表皮生长因子受体突变

表皮生长因子受体突变（精选7篇）

表皮生长因子受体突变 篇1

表皮生长因子受体(EGFR)属于酪氨酸激酶受体,是目前国内外研究者公认的一个肿瘤靶向治疗分子,它介导的信号转导途径调节细胞的生长、增殖和分化。在癌症中发现EGFR酪氨酸激酶区常发生各种突变,这些突变和酪氨酸激酶抑制剂的疗效密切相关[1]。

EGFR已成为近年来肿瘤治疗研究和抗肿瘤药物筛选的热点,有关EGFR突变与肿瘤发生以及EGFR突变在分子靶向治疗中的作用日益受到人们的关注。EGFR突变是癌症患者是否对酪氨酸激酶抑制剂敏感的强预测因子,因此EGFR基因突变的检测能为肿瘤靶向治疗提供依据。目前常用的EGFR突变检测方法有PCR-直接测序[2]、PCR-焦磷酸测序法、聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)[3]、突变体富集PCR荧光探针法、探针扩增阻滞突变系统(amplification refractory mutation system,ARMS)荧光探针法[4]、高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)、变性高效液相色谱法(denaturing high-

1. 检测方法

1.1 测序法

目前,DNA测序法是进行EGFR突变检测的可靠方法,也是使用最多的方法。测序法需要对测序样品扩增、纯化、序列分析,过程比较繁琐、耗时长,且对取材和技术要求比较高,更重要的是由于测序方法本身的限制灵敏度不高,只能对含量大于20%的突变基因进行检测。因此,此方法在临床应用中还存在一定的限制,不适于大量临床样品分析。

1.2 探针扩增阻滞突变系统(amplification refrac-tory mutation system,ARMS)荧光探针法

ARMS又名等位基因特异PCR(allele specific PCR,AS-PCR)。原理为:利用Taq DNA聚合酶缺少3'→5'外切酶活性,PCR引物的3'端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理,针对不同的已知突变,设计适当的引物以检测出突变基因。该法在设计引物时,在引物3'端设计一错配碱基,一个与野生DNA互补,一个与突变DNA互补,使之仅能与突变型或野生型互补而只扩增突变型或野生型基因。扩增产生的PCR产物可以通过凝胶电泳或是实时荧光定量PCR(real-time PCR)测定进行分析。蝎形探针扩增阻滞突变系统(Scorpions ARMS)是将ARMS和Scorpions实时PCR技术相结合的一种新技术。该技术所用探针为Scorpion探针,Scorpion探针是一种新型的探针,由一条发夹结构的探针和一条引物构成,探针的5'端和3'端分别标有报告荧光和淬灭荧光,3'端通过PCR blocker(一个非扩增的单体,防止探针退火后的延伸)与引物的5'端相连。在自由状态,报告荧光和淬灭荧光很接近,不产生荧光。变性阶段茎环结构打开,退火时引物与模板结合并延伸,环performance liquid chromatograph,DHPLC)、流式荧光杂交法等。如何评价这些试剂盒,如何为临床提供科学合理的依据是我们面临的问题。区与新合成的目的基因的互补区域结合,此时Scorpion探针与PCR产物在同一条DNA链上,是分子内的结合。由于发夹结构打开,报告荧光和淬灭荧光分离,因此可检测到报告荧光发出的荧光信号。

1.3 变性高效液相色谱法(denaturing high-performanceliquid chromatograph,DHPLC)

DHPLC能以3种方式操作:(1)在不变性温度条件下,可分离分子量不同的双链DNA分子或分析具有长度多态性的片段,类似于RFLP分析。(2)在充分变性温度条件下,单链DNA或RNA分子能被区分,适用于寡核苷酸探针合成纯度分析和质量控制。(3)在部分变性的温度条件下可进行基因突变检测、SNPs。

DHPLC技术的原理是基于发生错配的杂合双链DNA与完全匹配的纯合双链DNA解链特征的差异将它们分离开来。由于杂合双链DNA错配位点处氢键被破坏而形成“鼓泡”,在部分加热变性的条件下,更易于解链形成Y形结构,与固定相的结合能力降低,所以杂合双链将先于纯合双链被洗脱出来,通过洗脱峰的不同就可判断是否有突变存在。DHPLC可检测出含有单个碱基的置换、插入或缺失的异源双链片段。缺失或插入突变非变性方法和部分变性方法都能较好地检测出来,但利用非变性方法的检测结果中,野生型和突变型的区别更容易判断。

1.4 高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)技术

高分辨率熔解曲线(high resolution melting,HRM)是基于核酸的物理性质,通过饱和染料监控核酸的熔解曲线变化进行分析的一种技术,它是在常规PCR基础上增加一种饱和染料,无需使用序列特异性探针。其原理是由于扩增产物的序列、长度和碱基组成等决定了熔解曲线的变化,所以可通过熔解曲线的变化反映核酸性质的差异。HRM检测不受突变碱基位点和种类的局限,可应用于基因分型、短片段重复序列的分析、序列匹配、突变扫描、甲基化和RNA编辑等多方面。目前熔解曲线法已经发展到采用特异性探针结合,通过探针和靶序列结合后熔解温度的差异来进行突变检测。

2. EGFR基因突变检测试剂盒质量评价

肿瘤细胞的突变属于体细胞突变,即突变的肿瘤细胞仅占肿瘤细胞的一定比例,并不是所有肿瘤细胞均突变。因此,如何科学有效地评价现有的以及可能出现的新的试剂盒检测突变体的准确性、在野生型背景中检测突变体的灵敏度以及特异性等技术指标,保障临床检测试剂盒的质量可靠、检测结果可信是我们面临的问题。

首先应明确试剂盒适用肿瘤的组织类型、适用的样本类型(石蜡包埋组织样本、新鲜冷冻组织样本或其他样本)。部分试剂盒宣称可以用于外周血EGFR基因突变检测,PCR-TaqMan法、DHPLC法、ARMS法、酶切富集法PCR法均有对外周血检测的报道,尽管在比较配对肿瘤组织和外周血样本EGFR突变研究中具有比较好的一致性,但是在针对突变阳性样本的检测中阳性样本检出比例相差甚远,因此针对试剂盒声称可以用于外周血EGFR基因突变检测需要进一步研究。

临床应用结果表明EGFR基因靶向药物的疗效不仅与靶点基因EGFR突变类型相关,而且与EGFR突变丰度相关[5]。因此EGFR基因突变检测不能仅仅局限在检测是否突变,还要检测其突变的相对丰度,为临床提供更合理的用药指导。如何科学合理地检测EGFR基因突变,如何科学合理地确定突变比例阈值与临床用药相关性,也是EGFR基因突变检测试剂盒质量评价的部分内容。

在针对特异性评价方面需要考虑不同浓度的野生型核酸样本、不同突变类型间进行交叉反应。

2.1 EGFR基因突变体参考品的建立

目前人类EGFR突变主要是在第18、19、20和21外显子上发生的29种突变,在这些突变中,第19位外显子的缺失突变,以及第21位外显子核苷酸的2576T–G(L858R)突变在非小细胞肺癌(NSCLC)中频繁出现,这些突变被认为是经典的突变,带有这些突变的病人对治疗药物易瑞沙敏感。中国食品药品检定研究院已经构建了29种人类EGFR基因突变体参考品,基本覆盖了目前最为常见EGFR基因突变,为EGFR基因突变检测试剂盒评价和临床实验室质量评价提供了质控物质,可用于国内大多数试剂盒的性能评价要求,具有十分重要的应用价值。

2.2 行业标准的建立

在EGFR突变检测中存在几个技术难点:肿瘤组织中肿瘤细胞及非肿瘤细胞并存,EGFR突变分子与野生型分子的并存;组织块或血浆也影响EGFR突变的检测,外周血中基因组本底相对高,突变分子比例相对低,而且含量也低;样本中多少比例的突变可导致药物敏感/耐药未知。行业标准的建立是一个复杂的过程,目前检测突变阈值的设定仅仅依靠方法的检测限来确定,还没有和临床疗效进行结合,因此在对EGFR突变试剂盒进行评价时还没有上升到和临床结合的层次。需要对患者进行研究分析,阐明在多少比例的突变能导致靶向药物的敏感/耐药,从而制定科学合理的检测限,保障患者充分的权益。对组织样本和血浆样本的检测试剂盒应采用不同的要求。在技术指标的设定上需要进行选择性、检测限、特异性、准确性等指标的考核。

通过统一参考品的建立和应用、行业标准的建立,可以很好地规范产品,提升产品质量,保障临床检测质量,更好地为临床服务,为患者服务,也是我们对试剂质量检测和考核的目标。

参考文献

[1]Lynch TJ,Bell DW,Sordella R,Gurubhagavatula S,Okimoto RA,Brannigan BW,et al.Activating mutations in theepidermal growth factor receptor underlying responsiveness of non-small-cell lung cancer to gefitinib.N Engl J Med,2004;350:2129-39.

[2]Miyamae Y,Shimizu K,Mitani Y,Araki T,Kawai Y,et al.Mutation detection of epidermal growth factor receptor andKRAS genes using the smart amplification process version 2 from formalin-fixed,paraffin-embedded lung cancer tissue.JMol Diagn;2010;12:257–264.

[3]Zhang X,Zhao Y,Wang M,Yap WS,Chang AY.Detection and comparison of epidermal growth factor receptor mutationsin cells and fluid of malignant pleural effusion in non-small cell lung cancer.Lung Cancer 2008;60:175–82.

[4]Zhou C,Ni J,Zhao Y,Su B,Rapid detection of epidermal growth factor receptor mutations in non-small cell lung cancerusing real-time polymerase chain reaction with TaqMan-MGB probes.Cancer J;2006;12:33–39.

[5]Zhou Q,Zhang XC,Chen ZH,Yin XL,Yang JJ,et al.Relative abundance of EGFR mutations predicts benefit fromgefitinib treatment for advanced non-small-cell lung cancer.J Clin Oncol;2011;29:3316–3321.

表皮生长因子受体突变 篇2

关键词：非小细胞癌,肿瘤组织,表皮生长因子,基因突变

肺癌是临床常见的恶性肿瘤之一，近年来，其发生率和病死率均明显上升，多项研究表明[1,2],NSCLC患者表皮生长因子受体突变均发生在酪氨酸激酶域ATP结合域附近（第18～21外显子），约90%EGFR基因突变集中在第19和2l外显子，第18和20外显子为耐药性突变，第19和21外显子为活化性突变，但部分晚期肺癌患者因肿瘤部位取材困难很难获得足量肿瘤组织用于基因检测。由于EGFR突变基因具有肿瘤体细胞遗传的特性，因而在血液游离DNA中可能会检测到相同的遗传改变。各国学者采用多种方法进行研究，至今为止结论尚未统一，本组研究抽取90例NSCLC患者的肿瘤组织及匹配的血清标本，对NSCLC组织和EGFR突变的一致性进行分析研究，现将结果总结报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：

随机抽取2010年5月至2014年5月90例NSCLC患者的肿瘤组织及匹配的血清标本，所有患者均经临床病理组织检查确诊，未接受过靶向治疗及辅助化疗，患者病理分型参考2004年WHO肺癌组织分类[2]，临床分期参考IASLC肺癌TNM分期标准，取材均符合伦理要求。

1.2 方法：

血清标本均在手术前抽取全血，肿瘤组织经手术切除后浸泡于液氮中，将肿瘤标本和相匹配的血清标本保存于一80℃冰箱中待测。选用DNA Mini Kit 51304试剂盒（Qiagen），直接测序所用引物和Mix（大连宝生物工程有限公司）。ABI 3730XL,DxS EGFR29Mutation Kit,Lightcycler 480,PCR 8联反应条辅助器。所有标本均经DNA提取试剂盒提取，步骤按试剂盒说明书进行。将所提取的DNA采用超微量分光光度计检测，保存于一20℃冰箱中。PCR扩增和直接测序：PCR总反应体系为50μL,Mix 25μL，上游引物、下游引物均2μL，去离子水19μL,DNA模板2μL，扩增条件：93℃预变性2 min,94℃30 s,60℃30 s,72℃中30 s,72℃2 min，共35个循环。PCR反应设置内参照GAPDH，内参照扩增条件：93℃预变性3 min,94℃30 s,59℃30 s,72℃中30 s,72℃3 min，共35个循环。去PCR产物5μL，采用3%琼脂糖凝胶进行电泳，Gel-Pro Analyzer凝胶图像分析分析目的基因。对显示目的基因的PCR产物进行直接测序。

1.3 统计学处理：

所有数据均采用SPSS17.0软件进行统计分析，计数资料以百分率（%）表示，采用χ2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

肿瘤组织总共检出29例EGFR基因突变，总突变检测率为32.2%(29/90），其中19-del缺失16例（55.2%),L858R点突变13例（44.8%）；血清共检测出5例EGFR突变，均为L858R点突变，突变检出率5.6%(5/90）。

直接测序法检测血清E G F R活化性突变的特异度为1 0 0%(61/61），灵敏度为17.2%(5/29），阳性预测价值100%(5/5），阴性预测价值71.8%(61/85）。血清和肿瘤组织EGFR活化性突变的一致率为5.6%(5/90），具体见表1。

3 讨论

近年来，多种靶向药物被广泛应用于NSCLC的临床治疗中。据相关研究报道，对确诊的EGFR基因第19或21外显子突变的NSCM患者行一线药物化疗和厄洛替尼治疗，患者平均进展生存期分别为4.6、13.1个月，提示对NSCLC患者进行EGFR基因第19、21外显子突变状态的检测对指导临床治疗具有重要意义。本组研究抽取90例NSCLC患者的肿瘤组织及匹配的血清标本，采用直接测序法检测EGFR基因中第19、21外显子的突变状态，结果显示，肿瘤组织总突变检测率为32.2%，血清总突变检出率5.6%，血清的突变检出率明显低于肿瘤组织，与张静等研究结论吻合[3]，血清和肿瘤组织EGFR活化性突变的一致率为5.6%，此结果与邹敏等人研究报道一致[4]，此外，且灵敏度及特异度也低于肿瘤组织，说明在评价NSCLC患者EGFR基因突变状态方面，肿瘤组织检测更具优势。

参考文献

[1]张志红,倪琛琛,于敏,等.105例非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变分析[J].安徽医科大学学报,2011,46(8):740-742.

[2]宋国红,邸立军,任军,等.中国非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体基因突变的研究[J].现代肿瘤医学,2008,16(4):553-556.

[3]张静,梁智勇,曾碹,等.应用蝎形探针扩增组织突变系统检测非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变与病理改变的关系[J].中华病理学杂志,2008,37(5):294-299.

表皮生长因子受体突变 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取32例经铂类治疗方案失败的晚期NSCLC患者, 入选对象均知情同意。在32例晚期NSCLC患者中, 男20例, 女12例, 年龄在45~72岁之间, 平均年龄为 (63.16±5.81) 岁。所有患者经组织学检查均诊断为局部晚期NSCLC或转移NSCLC, 均无法进行手术治疗。入选标准: (1) 参考RECIST标准, 患者≥1个可测量病灶; (2) 预计生存期超过3个月者; (3) 在1个月内未接受抗肿瘤治疗者。排除标准: (1) 心、肝、肾功能不全者; (2) 骨髓造血功能缺损者。

1.2 方法

患者口服getfinibi 250 mg/片, 1次/d。根据患者病情变化, 适当调整剂量, 直到患者出现不能耐受的毒性。

1.3 EGFR酪氨酸激酶域基因突变检测

1.3.1 仪器与试剂

仪器为TGL-16G低温高速离心机 (上海安亭科学仪器厂生产) 与ERICOMP公司生产的PCR仪。试剂为EGFR、APES (美国SIGMA公司生产) 、细胞基因组DNA提取试剂盒 (上海生物工程股份有限公司提供) 、Taq DNApolymerase (大连宝生物工程有限公司提供) 、DNA凝胶回收试剂盒 (广州博亚公司提供) 。

注:与无EGFR基因突变组相比, P<0.05。

1.3.2 基因组DNA提取

标本采用10%福尔马林固定, 常规石蜡包埋与连续性切片时, 每换一个石蜡块时均要彻底清洁切片机。标本切8~10张, 切片厚度为10μm, 分别装在2个消毒的l.5 m L EP管中。然后置于组织的EP管离心5 s, 加入l m L二甲苯, 振荡30 min, 以速率为12 000 r/min离心5 min, 去上清, 重复3~5步。然后加入1 m L 100%乙醇, 混匀, 以速率为12 000 r/min离心5 min, 将乙醇吸出, 自然风干, 最后采用细胞基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA。

将200μL TE与400μL消化缓冲液加到干燥后的标本中, 混匀, 然后加入蛋白酶K 6~12μL。以速率为12 000 r/min离心5 min, 去上清, 并在上清中加入260μL无水乙醇混匀, 然后将液体转移到UNIQ-10柱, 以速率为8 000 r/min离心30 s, 然后加入50μL冲洗缓冲液, 再离心30 s。将离心管的冲洗缓冲液取出后, 离心30 s, 转移到新的离心管中。然后在UNIQ-10柱DNA吸附膜中加入50μL洗脱缓冲液, 以速率为12 000 r/min离心5min, 以提取出基因组DNA。

1.4 观察指标

实体瘤近期客观疗效评定标准[2], 近期疗效包括:完全缓解 (CR) 、部分缓解 (PR) 、稳定 (SD) 和进展 (PD) , 以CR+PR计算有效率, 以CR+PR+SD计算疾病控制率。

1.5 统计方法

资料均用SPSS18.0统计学软件处理, 计数资料采用χ2检验。

2 结果

2.1 EGFR酪氨酸激酶域基因突变检测结果

32例标本中共检测出12例基因突变。4例为19号染色体缺失突变。8例为21号染色体错义突变, 均为L858R变异 (T>G) 。经getfinibi治疗后EGFR基因突变组的客观有效率达58.33%, 高于无EGFR基因突变组的10.00%;疾病控制率达100.00%, 高于无EGFR基因突变组的20.00% (P<0.05) , 如表1所示。

2.2 EGFR基因突变及末突变组近期客观疗效

EGFR突变组有效率为58.33%, 明显高于无EGFR突变组的10.00%;疾病控制率为100.0%, 明显高于无EGFR突变组的20.00% (P<0.05) , 见表2。

3 讨论

肿瘤靶向治疗过程中, 需要遵循肿瘤进展过程, 细胞表面生长因子受体、细胞内信号传导通路中重要酶、蛋白质均可以成为作用靶点[3]。肿瘤细胞分化、周期、凋亡、迁移、浸润、淋巴转移和全身转移等过程的从DNA到蛋白水平的任何亚细胞分子可作为广义的分子靶点。随着特异性靶向治疗的出现, 肿瘤的治疗应用方法越来越多, 其治疗效果明显优于传统化疗[4]。目前非小细胞肺癌领域中靶向治疗研究比较多的是表皮生长因子受体 (epiderma1 growth factor receptor, EGFR) 阻断剂和血管内皮生长因子受体 (vascular endothelial growth factor receptor, VEGFR) 阻断剂。

EGFR作为一种糖蛋白受体, 大多存储于哺乳动物的上皮细胞膜。在信号作用控制下, 将难以控制细胞的生长。EGFR酪氨酸激酶具有复发率高、存活期短特征, 作为肿瘤治疗的重要靶分子。相关研究表明[5], 选择性酶抑制剂可进行阻断酪氨酸激酶活化, 抑制表皮生长因子受体激活、细胞凋亡。

在INTACTl中, 共1 093例初治晚期NSCLC患者随机进入健择/顺铂 (GP) 方案+getfinibi 250 mg/d或+getfinibi 500 mg/d或+安慰剂3组治疗。在INTAC他中, 共1 037例初治晚期NSCLC患者随机人组, 化疗方案为紫杉醇+卡铂 (TP) [6]。研究显示, getfinibi联合GP/TP方案化疗未见疗效提高或生存期延长。Getfinibi联合化疗组皮疹、腹泻不良反应高于安慰剂联合化疗组, 其他化疗常见不良反应3组差异无统计学意义。Ⅲ期多中心临床研究中, 在美国以外的国家进行的TALENT研究中, 共1172例未接受过化疗的晚期NSCLC患者, 随机应用顺铂/健择方案联合getfinibi 150 mg/d或安慰剂治疗[7]。edotinib联合化疗组中位OS、PFS及1年生存率分别为301 d (95%CI:274~315) 、167 d (95%CI:146-183) 和41%, 安慰剂联合化疗组分别为309 d (95%c I:282~343) 、179 d (95%c I:154~202) 和42%。getfinibi组与对照组对比, 差异无统计学意义。在该次研究中的32例标本, 基因突变的检出率为37.50 (12/32) , EGFR基因突变组的疾病控制率与客观有效率分别为100.00%、58.33%, 明显高于无EGFR基因突变组的20.00%、10.00%, 与刘红梅等人[8]的报道相符。由此可见对晚期NSCLC采用getfinibi靶向治疗, 治疗效果显著。因此, 对于EGFR酪氨酸激酶域突变的检测可以作为患者接受getfinibi治疗效果的预测指标。

参考文献

[1]赵子影, 彭六保, 李健和, 等.吉非替尼在表皮生长因子受体突变的晚期非小细胞肺癌患者一线化疗中的成本-效果性分析[J].中国医院药学杂志, 2013, 22 (12) :183-184.

[2]侯晓玮, 庄兴俊, 宋谦, 等.CT引导经皮肺穿刺活检检测晚期非小细胞肺癌表皮生长因子受体基因突变[J].介入放射学杂志, 2013, 2 (8) :125-128.

[3]仇晓军, 姚登福, 季斌, 等.非小细胞肺癌58例表皮生长因子受体突变状态[J].江苏医药, 2013, 7 (11) :804-806.

[4]孙晓军, 李杰.非小细胞肺癌患者血浆表皮生长因子受体基因突变检测及其临床意义[J].中华临床医师杂志, 2013, 7 (9) :2833-2837.

[5]杜艳萍, 江兴堂, 尹小文, 等.表皮生长因子受体基因突变在晚期非小细胞肺癌维持治疗中的作用[J].中国新药杂志, 2010 (17) :1580-1584.

[6]Govindan R, Page N, Morgensztern D, et al.Changing epidemiology of small-cell lung cancer in the United States over the last 30 years:analysis of the surveillance, epidemiologic, and end results database.Journal of Clinical Oncology, 2012, 20:631-632.

[7]杜艳萍, 江兴堂, 尹小文, 等.表皮生长因子受体基因突变在晚期非小细胞肺癌维持治疗中的作用[J].中国新药杂志, 2010, 17 (22) :1580-1584.

表皮生长因子受体突变 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2003年1月~2014年1月本院诊治的新疆维吾尔族非小细胞肺癌患者的组织蜡块43例,病情均经手术病理证实[8]。本组患者男23例(53.49%),年龄23~72岁,平均(56.95±2.54)岁;女20例(46.51%),年龄23~75岁,平均(57.88±2.74)岁;年龄分界:<60岁者11例(25.58%),≥60岁者32例(74.42%);鳞癌、腺癌、大细胞癌和其他癌症的情况分别为15例(34.88%),21例(48.84%),4例(9.30%)和3例(6.98%);依据国际通用肿瘤分期标准做TNM分期,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ期肿瘤分别为9例(20.93%),12例(27.90%),19例(44.19%)和3例(6.98%);有吸烟史者16例(37.21%),无吸烟史者27例(62.79%);受教育程度:初中及以下12例(27.91%),高中至大专17例(39.53%),大专以上14例(32.56%)。本组患者性别、年龄、病症分型、TNM分期及受教育程度等基线资料均未对本研究实验结果构成不良影响。

1.2 纳入与排除标准

纳入标准:患者病情符合本研究实验基本要求;均为新疆维吾尔族;研究实验展开条件均相同;临床资料无缺失。排除标准:较难完全配合本研究实验实施者;患者统计资料缺失,无法完成研究分析[9,10]。

1.3 方法

采用4%中性甲醛固定,经石蜡包埋本组所有患者的病理标本,行常规HE染色,选择肿瘤成分>80.00%的瘤组织切片进行EGFR基因突变检测。43例患者病理标本行ARMS-PCR法检测,均采用EGFR基因突变检测试剂盒检测,试剂盒购自厦门艾德生物医药科技有限公司[(货号:ADx-EG01,EG07,EG08,EG09),规格:24测试/盒]。反应条件分别为,第一次扩增:94℃预变性3 min,58℃30 s,72℃30 s,共25个循环,最后72℃延伸3 min;第二次扩增:94℃预变性3 min,58℃30 s,72℃30 s,共25个循环,最后72℃延伸3 min。具体操作步骤:将阳性质控品Tap酶(EGFR29)取出,室温解冻后摇匀,离心15 min后待用。然后将3份2.25μL EGFR29分别置入45μL待测标本DNA、45μL阳性质控品(STD)和45μL超纯水(NTC)中,用涡旋器摇匀15 min后再快速离心15 min[11]。揭开8联反应条条盖,取出DNA样品5μL分别加入8联PCR管反应条,盖上条盖做离心处理。然后加入PCR仪器,行扩增程序。共进行三个阶段,将各阶段收集到的信号,行实时PCR,并保存文件。

1.4 观察指标

统计本组43例NSCLC患者的EGFR基因,主要包括第19外显子和第21外显子L858R点的突变检测情况;分析本组所有患者各基线资料与EGFR基因突变的相关性。

1.5 统计学处理

采用SPSS 18.0统计软件对数据进行分析,计量资料以均数±标准差(±s)表示,采用t检验,计数资料用百分率(%)表示,采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 本组NSCLC患者EGFR基因突变检测情况

本组43例NSCLC患者EGFR基因突变的检出例数为5例(11.63%),其中4例患者为EGFR基因第19外显子缺失改变,占EGFR基因突变总数的80.00%(4/5),明显高于1例患者EGFR基因第21外显子L858R点突变,所占的20.00%(1/5),差异有统计学意义(P<0.01)。

2.2 本组NSCLC临床病症分型与EGFR基因突变的相关性

本组43例NSCLC患者临床病症分型与EGFR基因突变具有一定相关性,即腺癌患者EGFR基因突变检出率为19.05%(4/21),明显高于临床其他几个癌病症。见表1。

注:EGFR:表皮生长因子受体

2.3 本组NSCLC基线资料与EGFR基因突变的相关性

本组43例NSCLC临床基线资料中女性EGFR基因突变检出率为20.00%(4/20),较男性的4.35%(1/23)高(P<0.05),剩余3项基线资料比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

注:女性患者与男性患者EGFR基因突变检出率比较,#P<0.05;EGFR:表皮生长因子受体

3 讨论

肺癌在临床恶性肿瘤疾病中位居首位,具有极高的病死率,其中NSCLC又以75%的比率,为肺癌患病人数最多的病症。NSCLC确诊较晚,常见手术和化疗方法治疗已无法取得理想临床效果,患者5年存活期也较短。随着科学技术的进步和对NSCLC的深入研究,EGFR作为原癌基因的一种表达产物,EGFR高表达或基因突变会促进瘤血管生成,加快癌变进展,NSCLC患者肺细胞组织中EGFR表达普遍较高,因此寻找EGFR基因突变的关联因素并靶向抑制,对NSCLC疾病的治疗具较大帮助。由于国内外对新疆维吾尔族NSCLC患者EGFR基因突变的相关研究较少,本文相关研究具有十分重要的意义。

EGFR基因位于人类第7号染色体短臂7p12-14区,包括28个外显子,EGFR基因是上皮生长因子细胞增殖和信号转导的受体,与肿瘤细胞组织的侵袭、增殖、转移、凋亡抑制及血管生成有密切联系[12,13]。EGFR基因突变检测对非小细胞癌患者个体化疗具有积极帮助,所以本研究回顾性分析本院诊治的43例新疆维吾尔族NSCLC患者的临床资料,根据其EGFR基因突变检出率,患者临床病症分型与EGFR基因突变的相关性以及患者临床基线资料与EGFR基因突变的相关性予以综合性分析,旨在为NSCLC患者临床治疗提供依据。本次收集标本量较少,考虑原因为:①患者就诊时即为晚期,失去了手术机会,未能收集到组织标本;②特殊的地理区域及经济特点,患者经济承受能力较差,未能进一步诊断治疗;③部分患者经穿刺确诊为肺癌,但组织较小,无法完成EGFR基因的进一步检测。

研究结果显示,本组43例患者中EGFR基因突总检出率为11.63%(5/43),其中4例患者为EGFR基因第19外显子缺失改变,占EGFR基因突变总数的80.00%(4/5),明显高于1例患者EGFR基因第21外显子L858R点突变占EGFR基因突变总数的20.00%(1/5),其可能与小分子TKIs的敏感度具有一定关系。大量研究证实,18-21外显子为EGFR基因的主要突变点,而其中90%是19和21号的外显子突变,肿瘤细胞的耐药性与21号外显子点突变密切关联,这主要是由于C-T的转换在790位密码子出现,引起的EGFR基因中790位点的T790M转变,好发于药物治疗后癌症复发患者中[14]。本研究患者均未首次接受治疗,因此第21号外显子L858R突变检测率低于第19外显子缺失改变,上述理论研究很好地证明了本次实验结果。EGFR基因突变率在不同种族的人群中存在显著差异。文献报道,亚洲人口EGFR基因突变率能够达到40%左右,而高加索人群则还不到10%[15]。另有研究认为,新疆维吾尔族为罗马人种,本组患者的EGFR基因突变率为11.63%,考虑与种族差异有关,需要进一步的实验研究[16]。

本研究中针对患者临床病症分型与EGFR基因突变的相关性给予调查分析,结果显示,本组患者临床病症分型与EGFR基因突变具有一定相关性,即腺癌患者EGFR基因突变检出率最高:19.05%(4/21),明显高于鳞癌的6.67%(1/15),大细胞癌的0.00%(0/4)及其他癌病患者的0.00%(0/3)。提示NSCLC患者病症分析与EGFR基因突变具有一定相关性,由此看来,在临床治疗中可根据患者疾病类型做出良好治疗方案的拟定,这对增强NSCLC患者临床治疗效果,提高生存率,改善其生活质量均具有积极影响意义[17]。临床相关研究发现,我国汉族肺腺癌EGFR突变率约为75%,本研究新疆维吾尔族19.05%检出率明显比较低,因此临床应用EGFR-TKI的效果会受到限制,但是本研究样本较少,期待以后会有进一步的研究进展[18]。

本研究结果显示,本组43例非小细胞癌患者临床基线资料中女性患者EGFR基因突变检出率为20.00%(4/20),较男性患者4.35%(1/23)高,差异有统计学意义,但患者年龄、有无吸烟史、TNM分期等基线资料比较无明显差别。相关临床研究发现,EGFR基因突变检出率与性别无关联,男女患者相关检出率无明显差异,与本研究结果存在差异,分析原因可能与本研究样本基数比较少相关[19]。且本研究吸烟与非吸烟突变无明显差异,与相关研究存在区别,分析原因可能与当地选取样本二手烟、其他途径吸烟造成突变降低相关[20]。关于新疆维吾尔族NSCLC患者EGFR基因突变与相关病理特征因素的相关性,还需后续更多的临床研究及验证。

综上所述,新疆维吾尔族NSCLC患者EGFR基因突变与病理特征具有一定相关性,通常多见于腺癌,好发于女性患者,且EGFR的基因突变研究可有效促进肺癌分子靶向的治疗发展。靶向药物治疗虽然个体差异较大,但其能够针对性地阻断机体肿瘤细胞增殖,具有独特的靶向治疗机制,且毒副作用小。因此,可合理利用基因检测进行靶向治疗优势人群的筛选,完成个体化的治疗方案实施,从而进一步提升肿瘤患者的临床疗效。

摘要：目的研究新疆维吾尔族非小细胞肺癌(NSCLC)表皮生长因子受体(EGFR)基因突变与病理特征的相关性。方法 回顾性分析2003年1月~2014年1月新疆喀什地区第二人民医院诊治的新疆维吾尔族NSCLC患者的组织蜡块43例,病理标本均予EGFR基因突变检测试剂盒检测,观察患者EGFR基因突变检出率、临床病症分型与EGFR基因突变的相关性,基线资料与EGFR基因突变的相关性。结果 本组患者病理标本EGFR基因突变率为11.63%(5/43),第19外显子缺失改变率[80.00%(4/5)]显著高于第21外显子L858R点突变率[20.00%(1/5)](P<0.01);临床病症分型中腺癌EGFR基因突变检出率[19.05%(4/21)]较鳞癌[6.67%(1/15)]、大细胞癌[0.00%(0/4)]及其他癌[0.00%(0/3)]高(P<0.05),同时临床基线资料中女性EGFR基因突变检出率[20.00%(4/20)]较男性[4.34%(1/23)]高(P<0.05)。在临床基线资料中年龄、吸烟史和TNM分期的EGFR基因突变检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论 新疆维吾尔族NSCLC患者EGFR基因突变与病理特征具一定相关性,临床女性腺癌患者较多见。

表皮生长因子受体突变 篇5

1 材料和方法

1.1 材料

健康SD雄性大鼠46只(体质量280～300 g),清洁级,购自四川大学华西实验动物中心;Cetuximab(德国默克里昂制药公司);EGFR抗体(美国Santacruz);RT-PCR试剂盒(美国Santacruz)。

1.2 方法

1.2.1 分组

大鼠随机分为3组:CPC模型组(10只)、Cetuximab治疗组(30只)和假手术组(SO,6只)。治疗组分为3个亚组。

PARK[6]曾通过在大鼠胆管内留置异物的方法建立CPC模型,研究紫杉醇对CPC的抑制作用,本实验参照PARK等介绍的方法,复制动物模型。

Cetuximab给药组的3个亚组则在CPC模型组的基础上,以尼龙线为引导丝,插入20号静脉留置针进胆管,分别注入浓度为C 0.05%、C 0.10%和C0.20%溶液。SO组仅在开腹后关腹。

1.2.2 标本采集

术后1周,麻醉后,切取全部肝外胆管组织,将胆管分为两段,一段置于10%甲醛溶液中固定,常规行HE染色、PAS染色、Masson染色及免疫组织化学染色,另一段置于液氮中保存,行RT-PCR。

1.2.3 图像分析

美国Nikon&Spot图像采集系统采集图像,Image-proplus 4.5分析软件(美国Media Cybernetic公司)进行图像分析。按随机等距抽样原则选取测定视场,以积分光密度值(IOD)作为参数进行计算。

1.3 统计学方法

采用SPSS 12.0软件进行分析处理,计量资料以均数±标准差表示,各组间比较用方差分析(One-way ANOVA),两两比较用LSD-t检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 大体病理观察

采集胆管标本时,观察各组大鼠的胆管大体病理特征并测量直径:(1)CPC模型组的胆管壁增厚,管壁僵硬,胆管明显增粗,胆管弹性降低,管腔内可见胆汁浑浊,部分管壁已有少量附壁胆管结石形成。(2)C 0.05%组胆管直径比CPC模型组细,管壁薄。(3)C0.10%组及C 0.20%组的胆管直径小于C 0.05%组,胆管壁增厚及炎症反应程度较C 0.05%组减轻,质地柔软,但与SO组仍有差异(见图1)。

2.2 HE染色观察

CPC模型组胆管壁增厚,黏膜上皮增生,呈绒毛样向管腔内突起,管壁纤维组织,管腔直径明显变小,黏膜下腺体呈分枝状增生,以中性粒细胞为主的炎症细胞浸润增加。增生的胆管壁纤维组织包裹胆管壁腺体,黏液瘀滞,腺腔扩张。和CPC模型组相比,C 0.05%组胆管壁薄,纤维组织及黏膜下腺体少;C 0.10组%和C 0.20%组炎症改变轻于C 0.05%组,但仍未达到SO组水平(见图2)。

2.3 PAS染色观察

糖黏蛋白可表达于黏膜上皮及黏膜下腺体细胞质及细胞膜。在PAS染色中黏液糖蛋白呈紫红色。CPC模型组的胆管黏膜上皮及管壁腺体PAS染色明显增强,表现为胆管黏膜上皮及黏膜下腺体细胞质及细胞膜上阳性染色物质增多。C 0.05%组弱于CPC模型组;C 0.1%组和C 0.2%组弱于C 0.05%组,仍强于SO组(见图3)。

2.4 Masson染色观察

Masson染色下胶原纤维呈蓝色。CPC模型组胆管管壁及管周胶原纤维大量增生,增生的胶原纤维将黏膜下腺体包裹。C 0.05%组胶原纤维的密度和厚度较CPC模型组小;C 0.10%组和C 0.20%组较C0.05%组小,但两组间差别不明显,仍强于SO组(见图4)。

A:CPC模型组;B:C 0.05%组;C:C 0.10%组;D:C 0.20%组;E:SO组

A:CPC模型组;B:C 0.05%组;C:C 0.10%组;D:C 0.20%组;E:SO组

A:CPC模型组;B:C 0.05%组;C:C 0.10%组;D:C 0.20%组;E:SO组

A:CPC模型组;B:C 0.05%组;C:C 0.10%组;D:C 0.20%组;E:SO组

A:CPC模型组;B:C 0.05%组;C:C 0.10%组;D:C 0.20%组;E:SO组

2.5 EGFR的免疫组织化学染色观察

EGFR阳性表达:细胞浆和细胞膜呈棕黄色,以细胞浆为主。CPC模型组可见大量的EGFR阳性表达于增生的胆管黏膜上皮及黏膜下腺体的细胞浆和细胞膜,以积分光密度值(IOD)作为参数来量化各组间的EGFR表达(见图5、6)。C 0.05%组弱于CPC模型组;C 0.10%组和C 0.20%组均较C 0.05%组弱,但两组间差异不明显,仍略强于SO组。

1)与CPC模型组比较,P<0.05;2)与C 0.05%组或SO组比较,P<0.05

2.6 EGFR的RT-PCR检测结果

CPC模型组EGFR m RNA成高表达状态,C0.05%组较CPC模型组表达稍减少(P<0.05),但仍明显高于C 0.10%组及C 0.20%组(P<0.05),C 0.10%组及C 0.20%组EGFR m RNA复制数量差别不大,但表达仍大于SO组(见图7、8)。

CPC模型组(n=10);C 0.05%组(n=10);C 0.10%组(n=10),C0.20%组(n=10);SO组(n=6)。EGFR m RNA检测

1)与CPC模型组比较,P<0.05;2)与C 0.05%组或SO组比较,P<0.05

3 讨论

肝内胆管结石病治疗后复发率相当高[10],其主要原因是肝内胆管结石同时合并炎症、狭窄[11,12]。有研究指出肝内胆管结石反复发作的病理基础是慢性增生性胆管炎(CPC)[13,14],CPC与胆道感染及肝内胆管结石之间存在恶性循环[8,9]。PARK等[3]通过动物实验探讨了紫三醇对慢性增生性胆管炎的抗增殖作用,效果明显,由于其细胞毒性大等副反应,应用受到限制。本研究选择的Cetuximab是人/鼠嵌合型抗人EGFR单克隆抗体[15,16,17],探讨这种以EGFR为靶点的药物能否用于治疗慢性增生性胆管炎,从而预防肝内胆管结石的复发。

本研究中,笔者通过胆道局部给药,探讨了Cetuximab对CPC中过度增殖的胆管黏膜上皮、胆管壁腺体、管壁胶原纤维及过度分泌的黏液糖蛋白是否具有抑制作用及其效果。实验结果显示,在CPC模型组,胆管炎症明显,胆管黏膜上皮、胆管壁腺体、管壁纤维结缔组织增生明显,黏液糖蛋白分泌增多,说明动物模型复制是成功的;治疗组大体标本显示,炎症减轻,胆管质地软,胆管直径细,管壁薄;HE染色和Masson染色显示胆管壁增生组织受到明显抑制,管腔直径扩大;PAS染色显示胆管壁腺体黏液糖蛋白的分泌明显抑制,而黏液糖蛋白是成石初期主要的成核因素[18,19]。通过不同浓度的Cetuximab治疗组之间的比较,发现浓度在0.10%以下抗增生作用强度呈现剂量依赖性,而浓度为0.10%～0.20%的抗增生作用未见明显增强,可能受体拮抗作用已达到饱和。

通过对EGFR的免疫组织化学染色和EGFR的RT-PCR分析发现,随着Cetuximab浓度的增加,胆管EGFR蛋白和m RNA的表达较CPC模型组明显少,证实Cetuximab具有下调EGFR表达的作用,并有受体饱和效应。有研究指出Cetuximab可上调Cyclin/CDK抑制蛋白p27KIP1的表达,阻止细胞从G1期进入S期;Cetuximab可使磷酸化视网膜蛋白(Rb)减少,抑制转录因子E2F的释放,从而阻止细胞从G1期进入S期。Cetuximab还可诱导促凋亡基因Bax表达,使Bax/bcl-2比值升高,激活Caspase-8,促进细胞凋亡[20,21,22]。在基因水平,Cetuximab通过上调周期抑制因子,下调周期促进因子从而减少EGFR表达。该实验结果提示Cetuximab用于CPC,可以取得良好的抗增生作用。

表皮生长因子受体突变 篇6

1 非小细胞肺癌的流行病学特征

非小细胞肺癌 (non-smallcell lung cancer, NSCLC) 又称非小细胞癌, 是肺癌中对人危害极大的一种。与小细胞癌相比, 它的癌细胞分裂更缓慢, 扩散转移速度也较慢, 但其发病率很高, 占全部肺癌患者的80%~85%[1]非小细胞肺癌涵盖鳞癌、腺癌、大细胞未分化癌、细支气管肺泡癌, 患者总的5年生存率不到15%, 虽然NSCLC早期患者5年生存率高达80%, 但NSCLC根治术后 (包括进展期) 的5年生存率降至35%~50%, 因此在NSCLC早期诊断和及时治疗意义重大。然而NSCLC早期患者自己不易察觉或症状不明显, 仅有15%的患者可以确诊, 但确诊时多为中晚期, 大多数患者发现时已伴有近远处转移。40岁以上人群为NSCLC高发人群, 其发病率随岁数的增长而渐渐提高, NSCLC确诊的中位年岁为71岁, 男性患者病发高峰为75~79岁, 女性患者略低于男性为70~74岁, 青年患者 (年龄≤40岁) 相对较少[2]。手术切除是NSCLC首选的治疗方案, 手术医治对未发生转移的肿瘤原病发灶切除更有效, 但50%~60%的Ⅰ~ⅢA期患者在手术彻底后切除后仍会复发去世, 复发后的中位生存期为11.5个月。由于70%的患者在确诊时已错过手术最佳时机或已失去手术机会, 故手术治疗方法局限性大, 难以达到预期目的, 同时常用的放化疗以及免疫治疗对靶细胞的选择性特异性差, 治疗中常伴随杀伤大量健康细胞, 治疗的缓解率分别为25%~35%和15%~20%, 疗效也不完全使人满意。实际上有很多癌症患者都是药源性致死而并非死于癌症本身[3]。近年来, 分子靶向抗肿瘤药物的靶向性、低毒性和特异性日益引起研究者与临床工作者关注, 也是世界范围内研究的热点。临床应用数据显示, 表皮生长因子受体作为分子靶标在肺癌的诊断和治疗中正起着越来越重要的作用。

2 EGFR与肿瘤

2.1 EGFR简介

表皮生长因子 (epidermal Growth Factor, EGF) 最早在小鼠颌下腺进行分离纯化, 然后在人的胃酸中也发现存在。表皮生长因子受体 (epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) 是EGF细胞增殖的受体及信号传导的受体, 位于人类第7号染色体短臂P13~q22区, 由1186个氨基酸残基组成, 分子量约为170 k D。EGFR是一种分布于哺乳动物角质细胞、神经胶质细胞、上皮细胞、成纤维细胞等细胞膜外表的多功能糖蛋白, 这种跨膜蛋白结构由三部分组成:一个胞外功能区、一个短的穿膜区以及一个胞内区[4]。胞外功能区能够联结表皮生长因子等配体;胞内区域具有酪氨酸激酶活性, 此区域包括3个重要结构:氨基端小叶、α螺旋结构和羧基端小叶。EGFR与配体联结后, 在细胞外构成同源二聚体或异源二聚体, 二聚体发生内陷, 构象发生变化, 细胞内TK被激活, 分子内发生自身磷酸化激活有丝分裂, 磷酸化后的酪氨酸从而引发信号传导机制、激活分子位点、激活下游的多个通路。

EGFR是鸟类成红细胞白血病病毒 (avian erythroblsatic leukemia viral, v-er-b) 致癌基因同源体, 是原癌基因cerb B1的表达产物, 是跨膜受体酪氨酸激酶 (HER/Erb B) 族类成员之一, 别名HER1或Erb B-1。该家族包括HER1 (erb B1, EGFR) 、HER2 (erb B2, NEU) 、HER3 (erb B3) 和HER4 (erb B4) , 在细胞的生理过程中施展着显著的调控作用[5]。

EGFR基因涵盖28个外显子, 第18-21号位于外显子编码酪氨酸激酶域。EGFR基因5'调控区包含一个富含GC的启动子, 缺乏保守序列TATA盒和CAAT盒, 有多个位点可以作为转录起点。EGFR信号传导通路参与调节了多种生物学效应:如基因表达、生成新血管、抗凋亡、调控修复DNA的损伤、诱导细胞周期阻滞、细胞的增殖等。EGFR信号传导通路激活后, 主要通过以下几条通路实现信号传递: (1) Ras/Raf/MAPK通路; (2) PI3K/AKT通路; (3) PLC-γ通路; (4) JAK/STA通路, 通路 (1) 与细胞的增殖联系紧密, 而通路 (2) 与细胞的生长凋亡、侵袭迁移等生理功能有关。

2.2 EGFR与肿瘤的联系

肿瘤标志物一词最先出现于1978年, 美国学者Herberman在人类免疫及肿瘤免疫诊断大会上率先提出。肿瘤标志物是能够指示肿瘤存在的化学类物质[6]。此类物质在肿瘤组织中的含量远远高出健康组织, 它们可以指示肿瘤的性质和组织类型、细胞分化、细胞功效。肿瘤标志物敏感性好、特异性高, 对于肿瘤前期的诊断、分类、治疗有着积极的作用, 因此不断激发人们对其进行深入广泛的研究。除已知的癌胚蛋白、肿瘤相关抗原、特殊血浆蛋白等, 原癌基因、抑癌基因及其产物也广泛地被用作肿瘤标志物, EGFR即是一种实用性较强的肿瘤标志物。

EGFR在许多上皮性肿瘤中被异样激活, 生成异常激活的信号如受体高表达、基因突变、受体的配体高表达、基因扩增、负性调节机制失活等。受体激活后打通下游信号通路, 下游细胞内的底物发生汇集或磷酸化, 从而激活有丝分裂信号和其他加强肿瘤细胞活动的信号, 促成肿瘤的成长、发展。EGFR酪氨酸激酶功能缺失、EGFR胞内信号通路中关键因子的活性异常或信号通路中细胞定位异常, 与肿瘤的增殖分化等生理过程紧密相关, 均会引起肿瘤、免疫缺陷疾病及心脑血管疾病的发生。EGFR的特点决定了EGFR是一种可用性非常强的肿瘤标志物, 目前EGFR抑制剂已成为分子靶向治疗的重要靶点[7]。

3 目前对EGFR表达及突变的研究

3.1 EGFR表达

研究显示, EGFR是一种重要的基因, 调控很多肿瘤疾病:结肠癌、头部和颈部鳞状细胞癌、乳腺癌、神经胶质瘤等, 许多肿瘤都有EGFR过表达或异常表达, 晚期肺癌患者也经常存在EGFR过表达状态, 且预后不良。EGFR的过多表达在细胞内产生了大批信号, 激活下游细胞通路, 致使细胞过度生长并具备侵袭迁移性。肺癌患者的组织学分型不同, EGFR的过表达率也不一样, 表达率范围在40%~80%之间, 有研究认为, EGFR表达最多的是鳞癌, 其次是细支气管细胞癌。EGFR表达最低的是腺癌[8], 目前关于NSCLC患者EGFR表达检测的方法多为免疫组化方法。

Arfaoui等[9]研究发现NSCLC患者粘膜原发性肿瘤EGFR表达强度和分布比正常粘膜原发性肿瘤显著增加, EGFR阳性肿瘤患者比EGFR阴性肿瘤患者生存时间明显减短, 认为EGFR超表达是一个预测非小细胞肺癌患者的预后不良的标记。

周璇[10]选用免疫组织化学SP三步法检测63例NSCLC原发肿瘤组织及相应淋巴结转移癌组织中EGFR的表达状态, 在两类组织中, EGFR表达阳性的比例分别为76.2% (48/63) , 79.4% (50/63) , EGFR基本都在NSCLC肿瘤细胞胞浆表达, 少量细胞的胞膜也有表达。认为EGFR在NSCLC原发癌组织及相应淋巴结转移癌组织中的表达较正常肺组织中显著增高。王中秋等[11]选用采用免疫组织化学SP三步法检测100例NSCLC及与其相对应的100例癌旁健康肺组织中EGFR的表达情况, 认为EGFR在NSCLC组织中有63%阳性表达, 远大于其在健康组织13%阳性表达。

已有研究显示, 检测多种基因表达水平或作用关系在肺癌的诊断方面具有重要价值[12]。有研究用免疫组织化学法检测60例NSCLC患者在不同临床病理特征下组织中EGFR和Ki60的表达状态。发现NSCLC患者EGFR表达阳性率65%, 其中鳞癌71.43%, 腺癌55.00%, 腺鳞癌60%, 与文献报道的结果 (鳞癌74%~100%, 腺癌34%~97%, 大细胞癌33%~100%) 基本相似, Ki67阳性表达率为81.67%, 表明EGFR的阳性表达与NSCLC的生物行为密切相关, EGFR的表达与Ki67表达有协同作用。Zhu等[13]在研究中把VEGF和EGFR作为NSCLC的联合治疗靶点, 通过抑制两者, 发现肿瘤细胞的生长和转移得到明显的控制。宋懿懿等[14]检测186例NSCLC患者在不同临床病理特征下VEGF和EGFR的表达情况, 发现NSCLC组织中VEGF阳性表达率为35.48%, 而EGFR阳性表达率为55.91%。NSCLC组织中VEGF和EGFR的表达具备相关性, 可作为判别NSCLC患者病情及预后的参考提示。

EGFR的持续高表达可产生加速肿瘤细胞生长、肿瘤转移、新血管生成等恶劣结果。国内外有研究认为, EGFR在不同性别NSCLC患者中的表达存在差异。NSCLC女性患者的EGFR表达高于男性患者, 多数研究认为这可能是因为女性患者的基因突变率高于男性导致。如宋懿懿等[14]检测结果显示, EGFR在不吸烟人群、女性以及腺型NSCLC组织中表达偏高, 与淋巴结转移及分期密切相关。男性患者表达率显著低于女性患者、男性吸烟患者表达率显著低于女性不吸烟患者、鳞癌患者表达率显著低于腺癌患者 (P<0.05) ;N0、Ⅰ~Ⅱ期患者EGFR的阳性表达率显著低于N1~3、Ⅲ~Ⅳ期患者 (P<0.05) ;EGFR表达对生存率也有着显著的影响, EGFR表达阳性组患者的生存率明显低于EGFR表达阴性组患者。对于女性NSCLC患者, 由于EGFR的表达同癌症病理类型、癌症TNM分期及向淋巴结转移程度有密切的关系, 所以EGFR可作为判别女性NSCLC病情进展和预后的重要指标, 是关键的肿瘤标记物, 对患者分子靶向医疗方法的选取有重要的指导意义。

3.2 EGFR突变

EGFRVⅠ、EGFRⅡ和EGFRⅢ是三种EGFR突变蛋白, EGFRVⅢ是其中最为熟知的突变蛋白, 其突变模式为:胞外氨基酸残基缺失, EGFR配体结合域丢失导致受体酪氨酸激酶处于持续活化状态。在NSCLC中, EGFR突变总发生率约为26%[15], EGFR酪氨酸激酶区域的突变主要发生在18-21外显子, 全部突变总量中, 19外显子和21号外显子突变占90%, 这也许和此位置DNA的A-T序列的密集程度有联系[16], 同时也和对表皮生长因子受体-酪氨酸激酶抑制剂 (EGFR tyrosine kinase inhibitors, EGFR-TKIs) 的敏感性相关;EGFR突变常被视作是原癌基因的“激活突变”, 目前EFGR突变的检测方法有: (1) 直接测序法, 这个方法被视作是基因突变检测的“金标准”; (2) 核酸肽锁核酸 (PNA-LNA) 的聚合酶链式反应法; (3) 定点突变的PCR法:如mutation-specific PCR (MSP法) ; (4) 变性高效液相色谱法 (DHPLC) 等。

有学者对40例晚期NSCLC患者进行了CT引导下经皮肺穿刺活检[17], 从石蜡包埋组织中提取DNA, 采用巢式PCR扩增EGFR基因外显子18、19、20、21, 纯化后的PCR产物用Bigdye v3.1kit (ABI) 双向测序, 共测出EGFR基因突变15例 (37.5%, 15/40) , 其中, 11例为外显子19突变, 3例为外显子21突变, 1例为外显子19、21均存在突变, 非腺癌患者的EGFR基因突变率远小于腺癌患者。CT领导的经皮肺穿刺活检方法简易可行、安全可靠, 是晚期NSCLC患者获得肿瘤组织检测EGFR基因突变的可靠方法。

姜北等[18]收集48例晚期NSCLC患者血清及相应石蜡组织标本DNA, 通过直接测序法来测出EGFR基因19和21外显子的突变状态, 血清EGFR基因突变检出率为14.583% (7/48) , 组织样本中, EGFR基因突变检出率为31.2%, 认为血清与组织DNA检测出EFGR突变类型一致, 血清循环DNA可用于EFGR基因突变检测, 为肺癌靶向治疗提供实验依据。

张怡湜等[19]用石蜡组织提取DNA, 再用荧光定量法检测EGFR突变情况。在全部NSCLC患者中基因突变率为40.9%, 携带EGFR基因突变的患者大多是非吸烟者和腺癌患者。Yang等[20]采用实时荧光PCR技术检测315例NSCLC患者血清癌胚抗原 (CEA) 水平和EFGR突变情况, 发现二者存在正相关关系。

ISEL研究得出, 亚洲非抽烟女性腺癌患者是具备异质性的特别的群体。在这个群体中, EGFR基因突变 (包含19Del、L858R及T790M) 发生率更高。单因素分析结果得出, EGFR基因在腺癌中突变率明显增高;而多因素分析显示, 性别不再是影响原因。此次研究还发现, 在中国人群中肿瘤家族史与EGFR基因突变状态存在相关性。

不同人种肺癌的EGFR突变率存在较大差异, Li等[21]在对202例肺腺癌患者检测研究后发现, 我国汉族肺腺癌患者的EGFR突变率为75.3%。Schmid等[22]和Kris等[23]经过对大批肺癌病例研究后认为, 高加索人肺癌EGFR的突变率为7%~17%。在Han等[24]和Hsu等[25]的进一步研究显示了东亚人肺腺癌患者的EGFR突变率为30%~62%。我国不同民族间的肺癌的EGFR突变率也不同。单莉等[26]研究阐明中国维吾尔族人肺腺癌患者EGFR突变率为16.2%, 突变率显著小于汉族肺腺癌的EGFR突变率。

4 EGFR甲基化研究

4.1 DNA甲基化

DNA甲基化属于表观遗传学中的一种重要模式, 当前关于抑癌基因的甲基化探讨较多。DNA甲基化是指:DNA中CG两个核苷酸的胞嘧啶被选择性地增添甲基集团的化学过程。即以S-腺苷甲硫氨酸为供体, 遇到DNA甲基转移酶的作用后, 供体上的甲基集团转移到Cp G二核苷酸胞嘧啶5位碳原子上, 使其变成5-甲基胞嘧啶 (5 m C) 的化学修饰过程。Cp G二核苷酸是哺乳动物DNA甲基化发生的作用点, 密布于基因组的5'启动子和第一外显子位置, 也就是Cp G岛 (Cp Gislands, CGIs) , Cp G岛长为0.5~5 kb, GC含量接近55%, 尽管只占到DNA的1%, 但可以使染色质结构、DNA的稳定性和DNA与蛋白质的相互作用方式发生改动。甲基化方法的探讨对于基因的调控以及肿瘤的产生有十分紧密的关联。通常细胞中Cp G岛处于非甲基化的状态, 基因能正常表达。而当细胞产生癌变后, 这些CG位置就会显示甲基化状态, 基因转录调控受到影响, 基因的正常结构被打乱[27], 这可以导致基因功能的异常, 细胞生长分化失控, 最后形成肿瘤。DNA甲基化过程可逆。很多高甲基化缄默的基因能够被DNA甲基转移酶抑制剂 (如5-氮杂胞苷) 作用恢复表达也就是去甲基化, 组蛋白去乙酰化酶则能够提高DNA甲基转移酶抑制剂去甲基化的功能。

许多编码蛋白质的基因和编码micro RNA的结构基因内5'Cp G岛发生甲基化使基因失活, 肿瘤进一步发生发展, 基因失活存在于肿瘤产生发展的不同阶段。由于几乎所有癌症病变早期都存在肿瘤相关基因 (包括癌基因和抑癌基因) 甲基化的改变现象, 因此DNA甲基化现象是肿瘤早期诊断的理想标志物, 可以用于癌症危险人群的早期筛查[28]。基因的DNA甲基化的检测是诊断病情的重要指标, 也是鉴别肿瘤类型的重要辅助手段。经常使用判别DNA甲基化检测法有: (1) 甲基化敏感性内切酶法; (2) 亚硫酸氢盐修饰法; (3) 特异性识别甲基化修饰DNA的抗体以及蛋白法; (4) 使用质谱或色谱等精密仪器检测, 前三种技术措施的使用较广泛。DNA甲基化检测优势在于:通过PCR可以扩增检测很微量的DNA组织, 敏感性很高, 而且DNA甲基化区域明确, 便于设计引物以及探针检测。临床多选择两种或多种方法联合检测, 目的是提高检测效率和准确性。由于血清标志物创伤小、没有有害射线接触、耗资较少, 目前寻觅特异性较好和敏感性较高的血清肿瘤标志物是人们探讨的热门。DNA甲基化虽已普遍用于肺癌患者初期筛查诊断, 然而在临床的一些诊断中还存在少许问题:如单个基因的阳性率偏低, 特异性位点极少, 不能满足肺癌初期筛查标准;DNA甲基化标志物在临床无创或微创方式得到的介质如痰液血液中尚未得到验等。DNA甲基转移酶 (DNMT) 抑制剂缺少特异性, 能够使最初处于沉默状态的一些基因重新具备活性, 加快癌变的发生。

4.2 EGFR甲基化

DNA甲基化的起先探讨齐集在少数较明确的抑癌基因, 有研究认为, DNA甲基化不只在抑癌基因中, 原癌基因中也有其存在。检测细胞系以及组织中EGFR的Cp G岛甲基化状态能够得出, 乳腺癌细胞系CAMA1中EGFR的甲基化率高至90%, MB435和MB453甲基化率为30%~50%。在其他不同的细胞系中也有EGFR甲基化现象, 例如头颈部鳞癌细胞中EGFR甲基化率是35%, 肺癌细胞EGFR甲基化率是11%。在高表达EGFR的宫颈癌细胞系He La和EGFR表达阴性的白血病细胞系K562中, 前者EGFR基因启动子区域Cp G岛没有产生甲基化, 而后者EGFR基因启动子区域转录起始点周围出现高甲基化现象[29]。

5 EGFR用于癌症的靶向治疗

最近几年EGFR靶向药物渐渐问世并逐步应用于晚期NSCLC的医治, NSCLC分子靶向药物较多, 当前临床经常使用的靶向治疗可分为下列几类: (1) 以表皮生长因子受体为靶点的医治方法, 涵盖EGFR-TKIs及EGFR单克隆抗体; (2) 抗肿瘤血管生成的靶向治疗; (3) 多激酶 (多靶点) 治疗等。由于EGFR过表达对肿瘤细胞的发生发展有促进作用, 故可作为靶向治疗NSCLC的突破点[30], EGFR已成为靶向肺癌治疗手段中的重要的分子靶点。伴随分子生物学研究的不断钻研, 表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 (EGFR-TKI) 开辟了一条治疗肺癌的新途径。

EGFR酪氨酸激酶在癌组织中含量很高, 它能够有针对性地将磷酸根转移到蛋白质的酪氨酸残基上使其发生磷酸化。而小分子酪氨酸激酶抑制剂 (TKI) 对EGFR中高度保守的ATP结合位点竞争性进结合EGFR, 阻断氨基酸残基磷酸化, 控制酪氨酸激酶的活性以及下游信号通路的激活, 信号传导遭到干扰, 导致肿瘤细胞周期发生阻滞, 加速肿瘤细胞凋亡, 新生血管产生被抑制, 肿瘤细胞迁徙转移能力减弱, 从而可达到治疗肿瘤目标。对于配体依赖型和配体非依赖型的EGFR活化, EGFR-TKI都可以产生抑制作用。临床常用的吉非替尼 (gefitinb) 和厄洛替尼 (erlotinib) 两种药物均为喹啉类衍生物, 目前常作为二线或三线方案治疗NSCLC特别是晚期NSCLC。研究显示EGFR突变与Gefitinib、Erlotinib的疗效存在紧密关联。EGFR酪氨酸激酶编码区域是EGFR基因突变关键产生位置, 这个位置同时也是EGFR-TKI靶向药物的作用靶点, 酪氨酸激酶抑制剂的药物在NSCLC中, 尤其是在医治肺腺癌的过程中展现了特别好的抗肿瘤疗效, 一般情况下, 有EGFR突变的NSCLC患者对Gefitinib、Erlotinib治疗敏感, 有效率在80%以上;而无EGFR突变的患者对Gefitinib、Erlotinib治疗有效率在10%以下。因而, 在抗肿瘤治疗中通过使用抗EGFR疗法, 可以发挥对肿瘤生长的抑制功用。

有学者通过聚合酶链反应 (MSP) 法检测EGFR的甲基化状态, 并通过免疫印迹分析和定量实时方法研究EGFR蛋白质和m RNA的表达水平[31]。研究认为, DNA甲基化的抑制作用可能提高EGFR-TKIs和吉非替尼在非小细胞肺癌细胞的抗肿瘤效应。但EGFR-TKIs的疗效存在明显差异, 临床实践发现EGFR-TKI只对部分患者有效, 吉非替尼在晚期癌症患者中的有效率为8.9%~69%[32]。且许多患者经过一定治疗时间后出现疾病进展获得性耐药。患者产生EGFR-TKI耐药的原因可能是EGFR甲基化与突变的关系, 也可能与下游信号分子的结构性活化、EGFR旁路的TK信号激活有关。还需不断地研究确定, 有助于进一步为临床治疗提供指导依据。

6 展望

非小细胞肺癌是一组在组织学、转移方式、治疗后反应和基因表达等方面均表现出明显异质性的疾病, 深刻地了解非小细胞肺癌中EGFR分子与信号转变的重要意义, 可以指导我们从分子水平认识肿瘤。随着人们对非小细胞肺癌及其相关基因、相关功能的不断深入研究, 相信最终会找到令人满意的分子靶标并运用于各型癌症的诊断与治疗。

摘要：近半个世纪, 我国肺癌发病率和病死率均居全部恶性肿瘤之首。将来的20年, 我国的肺癌病发数和病死数还在持续上升, 传统的癌症治疗方法正面临着一个新的艰巨的挑战。近年来肺癌的分子病理指导下的个体化靶向治疗作为一项极具潜力的新方法已逐渐成为肺癌临床标准治疗的一部分, 有着传统化疗及免疫治疗无可匹敌的优越性。肺癌分子靶向的诊断和治疗正逐渐成为常规治疗以及最佳个体化治疗的重要依据。表皮生长因子受体已成为炙手可热的临床肺癌治疗的分子靶点。

表皮生长因子受体突变 篇7

1对象与方法

1.1研究对象对2011年2月-2015年10月我院普外科收治并手术治疗的52例胃癌患者的临床资料及组织病理学标本进行回顾性分析。纳入标准:(1)术后组织病理学诊断明确为胃癌;(2)术前未接受新辅助放疗、化疗或生物治疗;(3)临床病理资料相对完整;(4)有完整术后随访数据;(5)组织标本获取经患者或家属签署知情同意书。排除标准:(1)组织病理学诊断不明确者;(2)胃部良性肿瘤者;(3)术前接受新辅助放化疗及生物治疗者;(4)无术后随访数据者。根据纳入与排除标准,最终纳入52例患者,其中男34例,女18例,中位年龄52.3岁(31~78岁),TNM临床分期Ⅰ+Ⅱ期21例,Ⅲ+Ⅳ期31例。

1.2研究方法

1.2.1仪器设备:石蜡切片机、显微镜、电热恒温箱、微波炉、离心机、微量加样仪、切片架等。

1.2.2主要试剂:一抗试剂:MAB-0196 Monoclonal Anti-Human EGFR单克隆抗体;试剂盒选择即用型免疫组化二步法EliVisionTM染色试剂盒及DAB显色试剂盒,购自北京索莱宝科技有限公司。

1.2.3 EGFR免疫组织化学检测:本研究采用免疫组化EliVisionTM二步法对EGFR进行测定:首先对病例石蜡切片进行烘烤3h,然后脱蜡再用蒸馏水冲洗2min;然后进行抗原修复。消除过氧化物酶活性;然后使用PBS冲洗2次;加入一抗,37℃孵育1h;然后用PBS冲洗。将试剂(Polymer helper)滴入其中,于37℃条件下孵育20min;滴入试剂(Poly peroxidase anti-mouse/rabbit IgG),于37℃条件下孵育0.5h;PBS冲洗后DAB显色5min。

1.2.4EGFR蛋白表达:显色后在光学显微镜下进行观察,判断EGFR的表达情况。EGFR阳性者光镜下胃癌细胞膜以及细胞浆呈现棕黄色,而阴性者细胞膜以及细胞浆未见棕黄色颗粒样沉淀现象。阳性结果判定:每张切片选取5个视野,计数每个视野中细胞总数及EZH2阳性的细胞数。染色强度:不着色0分,淡黄色1分,棕黄色2分,棕褐色3分;阳性细胞所占的百分比:无着色为0分;阳性细胞上<25%为l分,阳性25%~50%为2分,阳性细胞上>50%为3分;两种积分相乘,>3分为阳性。

1.3统计学处理所有统计分析采用stata12.0(http://www.stata.com;StataCorporation,CollegeStation,TX)软件完成,计量资料采用(x±s)表示,首先进行正态分布检验,符合正态分布的资料,组间比较用t检验,不符合正态分布数据,用秩和检验;计数资料用率表示,组间比较用χ2检验或者Fisher精确检验;生存分析数据采用中位数表示,绘制生存曲线,组间比较采用风险比例模型Log-rank检验,双侧P<0.05表示差异具有统计学意义。

2结果

2.1EGFR在组织中的表达胃癌组织中EGFR阳性者24例,阳性率为46.2%(24/52),远癌正常胃组织EGFR阳性者6例,阳性率为21.4%(6/28),胃癌组织中EGFR的阳性率显著高于正常胃组织,差别有统计学意义(P<0.05)。

2.2EGFR表达与临床病理特征临床病理特征分析显示癌组织中EGFR阳性表达与患者肿瘤的大小、浸润深度和淋巴结转移有关(P<0.05),而与患者的年龄(P>0.05)、性别(P>0.05)等临床因素无关,具体见表1。

2.3EGFR与预后EGFR阳性患者的中位生存时间为17.2个月,EGFR阴性患者的中位生存时间为25.4个月,EGFR阳性患者中位生存时间显著低于阴性患者HR=2.01,95%CI:1.22~3.84(P<0.05)。见图1。

3讨论

来自全球范围的权威肿瘤流行病学研究显示,全球范围内每年胃癌新发病例数高达60万人,而因胃癌死亡的人数高达40万[5]。胃癌已成为威胁人类健康的重大公共卫生问题。我国为胃癌高发国家,胃癌的特点为患者年龄轻、病理类型大多为低分化癌、预后不良等[6]。早期患者比例低,患者术后5年生存率较低,且患者术后常常复发或转移,导致远期疗效较差,总体预后较差。

近年来随着分子生物学研究的不断进展,胃癌的一些相关标志物逐渐被发现,包括预后及诊断标准物等。EGFR是近年来发现的一类与胃癌预后及临床病理特征有关的蛋白。该蛋白属于酪氨酸激酶I型受体家族,既往在多种实体肿瘤研究中发现EGFR高表达与肿瘤预后不良有关。大多数研究结果认为EGFR高表达的肿瘤大多存在明显增强的恶性生物学行为,包括早期淋巴转移、分化程度较低、侵袭能力较强及早期血行转移等,是患者预后不良的独立危险因素和标志物。Mizukami等[7]检测胃癌患者中EGFR表达,其阳性表达率为46%,且阳性表达与胃癌患者的肿瘤大小、分化程度及淋巴结转移有关,提示EGFR阳性为预后不良的相关标记物。在本研究中,笔者采用免疫组化SP法检测了52例胃癌患者癌组织和远癌组织中EGFR的表达情况,研究发现,癌组织EGFR阳性率显著高于远癌正常胃组织(P<0.05)。此结果说明EGFR蛋白在胃癌的发生发展中可能起到了一定的作用。同时研究还发现,胃癌肿瘤较大、浸润深度较深及存在淋巴结转移的患者中EGFR阳性率较高,说明EG-FR阳性表达与患者肿瘤的大小、浸润深度和淋巴结转移有关,是肿瘤恶性生物学行为的标志物。从而也提示其可能与患者的预后不良有关。笔者进一步采用生存曲线法评估EGRF表达与患者生存期的关系,研究发现,EGFR阳性患者的中位生存时间为17.2个月,显著低于阴性患者25.4个月(P<0.05)。

因此,EGFR蛋白在人胃癌组织中阳性表达率较高,且与患者预后存在显著的相关性,可作为临床判断胃癌预后的一个重要指标。但患者的淋巴结转移及预后等与多种因素有关,本文未对其他混杂因素进行处理,可能结果受到一定的影响。因此,应进一步加大样本量,采用多元Cox回归和logisitc回归方法,探讨EGFR与患者临床病理特征及预后的关系,为临床胃癌的诊治提供更为可靠的依据。

参考文献

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[2]Yan S,Li B,Bai ZZ,et al.Clinical epidemiology of gastric cancer in Hehuang valley of China:a 10-year epidemiological study of gastric cancer〔J〕.World Journal of Gastroenterology,2014,20(30):10486-10494.

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[4]Ha SY,Lee J,Jang J,et al.HER2-positive gastric cancer with concomitant MET and/or EGFR overexpression:a distinct subset of patients for dual inhibition therapy〔J〕.Int J Cancer,2015,136(7):1629-1635.

[5]Siegel R,Naishadham D,Jemal A.Cancer statistics,2012〔J〕.CA Cancer J Clin,2012,62(1):10-29.

[6]焦军全,崔同建.胃癌中HER2研究进展〔J〕.当代医学,2012,18(7):22-24.