κB细胞活化核因子（精选7篇）
κB细胞活化核因子 篇1
鼻息肉作为耳鼻喉科的常见病、多发病, 会严重影响患者的鼻腔通气功能, 致使患者生活质量严重下降。然而时至今日, 国内外对于鼻息肉的确切发病机制仍不明确, 多数观点认为其是多因素、多种基因、多信号途径参与的共同结果。鼻息肉组织的病理切片中以炎症改变为主, 表现为上皮增生、细胞间质的高度水肿以及毛细血管增生等形态特征。核因子-κB (nuclear factor-κb, NF-κB) 是一个近年来新发现的炎症信号诱导的核转录调控因子, 国外最新研究发现鼻息肉上皮细胞中NF-κB的活性表达明显升高, 而同时国内多位学者采用免疫组织化学方法研究也证实鼻息肉中NF-κB在鼻息肉组织的炎症细胞、上皮细胞、部分腺体及血管内皮细胞的细胞核及细胞浆内均表现为高表达, 表明NF-κB在鼻息肉组织中过度活化, 细胞因子转录增强, 可能导致大量细胞因子的生成[1], 在鼻息肉的发生、发展中发挥着重要作用。白细胞介素4 (lnterleukin 4, IL-4) 作为Th2的自分泌细胞因子, 是免疫系统中作用最强、范围最广的细胞因子, 既能调节细胞免疫, 又能调节体液免疫。它对Th2细胞的生长发育分化起着关键性作用, 可使Th0直接转变为Th2, 增强细胞免疫作用, 在免疫细胞之间发挥多重免疫调节作用。有国内学者用免疫组织化学方法发现鼻息肉中IL-4的表达明显增高, 同时亦有研究发现鼻息肉中IL-4的表达不稳定, 在鼻息肉组织和正常鼻腔黏膜组织中表达差异无统计学意义[2]。而SOYKA[3]研究发现, IL-4会导致正常鼻腔黏膜上皮屏障的缺陷, 可能与鼻息肉的发病有关联。本次研究希望通过逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR) 技术进一步探讨NF-κB和IL-4 m RNA在鼻息肉组织中的表达及其对于未来鼻息肉临床治疗中可能发挥的作用。
1 资料与方法
1.1 临床资料
1.1.1 实验标本
选取2015年9月-2016年1月在丽水市中心医院行鼻息肉摘除术的90例鼻息肉患者的鼻息肉组织 (术后病检为鼻息肉) 作研究对象 (实验组) 。其中, 男性51例, 女性39例;年龄30~50岁。同期取80例患者因单纯鼻中隔偏曲需切除鼻甲组织作为对照组。其中, 男性42例, 女性38例;年龄33~54岁。所有患者术前至少停止使用抗生素类或激素类药物治疗4周以上。
1.1.2 主要试剂及设备
PCR反应仪 (德国Biometra公司) , Trizol RNA试剂 (美国Invitrogen公司) , 凝胶成像分析仪 (美国Beckman公司) , 逆转录试剂盒 (美国Invitrogen公司) 。引物合成交由上海捷瑞生物工程有限公司完成。
1.2 实验方法
1.2.1 提取总RNA法
标本采集后装入无菌冻存管内, 标记后将其放入-80℃冰箱冷冻保存。标本统一称量, 每100 mg鼻息肉组织加入1 ml RNA分离液提取标本RNA, 利用紫外分光光度计检测提取的RNA纯度。RNA的纯度可以通过计算测定260 nm/280 nm的紫外吸收值来评定。RNA纯度测定值需在1.9~2.0, 这样的RNA可以用来进行后续实验。
1.2.2 逆转录RT体系配置及PCR反应
逆转录 (Real-time RT polymerase chain, RT) 反应体系20μl由标本总RNA 8μl, 随机引物2μl, 5×逆转录反应缓冲液4μl, 逆转录酶1μl, RNA酶抑制剂0.5μl, 0.1 mol/L二硫苏糖醇溶液1μl, 脱氧核糖核苷三磷酸2μl, 无RNA酶的双蒸水1.5μl混合配置而成。PCR反应体系20μl由正反向引物各1μl, Taq PCR mastermix 10μl, 逆转录产物c DNA 1.5μl, 双蒸水6.5μl配置而成。本实验中共有3对引物序列, NF-κB的引物序列正向:5'-CTTTTCGACTAC GCGGTGA-3', 反向:5'-GGCAGCTAGGTGCAAAAC A-3', 扩增片段长度为390 bp。IL-4的引物序列正向:5'-CAGTTCTACAGCCACCATGAGA-3', 反向:5'-CATGATCGTCTTTAGCCTTTCC-3', 扩增片段长度为188 bp。β-actin看家基因的引物序列正向:5'-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3', 反向:5'-TCCCT CTCAGCTGTGGTGGTGAA-3', 扩增片段长度为590 bp。NF-κB的PCR反应程序设定为95℃预变性5 min, 然后按下列设定程序进行循环:94℃加热15 s, 59℃退火40 s, 72℃延伸45 s, 34个循环后于72℃再延伸10 min。IL-4的PCR反应程序设定为95℃预变性5 min, 然后按下列设定程序进行循环:先94℃进行加热15 s, 然后设定63℃退火30 s, 之后72℃延伸45 s, 反复进行35个循环后再于72℃延伸10 min后结束反应。
1.2.3 检测方法
采用RT-PCR反应将提取的标本RNA在一定反应条件下逆转录为c DNA。RT-PCR反应按照说明书进行操作。PCR反应后, 取9μl Marker及9μl产物在琼脂糖凝胶上持续电泳30 min, 分离PCR产物, 凝胶成像仪上可清晰看见目的基因及看家基因的DNA扩增片段条带。NF-κB的扩增片段条带位于390 bp、IL-4的扩增片段条带位于188 bp、看家基因β-actin的扩增片段条带位于590 bp。用仪器自带分析软件以NF-κB扩增条带吸收度值 (DNF-κB) 与内对照β-actin扩增条带吸收度值 (Dact) 的比值 (DNF-κB/Dact) 为NF-κB m RNA的表达水平, 同样以DIL-4/Dact为IL-4的m RNA的表达水平。逐个计算标本的光密度比值后, 对NF-κB、IL-4的相对表达水平进行半定量数值统计分析。
1.3 统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件进行数据分析, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 两组资料间的均数比较用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
RNA琼脂糖电泳显示, 28 s r RNA和18 s r RNA条带明亮清晰, 且第1条带 (28 s) 亮度为第2条 (18 s) 亮度的大约2倍, 显示提取的标本m RNA质量较好, 可以继续进行后面的实验 (见图1) 。实验组及对照组NF-κB、IL-4的m RNA均可见表达, 且其在实验组中的表达量高于其在对照组中的表达 (P<0.05) , 见图2、3和附表。
1~3:实验组;4~6:对照组
1:Marker;2~4:对照组;5~7:实验组;NF-κB在两组中可见表达, 条带位于390 bp
1:Marker;2~4:对照组;5~7:实验组;IL-4在两组中均见表达, 条带位于188 bp
(±s)
3 讨论
本研究采用逆转录-聚合酶链反应 (RT-PCR反应) 方法从基因水平来检测NF-κB和IL-4的表达, 更加准确地表明, NF-κB和IL-4在实验组中的表达均高于对照组, 其在鼻息肉的病理生理过程中可能发挥着极其重要的作用。
NF-κB是近年来发现的一组具有多种生物学效应的炎性转录因子, 人类最初发现其可以调控B免疫球蛋白的k轻链而将其命名为NF-κB。研究发现, NF-κB多以同源或异源二聚体P65和P50的形式与抑制蛋白家族成员形成复合体存在于人体组织细胞中。从近几年的研究来看, NF-κB在许多领域倍受关注, 其在机体的免疫反应、炎症反应、应激诱导反应、细胞的增殖与凋亡中都发挥着极其重要的作用[4]。NF-κB经典途径活化后基因主要编码MCP-1、IL-8等趋化因子, IL-4、IL-5、粒细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 等炎症细胞因子, 其中众多的炎症细胞因子如IL-4和TNF-α又可继续活化NF-κB信号通路, 诱发更多的炎症细胞因子表达水平上调, 导致最初炎症信号进一步放大, 形成“瀑布效应”, 这是NF-κB的正反馈调节, 同时也是NF-κB反应灵敏并迅速增加的重要机制[5]。有最新研究表明, NF-κB m RNA主要表达分布与鼻息肉组织的嗜酸性粒细胞、上皮细胞、部分腺细胞、浆细胞及血管内皮细胞的细胞核和细胞浆中。提示NF-κB与鼻息肉的关系密切, 可以通过抑制NF-κB的传导同路来抑制炎症细胞的分泌[6,7]。
IL-4是由抗原或丝裂原刺激B细胞、T细胞 (Th2) 产生的自分泌细胞因子, 它可活化肥大细胞及各种粒细胞, 与IL-5协同可刺激B细胞增殖并合成Ig E及Ig G1, 国外有研究表明, 在鼻息肉组织中的Ig E水平与IL-4水平呈正相关。在正常人体中Th1和Th2细胞处于相对平衡趋势, 机体存在多种保持Th1/Th2平衡的调节机制。其中认为IL-4、IFN-γ的相互调节是维持Th1/Th2平衡的关键因素[8]。Th1/Th2的平衡失调, Th2细胞因子表达占据主导可能与鼻息肉的发生发展关系密切, 而IL-4在Th2细胞因子产生和释放中发挥极其重大的作用[9,10]。NF-κB是介导细胞内信号传递最重要的核转录因子, NF-κB与Th细胞分化的关系的研究目前尚处于起步阶段。有研究发现, NF-κB参与Th1淋巴细胞免疫反应的调节过程, 但也有学者认为NF-κB通过对淋巴细胞中IL-4基因转录的调控, 使机体免疫反应向Th2淋巴细胞介导的体液免疫发展[11,12]。
本实验RT-PCR结果表明, NF-κB和IL-4在鼻息肉组织中基因表达水平高于正常鼻甲组织, 两者可能在鼻息肉的发病机制中起着至关重要的作用。当机体受到外界病源微生物的刺激时, NF-κB和IL-4的表达量骤然增加, 导致嗜酸性粒细胞的聚集, 继发加剧机体内Th2引发的炎症反应, 由Th2诱发的炎症反应在机体内不断加剧, 并不断刺激NF-κB和IL-4的进一步产生和释放。Th2所诱导的炎症反应不仅可双重刺激体内IL-4的产生, 与此同时也不断促使大量其他的炎症因子如粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子 (GM-CSF) 、IL-5、IL-8、IL-17、和TNF-α等, 这些不同的炎症因子与IL-4相互协同, 使机体逐步失去了Th1/Th2的平衡。NF-κB和IL-4均参与鼻息肉的发病过程, 研究表明, 机体局部微环境的破坏可进一步诱发机体Th1/Th2的失衡, 上述两个方面相互作用, 对鼻息肉的发病起着非常重要的作用。继续深入研究NF-κB和IL-4的表达及其与鼻息肉的发病关联, 可以在今后鼻息肉的临床预防、后期诊断及用药治疗上提供充足的理论依据和参考指标。
参考文献
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κB细胞活化核因子 篇2
近年来,研究认为核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)作为一种多极性细胞转录因子,可调控多种炎症因子的基因转录。研究也发现NF-κB可通过调节凋亡相关基因而抑制凋亡,NF-κB参与抗凋亡的途径与细胞因子、“死亡受体”和凋亡调控基因有关[4,5]。本研究着重探讨NF-κB与细胞凋亡在SAP并发肺损伤中的作用。
1 材料和方法
1.1 动物与分组
SD大鼠112只,雌雄不限,体质量250～300 g,随机分为对照组、SAP组与二硫代氨基甲酸吡咯烷(PDTC)预处理组,各组再分为3、6、9和12 h四个亚组(对照组n=8;SAP组、PDTC预处理组n=10)。
1.2 主要试剂
牛磺胆酸钠(TAC),PDTC(sigma公司产品);兔源性NF-κBp65多克隆抗体(武汉博士德生物公司产品);细胞凋亡原位检测试剂盒(Roche公司)。
1.3 动物模型制备
大鼠术前24 h禁食不禁水,1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉(0.3 m L/100 g),上腹部正中切口2 cm入腹,5号头皮针于十二指肠乳头附近穿刺十二指肠壁,逆行刺入胰胆管末端约1 cm,小动脉夹夹闭胰胆管两端,注入5%TAC(0.1 m L/100 g,0.1m L/min),注完10 min后拔除针头,放开动脉夹,逐层关腹,背部皮下注射生理盐水约3 m L补液。PDTC预处理组:建立SAP模型前1 h腹腔内注射PDTC(100 mg/kg)。对照组:手术方法同SAP组,胰胆管内注射等量生理盐水。
1.4 取材及组织切片
造模成功后各组分别于3、6、9和12 h处死,经左心室抽血3～5 m L,4℃3 000 r/min离心10 min,提取上清夜,-20℃冻存。4%多聚甲醛行灌注内固定后,取左肺上叶组织石蜡包埋、切片。
1.5 血清淀粉酶浓度检测
TOSHIBA TBA-40FR全自动血生化分析仪检测。
1.6 病理学检测
常规HE病理切片。
1.7 免疫组织化学检测
采用SP(Streptavitin/Peroxidase)法检测肺组织石蜡切片NF-κB的表达。一抗(兔抗P65多克隆抗体)工作浓度为1∶150。空白对照用0.01 mol/L PBS代替一抗。每组随机选取5张切片,每张切片随机选取5个高倍视野(×400),记数阳性细胞数。
1.8 肺组织细胞凋亡检测
采用TUNEL法进行检测。每组随机选取5张切片,每张切片随机选取5个视野(×400),记数凋亡细胞,以凋亡细胞占同一视野细胞总数的百分比表示,即凋亡指数(AI)。
1.9 统计学处理
所得数据均以均数±标准差(x±s)表示,组间差异显著性的比较采用单因素方差分析或t检验,相关性采用线性分析,均用SPSS 13.0软件完成。
2 结果
2.1 大体观察
对照组大鼠肺组织无明显病理改变。SAP各组肺组织均可见肺水肿,表面有散在出血点,部分大鼠胸腔有少量胸水,且随病程进展肺水肿逐渐加重。12 h组可见局部有小片状紫褐色肺不张区。PDTC预处理组表现同SAP组,但程度较轻。
2.2 光镜观察
对照组肺组织结构清晰,肺泡壁完整,肺间质无渗出。见图1。SAP各组肺组织均可见肺泡及肺间质水肿,间质内红细胞和炎性细胞渗出,水肿及细胞渗出随病程进展渐加重。6、9和12 h组还可见局灶性或小片状肺不张,塌陷实变或肺泡壁破裂。PDTC预处理各组炎性细胞浸润和红细胞渗出均有所减轻。见图2。
2.3 血清淀粉酶变化
SAP各组均明显高于对照组(P<0.05),6 h达峰值,9 h已明显下降,12 h继续下降但仍处于较高水平;PDTC预处理各组虽明显高于对照组,但低于SAP组(P<0.05)。见图3。
2.4 NF-κB在肺组织的表达
对照组肺组织中仅少量表达NF-κB,见图4。SAP3 h组NF-κB阳性信号较对组已明显表达,随时间进展,NF-κB阳性细胞数增多,表达强度增加,6 h组达高峰,9 h组表达开始下降,12 h仍保持较高水平。阳性信号主要表达于中性粒细胞、单核巨噬细胞、支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞及部胞质及胞核内,呈均匀棕黄色细颗粒状。见图5。PDTC预处理组阳性信号表达规律及部位同SAP组,见图6,但各时间点阳性细胞数均低于SAP组,差异有显著性(P<0.05)。见表1。
注:1)与SAP组比较,P<0.05;2)与正常组比较,P<0.05
2.5 肺组织细胞凋亡情况
对照组肺组织仅见少量肺泡间质细胞和肺泡上皮细胞凋亡。SAP组与PDTC预处理组可见中性粒细胞、单核/巨噬细胞、支气管黏膜上皮细胞、肺泡上皮细胞及部分血管内皮细胞凋亡。表2显示,3 h组凋亡指数较对照组已明显升高,6 h组凋亡指数最高,9 h组凋亡指数开始下降,12 h组继续下降但仍保持较高水平(图7)。PDTC预处理组凋亡指数均低于相对应的SAP组,差异有显著性(P<0.05)。
注:1)与SAP组比较,P<0.05;2)与正常组比较,P<0.05
3 讨论
研究表明,在SAP时存在细胞网络失衡,不断放大的细胞因子级联反应使得体内的细胞因子遭到破坏,促炎细胞因子TNF-α、IL-1超过抗炎细胞因子如IL-2、IL-10和IL-12。NF-κB参与了细胞因子在内的多种炎症介质的基因转录[6]。本研究中,在牛磺胆酸钠致大鼠SAP的发病早期即观察到NF-κB的明显激活,其表达表现为随时程先升高又下降,表达高峰为6 h。阳性信号主要表达于中性粒细胞、单核巨噬细胞、支气管黏膜上皮细胞及肺泡上皮细胞的胞浆和胞核中,同时NF-κB的表达与肺组织的病理改变严重程度有相关性,说明了NF-κB早期就参与了SAP并发肺损伤的发病过程。血清淀粉酶浓度变化与镜下观察到胰、肺组织的病理改变一致。同时S血清淀粉酶浓度的变化与肺组织NF-κB阳性细胞数变化具有相关性。说明了胰酶在SAP发生的早期释放,在直接造成胰腺组织的损伤的同时,也可以通过NF-κB的激活介导的炎症反应导致肺损伤的发生。
目前的研究揭示引起凋亡主要有两条途径:细胞外的死亡受体途径及细胞内的线粒体途径[7]。NF-κB与细胞凋亡的关系密切,其参与多种凋亡相关基因的转录调控,具有抑制细胞凋亡作用及促细胞凋亡的双向作用[8]。NF-κB的激活可能是细胞生存与凋亡的调定点。但具体机制目前还不十分清楚。也有研究表明急性胰腺炎(AP)时胰腺细胞的死亡存在凋亡的形式,且AP的严重程度与胰腺细胞的凋亡率呈负相关性[9]。相继的研究表明[10,11],通过不同的方法提前诱导胰腺腺泡细胞凋亡,可以减轻AP病情,但SAP并发肺损伤时肺内细胞凋亡与NF-κB关系尚未见相关报道。本实验观察到大鼠SAP并发肺损伤时肺内凋亡细胞较对照组明显增加并且与肺损伤程度有一定关系。肺组织内的凋亡细胞包括中性粒细胞、单核巨噬细胞、肺泡和支气管上皮细胞及肺微血管内皮细胞等,且凋亡细胞数具有时间依赖性并呈动态变化。同时肺组织内细胞凋亡情况与肺组织的病理改变一致,以上都提示了肺组织内细胞凋亡不仅参与了PALI早期病理过程,且与PALI进展有一定关系。而NF-κB在肺组织内的表达与细胞凋亡的相关性,提示NF-κB的激活与肺组织细胞凋亡有一定内在联系,但具体机制有待进一步研究阐明。
本研究中通过腹腔注射PDTC预处理大鼠SAP模型并与SAP组及对照组进行对比观察,发现应用PDTC后,肺的肉眼及镜下病理改变均有不同程度改善。血清淀粉酶浓度也明显下调。从而提示PDTC可以缓解SAP并发肺损伤的症状。同时应用PDTC后,NF-κB阳性细胞数明显减少,染色强度减弱。PDTC为二硫氨基酸酯,是一种强的抗氧化剂。到目前为止,能够诱导NF-κB活化的刺激物,均可被抗氧化剂阻断。由此推测,PDTC对SAP并发肺损伤的保护机制可能为:PDTC可能通过直接降低NF-κB与DNA结合能力,干扰NF-κB激活的信号通路,并可稳定IκBα或增加IκBα的合成等机制来抑制NF-κB的活性[12]。应用PDTC后肺内凋亡细胞有所减轻,机制尚不清楚,可能与其抑制NF-κB的活性有关,尚需进一步深入研究。以上说明,降低NF-κB的活性或阻止其激活的手段将有助于改善ALI的严重程度。
总之,NF-κB激活与细胞凋亡在SAP发生发展中有着重要的作用,其激活是各种炎症反应及凋亡途径的通路。因此,如何选择性地抑制NF-κB的激活,特异性减少促炎基因的表达,特异性抑制组织细胞的凋亡,对改善重症胰腺炎肺损伤的临床治疗效果也有非常重要的现实意义。
参考文献
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κB细胞活化核因子 篇3
关键词：原发肝细胞性肝癌,NF-κB,TNF-α,ICAM-1,免疫组化
原发肝细胞性肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一, 根据最新统计, 全世界每年新发肝癌患者约六十万, 居恶性肿瘤的第五位。目前我国发病人数约占全球的半数以上, 占全球肝癌病人的55.00%, 已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手, 其危险性不容小视[1]。本研究拟用免疫组化S-P检测原发肝细胞性肝癌和非肝癌组织中细胞间黏附分子-1 (Intercellular adhesion molecule-1, ICAM-1) 、核因子-κB (Nuelear factor-kappa B, NF-κB) 和肿瘤坏死因子α (Tumor necrosis factor alpha, TNF-α) 蛋白的表达情况, 分析这其表达与原发性肝细胞性肝癌生物学行为的关系, 探讨它们在原发性肝细胞性肝癌中发生、发展及生物学行为, 为临床治疗和预后提供科学依据。
1 材料与方法
1.1 材料
选取2007年1月~2011年12月河北永年县医院原发性肝细胞性肝癌手术标本34例。其中, 男22例, 女12例。年龄38~72岁, 中位年龄57岁;所有原发性肝癌患者术前均未行放、化疗治疗。取癌旁正常肝组织14例作对照 (病理切片证实) 。其中, 男9例, 女5例, 年龄30~73岁, 中位年龄55岁。
1.2 试剂与方法
常规免疫组化试剂盒SP、二硝基联苯胺 (DAB) 显色液及NF-κB、TNF-α和ICAM-1 (北京中杉金桥生物技术有限公司) 。采用SP免疫组化法, 方法操作按试剂盒说明书进行, 主要包括切片脱蜡水化, 微波修复抗原, 山羊血清封闭, 分别滴加NF-κB、TNF-α和ICAM-1工作液37℃1 h, 以生物素标记二抗及辣根酶标记链霉卵白素工作液孵育, DAB显色, 苏木素衬染, 中性树胶封片, 显微镜观察。取已知切片作为阳性对照, 以PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。
1.3 结果判断
NF-κB、TNF-α和ICAM-1阳性定位于细胞核和细胞质, 以各种抗体在细胞核或质出现棕黄色颗粒为阳性信号。定性观察按细胞有无显色及染色强度记分 (a) :细胞无显色为0分;浅黄色为1分;棕黄色为2分;棕褐色为3分。按显色细胞的比例记分 (b) :0分为显色细胞<10%;1分为10%~30%细胞显色;2分为31%~60%显色;3分为≥61%以上显色。每例积分=a×b。按积分高低判定:阴性为积分为0分;阳性为积分≥1分。由2名高年资病理医师逐一观察同一切片以减少人为因素造成的判断误差, 以2人观察结果一致作为最终评定结果。
1.4 统计学分析
应用SPSS 12.0统计软件, 计数资料采用χ2检验。相互关系用等级相关分析, P<0.05为差异有显著性。
2 结果
注:†P<0.05
2.1 NF-κB、TNF-α和ICAM-1在原发性肝细胞性肝癌组织、癌旁正常肝组织中的表达
表1显示:NF-κB在肝癌组织中的阳性表达率为88.24% (30/34) , 正常肝组织中的弱表达, 阳性表达率7.14% (1/14) , 二者比较差异有显著性 (P<0.05) 。14例癌旁正常肝组织中TNF-α阳性表达率为14.29% (2/14) , 34例原发肝细胞性肝癌中的阳性表达率为76.47% (26/34) , 两者比较差异有显著性 (P<0.05) ;14例癌旁正常肝组织中ICAM-1无表达, 34例原发肝细胞性肝癌组织中阳性表达率为85.29% (29/34) , 两者比较差异有显著性 (P<0.05) 。
2.2 NF-κB、TNF-α和ICAM-1在原发肝细胞性肝癌中的表达与临床病理指标的关系
详见表1。
2.3 NF-κB、TNF-α和ICAM-1在原发性肝细胞性肝癌组织中的相关性分析
表2显示:NF-κB、TNF-α和ICAM-1在原发性肝细胞性肝癌组织中的阳性表达呈明显正相关, 表明三者在肿瘤的发生、发展中起到协同作用。
3 讨论
癌症的形成是由关键的调节通路中错误积累所致的一种多步骤多阶段的复杂事件[2], 这个过程可分为, 肿瘤启动、促癌和进展三个阶段。侵袭和转移是进展阶段的主要特征[3]。转移是一个多环节、多阶段的过程, 其中肿瘤细胞本身黏附能力的改变, 促进异源细胞间的相互黏附, 使得不同细胞间的相互效应得以实现, 促进了肿瘤发生的转移。
NF-κB是在成熟B细胞核提取物中存在一种能与免疫球蛋白κ轻链基因的增强子κB序列特异结合的核蛋白因子, 由Rel家族成员组成的同源或异源二聚体转录因子[4]。静息状态下, NF-κB由p65、Pso与NF-κB的抑制分子IKB形成三聚体以非活化形式存在于细胞质中, 当外界刺激因素使细胞受到刺激后, IKK被激活, IKB分子磷酸化, 泛素化而降解, NF-κB从多聚体上释放, 进入胞核并与特定的κB序列结合行使其功能, 启动或调节早期反应基因的转录, 参与炎症反应、细胞增殖和细胞凋亡[5]。研究发现, 许多癌基因和致癌物都可以导致NF-κB激活[6]。本实验结果显示NF-κB蛋白阳性表达主要位于细胞浆核内, 在原发性肝细胞性肝癌组织中呈过度表达, 与癌旁正常肝组织中比较差异有显著性 (P<0.05) ;NF-κB与组织学分化有关 (P<0.05) , 说明在低分化肿瘤中NF-κB表达水平更高有关, 提示NF-κB表达水平高的肿瘤预后差;NF-κB与有无淋巴结转移及有无癌栓有关 (P<0.05) , 说明在肿瘤肝内血管侵犯转移中发挥了重要作用。
TNF-α主要由活化的巨噬细胞分泌产生, 位于第6号染色体HLA-Ⅲ类基因簇内 (6p21.3) , 长约2.76 kb, 由4个外显子和3个内含子组成。TNF-α与其受体TNFR1和TNFR2结合发挥生物学作用, 在炎症过程中, TNF-α对组织损伤和修复都发挥了重要作用, 可诱导病变细胞凋亡, 同时也诱导成纤维母细胞增生, 修复损伤血管时, 诱导多种血管生成因子表达。但是, 在肿瘤发生发展过程中TNF-α表现出矛盾的生物学功能[7,8]。最早人们发现, TNF-α是抗癌活性最强的细胞因子, 高剂量TNF-α局部治疗肿瘤可选择性地破坏肿瘤组织血管, 从而发挥抗肿瘤作用[9]。而在临床研究发现, 乳腺癌、前列腺癌, 膀胱癌、结肠癌、肝癌等肿瘤细胞和基质细胞中都有表达, 其阳性的患者预后较差[10]。肝癌小鼠动物模型研究显示, 致癌物处理肝干细胞, 可诱导细胞增生和TNF-α分泌, 而敲出了其受体基因后小鼠肝肿瘤形成明显降低。炎症细胞分泌的TNF-α可能作为肿瘤促进因子, 参与了肿瘤的发生发展[11]。本研究发现, 在肝癌组织中TNF-α呈阳性表达, 明显高于正常组织 (P<0.05) , 并且其表达与组织的分化程度、淋巴道转移和有癌栓有明显相关性 (P<0.05) , 表明TNF-α在肝癌的发生、发展中起促进作用。
TNF-α促进肿瘤生长的机制虽不是很清楚, 其与受体结合通过多条信号通路发挥生物学功能。对TNF-α与NF-κB在肿瘤发生、发展中的相互关系发现, TNF-α可通过NF-κB途径诱导激活诱导的胞苷脱氨酶 (activation induced cytidine deaminase, AID) 产生, 引起p53和c-myc等基因突变[12]。此外, 还通过NF-κB p65调节人类端粒酶催化亚基 (h TERT) 从胞质易位到核, 促进细胞无限增殖[13]。本研究亦发现, 在肝癌中二者的阳性表达呈正性相关。
ICAM-1属于免疫球蛋白超家族, 是一种单跨膜的单链糖蛋白, 细胞外区有5个免疫球蛋白样结构区, 其中Ⅰ区与LFA-1相结合, Ⅲ区与补体受体-3 (CR3或Mac-1) 相结合, ICAM-1通过与LFA-1和Mac-1结合发挥作用[14]。在人体内ICAM-1广泛存在于白细胞、白细胞、单核细胞、外周血淋巴细胞, 血管内皮细等处[15]。当肿瘤细胞发生浸润、转移时, 淋巴细胞和白细胞分泌如IL-1、TNF等细胞因子杀灭癌细胞, 同时也激活了淋巴管、血管内皮细胞内的NF-κB, NF-κB可激活ICAM-1启动子的部位活化ICAM-1, 使进人血液或淋巴结的癌细胞与淋巴细胞竞争性地与内皮细胞结合, 使癌细胞能在淋巴结或其他脏器中豁附、生长、增殖[16]。此外, ICAM-1过度活化可促使过多可溶性ICAM-1 (s ICAM-1) 进入血液, 竞争性抑制血液循环中ICAM-1/LFA-1依赖的MHC-1类抗原对游离癌细胞的免疫识别作用, 从而使癌细胞逃离免疫监视, 更容易发生侵袭和转移[17]。本研究发现, 在原发肝细胞性肝癌组织中ICAM-1的阳性表达率明显高于癌旁正常组织。此外, ICAM-1的阳性表达与是否有淋巴道转移和癌栓关系密切, 高表达ICAM-1的癌细胞可导致癌细胞间黏附力降低, 从而易于随淋巴细胞的迁移脱落母瘤, 进入血循环, 与淋巴细胞结合的瘤细胞在穿越血管壁时可以免受伤害, 并且在血循环中易于形成栓子, 易于在毛细血管内或淋巴窦滞留和着床, 随之形成转移灶。并且, ICAM-1的阳性表达与NF-κB的阳性表达也呈正性相关。
κB细胞活化核因子 篇4
关键词：姜黄素,佐剂性关节炎,骨密度,骨保护素,核因子κB受体活化因子配体
姜黄素( curcumin) 是从植物姜黄根茎中分离出来的天然多酚类产物。近年来在体外和体内对姜黄素进行了广泛的研究[1,2],发现姜黄素具有抗肿瘤、抗病毒、抗关节炎、抗氧化等作用,其作用机制涉及到多个靶点,包括转录因子如核因子κB( NF-κB) ,生长因子如血管内皮细胞生长因子( vascularendothelial growth factor,VEGF) ,炎性细胞因子如肿瘤坏死因子( tumor necrosis factor,TNF) -α、白细胞介素1( interleukin 1,IL-1) 、IL-6,蛋白激酶如丝裂原活化蛋白激酶 ( mitogen-activated protein kinase,MAPKs) 和Akt,以及其他酶如环氧合酶2 ( cyclooxy-genase-2,COX-2) 。由于其有效性,安全性及多目标调控性,姜黄素成为一个潜在的治疗及预防类风湿关节炎的药物。
类风湿关节炎( rhuematoid arthritis,RA) 是一种慢性炎症性疾病,以多关节滑膜炎为特征伴随软骨及骨破坏,引起关节畸形,甚至导致患者残疾。且RA的发病率随着环境及空气的污染呈逐年增高的趋势[3]。RA骨破坏包括局灶性炎症活动部位的骨侵蚀和关节周围的骨量减少,其机制并未被完全阐明,诸多证据表明RANK/RANKL通路是RA的骨质流失的关键 因素。RA动物模型 支持RANK/RANKL系统在骨侵蚀中发挥作用,AA大鼠模型是最常见的RA动物模型,其造模方法简单,成功率高[4]。本文通过观察姜黄素对AA大鼠血清OPG、RANKL蛋白表达及骨密度的影响,进一步探讨其对RA的作用机制,为姜黄素治疗RA提供动物实验参考。
1 材料与试剂
1. 1 动物
雄性SD大鼠30只,清洁级,实验起始体质量140 ~ 160 g,( 南京军区南京总医院的实验动物中心供应,使用许可证: SYXK20030032) 。
1. 2 试剂
姜黄素溶液: 浓度为5 mg /m L( 将姜黄素500 mg溶解于无菌的二甲基亚砜( dimethyl sulfoxide,DM-SO) 10 m L,加无菌生理盐水直至100 m L,用5 m L注射器进行分装,保存需要避光,冰箱温度调节在- 20℃ ,1周内使用完,禁止反复冻融。
2 实验方法
2. 1 分组及造模方法
将大鼠以随机数字表法分为3组: 正常组,模型组,姜黄素组,每组10只。用标准饲料饲养,饮水自由,将室温控制在18 ~ 26℃之间,湿度调控在70%左右,适应性喂养1周。除了正常组不造模,将其余2组大鼠左后跖处进行常规消毒,皮内注射完全弗氏佐剂0. 1 m L,制成AA模型,造模当天记做第0天。
2. 2 给药方法
模型组、姜黄素组,于第7天开始腹腔注射给药。姜黄素组给予姜黄素溶液50 mg /kg·d,连续21天; 模型组给予10% DMSO,5 mg / kg·d,连续21天; 正常组自由饮水。于最后一次姜黄素治疗后24小时,即第28天将大鼠仰卧位固定头部、四肢,行腹主动脉取血,离心,取血清,低温冰箱保存备检,ELISA法检测血清RANKL、OPG蛋白的表达; 取血后处死大鼠,剥离大鼠右侧胫骨,双能X线骨密度仪( dual energy x-ray absorptiometry,DXA) 测量大鼠胫骨骨密度记做整体骨密度,及胫骨远端1 cm处的兴趣区域骨密度记为兴趣区骨密度。
2. 3 检测指标和方法
2. 3. 1整体及兴趣区骨密度处死大鼠后,剥离大鼠右侧胫骨,取其标本,用DXA进行检测,记录整个胫骨的整体骨密度及兴趣区骨密度。
2. 3. 2血清RANKL、OPG蛋白表达参考文献[5]及试剂盒说明,离心机离心→取血清保存备检→激活标本→分别取OPG的ELISA试剂盒与RANKL的ELISA试剂盒→加入0. 5 m L的蒸馏水混匀,配制成10 ng / m L溶液→标准管8管→第1管加入标本稀释液900μL→第2至8管加入标本稀释液500μL→在第1管中加入10 ng /m L的标准品溶液100μL混匀后加样器吸出500μL移至第2管→如此反复稀释,从第7管中吸出500μL弃去,第8管为空白对照组→洗涤液: 用重蒸水1: 20稀释→加样: 每孔各加入标准品或待测样品100μL,将反应板充分混匀后至37℃120分钟→洗板: 用洗涤液将反应板充分洗涤4 ~ 6次,向滤纸上印干→每孔加入第一抗体工作液100μL,将反应板充分混匀后至37℃60分钟→洗板: 同前→每孔加入酶标抗体工作液100μL,将反应板充分混匀后至37℃30分钟→洗板: 同前→每孔加入底物工作液100μL,至37℃暗处15分钟→每孔加入100μL终止液混匀→30分钟内用酶标仪在40 nm处测吸光值→结果计算: 以标准品1000、500、250、125、62、31、15. 6、0 pg / m L作为横坐标,光密度( optical density,OD) 值为纵坐标,建立标准曲线→经多元回归计算结果。
2. 4 统计学处理
采用SPSS 17. 0统计软件进行统计学分析,计量资料以均数±标准差( x±s) 表示。多组均数比较采用单因素方差分析,两两比较用LSD法,若方差不齐则用Tamhane法。P < 0. 05差异有统计学意义。
3 结果
注射完全弗氏佐剂后3 ~ 4小时,造模组所有大鼠左后足即可出现红、肿的炎症表现; 第3天左右达到高峰; 第7天左右4只足爪均有不同程度的肿胀,表明造模成功。本实验的造模成功率为100% 。
3. 1 3 组大鼠骨密度的比较
3组大鼠右侧胫骨整体骨密度之间比较均无显著性差异( P > 0. 05) ; 模型组大鼠兴趣区骨密度值显著低于正常组大鼠兴趣区骨密度( P < 0. 01) ; 姜黄素组大鼠兴趣区骨密度值显著高于模型组( P <0. 01) 。由此可见,大鼠造模后一定时间( 28天) 内整体胫骨骨密度未出现显著性降低。而造模组大鼠胫骨远端的骨密度出现显著性降低,姜黄素的治疗能显著抑制AA骨密度下降,治疗后骨密度与正常组无显著性差异,详见表1。
注: 与正常组比较,aP < 0. 01; 与模型组比较,bP < 0. 01。
3. 2 3 组大鼠血清 RANKL、OPG 及其比值的比较
由表2可见,大鼠血清RANKL,与正常组比较,模型组、姜黄素组均显著升高( P < 0. 01) ; 与模型组比较,治疗组即姜黄素组显著降低( P < 0. 01) 。大鼠血清OPG,与正常组比较,模型组、姜黄素组均显著降低( P < 0. 01) ; 与模型组比较,姜黄素组显著升高( P < 0. 01) 。RANKL/OPG比值,与正常组大鼠比较,模型组、姜黄素组均显著升高( P < 0. 01) ; 与模型组比较,姜黄素组显著降低( P < 0. 01) 。姜黄素能够通过改变血清RANKL及OPG的表达,来改变其比值。
( x ± s ,n = 10)
注: 与正常组比较,aP < 0. 01; 与模型组比较,bP < 0. 01。
4 讨论
RA这一病名是由英国人Garrod第一个提出的,发病后表现为小关节肿胀疼痛等炎症症状,进而出现受累部位骨丢失,随着病情进展,骨破坏加重,呈不可逆性,如未进行正规治疗,2年内关节软骨及骨的破坏可达到50%[6]。关节软骨及骨破坏是RA的重要病理特征,而局部的骨侵蚀又是RA患者关节畸形、功能障碍的最主要原因,因此早期预防及控制骨破坏是改变RA预后的关键。RA的骨破坏早期表现为受累关节软骨及骨组织由病理组织取代,进一步发展为软骨及骨侵蚀,最终导致全身性的骨丢失,破坏关节结构。
OPG / RANKL / RANK信号途径是免疫系统紊乱疾病( 包括RA) 与骨破坏之间联系的重要通路,破骨细胞( Osteoclast,OC) 是参与骨破坏的主要细胞,而OPG/RANKL/RANK系统在OC分化成熟及活性保持中起着重要作用[7]。在正常的骨重建过程中,RANKL蛋白结合RANK,促使破骨细胞的生成,保持其活性,促进骨的吸收功能。当骨的吸收大于骨的形成时,成骨细胞系自动分泌更多的OPG,假性受体竞争结合RANKL,阻止RANKL与受体RANK结合,抑制破骨细胞生成、活化,抑制骨吸收功能,使骨吸收与骨形成又处于一个相对稳定的状态[8]。而骨丢失是RA特征性标志,其丢失程度与病情严重程度有关,本实验采用DXA检查大鼠胫骨整体及兴趣区的骨密度,通过骨密度来评价AA大鼠骨丢失情况。检查测得大鼠骨密度的情况: 造模后28天,所有组大鼠的整体骨密度差异无显著性差异。由此可见,大鼠造模后一定时间( 28天) 内整体胫骨骨密度并不会出现显著降低。而胫骨远端1 cm的骨密度即兴趣区骨密度,模型组兴趣区的骨密度是显著低于正常组的。而与模型组比较,药物干预组即姜黄素组显著升高。姜黄素,化学结构为C21H20O6,研究发现其对免疫、细胞因子、转录因子具有调节作用,因此能够产生广泛的生物学效应。但姜黄素难以溶于水,易于溶于DMSO等有机溶剂,本实验将姜黄素溶解于10% DMSO制成姜黄素溶液后,进行药物干预,目的是为了让大鼠能够更加好的吸收姜黄素,并且同时给予模型组大鼠腹腔注射10% 的DMSO,以观察姜黄素对AA大鼠的治疗作用。本实验中观察到在大鼠造模28天内,胫骨远端存在着一定程度的骨丢失,姜黄素能够抑制胫骨远端骨密度的降低。
研究表明[9,10,11]诸多炎症细胞因子( TNF-α、IL-1、IL-7、IL-17、IL-23、IL-34 ) 能够影响RA的炎症及骨破坏,目前没有有力的证据可以证明这些细胞因子能够直接激活破骨细胞,但有证据表明绝大多数细胞因子是通过RANKL/RANK通路间接调节破骨细胞分化及活性,从而发挥作用。炎性细胞因子通过诱导成骨细胞表达RANK,结合滑膜RANKL,来激活NF-κB或JNK,增强T细胞和DC的协同作用,促进破骨细胞的分化和增殖,最终导致软骨及骨质破坏。本实验采用ELISA法测得大鼠血清RANKL、OPG蛋白的表达,并计算出RANKL / OPG的比值。AA模型大鼠血清RANKL表达明显增加,OPG的表达明显减少,RANKL/OPG的比值明显增加,骨密度检查,兴趣区的骨密度明显低于其它组的大鼠,进一步表明AA炎症发生骨质破坏重要通路为OPG/RANKL通路。姜黄素干预治疗AA模型大鼠后,能降低血清的RANKL的表达,提高OPG的表达,最终RANKL / OPG的比值显著均低于模型组。因此可见,姜黄素能够影响到外周血清RANKL、OPG的含量,最终使得RANKL/OPG的比值显著低于模型组。由此推测,在RA治疗中,姜黄素通过调控RANKL/OPG的比值,来调节OPG / RANKL系统,从而参与到抑制RA骨丢失,防止RA骨破坏。
综上所述,姜黄素对RA具有肯定的治疗作用,
姜黄素与核因子-κB 篇5
1 NF-κB的生物学活性
NF-κB有5个家族成员:Rel A (p65) 、Rel B、cRel、p50和p52。它们的N末端均含有约300个氨基酸的Rel同源结构域, 该结构域的主要功能为介导Rel蛋白与DNA间的特异性结合。p50和p52分别与Rel A蛋白相互作用形成各种形式的同源或者异源二聚体, 最常见的是Rel A (p65) / NF-κB1 (p50) 异二聚体。未受刺激时Rel/NF-κB存在于胞浆之中, 与特异性抑制蛋白NF-κB形成无活性的复合体。受到刺激后NF-κB发生磷酸化和降解, 导致Rel/NF-κB转位进入胞核中, 引起靶基因表达。NF-κB可高效诱导多种细胞因子、黏附分子、趋化因子和急性期反应蛋白基因的表达, 同时对参与炎症反应放大与延续的多种酶基因的表达也具有重要的调控作用。肿瘤、自身免疫性疾病、慢性炎性相关性疾病等的发生、发展, 均与NF-κB的过度活化有着密切关系[4,5]。
2 肿 瘤
在与姜黄素相关的生物活动当中, 最重要的是其抗肿瘤特性, 牵涉多种信号转导途径在内。Belakavadi等[6]研究发现经姜黄素处理的埃利希腹水肿瘤细胞, 出现核聚集、DNA断裂和蛋白激酶激活的脱氧核糖核酸酶的易位等凋亡表现, 其机制可能是抑制了NF-κB p65的活化。Notarbartolo等[7]比较了姜黄素与顺铂、阿霉素在肝癌治疗中的作用, 表明可以抑制NF-κB 目标基因及凋亡相关蛋白的表达, 顺铂、阿霉素对基因表达具有直接作用, 而姜黄素通过减少Bcl-X (L) mRNA和增加Bcl-X (S) mRNA及凋亡相关蛋白的表达而发挥作用。Santihane等[8]报道姜黄素通过Ras/MAPK信号途径, 抑制由转化生长因子-β (TGF-β) 刺激的鼠角化细胞基质金属蛋白酶-9 (MMP-9) 的分泌。由NF-κB调节的基因可抑制凋亡、诱导增生并介导炎症、血管生成和肿瘤转移。Biswas等[9]发现姜黄素可以诱导肺泡上皮细胞A549的谷胱甘肽合成, 抑制NF-κB激活和白细胞介素-8的释放, 提示姜黄素具有氧化自由基清除剂的作用。此外, 姜黄素和顺铂联合应用时可协同减少卵巢癌细胞中自体同源的细胞因子白细胞介素-6的产生[10]。
Philip等[11]研究表明, 骨桥蛋白通过NF-κB介导的MTI-MMP的产生来刺激B16F10黑色素瘤细胞的生长基质金属蛋白酶-2和MMP-2前体的激活, 姜黄素可通过封闭IKB激酶 (IKK) /IKBa信号路径来抑制B16F10细胞中骨桥蛋白诱导的MMP-2前体的激活和MTI-MMP的表达。姜黄素抑制裸鼠体内由骨桥蛋白诱导肿瘤的生长以及肿瘤MMP-2前体的表达和激活, 进而抑制细胞的移动。姜黄素抑制肿瘤细胞的机制可能是阻断目标细胞的信号转导通路, 姜黄素可能是蛋白激酶C、血管生长因子和NF-κB的一种潜在抑制剂, 因此可以抑制NF-κB的活化和各种癌基因的表达[12]。
3 慢性炎性相关性疾病
近年来, 对姜黄素用于慢性炎性疾病的治疗成为新的热点, 主要涉及肺部、肝脏及糖尿病肾病。王建军等[13]探讨姜黄素对气管炎症及NF-κB的影响。结果表明哮喘模型组大鼠哮喘发作症状最明显, 姜黄素组大鼠症状轻, 正常对照组无症状。哮喘模型组支气管周围明显炎细胞浸润, 且以浆细胞、嗜酸性粒细胞浸润为主, 姜黄素组较哮喘模型组明显减轻, 正常对照组无明显炎细胞浸润。肺泡灌洗液总细胞数及嗜酸性粒细胞哮喘模型组明显高于正常对照组和姜黄素组。免疫组化发现哮喘模型组NF-κB的核着色最强, 姜黄素组较弱, 正常对照组微弱表达。证实姜黄素可抑制哮喘的慢性气道炎症, 其机制可能与姜黄素抑制哮喘大鼠NF-κB的活性有关。
Nanji等[14]发现姜黄素能够预防酒精诱导的大鼠肝脏脂肪变性、坏死、炎症, 以及通过抑制NF-κB的活化来防止细胞因子、趋化因子、环氧化酶的诱生。成扬等[15]研究姜黄素激活过氧化物酶体增殖因子活化受体γ (PPARγ) 信号对大鼠肝星状细胞活化、MMP活性和胞核NF-κBp65表达的影响。表明姜黄素可以激活PPARγ信号途径抑制大鼠肝星状细胞活化, 升高MMP-2、MMP-9活性, 抑制、干扰NF-κB的核转位。
刘慎微等[16]发现在糖尿病大鼠肾脏组织中NF-κB p65阳性颗粒多位于胞核周围, 提示有NF-κB二聚体的核转导。经姜黄素治疗后NF-κB p65在核内表达水平较糖尿病组明显下降, 光镜下姜黄素治疗组肾组织的病理变化较糖尿病模型组明显改善。表明姜黄素可明显改善糖尿病大鼠的肾脏病理变化, 其作用机制可能与抑制NF-κB p65的核转导有关。
4 自身免疫性疾病
姜黄素用于自身免疫性疾病的研究较少, 主要集中于巨噬细胞、炎症细胞因子等的实验研究。李新建等[17]发现姜黄素能够增加小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能, 小剂量姜黄素能够增加小鼠脾淋巴细胞的增殖, 大剂量姜黄素能够抑制小鼠脾淋巴细胞的增殖。姜黄素能够抑制脾淋巴细胞胞核NF-κB p65蛋白的表达姜黄素具有免疫调节作用, 且与剂量有关。可能的机制与抑制免疫细胞NF-κB的活化有关。进而发现姜黄素对炎症性肠病肠道黏膜炎症因子与转录核因子的抑制作用, 表明可以抑制炎症性肠病模型大鼠的炎症因子白细胞介素-1和白细胞介素-10的分泌, 其机制可能是通过调控NF-κB的活性, 显示姜黄素可能是炎症性肠病的潜在靶向治疗药物[18]。
5 结 语
κB细胞活化核因子 篇6
1 NF-κB的生物学特性
1.1 NF-κB的结构
NF-κB几乎存在所有的细胞中, 它首次发现于成熟B细胞核的提取物中, 因其能与B细胞免疫球蛋白的κ轻链基因增强子κB序列特异性结合而被命名。NF-κB家族中包括Rel A (p65) 、NF-κB1 (p50) 、NF-κB2 (p52) 、C-Rel和Rel B, 它们以同源性二聚体或者异源性二聚体的形式存在, 其中Rel A/NF-κB1是主要存在形式。这些蛋白亚型的N端共有一个由300个氨基酸组成的肽链, 称为Rel同源结构域, 包括二聚体化结构域、DNA结合结构域[1]、核定位序列 (HLS) 和IкB结合位点[2], 可使NF-κB从细胞质向细胞核转移, 调节靶基因的转录[3], 但是它们的C端存在差异。
1.2 NF-κB的功能
基于NF-κB的结构特点, 其主要功能是可以和DNA结合, 调节转录。但是各亚型之间略有不同。NF-κB1和NF-κB2的主要功能是结合DNA, 而Rel A、C-Rel和Rel B没有前体, 含有转录活性区, 可调节转录激活作用。NF-κB激活可调节趋化因子、细胞因子、血管生成因子的表达, 广泛参与细胞分化和凋亡、免疫反应[3]、炎性反应、肿瘤生成及转移等病理生理过程。在高尿酸血症的小鼠模型中发现, NF-κB信号通路被激活, TNF-α、MCP-1和趋化因子的表达上调[4]。肿瘤的生成与细胞凋亡和抗凋亡水平失衡有关, NF-κB一方面可以促进细胞凋亡, 通过上调p53和Ikappa B表达[5、6], 另一方面可以抑制细胞凋亡, 促进抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表达[7]。
1.3 NF-κB的活化
静息状态时, NF-κB与其抑制物IκB结合形成复合物, 从而掩盖NF-κB的核定位序列, 以无活性状态停留于细胞质内[8]。在受到细胞因子、氧自由基、病毒等外来因素的刺激, 抑制剂激活酶 (IKK) 被激活而引发IκB磷酸化被降解, 释放NF-κB, NF-κB进入细胞核与靶基因κB序列结合调控其表达[9]。
2 NF-κB与肾细胞癌
2.1 NF-κB与肾细胞癌的发生
肾细胞癌的发病率仅次于膀胱肿瘤, 2008年全球癌症数据统计显示肾细胞癌的发病率为每年约271000例[10], 且呈逐年上升趋势。肾细胞癌的病因尚不清楚, 但是相关危险因素已经明确, 肥胖、吸烟、高血压、肾脏疾病及病毒性肝炎均可增加其发病机会[11]。NF-κB是体内抗凋亡途径的关键因子, 持续激活该信号通路可使细胞恶性增值, 致使肿瘤的发生。香烟中存在大量的致癌物质, 其具体的致癌信号通路仍不清楚, 但是可以激活NF-κB, 而且活化的强度与烟雾的接触时间和剂量呈相关性[12]。有报道, 在用NF-κB的超级抑制物IκB处理的已致病为高血压的小鼠模型中, 肿瘤坏死因子 (TNF-α) 水平降低, 出现蛋白尿的小鼠减少到一半, 血管周围管状纤维化和肾脏的炎性细胞渗出物明显减少[13]。说明抑制NF-κB信号通路可以降低高血压肾病的发病率, 同时也减少了肾细胞癌发病的危险因素。肿瘤的形成也和特定的基因的异常表达有关。P53抑癌基因是生物体内一种抑制细胞转变癌细胞的基因, 其编码的P53蛋白可以修复损伤的DNA, 如果修复失败, P53蛋白即启动程序性死亡 (凋亡) 过程诱导细胞自杀, 阻止有癌变倾向的突变细胞的生成, 从而防止细胞恶变。肾癌细胞中通常保留野生型而功能不活跃的p53, 而且被抑制。动物实验发现, 在肿瘤移植的裸鼠模型中, 9-氨基吖啶和抗疟药奎纳克林形成的混合药物可以激活P53基因而抑制NF-κB, 起到抗肿瘤的作用[14]。c-myc基因可以易位、可调节多种物质, 也可以促进细胞分裂, 使细胞无限增殖, 参与多种肿瘤的发生发展。基因的扩增、重排或者启动子的插入均可导致c-myc致瘤性转化。研究发现在早期和转移的肾细胞癌中c-myc均表达, 且与细胞核多形性的级别有关, 级别越高所含有的增殖细胞越多[15], 烟雾中的镉盐能激活细胞中的NF-κB, 通过NF-κB进一步促进癌基因c-myc的表达[16]。
2.2 NF-κB与肾细胞癌的增殖
肾细胞癌的发展与NF-κB的促进细胞增殖和抗凋亡作用密切相关。且许多研究表明NF-κB通路活化可以促进肾细胞癌和其他肿瘤的生长。如前述, c-myc基因可促进肾细胞癌的发生, 也可调节癌细胞分裂, 使细胞增殖[17]。该基因的上游启动子序列中含有κB反应元件, 所以NF-κB的活化必然激活c-myc基因[18]。实验研究发现, 单纯的肾细胞癌组和用吡咯烷二硫基甲酸盐 (pyrrolidine dithiocarbamate, PDTC) 处理的肾细胞癌组相比较, 后者的NF-κB的活性受到抑制, 抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL的表达较前者增多, 而前者的促凋亡蛋白明显增加[7], 显示PDTC的抗肿瘤作用。实验研究显示在用TNF-α诱导的肾癌细胞中, NF-κB的表达水平明显升高, 而且NF-κB靶向作用的抗凋亡基因c-FLIP, Survivin, c-IAP-1和c IAP-2的表达水平也明显升高[19]。
2.3 NF-κB与肾细胞癌的转移
NF-κB的活化与肿瘤的转移密切相关, 其可以促进血管生成相关的因子转录表达, 如血管内皮生长因子 (VEGF) 、纤溶酶原激活物尿激酶 (u-PA) 、基质金属蛋白酶 (MMP) 及细胞间黏附因子 (ICAM-I) 等。实验发现用致瘤性蛋白CD74处理人胚胎肾脏293细胞后, 检测发现CD74可以通过Ras/Raf/MEK/ERK和Ras/PI3K/AKT激活NF-κB信号通路, 使VEGF的表达上调[20]。受NF-κB调控的金属蛋白酶 (MMP) 尤其是MMP2和MMP9因可以降解细胞外基质而促进癌细胞转移。有文献报道, 长期低剂量的TNF-α刺激可导致肿瘤的发生, 并且促使肿瘤细胞的增殖和转移。它不仅可以活化NF-κB和MMP9, 还能够表达促侵袭性蛋白E钙黏蛋白诱导肾癌细胞的上皮间质转化。在肾细胞癌中NF-κB p65过表达使E钙黏蛋白减少, 而应用NF-κB抑制剂后, TNF-α诱导的MMP9和E钙黏蛋白并未降低, 说明NF-κB与肿瘤细胞侵袭呈相关性但并非决定性[21]。骨调素是一种磷糖蛋白, 也参与肿瘤的发生和转移。研究发现骨调素在调节透明型肾细胞癌发展过程中, p65 NF-κB亚型与OPNmRNA的表达呈相关性, 阻止肿瘤细胞凋亡[22]。
3 讨论
特定的靶向治疗是继传统手术治疗和术后免疫治疗的最具有发展前景的治疗方法。NF-κB信号通路与肾细胞癌的发生发展密切相关, 特异性的阻断该信号通路将有一定的抗癌作用, 因此我们可以假设NF-κB信号通路为治疗肾细胞癌的一个靶点。但是, NF-κB几乎存在所有细胞中, 并且存在多种亚型, 非特异性的阻断该信号通路将会对机体造成严重损伤, 所以关于癌细胞中NF-κB特异性的研究以及仅作用于肿瘤细胞中的NF-κB的特异性抑制剂值得我们期待。
κB细胞活化核因子 篇7
1 材料和方法
1.1 病例选择
收集郑州大学第一附属医院口腔科1999～2005 年临床资料完整的病理标本OLK 46 例(单纯增生型11 例,异常增生型35 例)和OSCC 36 例(Ⅰ级13 例,Ⅱ级12 例,Ⅲ级11 例)。10 例正常口腔黏膜组织作为正常对照。常规固定包埋,切片厚4 μm。每例4 张连续切片。
1.2 主要仪器及方法
常规免疫组化SP染色法。小鼠NF- κBp65单克隆抗体,兔IκBα多克隆抗体,SP免疫组化检测试剂盒,均为北京中山生物有限公司产品。NF- κBp65、IκBα均以已知阳性的食管癌标本为阳性对照,用PBS代替一抗作为空白对照。
1.3 结果判定
光学显微镜观察 NF- κBp65、IκBα阳性细胞计数:每例随机选取10个高倍视野(×400)计数1 000 个细胞,计算阳性数百分比。根据Handel等[1]的分级标准双盲法计算细胞阳性染色程度:(-):阳性细胞<5%,():阳性细胞5%～25%,(): 阳性细胞26%～49%,():阳性细胞≥50%。
1.4 统计分析
采用SPSS 11.0软件包处理,运用χ2 检验和Spearman相关分析。以α=0. 05为检验水准。
2 结 果
2.1 NF- κBp65与IκBα的分布与表达
NF- κBp65蛋白的阳性表达主要位于细胞质,少量可见于细胞核,呈棕黄色颗粒,弥漫分布(图 1～4)。IκBa蛋白阳性染色主要位于细胞质内,偶见于核内,呈现棕黄色颗粒(图 5～8)(表 1)。
2.2 NF- κBp65与IκBα表达的相关性分析
在所有OLK病例中,NF- κBp65和IκBα蛋白阳性表达经Spearman等级相关分析显示:NF- κBp65和IκBα蛋白的表达在OLK癌变过程中呈负相关(rs=-0.544, P<0.05)(表 2)。
在OSCC病例中,NF- κBp65和IκBα蛋白阳性表达经Spearman等级相关分析显示:NF- κBp65和IκBα蛋白表达呈正相关(rs=0.833, P<0.05)(表 3)。
注:p65蛋白阳性率4 组比较,χ2=30.323, P<0.05; IκBα蛋白阳性率4 组比较,χ2=26.769, P<0.05;①与正常比较,P<0.05;②与单纯增生比较,P<0.05;③与异常增生比较,P<0.05
rs=-0.544,P=0.000
rs=0.833,P=0.000
3 讨 论
NF- κB是以p50/p65二聚体为主要形式的核转录因子,静息状态下与其抑制蛋白IκB结合滞留于胞质内,当受到一些刺激时IκB降解,从而NF- κB与IκB解离易位入核,调控多种靶基因的表达。NF- κBp65含转录活化区,参与基因转录的起始调节;IκBα是IκB蛋白家族中最重要的成员,其基因含有多个κB位点,因此p65的活化可上调IκBα基因转录,从而该蛋白表达升高。正常情况下NF- κB及IκBα极少表达,但在人类各种肿瘤组织中其表达率和表达部位发生改变,与肿瘤的发生、发展、及预后密切相关[2,3]。
本研究发现,NF- κBp65在正常口腔黏膜中不表达,在单纯增生型OLK中p65略有表达,但局限于上皮中层;随着上皮异常增生p65的表达增高,分布于上皮中下层;在OSCC中p65阳性表达可波及上皮全层,且可见少量核着色。4 组间p65阳性表达率差异有统计学意义,这与Nakayama等[2]的结果相一致。Domingo- Domench 等[3]在对前列腺癌的研究中认为可以通过测定p65核定位判定NF- κB的活性,但在OLK到OSCC的过程中作者发现p65核表达率随恶性程度增加而增加,但远远小于前列腺癌及子宫颈癌[4]等的核表达。这可能由于NF- κB具有明显的细胞特异性,在不同类型或同一类型的不同阶段的肿瘤中p65的表达强度及分布是不同的,持续活化的时间也可能不同。作者认为p65蛋白在口腔肿瘤的发生发展中可能主要定位于细胞质,细胞质内大量p65蛋白表达极易使p65蛋白短暂入核活化,从而调控着从OLK到OSCC的过程,发挥其促进细胞增殖及恶变的作用。
本实验观察到IκBα蛋白的表达由OLK转变到OSCC呈现一种动态变化:正常口腔黏膜中存在IκBα的弱表达,仅局限于基底层;当各种刺激使上皮出现单纯增生时IκBα的表达明显上调;但随着上皮异常增生的发展及异常增生程度的加重,IκBα的表达降低;而当OSCC发生后IκBα表达则反馈性增强。4 组间IκBα阳性表达率差异有统计学意义,这与莫珩[5]、谢东华[6]在肿瘤的演变过程中观察的结果基本一致,但与Nair等[4]的研究结果不一致,推测可能是肿瘤类型不同,抗体的类型及厂家不同均可以使抗体在敏感性和特异性上存在差异。本研究认为IκBα在上皮异常增生阶段的表达下调可能是口腔黏膜上皮癌变过程中的一个早期事件,能反映细胞的恶性改变,可作为口腔癌变监测的生物学指标之一。
NF- κB 作为重要的转录因子在肿瘤的发生发展中起着重要作用。当细胞受到异常刺激时,NF- κB被过度活化,与IκBα二者在动态中相互调控。Nair等[4]认为p65与IκBα在子宫颈上皮恶变过程中细胞着色率呈负相关,而谢东华等[6]发现膀胱癌组织二者表达呈正相关。本实验认为,随着病变程度加重,NF- κBP65的阳性表达率逐渐增强;但IκBα表达呈一种动态变化:可能轻微刺激诱导上皮增生的同时也使IκBα非转录性迅速上调[7],同时上皮增生组织局部的缺氧使NF- κB与IκBα分离,于是NF- κB少量活化,IκBα表达进一步增高;随着异常增生组织中新生血管的生成, NF- κB的激活通过IκBα的降解得以实现,NF- κB表达增高而IκBα表达降低,在OLK中p65与IκBα呈负相关表达;OSCC中NF- κB的过度活化启动编码IκBα的基因转录,反馈性地升高IκBα的表达,阻止NF- κB的过度活化,二者在高水平上维持相互制约,统计学分析显示呈正相关表达。NF- κBp65与IκBα可能在OLK恶变和OSCC发生的复杂过程中各自从不同的条件激活及失活,相互制约,从而发挥其自身的作用。不同肿瘤中研究结果的不同也提示二者在不同肿瘤发展中的协调与制约作用在不同阶段也各不相同。
有学者[8]认为IκBα的磷酸化与降解先于NF- κB的活化,是肿瘤形成的首要一步,可以通过抑制IκBα的基因治疗方法来抑制NF- κB的活性。但是OSCC发生发展除NF- κB及IκBα的调节外还受到其他因子的调节[9],因此如何抑制或终止OLK恶变还需更多研究。
摘要：目的:探讨核因子-κB(nuclear factorκB,NF-κB)p65及其抑制蛋白IκBα在口腔白斑(OLK)及口腔鳞癌(OSCC)中的表达及其关系。方法:应用免疫组织化学技术检测正常口腔黏膜上皮(n=10)、OLK(n=46)及OSCC(n=36)中的NF-κBp65、IκBα表达。结果:NF-κBp65在正常口腔黏膜、单纯增生型OLK、异常增生型OLK及OSCC的表达率分别为:0%、9.09%、42.86%、72.22%,4组之间差异具有统计学意义(P<0.05);IκBα在4组中呈动态表达,分别为:10%、81.82%、48.57%、86.11%,4组之间差异具有统计学意义(P<0.05)。NF-κBp65与IκBα的表达在OLK癌变过程中呈负相关(P<0.05),在癌组织中呈正相关(P<0.05)。结论:二者可能是检测OLK的恶变潜能及OSCC早期诊断的敏感指标。
关键词：口腔白斑,口腔鳞状细胞癌,核因子-κB,IκBα,免疫组织化学
参考文献
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