黏附因子CD44及肿瘤转移抑制因子MRP-1/CD9, 结果表明CD44及MRP-1/CD9的表达水平都显著降低 (P<0.01) , 说明786-O细胞黏附性的降低可能是由于KAI1的表达下调了CD44蛋白的表达, 同时细胞侵袭性的降低有可能又是KAI1的表达上调了MRP-1/CD9蛋白的表达。

黏附作用 篇3

1 材料

Caco-2细胞, 购于中国科学院上海生命科学研究院;2型猪链球菌1330 (弱毒) 株和458 (强毒) 株。

2 方法

2.1 主要溶液的配制

(1) PBS (-) 液:Na Cl 20.0 g+KCl 10.5 g+Na2HPO4·12H2O 2.8 g+KH2PO40.5 g, 先后溶于少量三蒸水中, 然后定容至2 000 m L, 磁力搅拌器上充分搅拌溶解, 分装于250 m L瓶中, 每瓶200 m L, 高压30 min, 4℃冰箱保存备用。细胞培养前添加青霉素100 U/m L、链霉素100 U/m L (双抗) (或根据需要添加3~4倍量双抗) , 分装, 标记, 4℃储存备用。 (2) 4%台盼蓝母液配制:称4 g台盼蓝加少许蒸馏水研磨, 加双蒸水定容到100 m L, 滤纸过滤, 4℃保存。使用时用PBS (-) 稀释10倍至0.4%, 取9滴细胞悬液与1滴台盼蓝染液混合, 3 min内测定细胞活力。 (3) THB培养基配制:胰蛋白胨20 g+酵母浸出物3 g+葡萄糖2 g+Na Cl 2 g+Na2CO32 g+牛肉膏5 g+Na HCO30.4 g, 先后溶于少量三蒸水, 定容至1 000 m L, 磁力搅拌器上充分搅拌溶解, 分装250 m L瓶中, 每瓶200 m L, 115℃高压20 min, 将p H调至7.5~7.8。 (4) 感染培养基配制:100 m L DMEM培养基中加入10%胎牛血清、0.1%的50 mmol/Lβ-巯基乙醇、0.2 g Na HCO3, 将p H调至7.2~7.4。

2.2 复苏细胞

(1) 从液氮罐中小心取出冻存管, 迅速浸没在37℃温水中快速均匀晃动, 使冻存细胞溶液快速完全融解。 (2) 1 000 r/min离心10 min, 弃上清, 用DMEM培养基将细胞重悬, 台盼蓝染色检测细胞活力后, 调整细胞密度接种于24孔板。细胞成活率=活细胞数/总细胞数×100%。 (3) 将剩余的细胞悬液吸入装有完全培养液的培养瓶中, 将培养瓶置于37℃、5%CO2条件下培养, 每日更换培养液, 约3~4 d传代一次。

2.3 细菌培养

(1) 用THB平板复苏菌株, 37℃培养24 h, 挑单菌落接种于THB液体培养基。 (2) 培养18 h, 再以1%量接种于THB液体培养基, 培养至OD600为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0, 并同时分别涂布THB平板, 以测定SS2菌株的生长曲线。 (3) 测完4种SS2菌株的生长曲线后, 取对数生长期的菌株, 6 000 r/min离心15 min, 弃上清, PBS重悬后6 000 r/min离心15 min, 弃上清, 再次PBS重悬后6 000 r/min离心15 min。 (4) 弃上清, 加入感染培养液, 并用感染培养液稀释成细菌:细胞=1:100的菌悬液。

2.4 黏附试验

(1) 取对数生长期SS2菌液 (5×108个/m L) , 8 000 g离心10 min, 用PBS重悬后6 000 g离心, 再重复一次。最后离心去上清, 用感染培养液重悬。 (2) 取出细胞板, 弃培养液, 用PBS清洗3次以除去抗生素。 (3) 按照细菌细胞比100:1加入至细胞板中, 用感染培养液定容至500 u L。 (4) 2 000 g离心5 min, 以加强细菌细胞接触。 (5) 37℃孵育30 min, 2 h和4 h之后弃培养液, 用PBS洗6次, 每次500 u L, 最后4次涂板。 (6) 每孔加入200 u L胰酶, 消化5 min, 加入300 u L PBS, 吹打后稀释102、104、105、106, 涂板。 (7) 2 h时, 在细胞板剩余孔中加入两个空白对照, 即只加入细菌, 不加细胞, 与其他孔作相同处理, 用PBS涂板。

2.5 侵袭试验

(1) 取对数生长期细菌 (5×108个/m L) , 6 000 g离心10 min, 弃上清;PBS重悬后6 000 g离心, 弃上清;再加入PBS重悬, 6 000 g离心, 后用感染培养液重悬。 (2) 取细胞板, 吸取DMEM完全培养液, 用1 m L PBS清洗3次, 以除去抗生素。 (3) 按细菌细胞比100:1加入细菌, 最后定容至1 m L。 (4) 2 000 g离心5 min, 以加强细菌细胞接触。 (5) 37℃孵育2 h和4 h, 弃感染培养液, 用1 m L PBS洗6次, 最后4次涂板。 (6) 每孔加入500 u L1%Triton X-100, 裂解物用PBS稀释102、104、106、108涂板、培养。

3 结果与讨论

3.1 SS2 (1330) 细菌的生长曲线

用THB平板复苏菌株, 37℃培养24 h, 挑单菌落接种于THB, 培养18 h, 再以1%量接种于THB, 培养至OD600为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0, 并同时分别涂布THB平板以测定SS2菌株的生长曲线, 见图1。

由SS2生长曲线可知, SS2细菌的对数生长期在10~12 h, 本试验采用过夜培养, 所得到的细菌处于对数生长期, 通过平板计数SS2为5×108个/m L。

3.2 黏附与侵袭试验计数结果

SS2细菌细胞壁上有磷脂酸等, 与动物皮肤及黏膜表面的细胞具有高度亲和力, 其荚膜成分、M蛋白等具有抗吞噬作用, 后者都是菌毛状, 具有黏附作用。黏附和侵袭试验结果见表1-表2。

洗液为PBS, 第6次洗液计数都小于102, 说明最后黏附和侵袭试验所计数都是与细胞发生黏附和侵袭到细胞内的细菌数, 而排除了未发生黏附和侵袭作用细菌所造成的偏差。对照试验是在没有接种细胞的孔板上, 对细菌进行相同处理, 以排除组间差异。

通过平板计数结果可以看出:458# (强毒株) 和1330# (弱毒株) 都可以与Caco-2细胞发生黏附, 并分析出458#比1330#更加容易黏附在细胞表面, 事实上, 458#比1330#更具有致病性。换句话说, 容易发生黏附的细菌具有更强的致病性, 由此推测, 大部分致病性SS2能高水平黏附于消化道黏膜细胞上。

4 结论

1) 猪链球菌同一血清型不同菌株之间以及不同血清型菌株之间的毒力有较大差异, 并非所有的血清型均有致病性, 且同一血清型的菌株不一定都引起相同的疾病, 本试验结果也证实了这一点。

黏附作用 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

本院2010年10月～2012年3月收治的咳喘患儿236例,年龄1～8岁,平均(3.6±1.4)岁,病程为3 d～2个月,平均病程为(6.1±2.4)d,其中男125例,女111例。患儿的诊断均符合2002年我国儿科呼吸学组相应制订的“儿童哮喘防治常规”的哮喘诊断标准:喘息、气促、胸闷、咳嗽、肺部存在哮鸣音、呼气相延长等,排除其他疾病引起病症的患儿。将患儿随机分为两组,采用小儿止咳糖浆治疗患儿118例为对照组,年龄为1～7岁,平均(3.7±1.5)岁,病程为3 d～2个月,平均病程为(6.2±2.7)d,其中男60例,女58例。采用小儿止咳平喘露治疗患儿118例为观察组,年龄为1～8岁,平均(3.5±1.4)岁,病程为4 d～2个月,平均病程为(5.9±2.3)d,其中男65例,女53例。两组患儿间一般情况(年龄、性别、病程等)差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经医院伦理委员会通过,且家属知情同意。

1.2 方法

对照组采用小儿止咳糖浆(江西汇仁制药集团生产)治疗,主要成分为甘草、桔梗、氯化铵等。1～3岁患儿2.5 mL/次,4～8岁患儿5 mL/次,3次/d,疗程3 d。观察组采用小儿止咳平喘露(本院制剂室加工制作)治疗,主要成分为杏仁45 g、麻黄45 g、制半夏35 g、苏子30 g、石膏100 g、甘草30 g、葶苈子30 g,加工浓缩为250 mL/瓶。用量为2 mL/次,3次/d,疗程3 d。临床指标检测方法如下:

1.2.1 组胺引喘法试验

试剂主要为磷酸组胺(国药集团化学试剂有限公司生产,批号为F20040315),给予患儿雾化吸入0.4%组胺雾化气体,雾化器为雅博Penguin Neb/9R空气压缩雾化器(上海天呈科技有限公司生产),进行20 s喷雾后,6 min内观察组胺引喘的潜伏期。

1.2.2 枸橼酸引咳法试验

试剂主要为枸橼酸(上海化学试剂一厂生产,批号为030513),给予患儿雾化吸入17.5%组胺雾化气体,雾化器也为雅博Penguin Neb/9R空气压缩雾化器,进行10 s喷雾后,2 min内观察组胺引喘的潜伏期。

1.2.3痰液嗜酸性粒细胞计数

取患儿痰液于光镜下进行白细胞总数计数,经离心后涂片,低速离心机为长沙维尔康湘鹰离心机有限公司生产,使用wright+giemsa染色,再于高倍镜下观察500个细胞,计数嗜酸性粒细胞,进行换算即可。

1.2.4 外周血可溶性细胞黏附分子-1检测

采用双抗体夹心ELISA法检测患儿的外周血可溶性细胞黏附分子-1,试剂盒为上海晶天生物科技有限公司生产,严格按照说明书进行操作。

1.3 统计学方法

所有数据资料均采用SPSS 16.0统计学软件进行处理,计量资料数据以均数±标准差(x±s)表示,比较采用t检验,计数资料采用百分率表示,组间对比采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患儿引喘潜伏期比较

两组患儿引喘潜伏期比较结果显示,观察组组胺引喘潜伏期、枸橼酸引咳潜伏期均明显长于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

2.2 两组患儿痰液嗜酸性粒细胞计数和外周血可溶性细胞黏附分子-1检测比较

两组患儿痰液嗜酸性粒细胞计数和外周血可溶性细胞黏附分子-1检测比较结果显示,观察组痰液嗜酸性粒细胞计数、外周血可溶性细胞黏附分子1均明显低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

3 讨论

有研究表明,哮喘就是机体内的一种气道炎症,其中炎性细胞、黏附分子、细胞因子、炎性介质的释放均是哮喘发生的关键环节[9]。哮喘具有较强的传染性,可通过多种途径实现传播,儿童的机体发育尚不健全,极易受到感染。随着周围环境的改变,小儿哮喘近年来的发病率有升高趋势。及时控制传播源和过敏原,并进行有效的治疗可以降低小儿哮喘的发病率[10]。

在气道炎症发生过程中,嗜酸性粒细胞起着重要作用,是哮喘发生的主要效应细胞,可以释放毒性蛋白损伤机体的气道上皮细胞,引发起到高反应性,嗜酸性粒细胞还可以参与多种细胞因子的合成和分泌,使得细胞因子得以在患儿体内长时间存活,监测嗜酸性粒细胞水平是一项诊治小儿哮喘的主要手段[11,12]。

外周血可溶性细胞黏附分子-1能参与嗜酸性粒细胞发生炎症反应时黏附、移行、募集等活动,还可强化机体的气道高反应性发展。血清可溶性细胞黏附分子-1是患儿机体细胞外主要的生物功能成分。外周血可溶性细胞黏附分子-1主要来源于细胞黏附因子的释放和脱落,在哮喘发生时,嗜酸性粒细胞异常表达,会增加可溶性黏附因子的释放,尤其是白细胞、内皮细胞等,进而增加了外周血可溶性细胞黏附分子-1的水平,因而检测外周血可溶性细胞黏附分子-1水平是诊治小儿哮喘的辅助手段。

目前小儿哮喘的治疗主要以药物控制治疗为主。小儿止咳平喘露是由杏仁、麻黄、制半夏、苏子、石膏、甘草、葶苈子等多种中药配制而成的,其中杏仁作用于机体后可生成氢氰酸起到镇咳祛痰、润肺止咳的功效,麻黄可以松弛患儿支气管平滑肌,解除痉挛,石膏对神经与肌肉具有一定的抑制作用,可起到镇静的功能,甘草用于机体肾上腺皮质激素后可起到抗炎、抗过敏的作用,制半夏具有燥湿化痰的功效,苏子和葶苈子可以降气消痰、平喘润肠。共同作用于患儿机体后,可以起到相辅相成的功效。扩大治疗效果。

本次研究表明,观察组组胺引喘潜伏期明显长于对照组,小儿止咳平喘露可以有效抑制咳喘患儿由组胺诱发的哮喘反应。观察组枸橼酸引咳潜伏期明显长于对照组,说明小儿止咳平喘露可以有效延长咳喘患儿由枸橼酸诱发的咳嗽反应。观察组痰液嗜酸性粒细胞计数、外周血可溶性细胞黏附分子-1均明显低于对照组,说明小儿止咳平喘露不仅可以有效降低咳喘患儿痰液中的嗜酸性粒细胞水平,还能有效降低咳喘患儿体内外周血可溶性细胞黏附分子-1水平。综上所述,小儿止咳平喘露具有显著的止咳平喘功效。

摘要：目的 探讨小儿止咳平喘露的平喘作用及其对外周血可溶性细胞黏附分子-1的影响。方法 选取本院2010年10月～2012年3月收治的咳喘患儿236例,随机分为两组,采用小儿止咳糖浆治疗患儿118例为对照组,采用小儿止咳平喘露治疗患儿118例为观察组,分别进行组胺引喘法观察、枸橼酸引咳法观察、痰液嗜酸性粒细胞计数、外周血可溶性细胞黏附分子-1检测,比较两组患儿的各项临床指标。结果 观察组组胺引喘潜伏期[(81.4±16.5)s]明显长于对照组[(52.7±12.0)s],观察组枸橼酸引咳潜伏期[(48.3±12.6)s]明显长于对照组[(30.1±9.2)s],观察组痰液嗜酸性粒细胞计数[(1.3±0.6)×106个/mL]明显低于对照组[(2.1±1.0)×106个/mL],观察组外周血可溶性细胞黏附分子-1[(42.7±13.8)μg/L]明显低于对照组[(59.2±17.5)μg/L],差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 小儿止咳平喘露具有显著的止咳平喘功效,不仅能明显减少患儿痰液中的嗜酸性粒细胞,还能有效降低患儿外周血可溶性细胞黏附分子-1的水平。

黏附作用 篇5

固体表面能否达到超疏水特性由其表面微结构和化学组成共同决定[1,2,3,4],一般制备超疏水表面从两方面入手:一方面是在粗糙表面上修饰低表面能物质,另一方面是在疏水材料表面构建粗糙结构。事实上,一般将增加表面的粗糙度和表面化学修饰相结合来构筑超疏水表面。本工作采用溶胶-凝胶法及浸涂法制备得到氧化铝薄膜,再通过沸水处理和接枝有机长链分子,制备得到一种具有强黏附力的超疏水表面,并对其疏水特性和强黏附原理进行了探讨。

1 实验

1.1 原料与试剂

聚乙烯亚胺(PEI,30%)和三丁醇铝,购于Aldrich公司。硬脂酸(STA)、二环己基碳化二亚胺(DCC)和乙酰乙酸乙酯(EAcAc),购于国药集团。丙酮、正己烷,天津市光复精细化工研究所。

1.2 氧化铝凝胶薄膜的制备

以三丁醇铝为前驱体,采用溶胶-凝胶法来制备氧化铝溶胶。将22.2g三丁醇铝和108.9g异丙醇在室温下搅拌混合1h,然后将11.8g螯合剂乙酰乙酸乙酯加入并搅拌3h。接着将8.5g异丙醇和6.5g蒸馏水的混合液慢慢加入进行水解24h,以获得稳定的氧化铝溶胶。以浸涂法将此溶胶均匀涂覆在经丙酮和蒸馏水清洗过的载玻片上,干燥后置于400℃的马弗炉中焙烧10min,再于沸水中处理20min,便得到氧化铝凝胶薄膜。最后,将涂覆有氧化铝薄膜的载玻片在稀释成浓度为0.2%的PEI溶液中浸泡20min,然后用蒸馏水清洗后再置于STA和DCC的正己烷溶液中(STA的摩尔浓度为3mmol/L;DCC的摩尔浓度为0.6mmol/L)反应24h,取出后分别用正己烷、丙酮和蒸馏水清洗,室温晾干即得到超疏水氧化铝薄膜。

1.3 氧化铝薄膜的表征

采用DSA-100光学接触角测量仪在室温下测量表面的静态接触角,测量时所用的水滴为5μL。本工作报道的数据是在5个不同位置下测量的平均值。用VERTEX70傅里叶变换红外光谱仪和XRD-7000LX X射线衍射分别测定超疏水氧化铝凝胶的化学结构和相结构。用PHI-5702-X射线光电子能谱测定试样表面原子状态。用JSM-6701F场发射扫描电子显微镜观察氧化铝薄膜表面的微观结构。

2 结果与讨论

2.1 超疏水氧化铝薄膜的制备及其润湿性

以三丁醇铝为前驱体,利用溶胶-凝胶法制得了稳定透明的氧化铝溶胶,再通过浸涂法将溶胶涂覆于载玻片上并处理后制备得到氧化铝凝胶薄膜。然后通过沸水处理、热处理使薄膜形成多孔结构,再修饰低表能物质以降低薄膜的表面自由能。本研究采用聚乙烯亚胺(PEI)和硬脂酸(STA)进行表面修饰。当多孔薄膜浸入到PEI溶液中后,由于氢键和范德华力的作用[7],氧化铝表面极容易吸附自组装一层PEI。当将吸附有PEI层的氧化铝表面进一步浸入STA的正己烷溶液后,在DCC的作用下,PEI与STA进行脱水缩合反应,从而在氧化铝薄膜表面形成了一层由PEI和STA缩合反应形成的单分子层,这样便在氧化铝薄膜表面接枝了由长碳链构成的单分子疏水层。

通过考察水滴在氧化铝薄膜表面的润湿性,对试样制备过程进行监控,得到各个程序中10μL水滴在氧化铝薄膜表面的润湿性照片及接触角,如图1所示。从图1(a)可以看出,氧化铝凝胶薄膜与水的接触角为56.8°;而当该薄膜经过沸水处理后,其表面接触角降至43.6° (如图1(b)),说明沸水处理后试样表面更加亲水。当氧化铝表面吸附PEI分子层后,其接触角又上升至67.3° (如图1(c));再经STA处理后,其表面疏水性显著增加,液滴接近于球状,接触角可达到154.2°(如图1(d)),表明此时氧化铝表面呈现出超疏水特性。从而制备得到具有超疏水特性的氧化铝表面。

2.2 超疏水氧化铝的表面结构及组成

通过对制得的超疏水氧化铝表面用扫描电镜进行观察可知:铝片经沸水处理后表面呈网状形态(如图2(a)所示),在网状形态中存在明显的凸起和凹坑,凸起之间相互联结,形成类似“花状结构”。凸起部分由长度约为70～130nm的柱状结构组成,而凹坑由尺寸大约为100～200nm的小孔组成。多孔的氧化铝经PEI和STA进一步修饰后(如图2(b)),其表面形貌仍然呈现“花状结构”。然而,相对于修饰前的形貌,经PEI和STA修饰后,其突出的变化是凹坑明显变小,其尺寸大约在50～100nm,并且由20～80nm的小孔组成;凸起的柱状结构也明显变粗,表面有类似絮状物、尺寸约为25nm的乳突。这就形象地说明超疏水氧化铝表面具有了微纳米双重粗糙结构,这为其疏水特性提供了结构支撑。

为了考察氧化铝薄膜的相结构和表面组成,依照超疏水氧化铝薄膜的制备过程,制备了相对应的氧化铝凝胶粉体,然后对其进行了XRD和FTIR分析,得到的结果可以反映氧化铝薄膜的物相结构和化学组成。图3为相对应的氧化铝凝胶粉体在不同阶段的XRD图谱。图3(a)为沸水处理后的氧化铝的衍射图谱,其中2θ 位于28.5°,38.5°,49.2°和65.5°的衍射峰为波姆石和γ-Al2O3的结晶峰。由于这几个峰均较宽且强度较低,说明经沸水处理和热处理后,只有部分氧化铝凝胶变成了波姆石和γ-Al2O3。表面接枝PEI和STA后,氧化铝的衍射峰基本不变(如图3(b)所示),表明接枝PEI和STA有机层对氧化铝的相结构不会产生任何影响,而只改变其表面组成。

图4为氧化铝凝胶粉体接枝PEI及STA前后的FTIR表征结果。其中3650～3000cm-1处是Al—OH键的伸缩振动吸收峰,而1510～1400cm-1是C—O键的振动吸收峰,1000～500cm-1是Al—O键的吸收峰。由于STA中的羧基和PEI中的胺基发生缩合反应形成O=C—N—C键,所以氧化铝薄膜经过PEI及STA修饰后,其红外谱图中于1640cm-1处出现酰胺-I(O=C)的吸收峰,在1570 cm-1处出现酰胺-II(—NH)的吸收峰,在2920cm-1和2850cm-1处分别出现了十分明显的亚甲基的非对称和对称伸缩振动峰。这表明氧化铝表面成功接枝上了PEI和STA有机长链分子。

图5为XPS技术测定的超疏水氧化铝表面原子状态图谱。可以看出,超疏水氧化铝表面由Al,O,C和N 原子构成,其中Al2p在电子结合能为73.9eV存在谱峰(图5(a)),表明经沸水处理的氧化铝表面的Al原子以Al2O3和AlO(OH)形式存在[8,9],这一结果与X射线衍射分析结果相一致(经沸水处理的氧化铝凝胶中存在波姆石和γ-Al2O3相)。正是由于氧化铝凝胶表面的部分波姆石在沸水中发生溶解[10],从而使氧化铝表面形成了如图2所示的多孔粗糙结构。同时,图5(b)中O1s位于531.6eV的峰来自于Al2O3和STA中的O原子[9,11],而图5(c)中的C1s可以被分成3个小峰,其中结合能为285.0eV的第一个峰是由STA中-CH基团中的碳原子引起,286.6eV的C1s来自于与N结合的碳原子(O=C-N-C*)[12],289.3eV的C1s来自于羰基碳原子(O=C*-N-C)[12]。另外,N1s 峰也可以被解析为3个小峰,如图5(d)所示,其中结合能为399.7eV和400.8eV的N分别来自于酰胺基团和与羰基相连(O=C-N*)[12,13]的氮原子,而402.0eV的N可能是由酰胺基团被氧化引起[14]。这些结果均表明STA的长碳链被成功接枝到具有粗糙结构的多孔氧化铝表面,从而使得氧化铝表面表现出超疏水特性。

2.3 氧化铝表面的强黏附性及黏附机理

在进行静态接触角测试时,将小水滴滴落到这种超疏水氧化铝表面后,水滴在其表面具有极强的黏附力。图6为将黏附有10μL小水滴的试样倾斜90°以及将其倒立时,水滴的黏附性照片。可以看出:在这两种情况下,水滴都不会滑落,表明水滴与超疏水氧化铝表面具有极大的黏附力,该黏附力能够抵抗水滴自身的质量和表面张力而使水滴牢固稳定地黏附于氧化铝薄膜表面。

这种强的黏附力作用应该是由Feng L.等[5]提出的“花瓣效应”(Petal effect)引起的,可以用Cassie浸渗模型(Cassie impregnating wetting state)[15]来进行解释。图7为水滴在超疏水氧化铝表面的润湿模型示意图,其从上向下依次将水滴在氧化铝表面的润湿情况进行放大,最底层是水与氧化铝薄膜表面接触的微观模型。这也就是说,在氧化铝表面的柱状凸起上有很多尺寸更小的乳突,这跟用扫描电镜观察到的结构(图2)相一致。水滴通过毛细管力作用可以进入到粗糙表面上较大尺度的凹槽中(如图7中的凹槽a),从而使得薄膜倾斜任何角度时水滴都会牢牢地固定在薄膜上,但水滴不能够进入到较小尺度的凹槽中(如图7中的凹槽b)[15],使空气被封闭在固液接触线区域,从而形成了固、气、液三相共存的复合界面。

undefined

根据公式(1)中的Cassie方程[16](θr和θ分别代表粗糙表面和光滑表面的接触角,其中本研究中,θr和θ分别为154.2°和82.7°;f1和f2分别表示与液滴接触的固相和气相的体积分数),计算得到本研究体系中的f2约为0.912,表明有较多的空气被水滴限制在较小尺寸的凹槽中,从而使氧化铝表面呈现出超疏水特性。但是,由于水滴通过毛细管力作用浸润了粗糙表面上较大尺度的凹槽,从而在呈现较大接触角的同时,水滴又与粗糙的氧化铝表面产生了较大的黏附力。正是基于水滴对这两种尺度凹槽的不同润湿效果,使得氧化铝表面既具有很高的接触角,同时又呈现出较强的黏附特性。

3 结论

(1)利用溶胶凝胶法和浸涂工艺,制备得到了氧化铝薄膜。

(2)氧化铝薄膜经过沸水处理、热处理和接枝有机层等工艺,研制得到一种新型的既具有超疏水特性又呈现出强黏附力的氧化铝薄膜。

黏附作用 篇6

关键词：纳米碳酸钙,生物黏附性,黏附力,释放度

碳酸钙是自然界广泛存在的一种很普通的非金属材料,也是一种传统的无机盐化工产品。近年来,随着碳酸钙的超细化及表面改性技术的发展,纳米碳酸钙制备技术和应用已成为国内外竞相开发的研究热点[1]。经过动物临床实验表明,碳酸钙对动物体内的驱铅效果明显优于其他药物,通过比较不同粒径的碳酸钙在体外模拟胃肠道环境中的除铅效果,发现将纳米碳酸钙制备成肠溶生物黏附制剂,可以通过阻断铅的肠肝循环,成为新型驱铅药物[2]。缓释制剂在动物体内的黏附力明显大于普通片剂,且肠的黏附力大于与胃的黏附力[3]。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

1.1.1 仪器

小型粉末压片机购自武汉天诚器械厂,自制黏附力测定装置,电子分析天平购自常州梅特勒-托利多仪器有限公司,60目筛。

1.1.2 材料

纳米碳酸钙购自美国Amresco公司,羟丙基甲基纤维素购自河北燕兴化工有限公司,卡波姆购自广州博峰化工科技有限公司,硬脂酸镁购自杭州东豪化工有限公司,大鼠购自广东省实验动物中心。

1.1.3 片芯

主药(纳米碳酸钙40~80 nm)75%,生物黏附性材料10%,崩解剂10%,润滑剂5%压片。通过实验选择功能性较好的卡波姆(Carbomer,CP)与羟丙基甲基纤维素(hydroxypropyl cellulose,HPMC)作为生物黏附性材料,做单因素考察。变量为生物黏附性材料,配置其中HPMC与CP含量比例为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1及3∶1,使用颗粒混合压片的方法制作片芯。

1.1.4 大鼠小肠

实验用的黏膜为大鼠胃和肠黏膜。取大鼠处死后的小肠上段,生理盐水清洗干净后储存于-20℃冰箱,使用前放置4℃冰箱解冻2 h,再放至室内常温下泡入生理盐水中至完全解冻。

1.2 实验方法

1.2.1 片芯制备工艺

生物黏附性片芯制备采用粉末直接压片法,由于粉末直接压片工艺简单,无需制粒、干燥,可有效地保护主药的稳定性,避免其因为湿法制粒造成的各种不稳定因素,从而保证产品的质量。粉末直接压片技术的优势还在于其避免加热和水分的影响[4]。粉末直接压片法:按比例称取纳米碳酸钙150 g、HPMC 10 g、CP 10 g,过80目筛后混合均匀,加入崩解剂微晶纤维素(microcrystalline cellulose,MCC)20 g、润滑剂硬脂酸镁10 g,混合均匀后放入小型粉末压片机,依次按压即得HPMC∶CP为1∶1片芯。分别制作黏附片含量其他辅料,用量不变。HPMC与CP在片芯中含量比例为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1及3∶1。

1.2.2 片重差异检查

取生物黏附性片芯HPMC与CP含量比例分别为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1及3∶1的样品各10片,分别对其片重差异进行测量,取测量最终重量,按《中国药典》2005版(二部)附录Ⅰ制剂通则,对片剂片重差异的规定进行检查。

1.2.3 黏附片体外黏附力的测定

按参考文献[5]黏附力测定方法建立测定装置,利用塑料袋中水的重量来测定片芯与大鼠小肠间的黏附力。将大鼠小肠组织剪成小段,片芯A和大鼠小肠黏膜B分别用502胶水固定于两片2 cm×2 cm的有机玻片a、b上,在片芯上滴生理盐水,使其湿润10 min后与小肠黏膜玻片接触,施加100 g的砝码保持6 min。将玻片a面朝上,b面朝下垂直挂吊挂,在玻片b下方挂上塑料袋,匀速缓慢向袋中注水,直至玻片a与b分离,记录塑料袋、水及玻片b的重量,即得到当前体外最大黏附力。分别取生物黏附性片芯HPMC与CP比例含量为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1及3∶1样品,按照黏附力测定方法建立测定装置,进行5次测定。见图1。

1.2.4 释放度测定

浆法:人工胃液模拟胃液中的条件,p H 6.0醋酸缓冲液模拟十二指肠肠液环境中的条件[6]。其中片芯处方筛选选择以500 ml p H 6.0醋酸缓冲液作为释放介质,采用缓冲液中Ca2+的释放量来间接评价片芯中纳米碳酸钙的释放程度,片芯释放度测定按中国药典2005版附录有关规定,37℃、100 t/min,累积释放时间为4 h,分别于0.5、1.0、2.0和4.0 h取样5 ml(同时补液5 ml),0.81 am微孔滤膜滤过,取上述续滤液30μl,加入钙显色剂4 ml,立即于573 nm测定吸收度,根据标准曲线方程计算各片在不同时间点的浓度,并计算累积百分释放率。黏附片则分别于人工胃液和p H 6.0醋酸缓冲液作为释放介质,采用溶液液中Ca2+的释放量来间接评价黏附片中纳米碳酸钙的释放程度,与片芯释放度测定方法相似,分别考察黏附片在人工胃液2 h p H 6.0醋酸缓冲液4 h内的释放行为,计算累积百分释放率。

Cn:第n次取样的释放介质中纳米碳酸钙的浓度(mg/L);Ci:笫1次取样的释放介质中纳米碳酸钙的浓度(mg/L);M:黏附片中纳米碳酸钙的标示量(rag)。

1.3 统计学方法

采用SPSS 21.0统计软件进行数据分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,用方差分析,两两比较用SNK-q检验,P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 片重差异

片重差异测量表明,生物黏附性片芯1∶1、1∶2、1∶3、2∶1及3∶1样品片重差异均符合《中国药典》2005版(二部)附录Ⅰ制剂中,附录片剂项下片重差异规定。经单因素方差分析,差异无统计学意义(F=0.106,P=0.980),可认为不同比例不影响片芯的重量。见表1。

2.2 生物黏附力的考察数据

黏附力测试结果显示,HPMC∶CP为1∶1的黏附力为(13.716±0.620)g,HPMC∶CP为1∶2的黏附力为(23.434±4.910)g,HPMC∶CP为1∶3的黏附力为(34.888±3.990)g,HPMC∶CP为2∶1的黏附力为(12.088±1.310)g,HPMC∶CP为3∶1的黏附力为(9.148±2.430)g,其中HPMC∶CP为1∶3的黏附力最高。经单因素方差分析,差异有统计学意义(F=103.949,P=0.000),不同比例片芯黏附力之间有差异。两两比较结果:3∶1组与2∶1组比较,经SNK-q检验,差异无统计学意义;1∶1组、1∶3组与1∶2组比较,经SNK-q检验,差异有统计学意义(q=0.058和0.036,P=0.012和0.047);2∶1组与1∶1组比较,经SNK-q检验,差异无统计学意义;3∶1组、1∶2组与1∶3组比较,经SNK-q检验,差异有统计学意义(q=0.279和0.188,P=0.029和0.031)。结果表明,CP的比例越大,测定的黏附力越大,黏附效果逐渐变强,反之CP比例越少黏附效果逐渐变弱,其中HPMC与CP比例为3∶1时黏附力最小,HPMC∶CP为3∶1与HPMC∶CP为1∶3的差异明显。不同比例片芯重量比较,差异无统计学意义,片重的重量差异不来源于不同比例。黏附力测试结果表明,HPMC∶CP为1∶3的黏附力最高。见表2。

HPMC与CP不同的含量可以直接影响碳酸钙黏附片的释放度,其中HPMC与CP比例中,CP含量多时释放速度最为缓慢,释放效果低于其他比例,HPMC多时释放速度较快,HPMC∶CP为1∶2和1∶3前期相对平稳,2 h后释放速度明显提高。见图2和表3。

预实验和单因素实验结果表明,HPMC和CP量是同时影响片芯释放和黏附性能的主要影响因素。综合数据分析结果与单独检测黏附力、单独检测释放度的结果成正比,HPMC∶CP为1∶3释放度作用都比较偏弱,且释放缓慢,HPMC∶CP为3∶1释放相对较快,随着HPMC减少,CP增加,药片的释放度明显降低,尤其在3 h时,对药片的释放影响更为明显,说明CP的缓释作用比HPMC更明显。以黏附片片芯在p H 6.0醋酸缓冲液中1和4 h的累积释放度(分别用X、Y表示)作为考察指标。在1~4 h作用下HPMC∶CP为1∶1、1∶2、1∶3、2∶1及3∶1的释放度分别为22.21%~74.19%、21.15%~69.43%、19.21%~62.14%、28.88%~87.62%及35.33%~91.55%,其中HPMC∶CP为3∶1的片芯在4 h后基本释放完全,HPMC∶CP为1∶3的片芯在4 h后仅释放62%。经过黏附片片重测定片芯均符合差异标准,不影响实验结果。在单因素实验中,黏附材料的含量比例对片芯的黏附力与释放度有直接影响,且HPMC与CP作为黏附材料测定的黏附力结果与释放度结果成正比,HPMC∶CP为1∶3的配方为最优配方。见表4。

mg

3 讨论

目前市场上很多钙剂用于补钙与预防铅中毒,其中很大一部分以碳酸钙为主要成分[6]。在碳酸钙肠定位驱铅该课题中,黏附性材料是决定药物疗效的重要因素[7,8],因此为测定最佳HPMC与CP比例,设计HPMC与CP释放度和黏附力的效果比较。另外,通过生物黏附片体外黏附力和释放度实验数据的比较,也有助于阐述对纳米碳酸钙肠定位驱铅提供有价值的理论依据[9]。本实验的测定以HPMC与CP为变量,碳酸钙为主药的体外黏附性和释放度,初步证实其具有小肠定位和生物黏附的双重功能。

基测定碳酸钙片剂的黏附力大小、释放率影响药物的吸收情况及药物维持时间,对体外黏附力和释放度测定的研究具有重要作用[10,11,12]。经过黏附片片重测定片芯均符合差异标准,不影响实验结果。在单因素实验中,黏附材料的含量比例对片芯的黏附力和释放度有直接影响,且HPMC、CP作为黏附材料测定的黏附力结果与释放度结果成正比,HPMC∶CP为1∶3的配方为最优配方。本实验中笔者通过测定碳酸钙生物黏附片作用到肠道的黏附力及释放度,为其定位驱铅研究的片剂制备提供理论基础。

参考文献

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[8]陈继英.生物黏附药物的研究进展[J].天津药学,2004,16(3):56-58.

[9]杨桂琴.中药新剂型-靶向制剂的应用[J].中国社区医师(医学专业),2013,15(4):222.

[10]刘娜,林华庆.生物黏附给药新剂型的发展近况[J].中国药师,2007,11:1133-1135.

[11]费玉元.羟丙甲基纤维素的合成工艺的改进研究[J].当代化工,2015,1:51-52.

黏附作用 篇7

1材料与方法

1.1材料与仪器

6周龄, 雄性清洁级SD大鼠40只, 平均体重(220±20)g, 购于河北医科大学实验动物中心( 合格证号:1405034)。 链脲佐菌素(STZ)、柠檬酸钠:美国Sigma公司; 内皮素-1 (ET-1) 及一氧化氮(NO) 试剂盒:武汉博士德生物工程有限公司;兔抗鼠多克隆ICAM-1(货号:PB0054)及VCAM-1抗体(货号:BA3840): 武汉博士德公司;血糖仪(罗康全活力型):德国罗氏公司;日立7600-010全自动生化分析仪:日本日立公司;多功能真彩色细胞图像分析管理:美国Media Cybernetics公司。

1.2方法

1.2.1动物模型建立适应性饲养1周,随机抽取30只按文献[2,3]方法略作改进, 一次性腹腔注射STZ 60 mg/kg,72 h后尾静脉取血,测血糖≥ 16.7 mmol/L, 血糖平稳1周后,确定为糖尿病大鼠。 剩余10只大鼠设为正常组,腹腔注射等量的柠檬酸钠缓冲液。

1.2.2分组与给药糖尿病大鼠随机抽分为模型对照组10只及三黄片组(哈药集团三精制药有限公司) 10只,其余弃去不用。 实验期间大鼠自由进食水,喂食标准饲料,每天更换垫料。 三黄片组给予生药10 g/kg体重灌胃,三黄片每天临时配制,其余两组每日给予同等剂量生理盐水灌胃。

1.2.3采血与血管免疫组化持续给药8周后,隔夜禁食12 h,不禁水。 以3%戊巴比妥(80 mg/kg)腹腔注射麻醉,腹主动脉采血测定血脂、NO及ET-1。同时留取胸主动脉,制备病理切片,SP免疫组化染色,应用图像分析软件分析大鼠胸主动脉组织中ICAM-1及VCAM-1阳性表达。

1.3统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析和处理,计量资料以均数±标准差(±s)表示,自身前后对照比较采用配对t检验, 多组间比较采用方差分析组间多重比较采用Dunnett′s t检验,以P < 0.05为差异有统计学意义。

2结果

模型对照组1只死于继发性腹部感染(可能为腹部注射STZ导致),三黄片组死亡1只,死因不详。

2.1三组给药前后血糖水平比较

三组给药前后血糖水平分别比较,差异无统计学意义(P > 0.05﹚;模型对照组及三黄片组给药前、给药后的血糖水平高于正常组(P < 0.05﹚,但模型对照组与三黄片组比较差异无统计学意义(P > 0.05﹚。 见表1

注:与正常组比较,*P < 0.05

2.2三组血脂水平比较

三组总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇及低密度脂蛋白胆固醇组间比较差异无统计学意义(P > 0.05﹚ 模型对照组及三黄片组三酰甘油高于正常组(P < 0.05),但模型对照组与三黄片组比较差异无统计学意义(P > 0.05﹚。 见表2。

注:与正常组比较,*P < 0.05

2.3三组ET-1及NO水平比较

模型对照组及三黄片组ET-1水平较正常组升高(P < 0.05),三黄片组ET-1水平较模型对照组下降(P < 0.05);模型对照组及三黄片组NO水平较正常组降低(P < 0.05),三黄片组NO水平较模型对照组升高(P < 0.05)。 见表3。

注:与正常组比较,*P < 0.05; 与模型对照组比较,▲P < 0.05;ET-1:内皮素-1;NO:一氧化氮

2.4三组ICAM-1及VCAM-1比较

模型对照组及三黄片组ICAM-1及VCAM-1阳性表达明显高于正常组(P < 0.01),三黄片组ICAM-1及VCAM-1阳性表达明显低于模型对照组(P < 0.01)。 见表4。 正常组可见少量ICAM-1(棕黄色颗粒样)表达(图1A),模型对照组及三黄片组可见大量的ICAM-1表达(图1B、1C);正常组可见少量VCAM-1 (棕黄色颗粒样)表达(图2A),模型对照组及三黄片组可见大量的VCAM-1表达(图2B、2C)。

注:与正常组比较,*P < 0.01;与模型对照组比较,▲P < 0.01;ICAM-1:细胞间黏附分子-1;VCAM-1:血管细胞间黏附分子-1

A:正常组(微弱表达);B:模型对照组(强表达);C:三黄片组(中等表达)

A:正常组(微弱表达);B:模型对照组(强表达);C:三黄片组(中等表达)

3讨论

糖尿病合并血管病变早期特征即动脉粥样硬化糖尿病动脉硬化是糖尿病大多数慢性并发症的共同病理基础,血管内皮细胞功能的受损是动脉硬化的启动因素。 高血糖导致氧化应激的增加及一些炎性因子的过度激活,使血管内皮功能紊乱,导致ET-1分泌增加及NO分泌减少,进而引起血流动力学紊乱,血流动力学失衡又会加重血管内皮损伤,其损伤是糖尿病动脉硬化的共同病理表现及重要原因[4,5]。 慢性炎症是动脉粥样硬化形成与进展的重要的独立危险因素[6]多种炎性因子如C反应蛋白、白细胞介素-6、肿瘤坏死因子-α 等介导的炎性反应与2型糖尿病血管并发症的关系密切,在糖尿病血管病变的发病机制中发挥重要作用。 大量证据显示,炎症导致细胞黏附分子异常、白细胞附壁等,最终引发内皮细胞功能异常,甚至凋亡。 ICAM-1及VCAM-1属于免疫球蛋白超家族成员,主要表达于血管内皮细胞、淋巴细胞、单核细胞等。 VCAM-1可引起表面效应细胞活化,免疫反应被启动,介导淋巴细胞等与血管内皮细胞黏附,损伤血管内皮,导致血管功能障碍[7]。 研究表明,动脉硬化的发生和发展与VCAM-1等黏附因子的过度表达相关[8]郑永强等[9]研究表明,抑制ICAM-1及VCAM-1的表达,可以防治糖尿病性动脉粥样硬化。

三黄片的主要成分为大黄、黄芩、盐酸小檗碱,有较多研究表明, 其组分具有抑制炎性因子表达的作用。 研究表明,大黄具有降低大鼠ET-1及升高NO的作用, 能够保护糖尿病大鼠内皮依赖的血管舒张功能,且能抑制ICAM-1及VCAM-1的表达,具有抗动脉硬化作用[10]。 小檗碱能降低肾脏血管内皮生长因子的表达,并能改善糖尿病肾病大鼠发病过程中的生化指标和肾脏病理损伤[11];小檗碱可减少白细胞介素-6及肿瘤坏死因子-α 的分泌, 减轻内脂素诱导的人脐静脉内皮细胞损伤[12];陶婷婷等[13]研究表明,在高胰岛素条件下, 人脐静脉内皮细胞分泌前列环素2(PGI2) 减少、ET-1增多;0.50、5.00 g/m L的小檗碱可提高人脐静脉内皮细胞对PGI2的分泌水平,减少ET-1的分泌,呈反向调节作用;朱凌波等[14]研究表明,小檗碱可显著降低高脂饮食兔血清总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白胆固醇水平,显著降低血清氧化低密度脂蛋白、脂蛋白相关磷脂酶A2、 单核细胞趋化蛋白-1、 基质金属蛋白酶-9水平, 升高血清基质金属蛋白酶抑制物-1水平, 可显著改善动脉硬化病变程度及稳定斑块,其机制可能与小檗碱能显著降低血清各项炎症标志物水平等作用有关。 李淼等[15]发现,三黄方及方中大黄、黄芩、黄柏在浓度范围100~1.5625 mg/L对小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞无显著毒性,三黄方通过抑制细胞因子NO、白细胞介素-1β、前列腺素E2、 肿瘤坏死因子-1α 释放发挥其抗炎作用。

卢聪等[16]研究表明,大黄素抑制血管平滑肌细胞增殖。 大黄酸能改善过氧化氢(H2O2)诱导损伤的血管内皮细胞形态,促进其增殖,抑制其凋亡,提升NO、一氧化氮合酶(NOS)的含量和超氧化物歧化酶(SOD)的活力,对血管内皮细胞有一定的保护作用[17]; 大黄酸能抑制白细胞介素-6诱导的血管平滑肌的促增殖作用和表型转换, 可能与调节基质金属蛋白酶-3/基质金属蛋白酶抑制剂1比值及增殖细胞核抗原的表达[18]。 景浩然等[19]研究表明,大黄酚可以在不影响小胶质细胞的细胞活性情况下,显著抑制内毒素(LPS)诱导的小胶质细胞炎性因子NO、肿瘤坏死因子-α 的表达。 李岩等[20]研究表明,黄芩苷能减少炎性因子肿瘤坏死因子-α 的过度表达, 其作用机制可能与黄芩苷抑制LPS引起的巨噬细胞CD36表达有关,从抗炎角度初步探讨了黄芩苷抗动脉粥样硬化的作用机制。 黄芩苷还可能部分通过上调NOS活性,增加NO含量, 从而实现抑制血管平滑肌细胞增殖的作用[21]。

本研究结果显示,复方清热类中药三黄片对糖尿病大鼠血糖及血脂无影响。 三黄片具有明显抑制ET-1升高、抑制NO降低的作用,但不能到达正常水平,推断其对血管内皮具有保护作用。 糖尿病大鼠胸主动脉ICAM-1及VCAM-1表达上调,表明其在糖尿病血管病变的发生、发展中起作用,而三黄片可以明显抑制血管ICAM-1及VCAM-1的表达。 本研究发现,三黄片具有改善血管内皮功能,同时抑制糖尿病大鼠早期ICAM-1及VCAM-1的过度表达,具有防治糖尿病血管病变的作用。