细胞核因子κB（共7篇）
细胞核因子κB 篇1
溃疡性结肠炎 (ulcerative colitis, UC) 又称慢性非特异性溃疡性结肠炎, 是一种原因尚不明确的大肠黏膜慢性炎症和溃疡性病变, 本病在我国发病呈上升趋势[1]。近年来, 随着对核因子 (nuclear factor kappa B, NF-κB) 结构和功能的深入研究, 发现NF-κB是一种转录因子, 广泛存在于各种组织中, 在免疫和炎症反应、细胞生长、病毒感染及其某些疾病急性期反应方面起重要作用[2]。研究资料显示, 免疫反应的异常是造成UC炎症和组织损伤的内在重要因素, 而细胞因子又在介导这一异常的免疫反应中起重要作用[3]。许多与此密切相关的细胞因子基因启动子或增强子部位均有κB位点, NF-κB在核内与κB序列结合促进各种炎性细胞因子如IL-4和IL-10等基因转录[4]。所以NF-κB活化可能是UC发生发展的关键所在。本实验测定活动期UC患者大肠黏膜NF-κB表达水平及血液中主要Th2细胞因子IL-4和IL-10水平含量, 探讨NF-κB在UC发病机制中的作用和作为UC活动性指标的临床价值, 及其与Th2细胞因子的相关性。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 对象
选择在门诊及住院经结肠镜检查确诊为UC的患者60例, 其中男34例, 女26例, 年龄21~80岁, 平均年龄 (49.51±1.82) 岁, 所有病例均为活动期, 按Truelove-Witts标准进行病情程度分级:轻度19例, 中度22例, 重度19例;采用Truelove内镜分级标准[5]将UC患者分为Ⅰ级15例, Ⅱ级27例, Ⅲ级18例。同时设立正常对照组30例, 为健康体检者或结肠镜检查正常并排除其他疾患者。溃疡性结肠炎诊断标准参考2007年在济南召开的第七次全国消化病分会炎症性肠病协作组制定的“对我国炎症性肠病诊断治疗规范的共治意见[6]”。1.1.2试剂和仪器兔抗人NF-κB p65多克隆抗体购自Neomarkers公司, SP试剂盒、DNA显色剂、EDA修复液 (1 mmol/L、p H6.0) 、IL-4和IL-10放射免疫分析 (RIA) 试剂盒购自北京福瑞生物工程公司。主要仪器如下:Olympus CF-H260电子结肠镜 (日本) , 德国Leica-DM1000光学显微镜及德国Leica-RM2016石蜡切片机, 国产常州TSJ-III全自动Y放射免疫计敏器。
1.2 方法
1.2.1 标本收集
UC组病例全部进行结肠镜检查并取活检, 在炎症最严重部位取活检至少2块, 正常对照组选择距肛门20 cm处结肠取活检。UC组患者均在凌晨抽取静脉血5 m L, 离心后取其血清, 立即放置于-20℃冰箱中保存, 待检测细胞因子。
1.2.2 免疫组织化学检测步骤
组织切片脱蜡至水30 m L/L, H2O2浸泡, 37℃15 min, PBS冲洗, 置ED-TA抗原修复液中, 95℃10 min, 室温自然冷却, PBS冲洗, 滴加8滴免疫性动物血清, 37℃15 min, 滴加兔抗人NF-κBp65多克隆抗体, 4℃过夜, 37℃复温60 min, PBS冲洗, 链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶工作液, 37℃孵育12 min, PBS冲洗, DAB溶液显色, 冲洗, 苏木素复染, 脱水, 中性树脂封片, PBS代替一抗作阴性对照。
1.2.3 血清实验室检查
采用放射免疫法, 按说明书程序操作检测UC组和正常对照组的IL-4和IL-10血清水平。
1.2.4 结果判断
所有切片均在同一条件的光学显微镜下观察, 结果以胞核或胞质中发现深黄色或褐色颗粒状物为阳性细胞 (NF-κBp65) 每张切片随机取5个不重复视野, 应用图像分析系统进行扫描分析, 取其灰度值的均值作为该切片的实验结果。阴性对照应无棕黄色反应产物。细胞因子测定结果, 由全自动Y放射免疫计数器预先编制程序, 直接给出有关参数、标准曲线及样品浓度。
1.2.5 统计学处理
采用SPSS11.5统计软件处理其数据资料, 结果以均数±标准差表示, 进行t检验, 相关分析采用Pearson法。检验水准α=0.05。
2 结果
2.1 UC与正常组织中NF-κBp65阳性表达的平均灰度值比较
UC组结肠黏膜上皮细胞、腺上皮细胞、固有层单核细胞和巨噬细胞的NF-κB表达较强, 且上皮呈连续性, 阳性细胞胞质和胞核都含有棕色颗粒 (见图1) 。正常对照组肠黏膜见散在的结肠上皮细胞, 腺上皮细胞有NF-κB表达 (见图2) 。UC组的NF-κB表达平均灰度值与正常对照组比较差异有显著性 (P<0.05, 见表1) 。
2.2 UC与正常组织中IL-4和IL-10表达比较
在UC组中, IL-4、IL-10表达与正常对照组比较差异无显著性 (P>0.05, 见表1) 。
注:1) 与正常组比较, P<0.05;2) 与正常组比较, P>0.05
注:1) 与轻度比较, P<0.01;2) 与中度比较, P<0.05;3) 与轻度比较, P>0.05;4) 与中度比较, P>0.05;5) 与Ⅰ级比较, P<0.01;6) 与Ⅱ级比较, P<0.05;7) 与Ⅰ级比较, P>0.05;8) 与Ⅱ级比较, P>0.05
2.3 NF-κBp65、IL-4和IL-10与UC患者病情UC活动性和内镜分级间的比较
活动期UC患者, 病情轻、中、重型NF-κBp65的表达灰度值比较, 病情中、重型低于轻型 (P<0.05, P<0.01) , 重型低于中型 (P<0.01) 。以内镜分级, Ⅲ级、Ⅱ级低于Ⅰ级 (P<0.01) , Ⅲ级低于Ⅱ级 (P<0.05, 见表2) 。UC患者血清中IL-4和IL-10在病情严重程度及内镜分级的比较中差异无显著性 (P>0.05, 见表2) 。
3 讨论
到目前为止, UC的特异性致病因素和发病机制仍未明确, 细胞因子在UC发病机制中的作用已得到公认。近年研究发现NF-κB调控UC患者细胞因子的释放, 从而参与了UC肠道的炎症和免疫反应, 提示NF-κB与UC关系密切[7,8], NF-κB在炎症性肠病 (inflammatory bowel disease, IBD) 的发生发展中占有重要的地位[9]。
NF-κB作为调节细胞基因转录的关键因子, 广泛存在于各种组织中, 能与许多细胞基因的启动子和增强子中的κB转录序列发生特异性结合, 转录因子NF-κB家族组成的二聚体复合物, 参与众多免疫炎症反应有关的基因转录调控以及细胞凋亡、肿瘤细胞的黏附和转移等多种生理病理过程的基因调控, NF-κB可调控任何含有κB位点的基因转录, 包括细胞因子及其受体, 促进或抑制凋亡蛋白、急性期反应蛋白、趋化分子、酶分子和转录因子等[10]。参与IBD发病的T2细胞因子IL-4、IL-10、IL-1β和TNF-α等都在转录水平受NF-κB调控[11,12]。本研究通过免疫组织化学方法检测NF-κB表达活性, 结果发现:NF-κB染色多位于肠黏膜腺上皮细胞胞质, 少数位于胞核, 胞质与胞核中出现棕黄色或褐色颗粒状物, 推测这种表达是NF-κBp65的活性形式, UC患者NF-κB表达水平明显增强;在水肿区, 临近溃疡区的表面上皮, 隐窝脓肿的隐窝上皮及上皮增生处表达明显, 且与病情活动性及内镜分级有相关性, 而NF-κBp65在正常组织无或低表达, 这表明NF-κB的诱导与UC的发生和发展密切相关[12];而且其表达水平与UC病情活动性及内镜分级密切相关, 实时地反映了UC活动情况, 通过检测其表达水平的强度, 亦有助于判断病变处于活动期或缓解期以及病情活动程度。
研究发现, 免疫因素在UC发病机制中起主要作用, 细胞因子在调节肠道免疫中扮演重要角色, 它们分为抑炎性细胞因子和促炎性细胞因子。研究证实, UC患者Th2增强, 特别是在缓解期UC患者有较多的类似肠易激综合征 (irritable bowel syndrome, IBS) 症状的发生率[13]。人类Th2细胞主要产生IL-4、IL-10及IL-13等细胞因子, 抑制炎症的作用十分明显, 而且UC结肠黏膜中细胞因子变化与其血清中变化基本一致[14]。本实验选择抑炎性细胞因子IL-4和IL-10作为实验观察指标, 结果显示, IL-4和IL-10在UC组的表达与正常对照组比较无差别 (P>0.05) , 并随着病情活动度的加重和内镜下分级的增加而无变化, 促炎性细胞因子通过免疫上调和促进炎症活动性而加重肠道黏膜的炎症反应和组织损伤, 而抑炎性细胞因子通过抑制上述多环节来发挥保护效应[15]。在UC组织中细胞因子IL-4和IL-10表达与病情活动性及内镜下严重度分级呈负相关性, 可以提示UC患者炎症恢复的连续性变化, 并可作为UC恢复监测的指标。
本研究表明, NF-κB在UC发病中有重要地位, 它参与了一系列免疫炎症反应有关的基因转录控制, 其表达水平对抑炎性Th2细胞因子的表达调控有重要意义, 并与UC的病情活动性密切相关, 通过检测其表达水平的强度及检测IL-4和IL-10水平对UC患者病情进行评估及治疗效果的判断, 可能具有潜在的指导作用, 这说明NF-κB在UC的疾病活动中可能起到枢纽作用, 当然, NF-κB调控的途径并不是UC的唯一发病机制, 复杂的因素及转录因子间相互作用, 有待进一步去研究。
细胞核因子κB 篇2
1 资料与方法
1.1 临床资料
1.1.1 实验标本
选取2015年9月-2016年1月在丽水市中心医院行鼻息肉摘除术的90例鼻息肉患者的鼻息肉组织 (术后病检为鼻息肉) 作研究对象 (实验组) 。其中, 男性51例, 女性39例;年龄30~50岁。同期取80例患者因单纯鼻中隔偏曲需切除鼻甲组织作为对照组。其中, 男性42例, 女性38例;年龄33~54岁。所有患者术前至少停止使用抗生素类或激素类药物治疗4周以上。
1.1.2 主要试剂及设备
PCR反应仪 (德国Biometra公司) , Trizol RNA试剂 (美国Invitrogen公司) , 凝胶成像分析仪 (美国Beckman公司) , 逆转录试剂盒 (美国Invitrogen公司) 。引物合成交由上海捷瑞生物工程有限公司完成。
1.2 实验方法
1.2.1 提取总RNA法
标本采集后装入无菌冻存管内, 标记后将其放入-80℃冰箱冷冻保存。标本统一称量, 每100 mg鼻息肉组织加入1 ml RNA分离液提取标本RNA, 利用紫外分光光度计检测提取的RNA纯度。RNA的纯度可以通过计算测定260 nm/280 nm的紫外吸收值来评定。RNA纯度测定值需在1.9~2.0, 这样的RNA可以用来进行后续实验。
1.2.2 逆转录RT体系配置及PCR反应
逆转录 (Real-time RT polymerase chain, RT) 反应体系20μl由标本总RNA 8μl, 随机引物2μl, 5×逆转录反应缓冲液4μl, 逆转录酶1μl, RNA酶抑制剂0.5μl, 0.1 mol/L二硫苏糖醇溶液1μl, 脱氧核糖核苷三磷酸2μl, 无RNA酶的双蒸水1.5μl混合配置而成。PCR反应体系20μl由正反向引物各1μl, Taq PCR mastermix 10μl, 逆转录产物c DNA 1.5μl, 双蒸水6.5μl配置而成。本实验中共有3对引物序列, NF-κB的引物序列正向:5'-CTTTTCGACTAC GCGGTGA-3', 反向:5'-GGCAGCTAGGTGCAAAAC A-3', 扩增片段长度为390 bp。IL-4的引物序列正向:5'-CAGTTCTACAGCCACCATGAGA-3', 反向:5'-CATGATCGTCTTTAGCCTTTCC-3', 扩增片段长度为188 bp。β-actin看家基因的引物序列正向:5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3', 反向:5'-TCCCT CTCAGCTGTGGTGGTGAA-3', 扩增片段长度为590 bp。NF-κB的PCR反应程序设定为95℃预变性5 min, 然后按下列设定程序进行循环:94℃加热15 s, 59℃退火40 s, 72℃延伸45 s, 34个循环后于72℃再延伸10 min。IL-4的PCR反应程序设定为95℃预变性5 min, 然后按下列设定程序进行循环:先94℃进行加热15 s, 然后设定63℃退火30 s, 之后72℃延伸45 s, 反复进行35个循环后再于72℃延伸10 min后结束反应。
1.2.3 检测方法
采用RT-PCR反应将提取的标本RNA在一定反应条件下逆转录为c DNA。RT-PCR反应按照说明书进行操作。PCR反应后, 取9μl Marker及9μl产物在琼脂糖凝胶上持续电泳30 min, 分离PCR产物, 凝胶成像仪上可清晰看见目的基因及看家基因的DNA扩增片段条带。NF-κB的扩增片段条带位于390 bp、IL-4的扩增片段条带位于188 bp、看家基因β-actin的扩增片段条带位于590 bp。用仪器自带分析软件以NF-κB扩增条带吸收度值 (DNF-κB) 与内对照β-actin扩增条带吸收度值 (Dact) 的比值 (DNF-κB/Dact) 为NF-κB m RNA的表达水平, 同样以DIL-4/Dact为IL-4的m RNA的表达水平。逐个计算标本的光密度比值后, 对NF-κB、IL-4的相对表达水平进行半定量数值统计分析。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 两组资料间的均数比较用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
RNA琼脂糖电泳显示, 28 s r RNA和18 s r RNA条带明亮清晰, 且第1条带 (28 s) 亮度为第2条 (18 s) 亮度的大约2倍, 显示提取的标本m RNA质量较好, 可以继续进行后面的实验 (见图1) 。实验组及对照组NF-κB、IL-4的m RNA均可见表达, 且其在实验组中的表达量高于其在对照组中的表达 (P<0.05) , 见图2、3和附表。
1~3:实验组;4~6:对照组
1:Marker;2~4:对照组;5~7:实验组;NF-κB在两组中可见表达, 条带位于390 bp
1:Marker;2~4:对照组;5~7:实验组;IL-4在两组中均见表达, 条带位于188 bp
(±s)
3 讨论
本研究采用逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR反应) 方法从基因水平来检测NF-κB和IL-4的表达, 更加准确地表明, NF-κB和IL-4在实验组中的表达均高于对照组, 其在鼻息肉的病理生理过程中可能发挥着极其重要的作用。
NF-κB是近年来发现的一组具有多种生物学效应的炎性转录因子, 人类最初发现其可以调控B免疫球蛋白的k轻链而将其命名为NF-κB。研究发现, NF-κB多以同源或异源二聚体P65和P50的形式与抑制蛋白家族成员形成复合体存在于人体组织细胞中。从近几年的研究来看, NF-κB在许多领域倍受关注, 其在机体的免疫反应、炎症反应、应激诱导反应、细胞的增殖与凋亡中都发挥着极其重要的作用[4]。NF-κB经典途径活化后基因主要编码MCP-1、IL-8等趋化因子, IL-4、IL-5、粒细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 等炎症细胞因子, 其中众多的炎症细胞因子如IL-4和TNF-α又可继续活化NF-κB信号通路, 诱发更多的炎症细胞因子表达水平上调, 导致最初炎症信号进一步放大, 形成“瀑布效应”, 这是NF-κB的正反馈调节, 同时也是NF-κB反应灵敏并迅速增加的重要机制[5]。有最新研究表明, NF-κB m RNA主要表达分布与鼻息肉组织的嗜酸性粒细胞、上皮细胞、部分腺细胞、浆细胞及血管内皮细胞的细胞核和细胞浆中。提示NF-κB与鼻息肉的关系密切, 可以通过抑制NF-κB的传导同路来抑制炎症细胞的分泌[6,7]。
IL-4是由抗原或丝裂原刺激B细胞、T细胞 (Th2) 产生的自分泌细胞因子, 它可活化肥大细胞及各种粒细胞, 与IL-5协同可刺激B细胞增殖并合成Ig E及Ig G1, 国外有研究表明, 在鼻息肉组织中的Ig E水平与IL-4水平呈正相关。在正常人体中Th1和Th2细胞处于相对平衡趋势, 机体存在多种保持Th1/Th2平衡的调节机制。其中认为IL-4、IFN-γ的相互调节是维持Th1/Th2平衡的关键因素[8]。Th1/Th2的平衡失调, Th2细胞因子表达占据主导可能与鼻息肉的发生发展关系密切, 而IL-4在Th2细胞因子产生和释放中发挥极其重大的作用[9,10]。NF-κB是介导细胞内信号传递最重要的核转录因子, NF-κB与Th细胞分化的关系的研究目前尚处于起步阶段。有研究发现, NF-κB参与Th1淋巴细胞免疫反应的调节过程, 但也有学者认为NF-κB通过对淋巴细胞中IL-4基因转录的调控, 使机体免疫反应向Th2淋巴细胞介导的体液免疫发展[11,12]。
本实验RT-PCR结果表明, NF-κB和IL-4在鼻息肉组织中基因表达水平高于正常鼻甲组织, 两者可能在鼻息肉的发病机制中起着至关重要的作用。当机体受到外界病源微生物的刺激时, NF-κB和IL-4的表达量骤然增加, 导致嗜酸性粒细胞的聚集, 继发加剧机体内Th2引发的炎症反应, 由Th2诱发的炎症反应在机体内不断加剧, 并不断刺激NF-κB和IL-4的进一步产生和释放。Th2所诱导的炎症反应不仅可双重刺激体内IL-4的产生, 与此同时也不断促使大量其他的炎症因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 、IL-5、IL-8、IL-17、和TNF-α等, 这些不同的炎症因子与IL-4相互协同, 使机体逐步失去了Th1/Th2的平衡。NF-κB和IL-4均参与鼻息肉的发病过程, 研究表明, 机体局部微环境的破坏可进一步诱发机体Th1/Th2的失衡, 上述两个方面相互作用, 对鼻息肉的发病起着非常重要的作用。继续深入研究NF-κB和IL-4的表达及其与鼻息肉的发病关联, 可以在今后鼻息肉的临床预防、后期诊断及用药治疗上提供充足的理论依据和参考指标。
参考文献
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细胞核因子κB 篇3
近年来,研究认为核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)作为一种多极性细胞转录因子,可调控多种炎症因子的基因转录。研究也发现NF-κB可通过调节凋亡相关基因而抑制凋亡,NF-κB参与抗凋亡的途径与细胞因子、“死亡受体”和凋亡调控基因有关[4,5]。本研究着重探讨NF-κB与细胞凋亡在SAP并发肺损伤中的作用。
1 材料和方法
1.1 动物与分组
SD大鼠112只,雌雄不限,体质量250～300 g,随机分为对照组、SAP组与二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)预处理组,各组再分为3、6、9和12 h四个亚组(对照组n=8;SAP组、PDTC预处理组n=10)。
1.2 主要试剂
牛磺胆酸钠(TAC),PDTC(sigma公司产品);兔源性NF-κBp65多克隆抗体(武汉博士德生物公司产品);细胞凋亡原位检测试剂盒(Roche公司)。
1.3 动物模型制备
大鼠术前24 h禁食不禁水,1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(0.3 m L/100 g),上腹部正中切口2 cm入腹,5号头皮针于十二指肠乳头附近穿刺十二指肠壁,逆行刺入胰胆管末端约1 cm,小动脉夹夹闭胰胆管两端,注入5%TAC(0.1 m L/100 g,0.1m L/min),注完10 min后拔除针头,放开动脉夹,逐层关腹,背部皮下注射生理盐水约3 m L补液。PDTC预处理组:建立SAP模型前1 h腹腔内注射PDTC(100 mg/kg)。对照组:手术方法同SAP组,胰胆管内注射等量生理盐水。
1.4 取材及组织切片
造模成功后各组分别于3、6、9和12 h处死,经左心室抽血3～5 m L,4℃3 000 r/min离心10 min,提取上清夜,-20℃冻存。4%多聚甲醛行灌注内固定后,取左肺上叶组织石蜡包埋、切片。
1.5 血清淀粉酶浓度检测
TOSHIBA TBA-40FR全自动血生化分析仪检测。
1.6 病理学检测
常规HE病理切片。
1.7 免疫组织化学检测
采用SP(Streptavitin/Peroxidase)法检测肺组织石蜡切片NF-κB的表达。一抗(兔抗P65多克隆抗体)工作浓度为1∶150。空白对照用0.01 mol/L PBS代替一抗。每组随机选取5张切片,每张切片随机选取5个高倍视野(×400),记数阳性细胞数。
1.8 肺组织细胞凋亡检测
采用TUNEL法进行检测。每组随机选取5张切片,每张切片随机选取5个视野(×400),记数凋亡细胞,以凋亡细胞占同一视野细胞总数的百分比表示,即凋亡指数(AI)。
1.9 统计学处理
所得数据均以均数±标准差(x±s)表示,组间差异显著性的比较采用单因素方差分析或t检验,相关性采用线性分析,均用SPSS 13.0软件完成。
2 结果
2.1 大体观察
对照组大鼠肺组织无明显病理改变。SAP各组肺组织均可见肺水肿,表面有散在出血点,部分大鼠胸腔有少量胸水,且随病程进展肺水肿逐渐加重。12 h组可见局部有小片状紫褐色肺不张区。PDTC预处理组表现同SAP组,但程度较轻。
2.2 光镜观察
对照组肺组织结构清晰,肺泡壁完整,肺间质无渗出。见图1。SAP各组肺组织均可见肺泡及肺间质水肿,间质内红细胞和炎性细胞渗出,水肿及细胞渗出随病程进展渐加重。6、9和12 h组还可见局灶性或小片状肺不张,塌陷实变或肺泡壁破裂。PDTC预处理各组炎性细胞浸润和红细胞渗出均有所减轻。见图2。
2.3 血清淀粉酶变化
SAP各组均明显高于对照组(P<0.05),6 h达峰值,9 h已明显下降,12 h继续下降但仍处于较高水平;PDTC预处理各组虽明显高于对照组,但低于SAP组(P<0.05)。见图3。
2.4 NF-κB在肺组织的表达
对照组肺组织中仅少量表达NF-κB,见图4。SAP3 h组NF-κB阳性信号较对组已明显表达,随时间进展,NF-κB阳性细胞数增多,表达强度增加,6 h组达高峰,9 h组表达开始下降,12 h仍保持较高水平。阳性信号主要表达于中性粒细胞、单核巨噬细胞、支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞及部胞质及胞核内,呈均匀棕黄色细颗粒状。见图5。PDTC预处理组阳性信号表达规律及部位同SAP组,见图6,但各时间点阳性细胞数均低于SAP组,差异有显著性(P<0.05)。见表1。
注:1)与SAP组比较,P<0.05;2)与正常组比较,P<0.05
2.5 肺组织细胞凋亡情况
对照组肺组织仅见少量肺泡间质细胞和肺泡上皮细胞凋亡。SAP组与PDTC预处理组可见中性粒细胞、单核/巨噬细胞、支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞及部分血管内皮细胞凋亡。表2显示,3 h组凋亡指数较对照组已明显升高,6 h组凋亡指数最高,9 h组凋亡指数开始下降,12 h组继续下降但仍保持较高水平(图7)。PDTC预处理组凋亡指数均低于相对应的SAP组,差异有显著性(P<0.05)。
注:1)与SAP组比较,P<0.05;2)与正常组比较,P<0.05
3 讨论
研究表明,在SAP时存在细胞网络失衡,不断放大的细胞因子级联反应使得体内的细胞因子遭到破坏,促炎细胞因子TNF-α、IL-1超过抗炎细胞因子如IL-2、IL-10和IL-12。NF-κB参与了细胞因子在内的多种炎症介质的基因转录[6]。本研究中,在牛磺胆酸钠致大鼠SAP的发病早期即观察到NF-κB的明显激活,其表达表现为随时程先升高又下降,表达高峰为6 h。阳性信号主要表达于中性粒细胞、单核巨噬细胞、支气管黏膜上皮细胞及肺泡上皮细胞的胞浆和胞核中,同时NF-κB的表达与肺组织的病理改变严重程度有相关性,说明了NF-κB早期就参与了SAP并发肺损伤的发病过程。血清淀粉酶浓度变化与镜下观察到胰、肺组织的病理改变一致。同时S血清淀粉酶浓度的变化与肺组织NF-κB阳性细胞数变化具有相关性。说明了胰酶在SAP发生的早期释放,在直接造成胰腺组织的损伤的同时,也可以通过NF-κB的激活介导的炎症反应导致肺损伤的发生。
目前的研究揭示引起凋亡主要有两条途径:细胞外的死亡受体途径及细胞内的线粒体途径[7]。NF-κB与细胞凋亡的关系密切,其参与多种凋亡相关基因的转录调控,具有抑制细胞凋亡作用及促细胞凋亡的双向作用[8]。NF-κB的激活可能是细胞生存与凋亡的调定点。但具体机制目前还不十分清楚。也有研究表明急性胰腺炎(AP)时胰腺细胞的死亡存在凋亡的形式,且AP的严重程度与胰腺细胞的凋亡率呈负相关性[9]。相继的研究表明[10,11],通过不同的方法提前诱导胰腺腺泡细胞凋亡,可以减轻AP病情,但SAP并发肺损伤时肺内细胞凋亡与NF-κB关系尚未见相关报道。本实验观察到大鼠SAP并发肺损伤时肺内凋亡细胞较对照组明显增加并且与肺损伤程度有一定关系。肺组织内的凋亡细胞包括中性粒细胞、单核巨噬细胞、肺泡和支气管上皮细胞及肺微血管内皮细胞等,且凋亡细胞数具有时间依赖性并呈动态变化。同时肺组织内细胞凋亡情况与肺组织的病理改变一致,以上都提示了肺组织内细胞凋亡不仅参与了PALI早期病理过程,且与PALI进展有一定关系。而NF-κB在肺组织内的表达与细胞凋亡的相关性,提示NF-κB的激活与肺组织细胞凋亡有一定内在联系,但具体机制有待进一步研究阐明。
本研究中通过腹腔注射PDTC预处理大鼠SAP模型并与SAP组及对照组进行对比观察,发现应用PDTC后,肺的肉眼及镜下病理改变均有不同程度改善。血清淀粉酶浓度也明显下调。从而提示PDTC可以缓解SAP并发肺损伤的症状。同时应用PDTC后,NF-κB阳性细胞数明显减少,染色强度减弱。PDTC为二硫氨基酸酯,是一种强的抗氧化剂。到目前为止,能够诱导NF-κB活化的刺激物,均可被抗氧化剂阻断。由此推测,PDTC对SAP并发肺损伤的保护机制可能为:PDTC可能通过直接降低NF-κB与DNA结合能力,干扰NF-κB激活的信号通路,并可稳定IκBα或增加IκBα的合成等机制来抑制NF-κB的活性[12]。应用PDTC后肺内凋亡细胞有所减轻,机制尚不清楚,可能与其抑制NF-κB的活性有关,尚需进一步深入研究。以上说明,降低NF-κB的活性或阻止其激活的手段将有助于改善ALI的严重程度。
总之,NF-κB激活与细胞凋亡在SAP发生发展中有着重要的作用,其激活是各种炎症反应及凋亡途径的通路。因此,如何选择性地抑制NF-κB的激活,特异性减少促炎基因的表达,特异性抑制组织细胞的凋亡,对改善重症胰腺炎肺损伤的临床治疗效果也有非常重要的现实意义。
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细胞核因子κB 篇4
1 对象与方法
1.1 对象
选择2006年11月~2007年7月间我院内分泌科住院的初诊断2型糖尿病患者20例,均符合WHO 1999年制定的糖尿病诊断与分型标准。其中,男性14例,女性6例,平均年龄(51.25±5.71)岁。一般情况较好,排除心、肝、胰腺疾病,排除感染、肿瘤、免疫性疾病,排除泌尿系感染,无严重高血压,近期未发生过糖尿病急性并发症和严重的慢性并发症。
选择同期参加门诊体检的正常对照者20例,男性11例,女性9例,平均年龄(54.30±7.39)岁。血糖、血压、血脂均正常,无心、肝、肾疾患。各组间年龄、性别构成、体重指数(BMI)、腰臀比(WHR)等比较,差异无显著性(P>0.05)。
1.2 方法
对所有受试者询问病史、年龄,测量血压以及人体参数:身高、体重、腰围、臀围等,计算BMI和WHR。所有对象抽血测定空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素值(FINS)、血白细胞计数(WBC)及中性粒细胞百分比(N%),计算胰岛素抵抗指数(Homa-IR)=FBG×FINS/22.5。流式细胞仪检测单核细胞中MCP-1蛋白和NF-κB的表达。然后,糖尿病组给予胰岛素强化治疗(7例采用胰岛素泵,13例采用三餐前短效胰岛素+睡前NPH),每天监测五点血糖,根据血糖水平调整胰岛素用量,将空腹及睡前血糖控制在3.9~8.3 mmol/L,3餐2 h后血糖<10 mmol/L。强化治疗的疗程为2周,强化治疗结束后亦复查上述指标。
1.2.1 流式细胞仪测单核细胞中N F-κB的表达
按FIX&PERM(购自美国Caltag laboratories公司)试剂盒说明进行操作。单核细胞的标记:加样管中加入PE-Cy5标记的鼠抗人CD14单抗2.5μL,再取100μL肝素钠抗凝血加入,振荡,避光反应。单核细胞的固定:取100μL固定液A加入加样管中固定,避光反应,加入PBS 2 m L离心弃上清。单核细胞的破膜及免疫荧光抗体染色:在对照管中加入5μL PE标记的小鼠抗人NF-κB P65单抗(试剂购自美国Santa Cruz公司),在检测管中加入5μL PE标记的小鼠抗人NF-κB P65单抗相应的Ig G同型免疫球蛋白单抗(试剂购自美国Santa Cruz公司),振荡,避光反应;加入PBS 2 m L后离心弃上清,加生理盐水至500μL,上流式细胞仪(美国Coulter公司)检测分析。
1.2.2 流式细胞仪测单核细胞上MCP-1蛋白的表达
加样管中加入PE-Cy5标记的鼠抗人CD14单抗2.5μL,PE标记的鼠抗人MCP-1单抗(试剂购自美国Bioscience公司)1.25μL,对照管中加入PE-Cy5标记的鼠抗人CD14单抗2.5μL,与PE标记的鼠抗人MCP-1单抗相应的Ig G同型免疫球蛋白单抗(试剂购自美国e Bioscience公司)1.25μL,加入肝素抗凝血100 u L,振荡,避光反应;加入溶血剂2 m L,避光反应,离心弃上清,PBS洗3遍,加生理盐水至500 u L,上流式细胞仪检测分析。
1.3 统计学处理
计量资料以均数±标准差表示,治疗前后两组间差异分析应用配对t检验,强化治疗前后和正常对照组间分析应用方差分析,数据的相关分析应用直线相关分析,所有统计均用SPSS15.0统计软件包进行,以P<0.05判定差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般资料分析
在糖尿病组和正常对照组中,BMI、WHR、SBP、DBP差异无统计学意义(P>0.05),FBG在糖尿病组明显高于正常对照组(P<0.05)(表1)。
2.2 糖尿病组治疗前后与正常对照组外周血单核细胞上MCP-1和NF-κB表达水平的比较
糖尿病组(治疗前)单核细胞上MCP-1和NF-κB表达显著高于正常对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。糖尿病组经胰岛素强化治疗后,血糖达标时间为(3.40±1.76)d,单核细胞上MCP-1和NF-κB表达水平较治疗前明显下降(P<0.01),但治疗后单核细胞上MCP-1和NF-κB的表达水平仍较正常对照组高,差异有显著性(P<0.01)(表2)。
2.3 糖尿病组治疗前后FBG、P2hBG、胰岛素抵抗指数(Homa-IR指数)、WBC和N%的变化
胰岛素强化治疗后FBG、P2hBG、Homa-IR指数(取对数)、WBC、N%明显降低,差异有统计学意义(P<0.01)(表3)。
2.4 糖尿病组强化治疗前后单核细胞上MCP-1和NF-κB表达水平降低与FBG、P2hBG、Homa-IR相关性分析
胰岛素强化治疗后,单核细胞上MCP-1和NF-κB表达水平降低与FBG、P2h BG、Homa-IR的下降均无相关性(r分别为0.033、0.274、0.028,P>0.05);(r分别为0.501、0.250、0.412,P>0.05)。
注:1)与对照组比较,P<0.01;2)示与治疗前比较,P<0.01
3 讨论
越来越多的研究显示,慢性炎症在2型糖尿病的发生和发展中占有重要地位,炎症标志物如C反应蛋白(C reactive protein,CRP)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor-α,TNF-α)、MCP-1和NF-κB的增高,在2型糖尿病以及糖尿病血管并发症的发生、发展中起着举足轻重的作用[2]。
MCP-1是细胞趋化因子CC亚家族中的一员,是介导炎症反应的的关键细胞因子,也是特异作用于单核细胞的强趋化蛋白。MCP-1基因启动子部位存在NF-κB和AP-1的结合位点,可与NF-κB上的DNA结合,从而激活基因的转录。NF-κB是一种能调节多种炎症和免疫基因表达的重要转录调节因子,它在胞浆内与NF-κB抑制蛋白(IκB)结合呈非活化状态,一旦被病毒、氧化剂、炎症细胞因子等刺激活化后,可与IκB解离并转入核内与特异的启动子结合,诱导许多因子的转录,如TNF-α、IL-6、MCP-1、细胞间黏附分子-1(Intracellular adhesion molecule-1,ICAM-1)、血管细胞间黏附分子-1(Vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)等,从而调控基因的表达,参与了糖尿病及其并发症的发生、发展[3、4]。本研究显示,初诊断的糖尿病组血单核细胞上MCP-1、NF-κB表达显著高于正常对照组(P<0.01),提示了糖尿病患者体内存在增强的炎症反应。因此,针对糖尿病患者的治疗既应该很好地控制血糖,又要减轻其炎症反应,才能更好地延缓糖尿病及并发症的进程。
现在多数研究证明,胰岛素是最强、最持久的降糖药物,能保护胰岛β细胞功能,因而缓解高糖毒性和高脂毒性[5]。本实验从另一方面证实,胰岛素还具有一定的抗炎作用,对2型糖尿病患者体内的炎症反应具有抑制作用,更突显了胰岛素强化治疗的重要性。本实验结果显示,糖尿病组经胰岛素强化治疗后,外周血单核细胞上MCP-1和NF-κB表达水平较治疗前明显下降(P<0.01),且WBC、N%也明显降低(P<0.01),提示了体内的炎症反应减轻,暗示胰岛素具有一定的抗炎效应。JESCHKE等[6]通过内毒素诱导炎症大鼠模型发现,胰岛素可通过抑制IL-1、IL-6、TNF-α等多种炎症因子的表达水平,削弱了大鼠全身炎症反应,证实胰岛素具有抗炎效应。目前,胰岛素的抗炎机制尚不十分明确。有学者提出,胰岛素可以抑制炎症因子的产生和释放。DANDONA等[1]发现,输注胰岛素可使单核细胞NF-κB浓度降低、IκB浓度升高,同时血浆I-CAM-1、MCP-1、PAI-1等多种炎症因子水平明显降低。TAKEBAYASHI等[7]报道,2型糖尿病患者经胰岛素强化治疗2周后证实,血hs CRP、MCP-1等炎症因子水平下降,进一步说明胰岛素有一定的抗炎症效应。另一方面,胰岛素还能增加抗炎因子的合成与释放,如IL-4、IL-10抗炎因子在胰岛素使用后水平明显升高[8]。另外,GAO等[9]发现,胰岛素可诱导一氧化氮(NO)的合成和释放,NO不仅能调节血管舒张,还是一种重要的抗炎分子。因此,对2型糖尿病患者进行胰岛素强化治疗,不但可以有效地控制血糖水平,降低高糖对β细胞的毒性作用,更降低了患者体内众多炎症因子的水平,减轻慢性炎症反应,延缓微血管和大血管并发症的发生、发展。另外,目前认为胰岛素抵抗亦是一个慢性非特异性炎症持续过程[10]。本实验研究显示,胰岛素强化治疗后可降低Homa-IR指数,增加胰岛素敏感性,改善了胰岛素抵抗状态。然而,血单核细胞上MCP-1和NF-κB表达水平的降低与Homa-IR的下降无显著相关性,提示胰岛素强化治疗后,体内MCP-1和NF-κB表达的降低不完全依赖于胰岛素抵抗的改善,抑或短期的胰岛素抵抗,尚不足以对体内MCP-1和NF-κB的表达产生明显的作用。对此问题,尚有待更多的研究进一步探讨。
总之,2型糖尿病与炎症反应的关系甚为密切。本研究实验显示,胰岛素强化治疗后可降低患者体内炎症反应因子MCP-1和NF-κB表达水平,同时降低了FBG、P2hBG、Homa-IR,提示胰岛素不仅具有控制血糖、改善胰岛素抵抗的功效,还具有一定的抗炎作用,抑制炎症反应,对预防和延缓2型糖尿病及其血管并发症的发生、发展起着重要的作用。
参考文献
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细胞核因子κB 篇5
关键词：4-氨基水杨酸半乳糖苷,RAW264.7细胞,肿瘤坏死因子-α,核因子κB p65
炎性肠病的年发病率约为2.2/10万[1], 而炎性肠病患者发生结直肠癌的风险较非炎性肠病者大大增加, 患炎性肠病8~10年后结直肠癌的发病率每年以0.5%~1%递增, 30年后高达18%[2]。溃疡性结肠炎 (ulcerative colitis, UC) 是炎性肠病中常见的一个类型, 反复发作的慢性炎症常给患者带来无尽的痛苦。氨基水杨酸是目前公认的治疗UC特别是轻中型UC患者的首选药物, 其疗效确切, 在此基础上, 实验室合成了氨基水杨酸的系列衍生物, 本实验中的4-氨基水杨酸半乳糖苷 (4-ASA半乳糖苷) 是4-氨基水杨酸与半乳糖通过糖苷键合成的前体药物之一, 目的是减少4-ASA在上消化道的吸收, 增加疗效。实验采用脂多糖 (LPS) 诱导RAW264.7细胞产生炎症细胞因子肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 及核因子κB (NF-κB) p65, 观察4-ASA半乳糖苷的体外药效学特点, 为其成为抗溃疡性结肠炎药物提供实验依据。
1 仪器与试药
LPS (L2880, Sigma公司) ;TNF-α试剂盒购自上海瑞齐生物制品有限公司;NF-κB p65抗体sc-8008 (鼠抗一抗, 北京中杉Santa Cruz分装) ;快捷型酶标羊抗鼠/兔Ig G聚合物KIT-5030 (二抗, 北京中杉公司) ;六孔板 (Corning公司) ;4-ASA半乳糖苷为山西医科大学药物化学研究所提供。
BJ-2CD型洁净工作台 (上海博迅实业有限公司医疗设备厂) 、KDC-40型低速离心机 (长沙高新技术产业开发区湘仪离心机仪器有限公司) 、311二氧化碳培养箱 (上海力申科学仪器有限公司) ;ELX-800酶标仪购自美国宝特公司。
2 方法
2.1 细胞培养
RAW264.7细胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基培养, 1~2 d换液1次, 2~3 d传代1次。待细胞处于对数生长期且形成致密融合单层后分组处理。
2.2 药物的配制
精确称取4-ASA半乳糖苷0.0016 g, 加二甲基亚砜 (DMSO) 和无血清培养基至1 m L溶解 (DMSO<0.5%) , 稀释, 制得浓度为100、400、1600 mg/L的溶液。滴加药物时使终浓度为10、40、160 mg/L。
2.3 ELISA检测4-ASA半乳糖苷对细胞上清中TNF-α的作用
调整细胞密度为1×109/L, 种96孔板, 实验设正常对照组、模型组、药物低、中、高剂量组, 每组设5个复孔。37℃、5%CO2孵箱孵育24 h后, 模型组、药物低、中、高剂量组各加入终浓度为5 mg/L的LPS 90μL, 正常对照组加等量无血清的DMEM培养基, 继续培养;60 min后, 药物低、中、高剂量组每孔加入4-ASA半乳糖苷10μL (终浓度分别为10、40、160 mg/L) , 正常对照组、模型组加等量无血清的DMEM培养基, 继续孵育24 h。培养结束时取上清, 按照ELISA试剂盒测定上清中TNF-α的含量。
2.4 细胞免疫法检测4-ASA半乳糖苷对NF-κB p65的作用
2.4.1实验分组
实验设正常对照组、模型组、4-ASA半乳糖苷10、40、160 mg/L组。取对数生长期的RAW264.7细胞, 调整细胞密度为1×106/m L, 种6孔板, 37℃、5%CO2孵箱孵育。待细胞长满盖玻片, 模型组与药物组各加300μL LPS, 对照组加相应的培养基, 1 h后, 药物组各加相应的药物300μL, 正常对照组与模型组加相应的培养基培养24 h。使LPS的终浓度为5 mg/L, 药物的终浓度分别10、40、160 mg/L。
2.4.2细胞免疫
培养结束后取出相应的6孔板, 弃去液体, 室温下用PBS洗2次, 不要让细胞干片;用4%中性福尔马林固定10 min, PBS漂洗3次, 每次2 min;滴加3%过氧化氢, 没过细胞5 min, 消除内源性过氧化物酶, PBS洗4次, 每次3 min;滴加一抗 (NF-κBp65一抗浓度为1∶100) 每孔100μL, 4℃冰箱过夜;用PBS代替一抗做阴性对照。取出6孔板, PBS洗3次, 每次2 min;滴加二抗工作液, 没过细胞, 37℃孵育20min, PBS洗3次, 每次2 min;二氨基联苯胺 (DAB) 显色, A、B、C各取50μL于1000μL蒸馏水中, 混匀。取出盖玻片, 显色, 用自来水终止;苏木精复染:苏木精染色, 过盐酸、氨水, 75%、90%无水乙醇脱水, 二甲苯透明;中性树胶封片。显微镜下观察。结果判定[3]:染色结果以细胞质、细胞核出现棕黄色颗粒为阳性。阳性细胞率<0.05为0分, 0.05~0.25为1分, >0.25~0.50为2分, >0.50~0.75为3分, >0.75为4分;胞质染色阴性为0分, 浅黄色为1分, 棕黄色为2分, 棕褐色为3分;细胞核阳性细胞<5%为0分, 5%~25%为1分, >25%~50%为2分, >50%~75%为3分, >75%为4分。NF-κB p65将三个分数相加, 每个标本取5个视野进行评分后取其均值。
2.5 统计学方法
采用SPSS 16.0软件进行统计分析, 计量资料数据以均数±标准差 (±s) 表示, 采用单因素方差分析, 两两比较进行LSD-t检验。计数资料以率表示, 采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
3 结果
3.1 4-ASA半乳糖苷对细胞上清中TNF-α的作用结果
由表1可知, 与正常对照组相比, 模型组TNF-α的表达显著升高, 与模型组相比, 4-ASA半乳糖苷10、40、160 mg/L组TNF-α的表达显著降低 (P<0.01) 。
注:与正常对照组比较, aP<0.05;与模型组比较, bP<0.01;TNF-α:肿瘤坏死因子-α;ASA:氨基水杨酸
3.2 4-ASA半乳糖苷对NF-κB p65的作用
由表2可知, 正常对照组NF-κB p65在细胞质和细胞核几乎不表达, 与对照组相比, 模型组细胞质与细胞核NF-κB p65表达显著增多 (P<0.01) ;与模型组比较, 4-ASA半乳糖苷10 mg/L组细胞质和细胞核NF-κB p65的表达显著减少 (P<0.05) ;与模型组比较, 40、160 mg/L组细胞质和细胞核NF-κB p65的表达更少, 差异有高度统计学意义 (P<0.01) 。细胞免疫结果见图1。
注:与正常对照组比较, aP<0.01;与模型组比较, bP<0.05, cP<0.01;NF-κB;ASA:氨基水杨酸
4 讨论
溃疡性结肠炎是以大量炎症细胞浸润, 肠道炎症损伤为主要表现的慢性炎症性疾病[3]。目前的研究认为[4,5], 促炎因子与抗炎因子之间的平衡失调是UC发病的一个主要原因, TNF-α主要由单核细胞和巨噬细胞产生, 是重要的促炎症因子, 并参与某些自身免疫病的病理损伤, 有研究表明[6,7], TNF-α的表达在UC活动期升高, 包括外周血单核细胞及血清中, TNF-α能介导肠黏膜损伤。林平等[8]研究发现, 在UC活动期, 患者血浆及粪便中的TNF-α亦升高。以上结果提示, 如果抑制TNF-α的表达将会使UC的症状得到缓解。实验中4-氨基水杨酸半乳糖苷可抑制TNF-α的表达, 为其抗炎作用提供了基础。
细胞核因子κB 篇6
1 资料与方法
1.1 一般资料
选择青岛市市立医院2015年12月~2016年5月择期行肺叶切除术的肺癌患者40例,本次研究经医院伦理委员会批准,患者签署知情同意书。采用随机数字表法将患者分为依达拉奉组和对照组,每组20例。
入选标准:ASAⅠ级或Ⅱ级;年龄49~75岁,体重55~86 kg;术前无严重的心、肺功能障碍,肝、肾功能未见异常,无免疫、内分泌、神经以及精神系统等疾病;近期无感染。
排除标准:术中单肺通气失败;无法维持氧合;术中持续的血流动力学不稳。
两组患者在性别比例、年龄、体重、手术时间以及单肺通气时间等方面比较,差异无统计学意义(P>0.05),具有可比性。见表1。
1.2 麻醉方法
麻醉诱导:患者入手术室开放外周静脉通路,常规监测患者心率(HR),无创血压(BP),心电图(ECG),脉搏血氧饱和度(Sp O2),行全身麻醉,静脉依次注射咪唑安定0.03 mg/kg、芬太尼3μg/kg,高流量(新鲜气流量8~10 L/min)吸入8%七氟醚,待意识消失后将新鲜气流量降至2 L/min、七氟醚呼气末浓度降至2%,静脉注射维库溴铵0.1 mg/kg,3 min后插入双腔支气管导管。两组患者均用纤维支气管镜确定双腔管导管的位置。诱导后,对患者进行桡动脉和中心静脉穿刺置管,测定平均动脉压(MAP)和中心静脉压(CVP),以便观察患者血流动力学方面的变化。依达拉奉组给予依达拉奉(商品名:必存,江苏先声药业有限公司,批号:80-130103)0.5 mg/kg加入氯化钠注射液100 m L,30 min内静脉滴注完毕;对照组给予等量氯化钠注射液。
麻醉维持:两组患者均间断静脉注射维库溴铵0.04~0.08 mg/kg、芬太尼0.05~0.1 mg,七氟醚呼气末浓度维持在1.7%~2.8%。单肺通气时双腔管非通气侧与大气相通,呼吸参数调整为8~10 ml/kg,呼吸频率为12~14次/min,维持呼气末二氧化碳分压(Pet CO2)在35~40 mm Hg。
术毕,待患者意识恢复,吞咽及咳嗽反射活跃,潮气量及每分通气量恢复正常,拔出双腔气管导管,安全送往恢复室观察。
1.3 观察指标
1.3.1 术中指标
应用Datex-Ohmeda AS/3多功能监测仪(Datex-Ohmeda公司,美国)监测HR、ECG、Sp O2、BP、PETCO2、七氟醚呼气末浓度和气道阻力。观察记录两组患者的手术时间、单肺通气时间以及麻醉诱导后(T0),单肺通气即刻(T1),单肺通气后60 min(T2),肺组织离体即刻(T3),膨肺后30 min(T4),术后120 min(T5)的HR、MAP和CVP。
1.3.2 ELISA法检测血浆IL-6、IL-10的浓度
两组患者分别在T0~T5时刻抽取静脉血,严格按照试剂盒使用说明测定血浆IL-6、IL-10的浓度,并计算IL-6/IL-10比值。
1.3.3 Western blot法检测肺组织TLR4蛋白、细胞核NF-κB蛋白
于T1时刻在预切除的肺叶上距肿瘤边缘>5 cm处取第一块肺组织,肺叶离体时在第一块取材临近部位再取第二块肺组织,-80℃保存待检[6]。取肺组织切成细小的碎片,加入组织/细胞裂解液,用玻璃匀浆器匀浆,离心后取上清,即为肺组织蛋白;严格按照核蛋白提取试剂盒提取肺组织核蛋白。BCA法检测蛋白浓度,加入样本孔中,经SDS-PAGE电泳分离蛋白,转移至PVDF膜上,封闭后加入兔抗人TLR4一抗、兔抗人NF-κB P65一抗,兔抗人β-action,4℃孵育过夜,洗涤后加入辣根过氧化酶标记的山羊抗兔二抗,孵育,加入化学发光试剂,曝光后显影,定影,分析目标条带灰度值与β-action的灰度值的比值,以反应蛋白表达水平。
1.4 统计学处理
采用SPSS 17.0统计软件对数据进行分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,组内比较采用重复测量设计的方差分析,组间比较采用独立样本t检验。计数资料采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 两组患者血流动力学的比较
两组患者围术期的血流动力学平稳,T0~T5时点的HR、MAP、CVP比较,差异无统计学意义(P>0.05),组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。
注:T0:麻醉诱导后,T1:单肺通气即刻,T2:单肺通气后60 min,T3:肺组织离体即刻,T4:膨肺后30 min,T5:术后120 min;HR:心率,MAP:平均动脉压,CVP:中心静脉压
2.2 两组患者血浆IL-6、IL-10浓度及IL-6/IL-10比值的比较
与T0时点比较,两组患者血浆IL-6、IL-10浓度以及IL-6/IL-10比值于T2~T5时刻明显上升(P<0.05)。与对照组比较,依达拉奉组患者血浆IL-6浓度以及IL-6/IL-10比值于T2~T5时刻显著降低(P<0.05)。见表3。
注:与组内T0比较,▲P<0.05;与对照组同时点比较,*P<0.05;T0:麻醉诱导后,T1:单肺通气即刻,T2:单肺通气60 min,T3:肺组织离体即刻,T4:膨肺后30 min,T5:术后120 min
2.3 两组患者TLR4和NF-κB P65蛋白表达的比较
与T1比较,两组患者肺组织TLR4、细胞核NF-κB P65蛋白的表达水平于T3时刻明显上升(P<0.05)。与对照组比较,依达拉奉组肺组织TLR4、细胞核NF-κB P65蛋白的表达水平于T3时刻显著降低(P<0.05)。见表4。
注:与组内T1比较,▲P<0.05;与对照组同时点比较,*P<0.05;T1:单肺通气即刻,T3:肺组织离体即刻
3 讨论
单肺通气已被广泛用于胸外科手术,为手术提供良好术野。但单肺通气属非生理状态,开胸侧肺完全萎陷,萎陷肺组织血流减少、肺泡组织缺氧和通气/血流比例失调,手术操作、机械通气也会造成肺组织损伤,膨肺时缺血再灌注进一步加重机体炎性细胞因子失衡进而促发全身炎性反应[7,8,9],从而严重影响患者预后。所以,有效抑制单肺通气患者过度炎性反应至关重要。
依达拉奉是一种新型氧自由基清除剂,可以抑制脂质自由基生成,并抑制促炎性细胞因子表达[10]。IL-6是机体炎症反应早期应答因子,其水平急剧上升可反映促炎性因子大量激活,而IL-10是机体重要的抗炎性细胞因子,能负性调节炎性应答反应[11,12]。IL-6/IL-10比值可大致反映机体促炎/抗炎性细胞因子相对平衡,预测患者预后,比值升高提示预后不佳。本研究结果表明,依达拉奉组在T2~T5时刻,IL-6血浆浓度和IL-6/IL-10比值显著低于对照组,提示依达拉奉可有效抑制促炎性细胞因子生成,维持促炎/抗炎性因子相对平衡,与相关研究结果一致[1]。
TLR4是机体固有免疫反应的重要组成部分,是一种细胞表面信号传导跨膜受体,在人体内分布广泛,几乎表达于所有的细胞系[13,14]。单肺通气时引起的病理变化导致内源性配体与TLR4结合[15,16],最终激活NF-κB,NF-κB是由P50亚基和P65亚基组成的异源二聚体,激活后与抑制蛋白分离,转入细胞核内,P65末端含有反式激活结构域,有激活基因转录功能,调节机体炎症反应基因表达,从而促进TNF-α、IL-6等促炎性细胞因子表达与释放[17,18,19,20]。本研究结果显示,依达拉奉组肺组织TLR4、细胞核内NF-κB P65蛋白表达水平显著低于对照组,与促炎性细胞因子IL-6血浆浓度和IL-6/IL-10比值变化相一致,提示依达拉奉可通过抑制TLR4/NF-κB信号转导途径而减少促炎性细胞因子生成,从而抑制过度炎症反应,维持促炎/抗炎性细胞因子相对平衡。
细胞核因子κB 篇7
1 NF-κB的生物学特性
1.1 NF-κB的结构
NF-κB几乎存在所有的细胞中, 它首次发现于成熟B细胞核的提取物中, 因其能与B细胞免疫球蛋白的κ轻链基因增强子κB序列特异性结合而被命名。NF-κB家族中包括Rel A (p65) 、NF-κB1 (p50) 、NF-κB2 (p52) 、C-Rel和Rel B, 它们以同源性二聚体或者异源性二聚体的形式存在, 其中Rel A/NF-κB1是主要存在形式。这些蛋白亚型的N端共有一个由300个氨基酸组成的肽链, 称为Rel同源结构域, 包括二聚体化结构域、DNA结合结构域[1]、核定位序列 (HLS) 和IкB结合位点[2], 可使NF-κB从细胞质向细胞核转移, 调节靶基因的转录[3], 但是它们的C端存在差异。
1.2 NF-κB的功能
基于NF-κB的结构特点, 其主要功能是可以和DNA结合, 调节转录。但是各亚型之间略有不同。NF-κB1和NF-κB2的主要功能是结合DNA, 而Rel A、C-Rel和Rel B没有前体, 含有转录活性区, 可调节转录激活作用。NF-κB激活可调节趋化因子、细胞因子、血管生成因子的表达, 广泛参与细胞分化和凋亡、免疫反应[3]、炎性反应、肿瘤生成及转移等病理生理过程。在高尿酸血症的小鼠模型中发现, NF-κB信号通路被激活, TNF-α、MCP-1和趋化因子的表达上调[4]。肿瘤的生成与细胞凋亡和抗凋亡水平失衡有关, NF-κB一方面可以促进细胞凋亡, 通过上调p53和Ikappa B表达[5、6], 另一方面可以抑制细胞凋亡, 促进抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表达[7]。
1.3 NF-κB的活化
静息状态时, NF-κB与其抑制物IκB结合形成复合物, 从而掩盖NF-κB的核定位序列, 以无活性状态停留于细胞质内[8]。在受到细胞因子、氧自由基、病毒等外来因素的刺激, 抑制剂激活酶 (IKK) 被激活而引发IκB磷酸化被降解, 释放NF-κB, NF-κB进入细胞核与靶基因κB序列结合调控其表达[9]。
2 NF-κB与肾细胞癌
2.1 NF-κB与肾细胞癌的发生
肾细胞癌的发病率仅次于膀胱肿瘤, 2008年全球癌症数据统计显示肾细胞癌的发病率为每年约271000例[10], 且呈逐年上升趋势。肾细胞癌的病因尚不清楚, 但是相关危险因素已经明确, 肥胖、吸烟、高血压、肾脏疾病及病毒性肝炎均可增加其发病机会[11]。NF-κB是体内抗凋亡途径的关键因子, 持续激活该信号通路可使细胞恶性增值, 致使肿瘤的发生。香烟中存在大量的致癌物质, 其具体的致癌信号通路仍不清楚, 但是可以激活NF-κB, 而且活化的强度与烟雾的接触时间和剂量呈相关性[12]。有报道, 在用NF-κB的超级抑制物IκB处理的已致病为高血压的小鼠模型中, 肿瘤坏死因子 (TNF-α) 水平降低, 出现蛋白尿的小鼠减少到一半, 血管周围管状纤维化和肾脏的炎性细胞渗出物明显减少[13]。说明抑制NF-κB信号通路可以降低高血压肾病的发病率, 同时也减少了肾细胞癌发病的危险因素。肿瘤的形成也和特定的基因的异常表达有关。P53抑癌基因是生物体内一种抑制细胞转变癌细胞的基因, 其编码的P53蛋白可以修复损伤的DNA, 如果修复失败, P53蛋白即启动程序性死亡 (凋亡) 过程诱导细胞自杀, 阻止有癌变倾向的突变细胞的生成, 从而防止细胞恶变。肾癌细胞中通常保留野生型而功能不活跃的p53, 而且被抑制。动物实验发现, 在肿瘤移植的裸鼠模型中, 9-氨基吖啶和抗疟药奎纳克林形成的混合药物可以激活P53基因而抑制NF-κB, 起到抗肿瘤的作用[14]。c-myc基因可以易位、可调节多种物质, 也可以促进细胞分裂, 使细胞无限增殖, 参与多种肿瘤的发生发展。基因的扩增、重排或者启动子的插入均可导致c-myc致瘤性转化。研究发现在早期和转移的肾细胞癌中c-myc均表达, 且与细胞核多形性的级别有关, 级别越高所含有的增殖细胞越多[15], 烟雾中的镉盐能激活细胞中的NF-κB, 通过NF-κB进一步促进癌基因c-myc的表达[16]。
2.2 NF-κB与肾细胞癌的增殖
肾细胞癌的发展与NF-κB的促进细胞增殖和抗凋亡作用密切相关。且许多研究表明NF-κB通路活化可以促进肾细胞癌和其他肿瘤的生长。如前述, c-myc基因可促进肾细胞癌的发生, 也可调节癌细胞分裂, 使细胞增殖[17]。该基因的上游启动子序列中含有κB反应元件, 所以NF-κB的活化必然激活c-myc基因[18]。实验研究发现, 单纯的肾细胞癌组和用吡咯烷二硫基甲酸盐 (pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC) 处理的肾细胞癌组相比较, 后者的NF-κB的活性受到抑制, 抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表达较前者增多, 而前者的促凋亡蛋白明显增加[7], 显示PDTC的抗肿瘤作用。实验研究显示在用TNF-α诱导的肾癌细胞中, NF-κB的表达水平明显升高, 而且NF-κB靶向作用的抗凋亡基因c-FLIP, Survivin, c-IAP-1和c IAP-2的表达水平也明显升高[19]。
2.3 NF-κB与肾细胞癌的转移
NF-κB的活化与肿瘤的转移密切相关, 其可以促进血管生成相关的因子转录表达, 如血管内皮生长因子 (VEGF) 、纤溶酶原激活物尿激酶 (u-PA) 、基质金属蛋白酶 (MMP) 及细胞间黏附因子 (ICAM-I) 等。实验发现用致瘤性蛋白CD74处理人胚胎肾脏293细胞后, 检测发现CD74可以通过Ras/Raf/MEK/ERK和Ras/PI3K/AKT激活NF-κB信号通路, 使VEGF的表达上调[20]。受NF-κB调控的金属蛋白酶 (MMP) 尤其是MMP2和MMP9因可以降解细胞外基质而促进癌细胞转移。有文献报道, 长期低剂量的TNF-α刺激可导致肿瘤的发生, 并且促使肿瘤细胞的增殖和转移。它不仅可以活化NF-κB和MMP9, 还能够表达促侵袭性蛋白E钙黏蛋白诱导肾癌细胞的上皮间质转化。在肾细胞癌中NF-κB p65过表达使E钙黏蛋白减少, 而应用NF-κB抑制剂后, TNF-α诱导的MMP9和E钙黏蛋白并未降低, 说明NF-κB与肿瘤细胞侵袭呈相关性但并非决定性[21]。骨调素是一种磷糖蛋白, 也参与肿瘤的发生和转移。研究发现骨调素在调节透明型肾细胞癌发展过程中, p65 NF-κB亚型与OPNmRNA的表达呈相关性, 阻止肿瘤细胞凋亡[22]。
3 讨论
特定的靶向治疗是继传统手术治疗和术后免疫治疗的最具有发展前景的治疗方法。NF-κB信号通路与肾细胞癌的发生发展密切相关, 特异性的阻断该信号通路将有一定的抗癌作用, 因此我们可以假设NF-κB信号通路为治疗肾细胞癌的一个靶点。但是, NF-κB几乎存在所有细胞中, 并且存在多种亚型, 非特异性的阻断该信号通路将会对机体造成严重损伤, 所以关于癌细胞中NF-κB特异性的研究以及仅作用于肿瘤细胞中的NF-κB的特异性抑制剂值得我们期待。