基因组DNA甲基化（共8篇）
基因组DNA甲基化 篇1
DNA甲基化作为表观遗传学的主要形式之一, 是正常发育、分化所必需的, 可通过特定甲基化形式的拷贝而遗传, 因此受到人们的高度重视。DNA甲基化是在DNA甲基转移酶 (DNA Methyltransferases, DNMTs) 的作用下, 一个甲基被添加到胞嘧啶环的第5碳原子上形成5-甲基胞嘧啶的过程。这种DNA修饰方式不改变基因序列, 但能调控基因的表达[1]。DNA甲基化水平用5-甲基脱氧胞苷 (5-mC) 占DNA中总胞苷的百分数表示[2]。
目前, 在法医学上已经有大量的关于整体基因组DNA甲基化水平与年龄关系的研究, 用于推断个体的年龄。作为一种商品, 猪生长周期较短, 一般以日龄代表其生长发育阶段, 而日龄与体重呈高度正相关[3], 因此体重可代表其生长发育阶段。目前, 还未见到猪不同生长发育阶段DNA甲基化水平检测的相关报道。试验采用高效液相色谱 (HPLC) 法检测不同体重阶段荣昌猪阉公猪的基因组DNA甲基化水平, 探讨其随生长发育阶段变化的规律, 以期为生产提供参考。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
Waters600E高效液相色谱仪、Waters2487紫外检测器、Millennium 32色谱软件;4种脱氧核苷标准品 (2′-脱氧胞苷、2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、2′-脱氧胸苷) 和核酸酶P1购自美国Sigma公司, 5-甲基脱氧胞苷购自上海生工生物工程技术服务有限公司, 核酸酶A和牛小肠碱性磷酸酶购自TaKaRa公司。
1.2 样品采集
按《荣昌猪饲养标准 (GB 7223—1987) 》统一饲养, 屠宰时采集荣昌猪阉公猪肝脏组织, 10kg阶段12头, 20kg阶段11头, 35kg阶段12头, 50kg阶段12头, 80kg阶段12头, 100kg阶段11头。
1.3 DNA的提取及检测
取-80℃冷冻的肝脏25mg, 用常规酚-氯仿法提取DNA, 1%琼脂糖电泳检测, 并用紫外分光光度计检测DNA浓度[4]。
1.4 DNA的水解
取提取的DNA 20μL置于PCR仪, 95℃变性2min, 然后立即置于冰水浴中[4]。
1.5 高效液相色谱分析
根据5种脱氧核苷的性质, 优化分离效果得到最佳的色谱条件:色谱柱, SymmetryshieldTM RP18柱 (150mm×3.9mm, 5μm) ;流动相, 0.1%磷酸 (H3PO4) , 并用三乙胺调pH值为3.0;流速, 1.0mL/min;检测器波长, 273nm;柱温, 25℃;灵敏度, 2.000 0AUFS;进样量, 20μL[5,6]。
根据5种脱氧核苷出峰的实际情况, 将2′-脱氧胞苷、2′-脱氧腺苷、2′-脱氧鸟苷、2′-脱氧胸苷的浓度范围定位在25～1 000μmol/L, 5-甲基脱氧胞苷的浓度范围定位在12.5～500μmoL/L。配制成5种不同浓度的混合标准样品 (5-甲基脱氧胞苷12.5, 25, 125, 250, 500μmoL/L) 和其他4种脱氧核苷25, 50, 250, 500, 1 000μmoL/L, 用于制备标准曲线。经单一的各种脱氧核苷和混合的HPLC分析, 除2′-脱氧腺苷与混合标样中各组分洗脱峰的保留时间有所提前以外, 其余4组的单一标样洗脱峰的保留时间与混合标样中各组分洗脱峰的保留时间基本一致。
1.6 数据处理
以5-甲基脱氧胞苷的含量占总胞苷的百分含量 (5-mC/5-mC+dC) 代表基因组DNA甲基化水平, 结果用Excel 2003和SPSS软件进行反正弦转换后再进行单因素方差分析, 采用LSD法进行多重比较, 最后还原成原来的数值。
2 结果与分析
2.1 5种脱氧核苷混合标样的色谱图 (见图1) 和测定的定量工作曲线方程
经各脱氧核苷标样单组分及混合组分的HPLC分析, 各组分的出峰时间分别为:2′-脱氧胞苷, 1.86min;5-甲基脱氧胞苷, 2.64min;2′-脱氧腺苷, 8.63min;2′-脱氧鸟苷, 11.35min;2′-脱氧胸苷, 13.83min。通过不同浓度各脱氧核苷标样的HPLC峰面积 (y) 建立的与浓度 (x) 的回归关系方程见表1。
2.2 不同体重阶段猪的5-mC相对含量 (见表2)
将样本HPLC洗脱峰的保留时间与标样的保留时间比较确定每个组分峰, 再根据标准曲线换算得出样品中脱氧核苷的浓度。从表2可知, 5-mC的相对含量在100kg体重阶段最小, 为2.834%;在10kg体重阶段最大, 为3.840%。10kg体重阶段显著高于80kg体重阶段 (P<0.05) , 极显著高于100kg体重阶段 (P<0.01) ;20, 35, 50kg体重阶段显著高于100kg体重阶段 (P<0.05) ;其余各体重阶段间的差异不显著 (P>0.05) 。由此可知, 荣昌猪阉公猪肝脏组织基因组DNA的甲基化水平随着体重的增加而逐渐降低。
注:同列数据肩标字母相同表示差异不显著 (P>0.05) , 字母相邻表示差异显著 (P<0.05) , 字母相间表示差异极显著 (P<0.01) 。
3 讨论
3.1 影响HPLC检测DNA甲基化水平的因素
影响HPLC检测DNA甲基化水平的因素有流动相、pH值、柱子型号、柱温、流速、检测波长以及灵敏度等, 其中流动相是最主要的因素。试验选用0.1%磷酸作为流动相 (pH值为3.0) , 5种脱氧核苷均能有效地分离;波长为254nm和273nm时都能分离, 但是在254nm时对脱氧腺苷的分离效果不如273nm时好, 因此选择最佳波长为273nm;试验的70份样本均在同一条件下测定, 20min内5种脱氧核苷全部洗脱, 部分样本测定了2次, 结果基本一致, 重复性较好。检测过程中, 标准混合样品和检测的样品出峰保留时间基本一致。
3.2 不同体重阶段猪的DNA甲基化水平变化规律
猪生长的快慢与猪的品种、生长发育阶段有关;此外, 与饲养管理和营养调剂也有很大关系。根据猪的整个生长发育过程可分为4个时期:初生期, 1～10kg;细胞成熟期, 11～30kg;细胞分裂增长期, 31～120kg;细胞成熟老化期, 120kg以上。本地猪一般在30～90kg生长发育最快[7]。荣昌猪阉公猪在10～50kg体重阶段肝脏5-mC相对含量有减少趋势 (P>0.05) ;51～100kg荣昌猪阉公猪肝脏的5-mC相对含量显著下降 (P<0.05) 。荣昌猪阉公猪肝脏5-mC相对含量从10～100kg呈先慢后快的变化规律, 符合本地猪的生长发育规律。10～50kg体重阶段的荣昌猪阉公猪处于细胞的成熟期到细胞分裂增长期, 细胞成熟、分裂少或不分裂, 5-mC的相对含量减少缓慢;51～100kg体重阶段的荣昌猪阉公猪处于细胞分裂的增长期, 此时猪血液循环旺盛, 细胞迅速增长, 长得特别快, 随着体重的快速增长5-mC的相对含量减少得较快。
脊椎动物DNA甲基化含量在2%～7%, 而梁秋菊等[8]用高效液相色谱法检测了纯种大白猪 (LW) 、长白猪 (L) 、梅山猪 (M) 及其LW×L、L×LW、LW×M和M×LW杂种猪肌肉中5-mC相对含量, 结果在11.45%～20.26%之间, 血液中5-mC相对含量在2.97%～7.88%之间。本试验检测出荣昌猪阉公猪肝脏组织的5-mC相对含量在2.834%～3.840%之间, 比前者低。可能的原因是研究的猪品种和组织不同。唐韶青等[9]用甲基敏感扩增多态性 (MSAP) 检测不同动物部分组织基因组甲基化程度, 结果表明:不同动物来源相同组织基因组的甲基化程度不同, 相同动物不同组织基因组的甲基化模式具有特异性。因此, 动物DNA甲基化水平在同一种属不同基因型之间可能存在着差异, 同一基因型不同组织之间也可能存在差异。
摘要：采集不同体重阶段 (10, 20, 35, 50, 80, 100 kg) 的健康荣昌猪阉公猪肝脏组织, 用HPLC法检测其DNA甲基化水平。结果表明:5-甲基脱氧胞苷 (5-mC) 占总胞苷的百分含量在10 kg体重阶段显著高于80 kg体重阶段 (P<0.05) , 极显著高于100 kg体重阶段 (P<0.01) ;20, 35, 50 kg体重阶段显著高于100 kg体重阶段 (P<0.05) ;其余体重阶段间差异不显著 (P>0.05) 。说明荣昌猪基因组DNA甲基化水平随体重的增加呈下降趋势, 1050 kg体重阶段下降幅度较小, 51100 kg体重阶段下降幅度较大。
关键词：荣昌猪,DNA甲基化,高效液相色谱法
参考文献
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基因组DNA甲基化 篇2
关键词：甲基化；肿瘤
中图分类号：Q7文献标识码：A文章编号：1674-0432（2011）-03-0068-1
DNA甲基化（DNA methylation）就是在DNA上在DNA甲基轉移酶的催化下添加甲基基团的一种化学修饰，其提供甲基的氨基酸为甲硫氨酸，被甲基化的部位为胞嘧啶的5位碳原子上，DNA甲基化在生物稳定遗传即基因水平上的稳定遗传具有重要的作用。甲基化是在CpG双核苷酸序列上胞嘧啶的5号碳原子上一种重要调控方式，在基因组里面大多CpG位点很多都是甲基化的，很少的低甲基化的CpG位点大小约为1kb左右，被称为CpG岛，CpG岛位于基因的启动子区，包含着5'端的外显子和内含子，并且与基因的5'端密切相关。
1 DNA甲基化与染色质结构的变化
DNA甲基化与染色质变化的关系非常密切，组蛋白含有的八聚体“尾”乙酰化与脱乙酰基可以增强转录和抑制染色质本身的转录。甲基结合蛋白MeCP2和组蛋白脱乙酰基酶HDAC1都可以影响转录的过程。DNA甲基转移酶C2末端存在催化结构域，N2末端存在调节结构域(DNMT)，调节结构域能使CpG岛发生甲基化。DNMT家族含有DNMT1、DNMT2、DNMT3a、DNMT3b等种类，科学家推测在肿瘤组织中含有很多CpG岛的高度甲基化以及低度甲基化与甲基转移酶和DNA脱甲基酶关系密切。
2 甲基化与癌症的关系
通过DNA启动子异常甲基化，可以导致肿瘤的发生。DNA的高甲基化可以使肿瘤抑制基因以及编码细胞黏附分子和生长调控蛋白的基因失活。有报道说明CpG岛的甲基化可以促进胆管癌的发生。CpG岛的甲基化能够使转录过程停滞，进而发生癌症。进来研究发现CpG岛高甲基化与CpG岛保护因子缺失、肿瘤中DNMT过度表达、DNMTs结合因子功能失调和基因组各部分复制时空紊乱有关。反式作用因子能够保护CpG岛不发生甲基化，如果缺乏CpG岛保护因子，那么将导致CpG岛甲基化状态的出现；DNMTs与肿瘤中的甲基化异常有关，并参与肿瘤的发生发展，很多细胞培养、动物学试验、临床试验均证实使用DNMT1抑制剂，可抑制肿瘤生长；基因组中高转录活性的常染色体部分在S早期复制，而转录失活的异染色体部分通常在S晚期复制，复制时间和空间改变将导致基因表达异常。Soares等研究发现乳腺癌的DNA明显低甲基化，广泛DNA低甲基化和疾病进展的程度、恶性肿瘤的组织学分级具有显著相关性。
经研究发现，肿瘤相关基因的异常甲基化在肿瘤形成过程中起着重要的作用。一些癌基因诸如hMLH1、APC、VHL、P15INK4b、P16INK4α、GST3、E-cadherin等启动子区的高度甲基化都可使相应基因表达受抑，进而促进肿瘤的形成。在研究hMLH1基因时发现，“错误配对修复系统”中的“错配矫正酶”的编码基因(mutH、mutL、mutS)。
5-杂氮脱氧胞嘧啶能够使受到抑制表达的甲基化使基因恢复表达，再次发挥原有功能。如果抑癌基因发生甲基化则其正常功能就不能正常发挥就会导致癌症的产生。P16INK4α如果发生过甲基化则P16蛋白表达将会发生异常，将扰乱细胞的正常复制周期，例如在乳腺癌、肺癌和结肠癌中都有此现象的发生。肿瘤转移抑制基因E-cadherin能压制肿瘤细胞的浸润与转移，E-cadherin启动子区如果出现过甲基化，就会激活肿瘤细胞的生长，进而出现癌症，在乳腺癌、胃癌和前列腺癌的细胞系以及胃癌和肝癌的组织中都有此种现象发生。
3 结语
细胞全基因组水平的低甲基化与局部区域关键基因的高度甲基化是肿瘤两个基本的特征，并且其甲基化状态的改变往往会出现于细胞恶性增生的早期，同时伴随着恶性肿瘤的产生、发展而变化。因此，对细胞甲基化状态的及时检测对于预防、治疗及观察预后都具有极其重大的意义。目前许多实验已证实，单个关键基因甲基化状态的改变并不会对肿瘤的产生、发展起决定作用。所以，能不能快速、高效地对细胞全基因组的甲基化状态进行检测，便成为了现在甲基化研究中一项极其重要的任务。
参考文献
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不同甘蔗品种DNA甲基化分析 篇3
DNA甲基化是一种表观遗传 (epigenetic) 现象。在发育过程中, 虽然基因表达调控发生改变, 但DNA的一级结构没有变化, 它可以遗传, 也可能发生逆转 (脱甲基化) [2]。在高等植物中, 胞嘧啶甲基化在基因表达调控中扮演了很重要的角色[3,4,5]。检测DNA甲基化的方法有多种, MSAP (Methylation Sensitive Amplification Polymorphism, 甲基化敏感扩增多态性) 技术, 是在AFLP技术基础上建立起来的, 之后被用于水稻基因组胞嘧啶甲基化的检测上[6], 现已广泛应用于棉花、苹果、拟南芥、香蕉、土豆、草莓等植物上, 评估胞嘧啶甲基化的程度和模式[7,8,9,10,11,12]。鉴于此, 研究从表观遗传学的角度出发, 采用MSAP技术检测不同甘蔗品种不同时期的甲基化多态性, 分析甘蔗生长过程中DNA甲基化水平、模式与变化, 为进一步开展相关研究奠定基础。
1材料与方法
1.1材料
供试8个甘蔗品种信息列于表1。试验材料种植于广西农业院甘蔗研究所本部试验农场。
1.2总DNA提取与MSAP分析
选取生长正常的伸长期和成熟期单株, 取其1叶用于DNA提取。DNA提取及MSAP分析参照Xiong方法实施[13]。
1.3数据处理
标记MSAP扩增片段大小, 以0和1建立数据库。在相同迁移率位置上, 有带的记为1, 无带的记为0。参照DNA分子标记数据分析方法, 将MSAP标记作为等位基因进行多态性研究, 每1条扩增条带视为1个性状。
图1中1~8分别为柳城05-136、桂糖03-1438、桂糖05-3626、桂糖07-645、桂糖06-1001、桂引C1-2003、桂糖06-244、桂糖06-1721。
图2中1~5分别为柳城05-136、桂糖05-3626、桂糖07-645、桂引C1-2003、桂糖06-244。
2结果与分析
2.1 DNA质量检测
取1μL基因组DNA用Nano Drop ND-1000紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度, OD260/OD280比值在1.8~2.0范围内, 纯度较高, 取出2μL纯化的基因组DNA用0.8%琼脂糖凝胶检测结果如图1、图2所示, DNA主带清晰, 降解较少, 适合进行下一步分析。
2.2甘蔗品种甲基化分析
2.2.1甲基化模式
根据Hpa II和Msp I对CCGG序列甲基化是否敏感, 可将酶切结果分4种不同类型, 见表2、图3。
2.2.2伸长期甲基化分析
使用不同引物甲基化的差异见表3。
3对引物扩增结果表明, 不同引物间甲基化略有差异, 引物E7+H/M5甲基化多态性条带最多, 达14条, 甲基化率为30.43%;引物E5+H/M5甲基化多态性条带仅为8条, 甲基化率为27.59%, 在3对引物中甲基化率最低。
在甘蔗伸长期, 用3对MASP引物分析8个甘蔗品种甲基化程度, 共检测到590个位点, 见表4。总甲基化的位点数 (包括全甲基化和仅一条链甲基化的半甲基化) 分别为19、13、15、19、19、17、10和27, 甲基化率分别为18.63%、15.48%、15.96%、19.59%、21.11%、19.32%、12.35%和29.03%。其中, 全甲基化 (双链甲基化) 的条带数分别为10、8、10、14、11、8、7和18, 全甲基化比率分别为9.80%、9.52%、10.63%、14.43%、12.22%、9.09%、8.64%和19.35%。半甲基化的带数分别为9、5、5、5、8、9、3和9, 半甲基化率为8.82%、5.95%、5.31%、5.15%、8.89%、10.23%、3.70%和9.68%。从A、B、C 3种不同类型条带的总数来看, 全甲基化高于半甲基化。由此可见, 伸长期的甘蔗基因组CCGG位点发生甲基化的方式主要是以内部胞嘧啶 (Cm5CGG) 双链甲基化为主。
2.2.3成熟期甲基化分析
5个甘蔗品种成熟期甲基化水平分析表明 (表5) , 2对引物组合 (E3+H/M5, E5+H/M5) 共检测到394条带, 总甲基化条带数分别为13、6、13、8和10, 甲基化率分别为13%、6.98%、14.94%、10.39%和10.64%。其中, 全甲基化条带数分别为11、6、12、7和7, 全甲基率为11%、6.98%、13.79%、9.09%和7.45%;半甲基化的带数分别为2、0、1、1和3, 半甲基化率分别为2%、0、1.15%、1.30%和3.19%。从A、B、C 3种不同类型条带的总数来看, 全甲基化高于高半甲基化高。由此可见, 成熟期的甘蔗基因组CCGG位点发生甲基化的方式主要是以内部胞嘧啶 (Cm5CGG) 双链甲基化为主。
3小结与讨论
甘蔗甲基化分析表明, 伸长期甲基化率为15.47%~29.03%;成熟期甲基化率为6.98%~14.94%;全甲基化率高于半甲基化。
DNA甲基化是植物基因调控机制中不可缺少的一部分, 特别是对开花时间、胚乳发育等特殊组织的发育过程或发育状态进行调控。甘蔗甲基化分析表明, 在伸长期甘蔗的平均甲基化水平高于水稻[13]、香蕉[10]、栗树[14], 低于拟南芥[9]和休眠期间牡丹花芽[15]。成熟期的甲基化水平明显较低。在甘蔗生长发育过程中, 伸长期主要积累蔗茎产量, 而成熟期则主要积累糖分。成熟期甲基化水平明显低于伸长期, 可能与需要启动大量参与糖分合成、转运、积累的相关基因参与代谢有关。
DNA甲基化与动脉粥样硬化 篇4
关键词：DNA甲基化,动脉粥样硬化,表观遗传学,关系
动脉粥样硬化主要指的是发生于大中型动脉、平滑肌细胞异常活动 (增殖、迁移、钙化等) 的一种疾病, 该疾病病理特征可引发冠心病、肾动脉狭窄、脑卒中等心血管疾病, 严重影响患者身心健康及生活质量[1]。目前动脉粥样硬化发病机制尚不明确, DNA甲基化作为表观遗传学不可或缺的一部分, 其模式的改变会影响到基因转录及基因表达。相关研究表明DNA甲基化与动脉粥样硬化之间有一定的关联, 前者可能参与后者的发生发展[2]。本研究就此对DNA甲基化内涵及其与动脉粥样硬化的关系展开详细的论述。
1 DNA甲基化内涵
DNA甲基化是从表观遗传学中延伸出来的一种修饰方式, 主要指的是经由DNA甲基转移酶DNMTs将被复制后的基因序列催化, 使甲基基团变换位置到胞嘧啶碱基上。DNA甲基化常在双核苷酸丰富的区域中发生, 致使基因序列的空间构型产生变化, 抑制蛋白的结合。同时其可以有效关闭特定基因活性, 特别是甲基化, 可以促进DNA重新活化及表达, 且在细胞分裂过程中维持稳定性。其中, 甲基化状态有去甲基化 (主要指的是发育中的部分基因) 、高度甲基化 (女性一条失去活性的X染色体等) 及不间断的低甲基化 (管家基因等) 三种状态。
DNA甲基化在维持人体健康中有着至关重要的作用, 如促进胚胎发育、维持正常细胞功能等。在对小鼠实验中若随意少设置一种甲基转移酶, 都会对小鼠胚胎造成巨大威胁, 更不用说人类。一般而言人类基因组中含有5万多个Cp G岛, 对于正常人来说, 人体基因组中Cp G岛的Cp G位置一般处于去甲基化或低甲基化状态, 岛外的Cp G位点一般也处于甲基化状态。一旦DNA甲基化模式被改变, 就会影响基因表达及其他, 引发肿瘤、动脉粥样硬化等相关疾病。目前很多专家将DNA甲基化是否异常作为肿瘤早期预测、分级及预后评估的重要标准。此外, DNA甲基化异常引发相关疾病的过程是可以改变的, 这可能成为临床相关疾病治疗及预防的入口。
2 DNA甲基化与动脉粥样硬化的关系
目前很多文献表明, 基因表观遗传学中的重要组成部分——DNA甲基化改变可能引发动脉粥样硬化, 两者之间有着某种特定联系。外国学者对小鼠进行实验, 将Apo E基因给去掉, 结果发现小鼠内动脉粥样硬化斑块部位及增殖血管平滑肌细胞中的5-甲基胞嘧啶相应的有所减少, 其认为这可能与DNA甲基化异常有关。异常基因甲基化导致平滑肌细胞增殖, 并迁移到内膜生成动脉粥样硬化。与肿瘤细胞生物学特征基本一致。之后很多学者研究均表明异常DNA甲基化会影响动脉粥样硬化的生长发展, 从而引发冠心病等心血管疾病。另外一些特异性DNA甲基化也会抑制动脉粥样硬化的生长, 主要表现在以下几个方面。
2.1 雌激素受体基因影响动脉粥样硬化
ER (即雌激素受体基因) 是一种核受体, 可以阻止低密度脂蛋白的合成而促成肝脏高密度脂蛋白合成, 有效减少胆固醇含量, 保护心血管。雌激素受体基因主要有两种类型:一种是ER-a亚型。相关文献表示冠心病患者体内ER-a亚型雌激素可对高度甲基化产生作用, 且半胱氨酸 (高同型) 可以激活甲基化及冠状动脉硬化;另一种为ER-b亚型, 可以诱发动脉粥样硬化。有学者对ER-b亚型雌激素进行研究, 发现它启动的甲基化水平及基因表达比正常组织高许多, 主要与ER-b亚型基因中m RNA表达变多有关。
2.2 EC-SOD对动脉粥样硬化的影响
EC-SOD (即细胞外超氧化物歧化酶) 是一种至关重要的抗氧化酶, 主要由血管平滑肌细胞等产生。将细胞外超氧化物歧化酶于细胞外处理掉 (释放) 可有效降低氧化应激反应。相关细胞实验 (人脐静脉内皮) 表明采取胱氨酸 (低同型) 制约动脉粥样硬化时, 细胞外超氧化物歧化酶表达能力明显减少。此外, 对患有高血脂症 (遗传性疾病) 的兔子进行实验, 发现细胞外超氧化物歧化酶启动甲基化时二核苷酸减少, 提高细胞外超氧化物歧化酶基因转录, 产生动脉粥样硬化。
2.3 抗癌基因-P53
P53抗癌基因可增加蛋白Bax表达, 导致细胞凋亡。相关文献表明, P53抗癌基因高度甲基化与动脉粥样硬化之间有一定的关联。对患有动脉硬化 (发生在颈静脉中) 的老鼠进行实验, 且分为两组, 一组为P53基因缺失组 (实验组) , 一组为P53基因存在的野生型小鼠组 (对照组) , 发现实验组小鼠静脉移植体内重新生长的内膜厚度及细胞密度明显高于对照组。由此可见P53基因缺失会让血管平滑肌细胞增殖, 促进静脉移植体内生成新内膜且其厚度、密度较高。此外, 对于没有Apo E基因的小鼠来说, 若动脉粥样硬化斑块稳定性不变, 则P53能有效抑制动脉粥样硬化的发展, 保护平滑肌细胞。通过一系列的实验和研究, 目前医学界认为P53基因对血管平滑肌细胞生长起抑制作用, 而甲基化会损害P53基因, 引发动脉粥样硬化, 从而出现心血管疾病[3]。
2.4 性别影响
目前临床上患有心血管疾病的多为男性, 但实际上男、女患心血管疾病的发病概率基本一致。存在的差异可能与性染色体及性激素有关, 表现在肝细胞HNF4等转录因子的表达上。具体来说, 女性特殊基因位点的甲基化会提高心肌梗死发病率, 但男性发病却与上述基因没有联系。此外, 社会环境、生活方式等因素也会诱发心血管疾病。
3 结束语
综上所述, 甲基化在调控基因表达上有着十分重要的意义, 可作为某些疾病治疗的重要依据。目前DNA甲基化合理调节在白血病等治疗中得到应用, 但在冠心病的治疗中还需深入研究。可以确定的是, DNA甲基化可作为冠心病早期预测、分级、治疗及预后的重要依据。
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[2]王丽, 赵翠萍.DNA甲基化及其与动脉粥样硬化的关系[J].国际心血管病杂志, 2012 (2) :79-82.
基因组DNA甲基化 篇5
DNA甲基化被认为是第一表观遗传学标志[1]。DNA甲基化在机体发育、染色体稳定性以及维持基因表达水平方面扮演着关键的角色[2]。DNA甲基化是在基因的Cp G岛区域Cp G二核苷酸结构的胞嘧啶上加入了一个甲基集团, 从而引起染色体的关闭以及基因表达的沉默。Cp G岛是一段常常高频率出现于基因启动子序列中富含Cp G二核苷酸结构的区域。据报道, Cp G岛的超甲基化所引起的基因表达沉默参与各种细胞活动, 其中包括细胞周期调控、DNA修复、细胞粘附、信号转导、细胞凋亡以及细胞分化[3]。在哺乳动物细胞中, 大约60%的蛋白编码基因在启动子区都含有Cp G岛。这些Cp G岛在转录活性基因中通常是不发生甲基化的 (像持家基因) , 而在发育与组织特异性基因中通常发生DNA甲基化而在所分化成的组织中引起相应基因的表达沉默[4]。此外, 很多基因在正常组织中不发生甲基化, 却在肿瘤组织中出现异常的甲基化现象。自从首次发现肿瘤中发生超甲基化的基因, 成视网膜细胞瘤抑制基因 (RB1) 之后, 陆续发现很多抑癌基因, 与在正常的组织细胞中相比, 在肿瘤组织中发生超甲基化修饰, 如VHL、CDKN2A或者BRCA1[5]。
迄今为止, 在脊椎动物中已经识别出了6种甲基Cp G结合蛋白, 其中包括Me CP2、MBD1、MBD2a、MBD2b和MBD3[6,7]。这些蛋白普遍的功能特征是它们结合DNA分子中的甲基Cp G结构, 而且经常与HDAC家族成员的功能相关联[6], 彼此协作共同调控基因表达, 如多重的超甲基化基因 (MLH1、TIMP-3、CDKN2B以及CDKN2A等) , 在DNMT1和HDAC抑制剂的联合作用下, 能够有效地恢复基因表达活性, 说明DNMT1和HDAC在肿瘤细胞的基因沉默过程中都发挥着至关重要的作用[8]。Rountree等在最近的研究中也证实了上述的发现, 研究显示, DNMT1蛋白参与HDAC以及其他协阻抑物转录抑制复合物的形成[9]。
近年来, 越来越多的特异基因Cp G岛启动子区的DNA超甲基化所引起的基因表达沉默, 已经成为了很多肿瘤细胞关键的标志性特征[10]。但值得注意的是, 与DNA超甲基化一样, 全基因组水平的低甲基化现象也是肿瘤细胞非常重要的特性。基因组水平的DNA低甲基化现象能够引起染色体的不稳定性以及影响DNA重复序列和着丝粒卫星DNA的稳定性[11]。如全基因组水平的DNA低甲基化与局部DNA超甲基化修饰在乳腺癌中都已频繁地被发现[12]。
目前, 甲基化水平的研究方法主要分为基因组DNA甲基化分析方法以及特定DNA片段甲基化检测方法。基因组DNA甲基化分析方法主要包括甲基化敏感扩增多态性 (MSAP) 技术[13]、高效液相层析 (HPLC) 和高效毛细管电泳 (HPCE) [14];特定DNA片段甲基化检测方法主要包括基于亚硫酸氢钠处理的甲基化特异性PCR法[15]、甲基化敏感的限制性内切酶PCR (MSRE-PCR) [15]以及甲基化敏感的酶限制位点探针法与微阵列分子杂交法[16]。近年来, Min Hu等[17]开发的MSDK技术 (methylation-specific digital karyotyping) 在基因组水平甲基化的高通量分析中有了一定的应用, 在此基础上, Jian Li等[18]发展了该技术, 与DNA测序技术相结合的MMSDK技术在筛选未知的甲基化基因方面有了深度的应用。
鉴于此, 在本项研究中, 我们将利用无Cp G岛结构的p Cp Gfree载体, 在其多克隆位点的一侧或两侧插入CCGG序列, 同时利用HpaⅡ/MspⅠ限制性内切酶体系对甲基化敏感性的差异特点 (HpaⅡ只限于切割CCGG序列中第二个C非甲基化状态的DNA及MspⅠ能够同时切割CCGG序列第二个C甲基化和非甲基化状态的DNA) , 构建一种除了多克隆位点插入的CCGG序列之外, 其它地方不含有Cp G岛结构的甲基化研究载体。利用该载体, 可以将经亚硫酸氢钠处理的基因组DNA (甲基化的CCGG序列不变, 而非甲基化的CCGG中的C转化成T) 用MspⅠ酶切处理后克隆到所构建的甲基化载体p Cp Gfree, 从而获得含有CCGG中第二个C甲基化的基因组DNA文库。利用载体上的引物, 可以方便地对含有CCGG甲基化的基因片段或DNA区域进行扩增或测序, 既免除了根据每个插入片段设计引物的繁琐又避免了扩增基因组中相应片段DNA可能造成的非特异性扩增。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
质粒p MD®19-T Simple Vector (Takara®) 和p Cp Gfree-basic (Invivo Gen®) ;大肠杆菌菌株DH5α (天根®) 和GT115 (Invivo Gen®) 。
1.1.2 试剂
限制性内切酶HindⅢ、Bam HⅠ (Thermo®和NEB®10U/μl) 、HpaⅡ和MspⅠ (Takara®10U/μl) ;T4DNA连接酶 (NEB®和Takara®350U/μl) ;Easy Taq酶 (Trans Gen®5U/μl) ;氨苄青霉素 (Amp) , 博来霉素 (Zeocin) , X-Gal, IPTG。其他相关试剂:质粒提取试剂盒 (OMEGA®) , 胶回收试剂盒 (OMEGA®) 。PCR引物由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。
1.1.3 仪器
细菌培养与质粒制备相关仪器:电子天平 (上海菁海仪器有限公司) ;磁力搅拌器 (江苏荣华仪器制造有限公司) ;p H计;高压蒸汽灭菌锅 (日本Sanyo) ;超净工作台 (苏净安泰) ;制冰机 (德国Ziegra) ;恒温水浴锅 (上海科析试验仪器厂) ;恒温培养箱 (国华企业) ;温控摇床 (国华企业) ;分光光度计;高速冷冻离心机 (美国Thermo Scientific) 。
DNA检测:微波炉, 稳流稳压电泳仪 (北京六一仪器厂) ;紫外成像仪 (伯乐®) ;其他试验所用仪器:PCR仪 (美国伯乐®) 。
1.1.4 培养基
大肠杆菌培养LB液体培养基 (胰蛋白胨5g, 酵母提取物2.5g, 氯化钠2.5g, 蒸馏水定容至500ml, 调节p H至7.0) 。LB固体培养基 (胰蛋白胨5g, 酵母提取物2.5g, 氯化钠2.5g, 琼脂粉7.5g, 蒸馏水定容至500ml, 调节p H至7.0) 。
大肠杆菌培养TB培养基 (胰蛋白胨12g, 酵母提取物24g, 甘油4ml, 加水至900ml并高压灭菌, 加入100ml无菌的0.17mol/L KH2PO4和0.72 mol/L K2HPO4溶液) 。
1.2 方法
预想构建的优化载体p Cp Gfree-MspⅠ质粒与原材料载体p Cp Gfree-basic质粒如图1所示。
1.2.1 HpaⅡ/MspⅠ酶切体系对甲基化的敏感性分析
合成一段已知的DNA序列 (Takara®) , 双链DNA序列如下表1。其中包含一个C (5m C) GG位点。然后根据HpaⅡ/MspⅠ (Takara®) 酶切体系的甲基化敏感性验证其酶切效率。
1.2.2 p Cp Gfree-basic质粒的优化改造
1.2.2. 1 质粒优化改造引物设计及目的片段获得
由于p Cp Gfree-basic本身不含有CCGG位点, 且在大肠杆菌中克隆复制过程中不发生Cp G结构的甲基化修饰。为了构建具有已知CCGG位点的质粒载体, 以p Cp Gfree-basic质粒序列的富含AT碱基区域为模板设计引物, 引物序列如下表2。
在引物1中, 正向引物 (MSPⅠ-F1) 5’端加入Bam HⅠ (GGATCC) 和MSPⅠ (CCGG) 酶切位点, 反向引物 (MSPⅠ-R1) 5’端加入HindⅢ (AAGCTT) 和MSPⅠ (CCGG) 酶切位点;在引物2中, 正向引物 (MSPⅠ-F2) 5’端加入Bam HⅠ (GGATCC) 单酶切位点, 反向引物 (MSPⅠ-R2) 5’端加入HindⅢ (AAGCTT) 和MSPⅠ (CCGG) 酶切位点;在引物3中, 正向引物5’端加入Bam HⅠ (GGATCC) 和MSPⅠ (CCGG) 酶切位点, 反向引物5’端加入HindⅢ (AAGCTT) 单酶切位点。
1.2.2. 2 构建p MD19-T-CCGG克隆载体
以p Cp Gfree-basic质粒序列为模版, 用表2中3对引物分别PCR扩增出3段无实际功能的DNA片段, PCR反应程序:94℃2min;94℃30s, 58℃30s, 72℃30s, 30个循环;72℃10min。取2μl PCR扩增产物为模板, 进行1%琼脂糖凝胶电泳, 扩增片段大小约460bp, 与预期相符合。使用E.Z.N.A Gel Extraction Kit试剂盒回收PCR产物。步骤按试剂盒说明书进行操作。PCR所得目的片段进行胶回收后与p MD19-T载体连接, 产物转化进入大肠杆菌DH5α, 蓝白斑筛选阳性克隆。使用OMEGAPlasmid Mini KitⅠ质粒提取试剂盒提取通过液体培养基扩大培养的阳性克隆质粒, 并以提取质粒为模板, PCR检测重组载体。PCR反应程序如上。取2μl扩增产物为底物进行1%琼脂糖凝胶电泳, 扩增片段大小约460bp, 与预期相符合, 经测验证序列正确性后, 载体分别命名为p MD®19-T-CCGG-1、p MD®19-T-CCGG-2、p MD®19-T-CCGG-3。
1.2.2. 3 构建p Cp Gfree-MspⅠ重组质粒
p MD®19-T-CCGG-1、p MD®19-T-CCGG-2、p MD®19-T-CCGG-3载体分别再经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切所得片段与相同酶切载体p Cp Gfree-basic所得骨架连接获得的新载体即是改造优化之后的含有CCGG位点的载体, 命名为p Cp Gfree-MspⅠ-1、p Cp Gfree-MspⅠ-2、p Cp Gfree-MspⅠ-3。将连接后的载体转化大肠杆菌GT115感受态细胞, 液体培养基扩大培养阳性克隆。使用OMEGAPlasmid Mini KitⅠ质粒提取试剂盒提取阳性克隆质粒, 经MSPⅠ单酶切验证后, 测序验证序列准确性。
2 结果与分析
2.1 HpaⅡ/MspⅠ酶切体系的甲基化敏感性分析
注:M泳道代表DNA Marker;C泳道代表双链DNA对照;1泳道代表双链DNA经MspⅠ酶切产物;2泳道代表双链DNA经HpaⅡ酶切产物。Lane M:DNA marker;Lane C;Represents double strand DNA control;Lane 1:MspⅠrestriction enzyme digested double strand DNA;Lane 2:HpaⅡrestriction enzyme digested double strand DNA.
用HpaⅡ或/MspⅠ分别酶切人工合成CCGG序列 (即表1中双链合成DNA序列) 的第二个C甲基化的片段结果如 (图1) 所示。酶切反应结束后, 2.0%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果显示, 与未加任何限制性内切酶的DNA对照组相比, MspⅠ酶切组能够识别并切割C (5m C) GG点, 且所得电泳结果中片段大小与预期相符合;而HpaⅡ酶切组则不能完成切割, 说明MspⅠ能够特异识别并切割具有内部甲基化的C (5m C) GG位点, 而HpaⅡ不能特异切割酶切C (5m C) GG位点, 说明HpaⅡ/MspⅠ酶切体系可以敏感地识别并区分C (5m C) GG甲基化位点。
注:M泳道代表DNA Marker;1、2泳道代表第一对引物扩增产物;3、4泳道代表第二对引物扩增产物;5、6泳道代表第三对引物扩增产物。Lane M:DNA marker;Lane 1 and 2;PCR amplified DNA fragments use the first pair primers;Lane 3 and 4:PCR amplified DNA fragments use the second pair primers;Lane 5 and 6:PCR amplified DNA fragments use the third pair primers.
2.2 p Cp Gfree-basic质粒优化改造
以p Cp Gfree-basic质粒为模板用 (表2) 中的3对引物, PCR扩增后电泳检测PCR产物片段为460bp, 片段大小与预期相符如 (图3) 。上述PCR扩增成功的目的片段经Bam HⅠ/HindⅢ双酶切后与相同酶切的p MD19-T Simple Vector载体骨架连接后, 转化大肠杆菌和蓝白斑筛选、液体培养基扩大培养后, 获得的重组载体经琼脂糖凝胶电泳检测结果如 (图4) 所示。选取6组克隆进行PCR验证, 结果如 (图4) 所示扩增片段大小约460bp, 与预期相符合, 经测验证序列正确性后, 分别命名为p MD®19-T-CCGG-1、p MD®19-T-CCGG-2、p MD®19-T-CCGG-3。
Bam HⅠ和HindⅢ双酶切p MD®19-T-CCGG-1、p MD®19-T-CCGG-2、p MD®19-T-CCGG-3载体以及p Cp Gfree-basic质粒, 酶切结果如 (图2-5) 所示。酶切片段经凝胶回收连接、转化大肠杆菌GT115感受态细胞、液体培养基扩大培养并提取质粒后, 经测序验证获得改造优化之后的含有CCGG位点的载体, 命名为p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-1、p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-2、p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-3。
2.3 HpaⅡ或MspⅠ酶切验证
用HpaⅡ或MspⅠ对p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-1载体分别进行单酶切, 经琼脂糖凝胶电泳验证表结果如 (图3-7) 所示, 酶切所获得的片段均为460bp, 载体构建成功。但是用HpaⅡ或MspⅠ对p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-2、p Cp GfreeHpaⅡ/MspⅠ-3载体分别进行单酶切, 则酶切效果明显明显不如p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-1载体的酶切效果理想。
3 讨论
DNA甲基化与癌症等重大疾病的发生发展有着密切的联系。DNA的甲基化改变包括高甲基化 (hypermethylation) 和低甲基化 (hypomethylation) 两种态。一般来说, 基因启动子区DNA高甲基化意味着基因的沉默, 而低甲基化意味着基因的激活。抑癌基因等肿瘤相关基因的高甲基化和整个基因组水平的低甲基化在癌症的发生发展的过程中起着重要作用。近年来, 借助于高通量测序技术的发展, 高通量基因组甲基化测序技术应运而生。其中最基本的是基于亚硫酸氢钠转化的Golden Gate甲基化分析技术[19]和Infinium磁珠芯片分析技术[20,21], 以及基于DNA杂交技术和免疫共沉淀技术发展起来的DNA甲基化测序技术[20,21,22], 如染色质免疫共沉淀测序法 (CHIP) 、甲基化DNA免疫共沉淀测序法 (Me DIP) [23]。再有就是将亚硫酸氢钠转化技术与对甲基化胞嘧啶敏感 (Bst UI、HpaⅡ) 或不敏感 (MspⅠ) 限制性内切酶技术相结合的DNA甲基化测序技术[24]和与基因芯片技术结合形成的高通量甲基化测序技术。基于这些高通量测序技术, 发展出下一代高通量测序平台, 包括454焦磷酸测序技术[25]和Illumina (Solexa) 测序技术[26]等。然而, 基于DNA杂交技术的一个缺陷是当探针比较短时, 特异性会降低[25], 而基于免疫沉淀技术的甲基化测序技术的一个局限是对抗体的纯度及特异性要求较高[27]。
注:M泳道代表DNA Marker;1、2泳道代表p MD19-T-CCGG-1两个不同的T-A克隆载体;3、4泳道代表p MD19-T-CCGG-2两个不同的T-A克隆载体;5、6泳道代表p MD19-T-CCGG-3两个不同的T-A克隆载体。Lane M:DNA marker;Lane 1 and 2:Two different clones of plasmid p MD19-T-CCGG-1;Lane 3 and 4:Two different clones of plasmid p MD19-T-CCGG-2;Lane 5 and 6:Two different clones of plasmid p MD19-T-CCGG-3.
注:M泳道代表DNA Marker;C泳道代表DNA阴性对照;其他泳道代表图3~4中各质粒的PCR检测结果。Lane M:DNA marker;Lane C;Negtive control of DNA;other lanes represent the PCR confirmation results of the TA plasmids in Figure 4.
注:M泳道代表DNA Marker;1泳道代表p Cp Gfree-basic质粒DNA对照;2泳道代表p Cp Gfree-basic经Bam HⅠ单酶切对照;3、4泳道代表p Cp Gfree-basic经Bam HⅠ和HindⅢ双酶切产物;5~8泳道为p MD®19-T-CCGG-1的酶切处理, 处理及电泳顺序与p Cp Gfree-basic组一致;9~12泳道为p MD®19-T-CCGG-2的酶切处理, 处理及电泳顺序与p Cp Gfree-basic组一致;13~16泳道为p MD®19-T-CCGG-3的酶切处理, 处理及电泳顺序与p Cp Gfree-basic组一致。Lane M:DNA marker;Lane 1:p Cp Gfree basic;Lane 2:Bam HⅠdigested p Cp Gfree basic;Lane 3 and 4:Bam HⅠand HindⅢdouble digested p Cp Gfree basic;Lane 5-8:Bam HⅠor Bam HⅠand HindⅢdigested p MD®19-T-CCGG-1;Lane 9-12:Bam HⅠor Bam HⅠand HindⅢdigested p MD®19-T-CCGG-2;Lane 13-16:Bam HⅠor Bam HⅠand HindⅢdigested p MD®19-T-CCGG-3.
注:M泳道代表DNA Marker;C泳道代表优化载体的阳性克隆质粒DNA对照;1泳道代表p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-1经MspⅠ酶切产物;2泳道代表p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-1经HpaⅡ酶切产物。Lane M:DNA marker;Lane C:modified p Cp Gfree basic plasmid control;Lane 1:HpaⅡ/MspⅠRestriction enzyme digested p Cp Gfree-HpaⅡ/MspⅠ-1 plasmid;Lane 2:HpaⅡrestriction enzyme digested p Cp GfreeHpaⅡ/MspⅠ-1 plasmid.
基因组DNA甲基化 篇6
1 DNA甲基化的概念
DNA的甲基化修饰是真核细胞基因表达调控的特点之一。通过在DNA的CG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加甲基, 即可抑制或关闭基因表达。作为一种重要的表观遗传修饰, DNA甲基化参与机体的许多生物学过程。比如, 在胚胎发育过程中的DNA甲基化模式的改变是个体发生的关键, 其与基因转录抑制、基因组印迹、X染色体失活、染色质完整性的维持及细胞分化和发育的调控等都有密切的关系。在哺乳动物中, DNA甲基化多发生在对称的CpG二核苷酸上。CpG岛就是富含CpG序列的片段, 通常处在管家基因的转录起始点上。2008年, Cheng X和Blumenthal R M在研究中发现, 抑癌基因启动子CpG岛甲基化的发生所导致的抑癌基因的关闭可能与肿瘤的生成有关。
2 DNA甲基化的调控因素
DNA的甲基化是通过DNA甲基转移酶直接催化和维持, 但这并不是DNA甲基化唯一的调控因素。在基因沉默相关的各种组蛋白修饰中, 最典型的是组蛋白去乙酰化、H3K9甲基化。在各种生物体中, 这些修饰方式与DNA甲基化协同作用抑制转录。
2.1 DNA甲基转移酶与DNA甲基化的关系
1964年, Gold M等在Escherichia coli中鉴定出第一个DNA甲基转移酶。目前的DNA甲基化反应机制是在原核生物的DNA-C5甲基转移酶中首先发现的。当DNA甲基化酶结合DNA后, 将目标的胞嘧啶反转暴露于DNA双螺旋外, 并嵌入酶的催化结构域中。伴随着碱基对氢键的断裂及碱基堆积力的缺失, 半胱氨酸的亲和基团与胞嘧啶第六位碳 (C6) 共价结合。由于S-腺苷甲硫氨酸 (SAM) 的甲基基团结合于S原子上, 分子极不稳定, 在酶的作用下甲基从SAM转移至被激活的C5, 随着C5位上质子的释放与共价中间物的转变, 最终完成DNA甲基化修饰过程。
目前, 在哺乳动物中已经发现和确定了4种DNA甲基转移酶, Dnmt 1、Dnmt 2、Dnmt 3a和Dnmt 3b。它们的结构由N端调节区、C端催化区及中间连接区三部分组成 (Dnmt 2不含N端调节区) 。其中 Dnmt 1是DNA复制后负责维持子链甲基化的酶;Dnmt 2的功能目前尚不明确, 推测与氨酰tRNA甲基化相关;而 Dnmt 3a和 Dnmt 3b的功能是负责外源基因的甲基化, 催化 CpG从头甲基化。另外, 还有一个调节蛋白 Dnmt 3L, 是一种 Dnmt 3的类似蛋白, 它的N-末端只有类似植物同源结构域的基序 PHD 结构域, C-末端只延伸至保守基序Ⅷ, 缺乏有效的催化结构域。但它是DNA从头甲基化的调节因子, 通过与 Dnmt 3a和 Dnmt 3b的C 端结合, 可提高它们的催化活性, 正向调节DNA从头甲基化。
长期以来, 人们对于DNA甲基化和DNA甲基化酶的研究仅限于脊椎动物并大部分限于哺乳动物。2006年, Ying Wang等人发表了关于鉴定蜜蜂中甲基化相关基因表达的文章, 证明在无脊椎动物中同样存在完备的甲基化表观遗传修饰功能, 大大拓宽了甲基化研究的领域。
2.2 组蛋白去乙酰化与DNA甲基化的关系
在基因转录抑制过程中, 基因启动子DNA甲基化与组蛋白修饰相互作用。DNA甲基化可通过介导组蛋白去乙酰化酶 HDAC活性来抑制基因转录。研究表明, NGF诱导的 PC12 细胞分化过程中, Dnmt 3b的N端ATRX区域募集 HDAC2 到 T-Cad 基因启动子, 介导 T-Cad基因表达抑制[1]。2001年, Cervoni N等通过瞬时转染哺乳动物细胞, 发现组蛋白去乙酰化可能指导DNA甲基化。2005年, Santoro R等人的研究表明, HDAC对基因转录的抑制不具有普遍性, 而是选择性地抑制一些基因表达, 协同 Dnmt 发挥作用。他们发现HDAC抑制剂TSA (trichostation A) 会引起Neurospora特异的胞嘧啶超低甲基化, 抑制了哺乳动物rRNA编码基因的CpG甲基化。
2.3 组蛋白甲基化与DNA甲基化的关系
DNA甲基化和组蛋白甲基化之间的相互作用比较复杂。一般认为, 在基因转录抑制中, 组蛋白甲基化是主要事件。2003年, Lehnertz B等人在组蛋白 H3K9 甲基转移酶 SUV39H 敲除的胚胎干细胞的研究中发现, 组蛋白 H3K9 甲基化的丧失直接影响Dnmt 3b介导的DNA甲基化。紧接着Strannikova M等[2]在RASSF1A基因启动子甲基化失活的研究中也发现, 组蛋白H3K9的甲基化先于DNA甲基化。最近, Vire E等[3]在研究组蛋白 H3另一甲基化位点酪氨酸27 (K27) 甲基化的过程中也证实组蛋白甲基化在基因转录抑制中起主导作用。在此基础上, Li H等[4]的研究发现Dnmt 3a和Dnmt 3b的 PHD 区域可与组蛋白 H3K9 甲基转移酶SETDB1 的N端结合, 从生化的角度进一步将组蛋白甲基化和DNA甲基化联系起来。
2.4 DNA甲基化、组蛋白去乙酰化及组蛋白甲基化的协同作用
DNA甲基化、组蛋白去乙酰化和组蛋白甲基化是三种最典型的与染色质凝聚状态有关的共价修饰方式。一方面DNA甲基化影响组蛋白修饰模式;另一方面对真菌、植物和哺乳动物的研究结果表明, 组蛋白甲基化可能是指导DNA甲基化的一种常规信号。但是三者在基因沉默过程中的起始位置在不同的生物体中或不同的基因中可能不同。就目前的研究结果来看, 有种理论认为在部分生物体内甲基化 H3K9 可与接头蛋白HP1 结合并募集 Dnmt 1 导致 CpG 甲基化, 而mCpG可与其结合蛋白MBD募集组蛋白去乙酰基酶 ( HDACs) 使 H3K9 去乙酰化, 最后 mCpG 与其结合蛋白 MBD 通过接头分子HP1募集组蛋白甲基转移酶 (histone-lysine methyltransferas, HKMT) 再使H3K9甲基化。这样表观遗传信息就构成一个循环, 从组蛋白流向DNA再返回组蛋白。在该理论中, DNA甲基转移酶与HDAC相互作用, 可能为传递HDAC活性提供一个可能的选择性通道, 而HDAC活性又为H3K9再甲基化作好了准备。
外部的刺激通过原初信号传递后, 激活组蛋白甲基化转移酶, 从而诱发组蛋白的甲基化作用。这时HP1接头蛋白与甲基化的组蛋白结合, 激活Dnmt使得相关基因的CpG岛发生甲基化作用。CpG岛发生甲基化作用以后, 进一步激活HDACs组蛋白去乙酰化酶, 使其表达量上升[5]。组蛋白中赖氨酸和精氨酸上带有正电荷, 而DNA带有负电荷。通常情况下, 组蛋白去乙酰化酶 (HDAC) 和组蛋白乙酰化酶 (HATs) 调节着赖氨酸和精氨酸的乙酰化状态, 以保持基因的活性或失活状况。HAT活性强时, 组蛋白呈乙酰化状态, 赖氨酸和精氨酸中的正电荷被中和, 组蛋白与DNA结合的能力减低。此时, 基因转录因子容易进入启动子区域。反之, HDAC活性增强时, 基因转录因子就不容易进入启动子区域。因此当组蛋白去乙酰化酶表达量上升时, 基因有可能沉默。
3 DNA甲基化与亚端粒甲基化的关系
DNA甲基化转移酶在一系列信号传导后能选择性地将一些目标基因沉默。2006年, Nature Cell Biology杂志上的一篇文章引起了世人的关注, Gonzalo S等[6]人在小鼠中发现亚端粒高度甲基化现象, 而在Dnmt 1突变型中却发现亚端粒的甲基化被明显抑制, 从而引发了DNA甲基化转移酶与亚端粒低甲基化关系的研究热潮。所谓的亚端粒是指在染色体末端的复杂片段, 含有丰富的假基因和重复序列, 在非同源染色体之间享有相同的同族性, 它的重排改变与染色体末端的稳定性密切相关。2008年, Yehezkel S等在临床ICF病例中发现由于这些病人是 Dnmt 3b 缺陷型, 从而导致亚端粒甲基化的异常。2009年, Osman E等人在研究 Dnmt 多态性时发现Dnmt1、Dnmt2、Dnmt3L的微小突变和DNA的低甲基化现象有关, 而进一步的免疫沉淀反应表明这个低甲基化的位点在亚端粒的基因组区域中。
目前, 大部分研究主要以MeDIP (免疫沉淀技术) 为基础构建DNA甲基化的微阵列芯片, 从而探索亚端粒的甲基化现象, 一般是培育 Dnmt 缺陷型的小鼠或者从ICF病人中抽取样本进行观察。
4 亚端粒甲基化和端粒长度的关系
染色体亚端粒的修饰现象很早就被科学家关注, 2004年Susanne S等人在Hela细胞中利用限制性内切酶研究端粒长度时锁定了一个命名为X-region 的亚端粒DNA片段。这段 2～4 kb 的亚端粒DNA不受限制性内切酶的作用, 研究发现它的序列变化与端粒的长度有密切关系, 从而揭开亚端粒DNA修饰效应与端粒长度关系研究的序幕。在进行表观遗传修饰的探索时, 人们很自然地将目光投向了DNA甲基化现象。以小鼠为生物模式的研究大量展开, 在去除端粒酶的小鼠内发现DNA甲基化水平下调导致的亚端粒低甲基化现象与端粒的延长有关。2008年, Roberta B等人在前人研究的基础上, 构建了新的DNA甲基化对端粒长度的调控途径并找到了转录调控的重要元件Rbl2。上游 miR-290 基因簇的下调表达激活了Rbl2, 它的产物将抑制 Dnmt 的作用, 并进而诱导端粒的变化。尽管如此, 对人体亚端粒甲基化与端粒长度的关联认知仍存在空白。在2006年, Gonzalo S指出, 由Dnmt缺陷引发的亚端粒DNA低甲基化和端粒长度增长的现象与在部分人类癌症细胞中亚端粒、端粒的变化情况很接近, 暗示人们对亚端粒低甲基化和端粒长度之间关系的研究可以从肿瘤细胞入手。令人沮丧的是, 2009年Myung E L等人将这方面的研究推进到人类肿瘤细胞, 却未能得到预期的结果。他们的研究表明, 人类的肿瘤细胞在亚端粒上有不同的甲基化模式, 而亚端粒甲基化作用前后并没有监测到端粒长度明显的变化, 所以他们认为在人体中DNA亚端粒的甲基化与端粒的长度并没有直接的关联。同时, Laura和Luke研究小组在端粒酶阳性细胞和ALT细胞的端粒重复RNA序列研究过程中, 也得出了相似的结论, 人类亚端粒甲基化与端粒长度关联的研究变得更加复杂。
5 小结
随着端粒研究的持续升温, 人们很自然地试图去寻找两者之间的关系。尽管当前人类对亚端粒DNA甲基化和端粒长度关系的研究遇到阻碍, 但相信随着研究的深入和组织样本量的扩大, 这个疑难问题最终会得到圆满的解释。当然, 也有一些研究者另辟蹊径将目光投向了无脊椎动物, 2009年Phalke S等人在果蝇中发现 Dnmt 2对果蝇体细胞中逆转录转座子沉默现象和端粒完整性的影响。他们构建Dnmt 2 突变型果蝇, 研究2R、3R染色体端粒相关序列的沉默及端粒的长度变化, 从而将Dnmt与端粒长度关系的研究推向新的领域。就应用的角度而言, 有人着眼于DNA甲基化与昆虫染色体端粒长度的研究, 从而为病虫害的防治提供了新的手段。也有人以哺乳动物为生物模式, 通过表观遗传学的研究揭示胚胎早期的发育与人类衰老的秘密, 希望研制出抗衰老药物。还有人着眼于肿瘤的发生机制, 希望通过DNA甲基化对肿瘤细胞的端粒长度进行负调控, 从而降低肿瘤细胞基因组的稳定性, 为肿瘤临床诊治提供新的思路。
参考文献
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基因组DNA甲基化 篇7
1 mi RNA的功能
mi RNA是一种单链的内源性非编码小RNA,长度一般为18~22个核苷酸,在RNA聚合酶Ⅱ或RNA聚合酶Ⅲ转录下,由茎环结构的转录前体加工而合成。它们广泛存在于真核生物的细胞内,参与多种生物学过程并高度保守。1993第一次被报道,在21世纪被真正的识别。研究发现,mi RNA通过与靶基因3′非翻译区(3′-UTR)不完全互补结合引起靶m RNA的降解或抑制其翻译,调控基因的表达,进而在细胞的增殖、凋亡、代谢过程中发挥作用[4]。每个mi RNA可以有多个靶基因,同一基因也可能被众多mi RNA靶识别,由此形成复杂的调控网络,精细调控功能基因的表达。
2 DNA甲基化异常与胃癌
DNA甲基化最常见的就是Cp G二核苷酸中胞嘧啶的甲基化修饰,在DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)催化下,胞嘧啶5位碳原子上发生甲基转移,生成5-甲基胞嘧啶(5-m C)。在基因组的某些区域中,通常是基因的启动子区域,5′端非翻译区和第一外显子区Cp G序列密度非常高,超过均值5倍以上,成为鸟嘌呤和胞嘧啶的富集区,称之为Cp G岛[5]。在正常细胞中,位于抑癌基因启动子区域的Cp G岛处于低水平或未甲基化状态。在肿瘤中该区域的Cp G岛呈高甲基化状态,染色质构象发生改变,抑癌基因的表达被关闭,参与肿瘤的发生。研究报道p16基因启动子区高甲基化在胃癌发生中起重要作用[6]。胃癌中胰岛素样生长因子结合蛋白-3(IGFBP-3),Ras相关结构域家族1A基因(RASSF1A)沉默与其启动子DNA甲基化有关[7,8]。最近的研究检测发现,102例胃癌标本中有丝分裂前期检查点基因(CHFR)的甲基化率为34.3%,并提示CHFR甲基化是增加抗癌药物多西紫杉醇治疗敏感性的重要因素[9]。转录因子21(TCF21)低表达与胃癌侵袭、转移及预后密切相关,异常DNA甲基化是导致TCF21低表达的重要原因[10]。DNA甲基化在胃癌的发病过程中起着重要作用,其相互关系的研究进展,将为胃癌的早期诊断、治疗、预后判断等提供新的理论基础。
3 胃癌中mi RNA的异常表达
在胃癌中存在多种mi RNA的异常表达,并通过不同途径调控各自靶基因的表达,发挥癌基因或抑癌基因样作用。
3.1 促癌作用的mi RNA高表达
部分mi RNA在胃癌组织和细胞系中的表达往往高于非胃癌组织和细胞系,通过促进肿瘤细胞的增殖、转移、侵袭等多种机制发挥其致肿瘤作用。mi R-NA-221及mi RNA-222在胃癌组织中异常高表达,调控其靶基因p21家族成员p27、p57表达下降,促进细胞增殖[11]。而敲除胃癌细胞系SGC7901中mi RNA-211、mi RNA-222表达后可抑制细胞的增殖,并增加了胃癌细胞对放疗的敏感性[12]。mi RNA-21在胃癌中的过度表达增加了对抑癌基因———磷酸酶张力蛋白同源物(PTEN)的抑制作用,下调程序性细胞死亡因子4(PDCD4)的表达,从而促进胃癌的淋巴结转移和血管侵袭[13,14]。有报道mi R-17-5p/20a在胃癌组织中表达增高。在胃癌细胞中沉默mi R-17-5p/20a表达后,诱导细胞周期的阻滞及细胞调亡,并揭示mi R-17-5p/20a通过转录后调控其靶基因p21和p53诱导的核蛋白1(TP53INP1)的表达[15]。对mi R-421在胃癌中表达的研究发现,进展期胃癌标本中mi R-421表达明显高于正常对照组和癌前病变组,mi R-421通过调节其靶基因———上皮型钙黏蛋白(E-cadherin)和半胱天冬酶-3(Caspase-3)的表达抑制胃癌细胞凋亡,促进细胞转移。mi R-421的表达程度与患者预后密切相关[16]。mi RNA-199a-3p在早期胃癌患者中的表达水平明显增高,而患者术后mi RNA-199a-3p表达明显降低。其诊断早期胃癌的敏感度和特异度以及准确性分别为76%、74%、75%,表明其可能是比较理想的胃癌诊断标志物[17]。mi R-544在胃癌中发挥癌基因样作用,在胃癌细胞中过表达mi R-544能抑制其靶基因———易洛魁家族同源盒基因1(IRX1)的抑癌作用,并促进细胞增殖,参与细胞周期调控[18]。
3.2 抑癌作用的mi RNA低表达
如mi R-339在原发性胃癌组织中表达明显降低。在胃癌细胞中过表达mi R-339可明显抑制细胞增殖、迁移、侵袭和致瘤性[19]。mi R-129-5p过表达减少胃癌SGC7901/VCR和SGC7901/ADR细胞的耐药性,而下调mi R-129-5p有相反的效果[20]。研究表明,mi R-200b和mi R-200c在胃癌标本和细胞株中表达下调,mi R-200b和mi R-200c水平与临床分期显著相关[21]。人胃癌组织中mi R-146a/b与泛素样含PHD和环指域1基因(UHRF1)的表达呈负相关。mi R-146a和mi R-146b作为UHRF1的直接调控上游因子,通过靶向3′-UTR降低UHRF1的表达[22]。mi R-433和mi R-127在胃癌组织中的表达显著下调。而且,较低水平的mi R-433和mi R-127与临床胃癌患者p M或p TNM分期相关。在胃癌细胞系HGC-27中,mi R-433和mi R-127过表达可通过与致癌相关基因———鼠类肉瘤病毒癌基因(KRAS)和促分裂素原活化蛋白激酶4(MAPK4)相互作用抑制细胞增殖、迁移和侵袭[23]。
4 胃癌中DNA甲基化调控mi RNA异常表达
mi RNA的表达失调与转录失调、染色体异常和表观遗传改变有关。DNA甲基化是一种重要的基因表达调节方式,是表观遗传修饰的重要内容。近年来研究报道,启动子区Cp G岛的DNA甲基化状态参与调控胃癌中mi RNA的异常表达[24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34]。
4.1 DNA高甲基化与mi RNA表达
DNA甲基化包括基因组总体甲基化水平降低和某些基因启动子区域发生高甲基化。Cp G岛高甲基化可导致基因表达缺失。Ando等[24]于2009年首次证实DNA甲基化参与调控胃癌细胞中mi RNA的异常表达,发现在多种胃癌细胞株中mi R-124a-1,mi R-124a-2和mi R-124a-3启动子区高甲基化导致其表达下调。应用去甲基化药物5-氮杂-2′-脱氧胞苷(5-Aza-Cd R)使细胞恢复了mi RNAs的表达。同时作者发现,幽门螺旋杆菌感染诱导mi RNA启动子甲基化,增加胃癌的发病风险。最近的报道发现,胃腺癌中启动子区高甲基化诱导mi R-124a表达沉默,并证实了其新的靶基因———多胺代谢酶精胺氧化酶(SMOX)[25]。Hashimoto等[26]观察到胃癌标本及细胞中mi R-181c的表达降低,5-Aza-Cd R处理胃癌细胞后,mi R-181c表达恢复。应用甲基化特异性PCR(MSP)和亚硫酸氢钠测序PCR(BSP)检测到mi R-181c启动子区Cp G岛的高甲基化状态,提示胃癌中存在mi RNA-181c基因甲基化沉默,并通过靶点癌基因NOTCH4及KRAS发挥致癌作用。有报道在乳腺癌、食道癌等多种肿瘤中mi R-10b发挥癌样作用,但Kim等[27]发现,胃癌中mi R-10b启动子区域发生高甲基化,诱导mi R-10b表达沉默,导致其靶基因———微管关联蛋白RP/EB家族成员1(MAPRE1)过表达,进而促进胃癌细胞增殖。在胃癌组织和5种胃癌细胞中检测到mi R-335的低表达,应用MSP和BSP检测mi R-335启动子上游Cp G岛的DNA甲基化状态,结果显示mi R-335表达与DNA甲基化状态呈负相关[28]。最近的研究报道发现,胃癌细胞中mi R-219.2、mi R-663b、mi R-1237、mi R-495、mi R-200c和mi R-141的转录受DNA甲基化调控。由于启动子区DNA高甲基化导致其表达下降。且mi R-495通过调节其靶基因———肝再生磷酸酶(PRL-3)表达,参与胃癌腹膜转移的发生。在胃癌细胞中应用DNA甲基化转移酶抑制剂———地西他滨可恢复mi R-200c和mi R-141的表达,为地西他滨在胃癌治疗中的应用提供了有力的证据[29,30,31]。
4.2 DNA低甲基化与mi RNA表达
肿瘤基因组广泛低甲基化的程度与肿瘤恶性程度密切相关,其作为生物学指标具有一定的诊断价值。部分mi RNA基因启动子区的异常低甲基化诱导其表达增加,发挥对靶基因的抑制作用,促进肿瘤的发展转移。Tsai等[32]报道,胃癌组织中mi RNA-196b基因启动子区Cp G岛呈低甲基化状态,提示其为mi RNA-196b表达异常增加的机制之一。体外实验证实,胃癌细胞中mi RNA-196b基因启动子区高甲基化处理,抑制mi RNA-196b转录激活。研究发现胃癌组织中mi RNA-210表达升高,检测其启动子区Cp G岛呈低甲基化状态。mi RNA-210通过抑制其靶基因———与sprouty相关的细胞膜蛋白(SPRED2)表达,促进胃癌细胞迁移[33]。新的研究报道证实胃癌组织及患者血浆中mi R-106a表达明显升高,并与胃癌的淋巴转移和分期相关。MSP检测表明与癌旁组织比较,胃癌组织中mi R-106a的基因启动子区Cp G岛甲基化率显著降低[34]。
5 展望
综上所述,DNA甲基化可能是胃癌中mi RNA表达异常的调控机制。mi RNA基因启动子区异常高甲基化或低甲基化状态,可使mi RNA表达失调,进而发挥癌基因或抑癌基因样的作用,参与胃癌的发生、发展。随着对甲基化的mi RNA及其作用靶点研究的进一步深入,其为胃癌的表观遗传修饰提供了新的研究方向。DNA甲基化是一种可逆的表观遗传学修饰方式,甲基化mi RNA也有望为胃癌的靶向治疗开辟崭新的领域。
摘要：microRNA(miRNA)是一类长18~22个核苷酸的内源性非编码小RNA,在转录后水平调节靶基因的表达,参与细胞生长、分化和凋亡等生物学过程,其异常表达与胃癌的发生、发展密切相关。近年研究发现,DNA甲基化可能是miRNA表达异常的调控机制。miRNA基因启动子区DNA高甲基化或低甲基化改变可使miRNA表达失调,进而导致miRNA的靶基因表达异常,参与胃癌的发生、发展。本文就DNA甲基化调控miRNA在胃癌中的研究进展作一综述。
基因组DNA甲基化 篇8
1 材料与方法
1.1 标本来源
110例食管癌患者手术切除大体标本均来自河北医科大学第四医院2009年6月~2011年1月收治的患者。所有患者术前均未接受放疗或化疗, 术后病理确诊均为食管鳞癌以及其30例癌旁正常组织, 并记录食管鳞癌的临床病理学变化, 包括肿瘤分期、分化程度和淋巴结转移。标本离体后立即取材, 置于液氮中速冻后转入-70℃冰箱冻存做DNA提取使用。全部肿瘤组织均经病理诊断为鳞状细胞癌, 肿瘤分级、TNM分期分别按照标准世界卫生组织 (WHO) 和国际抗癌联盟 (UICC) 的标准。
1.2 方法
新鲜组织-70℃保存, 利用DNA试剂盒 (上海生工技术公司) , 按步骤进行操作。双蒸水11μL42℃水浴20 min;另准备新鲜配制的DNA修饰:在提取的DNA溶液中加入3 mol/L Na OH 2μL, (含对苯二酚0.11 g和2 500μL双蒸水) 5 mol/L亚硫酸氢钠 (p H 5.0) 380μL, 100μL石蜡油覆盖, 50℃避光水浴16 h;吸取石蜡油下层液体, 以Wizard DNA Clean-Up System (Promega公司) 纯化DNA。
1.3 MSP反应
甲基化特异性PCR (methylation-specific PCR, MSP) 原理:基因组双链DNA变性解链后, 在亚硫酸氢钠作用下发生C→U (T) 转化, C若已有甲基化则不会改变, DNA甲基化修饰只发生于Cp G岛上, 因此在亚硫酸氢钠作用下, Cp G岛若无甲基化修饰, 则序列中的C完全转化为U, CG→UG, 若有甲基化则C不会变为U, 针对Cp G岛甲基化和非甲基化两种DNA设计甲基化引物MF/MR和非甲基化引物UF/UR, 进行PCR, 如果DNACp G岛未发生甲基化 (正常组织) , 那么非甲基化引物UF/UR会扩增出相应的条带, 如果DNACp G岛发生甲基化 (癌变组织) , 那么甲基化引物MF/MR会扩增出相应的条带。
根据SFRPs基因启动子区域关键性Cp G位点分别设计甲基化引物和未甲基化引物 (由上海生公合成引物) 。经过亚硫酸氢钠和对二苯酚的修饰反应后, 由DNA Wizard clean-up kit纯化所获得的DNA。MSP的反应体系为:10×MSP Buffer 2μL、Mg Cl2 (25 mmol/L) 1.2μL、d NTP (2 mmol/L) 1μL、primer1 (50μmol/L) 1μL、primer2 (50μmol/L) 1μL、Taq酶 (5 U/μL) 0.5μL、亚硫酸氢钠修饰过的DNA2.5μL、H2O 2.3μL, 总体积为20μL。SFRP1循环条件:95℃1 min、63.9℃45 s、72℃40 s共36个循环, 72℃延伸10 min。SFRP2循环条件:95℃1 min、64℃45 s、72℃40 s共36个循环, 72℃延伸10min。SFRP4循环条件:95℃1 min、56℃45 s、72℃40 s共36个循环, 72℃延伸10 min。SFRP5循环条件:95℃1 min、63℃45 s、72℃40 s共36个循环, 72℃延伸10 min。2%琼脂糖凝胶电泳鉴定, 在凝胶图像分析系统中观察电泳结果 (表1) 。
2 结果
2.1 SFRPs电泳图110例食管癌组织及30例癌旁组织中基因基因启动子区Cp G岛甲基化结果
由图可鉴, 110例食管癌组织中基因甲基化条带明显 (如图前3组癌组织中甲基化条带位置明显) , 而30例癌旁正常组织中则出现的是非甲基化条带 (如图后2组正常组织中非甲基化条带位置明显) 。110例食管鳞癌组织SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5基因启动子区甲基化阳性率分别为61.8% (68/110) 、66.7% (73/110) 、62.7% (69/110) 、64.3% (71/110) , 明显高于癌旁正常组织的13.3% (4/30) 、13.3% (4/30) 、20% (6/30) 、26.7% (8/30) (见图1~4) 。
2.2 SFRPs基因与临床病理学资料之间的关系
基因SFRPs甲基化阳性率与淋巴结转移和肿瘤分化程度有关, 见表2~5。
2.3 条带结果判断
基因启动子区甲基化经过甲基化特异PCR (MSP) 检测之后得到结果分析。基因基化状态有三种情况:一是甲基化特异引物 (M) 扩增出目的条带, 而非甲基化特异引物 (U) 无条带扩出, 这种情况为甲基化;二是非甲基化特异引物 (U) 扩增出目的条带, 而甲基化引物 (M) 无条带扩出, 这种情况为非甲基化;三是两对引物均扩增出目的条带, 为半甲基化, 记入甲基化[5,6,7,8]。
SFRP 1基因;C:癌组织;N:正常组织;M:DNA标记 (500 bp, 400bp, 300 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 75 bp, 50 bp) 。
SFRP 2基因;C:癌组织;N:正常组织;M:DNA标记 (500 bp, 400bp, 300 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 75 bp, 50 bp)
SFRP 4基因;C:癌组织;N:正常组织;M:DNA标记 (500 bp, 400bp, 300 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 75 bp, 50 bp)
SFRP 5基因;C:癌组织;N:正常组织;M:DNA标记 (500 bp, 400bp, 300 bp, 200 bp, 150 bp, 100 bp, 75 bp, 50 bp)
通过图表分析, 110例出现淋巴结转移组的食管鳞癌组织 (60例) 和中、低分化食管鳞癌组织 (62例) 甲基化阳性率高于无淋巴结转移组 (8例) 及高分化食管癌组织 (6例) 。P<0.05, 差异有显著性。而在性别、年龄及肿瘤分期中的比较, 没有显著性差异 (P>0.05) 。
通过图表分析, 110例出现淋巴结转移组的食管鳞癌组织 (70例) 和中、低分化食管鳞癌组织 (69例) 甲基化阳性率高于无淋巴结转移组 (3例) 及高分化食管癌组织 (4例) 。P<0.05, 差异有显著性。而在性别、年龄及肿瘤分期中的比较 (P>0.05) , 没有显著性差异。
通过图表分析, 110例出现淋巴结转移组的食管鳞癌组织 (66例) 和中、低分化食管鳞癌组织 (62例) 甲基化阳性率高于无淋巴结转移组 (3例) 及高分化食管癌组织 (7例) 。P<0.05, 差异有显著性。而在性别、年龄及肿瘤分期中的比较, 没有显著性差异 (P>0.05) 。
通过图表分析, 110例出现淋巴结转移组的食管鳞癌组织 (65例) 和中、低分化食管鳞癌组织 (67例) 甲基化阳性率高于无淋巴结转移组 (6例) 及高分化食管癌组织 (4例) 。P<0.05, 差异有显著性。而在性别、年龄及肿瘤分期中的比较, 没有显著性差异 (P>0.05) 。
3 讨论
在我国, 食管癌以鳞状细胞癌为主, 发病率高, 临床疗效不佳, 5年生存率仅为35%左右[7]。故探讨食管鳞状细胞癌的临床病理特征以及它们的相互关系仍然具有重要的临床意义。
SFRPs是直接与Wnt结合的分泌型糖蛋白家族[9], 定位于染色体8p12-11.1[10], 由SFRP基因编码。SFRPs蛋白结构中含有半胱氨酸富含区域 (cysteine-rich domain, CRD) , 此半胱氨酸富含区与卷曲蛋白受体家族中的CRD具有30%~50%的同源性。SFRPs蛋白可以通过竞争性抑制Frizzled受体与Wnt的结合从而封闭Wnt的信号传导[11]。目前已发现SFRPs家族共有8名成员, 即SFRP1、SFRP2、SFRP3、SFRP4、Sfrp5以及Sizzle、Sizzle2和Cresent。在多种肿瘤中SFRPs基因表达下调, 包括胃癌和间皮瘤等。研究显示在肿瘤中RT-PCR检测SFRPs其m RNA表达率很低, 以及Western Blot以及免疫组织化学显示蛋白表达与正常组织相比很低[2,3]。
研究显示SFRP1干扰了Wnt的信号转导通路。由于SFRP1对Wnt信号通路的负调节, 且其可促进凋亡的发生, 故SFRP1表达下调常可导致Wnt信号转导通路的过度激活, 细胞的过度增殖, 从而导致肿瘤的发生。在乳腺癌中对SFRP1基因的研究较多, 所以, SFRP1被描述为乳腺癌中的一个肿瘤抑制基因 (tumor suppressor gene, TSG) 。对结直肠腺癌、腺瘤和异常隐蔽病灶的研究中, 发现SFRP1基因的甲基化频繁。本研究作为抑癌基因的SFRP1在食管癌中的甲基化率较高, 也有研究显示其与食管癌基因甲基化谱相关性不高, 有待进一步深入研究。
SFRP2基因能够增加MCF-7细胞系抵抗TNF诱导的凋亡, 这与SFRP1基因可以促进凋亡的发生恰恰相反, 所以有人认为SFRP2基因以其高表达参与肿瘤的发生。但多数研究还是表明了SFRP2基因启动子区发生高甲基化与肿瘤的发生相关。据TU-RA等[12]报道, SFRP2基因在大肠癌中频繁出现启动子区甲基化及表达沉默。而且SFRP2基因的过表达可以促进细胞凋亡, 抑制肿瘤生长。因此SFRP2基因甲基化为食管癌诊断与治疗提供信息。SFRP4基因位于染色体8p21, 此位点在多种肿瘤中表达缺失, 所以SFRP4基因也被疑似为一种抑癌基因。研究显示在卵巢癌、前列腺癌及肺癌中也都存在SFRP4基因甲基化的现象[13,14]。本实验研究对食管癌的统计中, 对SFRPs家族中的这四个基因的甲基化情况做了统计, 结果发现四个基因在食管癌组织中都出现了高甲基化, 且甲基化率明显高于癌旁正常组织。
基因组DNA甲基化特异PCR (MSP) 是一种简便、特异的、敏感的检测单基因甲基化的方式。其基本原理是用亚硫酸氢钠处理基因组DNA, 未甲基化的胞嘧啶变成尿嘧啶, 而甲基化的胞嘧啶不变, 然后用特异性的引物对所测基因的同一核苷酸序列进行扩增。扩增产物用DNA琼脂糖凝胶电泳, 凝胶扫描观察分析结果。与其他方法相比, MSP从非甲基化模板背景中检测甲基化模板的敏感性大大提高, 是最敏感的甲基化测定方法。适用于研究中大量样本的DNA片段。本实验在方法和过程上提供了较强的理论依据。
肿瘤的发生和发展是多基因、多因素、多阶段共同参与的复杂过程, 本实验研究结果显示SFRP1、SFRP2、SFRP4和SFRP5这四种基因在肿瘤组织中的甲基化状态与食管鳞癌的发生有关。而且有研究显示各自的m RNA表达水平在食管鳞癌组织内和癌旁组织内的统计学结果与其基因甲基化情况一致, 所以这四种基因的甲基化可能作为食管鳞癌有参考意义的诊断标志物, 将有助于从分子水平揭示食管鳞癌的病因, 为食管鳞癌的早期预防和早期诊断提供有价值的参考指标。
摘要：目的 检测食管鳞状细胞癌和癌旁正常组织SFRPs基因启动子区甲基化变化特征及其与临床病理变化的关系。方法 采用甲基化特异性聚合酶链反应 (MSP) 。结果 110例食管鳞癌组织SFRP1、SFRP2、SFRP4、SFRP5基因启动子区甲基化阳性率分别为61.8% (68/110) 、66.7% (73/110) 、62.7% (69/110) 、64.3% (71/110) , 明显高于癌旁正常组织的13.3% (4/30) 、13.3% (4/30) 、20% (6/30) 、26.7% (8/30) 。淋巴结转移组和中、低分化食管鳞癌组织甲基化阳性率明显高于无淋巴结转移组及高分化食管癌组织, 但是与性别, 年龄及肿瘤分期无明显关联。结论 本研究结果显示, SFRPs基因启动子区甲基化与食管鳞癌发生发展密切相关.这些基因的甲基化检测可为食管癌的防治和预后评价提供遗传学理论依据。。