@靶基因功能

@靶基因功能（共4篇）

@靶基因功能 篇1

中药药效物质是揭示中药药效/毒理的先决条件,是中药质量控制以及提高临床疗效和安全性的基石,也是中药现代化的关键和难点问题之一。尽管目前学术界对于中药药效物质的定义尚无定论,然而从最终效应的角度分析,中药药效的发挥必定是中药各个药效成分单独作用或者联合作用所产生的结果[1]。单味中药的成分虽然成百上千,但由于药物溶解度、服用量以及吸收代谢等因素的限制,最终到达人体特定的靶细胞、靶组织,且能发挥药理作用的成分数目非常有限。那么,除了来源于细胞液泡的次生代谢产物和糖类、来源于细胞壁的纤维素等,这些目前熟知的药效物质以外,占细胞体积20%左右的细胞核中是否含有潜在的活性成分、是否还存在着一些目前尚未发现的生物活性物质,目前尚无定论。

微小核糖核酸(microRNA,简称miRNA)是一类特殊的非编码单链小分子RNA,由19~25个核苷酸组成。大量研究证实,miRNA可通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA而阻碍其翻译,从而在生物生理、发育、代谢以及疾病发生、发展、转归过程中起着广泛而超乎想象的作用,现已作为药物干预的新靶点而成为生物医学研究的热点[2,3]。特别是近年来的研究证实,植物miRNAs结构稳定,能跨物间“穿梭”。丹参、地黄、米碎花等中药中的一些miRNAs均可以通过水煎口服、吸收进入血内,并具有显著的生物活性和组织靶向性[4,5,6]。因此,miRNAs可能是不同于次生代谢产物的、很重要的一类新的中药药效物质,但此方面的研究目前还几乎没有开展。

地黄(Rehmannia glutinosa Libosch)为玄参科地黄属Rehmannia Libosch.ex Fisch.et Mey多年生草本植物,是著名的“四大怀药”之一,具有滋阴清热、补血止血等功效,为清热凉血要药,用于温热病热入营血,身热口干、舌绛或红等症状,为多种方剂配伍要药及中成药的主要原料。现代研究表明,其主要含有梓醇、地黄苷、红景天苷等化学成分[7],具有抗炎和神经保护等多种药理活性[8,9,10]。但这些研究发现与其“清热凉血”的主治功效尚相去甚远,尚不能阐明其药效物质基础及作用机制。因此,本研究采用高通量测序的方法,从miRNA角度揭示地黄的药效物质基础,探讨地黄核酸类物质对机体生理功能的影响,拓展现有以次生代谢成分为主体的药效物质研究模式,为目前药效物质尚不明确的中药研究提供一种有益的尝试,也为具有我国特色的中药miR-NA新药研发提供依据。

1 材料

1.1 实验动物与药材

雄性清洁级ICR小鼠,体质量18~22 g,由浙江省实验动物中心提供,实验动物许可证号:SCXK(浙)2014-0001。地黄:采自河南焦作,经浙江中医药大学俞冰副教授鉴定为R.glutinosa R.Brown新鲜块根。

1.2 实验仪器与试剂

Hiseq 2500高通量测序仪:Illumina,USA;Bioanalyzer 2100生物分析仪:Agilent,USA;Qubit 2.0核酸定量仪:Life technologies,USA;荧光定量PCR仪:BIO-RAD,USA。RNA质检试剂盒:Agilent,USA;总RNA纯化试剂盒:LC Science,USA;动物RNA纯化试剂盒:LC Science,USA;Trizol reagent:Invitrogen,USA;高通量测序试剂盒:Illumina,USA。

2 实验方法

2.1 样品制备

实验分3组,地黄原植物组、空白组和喂食地黄组。其中,空白组和喂食地黄组,每组各5只小鼠。取2 g新鲜采集的地黄块根迅速置-80℃冰箱冻存,用于后续的地黄miRNA提取。另取50 g新鲜采集的地黄块根,在冰浴中碾磨,制成1 g生药/m L浓度的匀浆。将地黄匀浆灌胃给予小鼠(预先禁食12 h),按10 g生药/kg体质量给药(相当于临床等效剂量)。分别于灌胃后1 h,随机挑选5只喂食地黄的小鼠,取血分离血浆置于-80℃保存。同时,分别于上述各时间点随机取5只小鼠作空白对照,分离制备血浆,进行后续高通量测序。

2.2 miRNA c DNA文库构建及高通量测序[11]

采用Illumina试剂盒,将总RNA样品经富集、纯化,c DNA合成及PCR扩增后,获得小RNA文库,经文库质量检测合格后上机进行高通量测序分析。测序所得35个核苷酸及以下序列存在很多无用信息,需要通过去接头序列、低质量序列、污染及进行序列统计等过程来完成初级分析,然后与美国国家生物技术信息中心Gene Bank上玄参科植物RNA数据作为查询库,滤除非miRNA的小核酸序列,最后只保留16~30个核苷酸的高质量miRNA序列。对于剩余序列,则分别截取完全一致的RNA匹配序列位点上游或下游各300个核苷酸的序列,用RNAfold软件进行二级结构预测。当候选miRNA位于二级茎环结构的臂上,并满足miRNA的判断要求,则确认为地黄特有的miRNA。

经过质量控制程序处理和一系列非目标序列过滤处理后,分别构建地黄miRNA文库、喂食地黄小鼠血浆miRNA文库及空白小鼠血浆miRNA文库,用于后续数据分析。

2.3 地黄药效miRNAs的Q-PCR验证[12]

筛选喂食地黄与不喂食地黄小鼠血浆中的差异miRNA,并与地黄miRNA作比对,获得通过喂食进入血液的地黄miRNA,即地黄药效miRNA。采用荧光定量PCR法,检测地黄miRNA、喂食地黄小鼠血浆miRNA和空白小鼠血浆miRNA的表达丰度,验证小鼠体内检出的地黄miRNA。

2.4 miRNA靶基因预测及其功能分析

使用Target Scan、miRanda两款软件对筛选出的miRNAs分别进行靶基因预测。对两款软件预测出的靶基因分别按照每款软件的评分标准进行筛选。Target Scan算法中去除context score percentile小于50的靶基因,miRanda算法中去除最大自由能(Max-Energy)大于-10的靶基因。最后取交集作为目标miR-NAs的最终靶基因。最后对各个miRNA的靶基因分别进行Gene Ontology(GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)pathway分析,构建miRNA与靶基因的网络信号图。

3 实验结果

3.1 样本保守miRNA的鉴定及地黄新miRNA的发现

依据miRNA基因在动植物中广泛保守这一特性,按照生物信息分析流程,将地黄、小鼠全血样本高通量测序获得的原始数据与miRBase数据库及相关基因组序列比对,筛选分析后获得样本已知miRNA及全新的miRNA基因共357个。进一步分析鉴定喂食地黄与不喂食地黄小鼠血浆中的差异miRNA,并与地黄miRNA作比对,从上述差异miRNA中筛选得到2个地黄miRNA,见表1。进一步采用Q-PCR法,验证上述2个miRNA在地黄及喂食地黄小鼠血浆中的表达丰度,最终鉴定出2个地黄miRNA(表1中的miR2118、miR5290),可在地黄及喂食地黄小鼠血浆中稳定表达,见图1。

定位:成熟miRNA在前体中的定位;LM:成熟miRNA的长度;LP:前体序列的长度。

3.2 药效microRNA的靶基因预测及其功能分析

对上述鉴定所得的2个地黄miRNAs采用Target Scan与MiRanda软件,以人类mRNA为靶标,进行靶基因预测,共预测得到这2个地黄miRNA可能调控的3604个靶基因,并进一步对这些靶基因经GO分析,可知鉴定所得的2个地黄miRNA可能调控的靶基因的宏观功能范畴。发现这些靶基因主要在生化过程、细胞成份和分子功能三大区域发挥功能,见图2,参与转录调控、生物大分子合成代谢调控、磷酸化反应及胞内蛋白激酶级联反应、蛋白质转运及胞内离子运输等重要的生物学过程,发挥金属离子通道活化调控、跨膜转录因子活化、离子通道活化调控、胞内蛋白激酶信号传导等生物学功能。

KEGG通路数据库可提供生化物质相互转化所有可能的代谢途径,通过Pathway显著性富集能确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径[13]。采用DA-VID程序对2个地黄miRNA进行预测靶基因的生物学通路KEGG分析,以Pvalue of Fisher’s Exact Test<10-3为基准,筛选出地黄miRNA主要参与的8条信号通路,分别是慢性骨髓白血病、MAPK信号通路、神经胶质瘤、细胞内吞、神经营养因子信号通路、轴突传递、癌症相关信号通路、Hedgehog信号通路等,见图3。其中,图4为MAPK信号通路示意图(灰色标记部分为miRNA可能干预的靶点),是地黄药效miRNA抗炎效应的主要作用通路。利用cytoscape软件绘制MAPK信号通路的miRNAs-gene网络结构图,见图4,利用结构图论的方法对网络中miRNA在网络中的调控地位进行评价,评价的标准以miRNA在网络中的度(Degree)来衡量,度表示网络中的miRNA调控靶基因的数目,度越大代表miRNA调控的靶基因越多,在网络图中miR2218、miR5290的度基本相当,均为核心miRNAs(中间黑色节点代表miR-NA,周围淡灰色代表gene,灰色边代表miRNA对gene有调节作用。)。其主要作用靶标mRNA见图5。

1-12.生化过程;13-20.细胞成分;21-30.分子功能

由图3~5可知,地黄miRNA主要参与MAPK信号通路、细胞内吞、神经营养因子信号通路、轴突传递及癌症相关等信号通路,主要涉及细胞凋亡、炎症介质及下丘脑-垂体-肾上腺轴的神经内分泌调节过程,进而负责调节糖、脂肪、蛋白质三大营养物质及水盐代谢。临床实践证明,生地黄主要用于治疗消渴(糖尿病)、高血脂等代谢性疾病,以及脑缺血等神经性损失疾病,而这些疾病的机制均与以中枢神经系统为核心的神经免疫内分泌系统紊乱有关。因此,笔者推测地黄miRNA可能是其发挥抗血糖、神经保护作用的物质基础。

3讨论

核酸是细胞最基本和最重要的生物大分子。早在15年前国外学者即已开始着手核酸药物的大规模筛选和合成,并主要用于治疗肿瘤和HIV等病[14]。而核酸类成分(如虫草素、香菇太生、腺嘌呤)也是很多中药的活性成分,其广泛存在于冬虫夏草、香菇、灵芝、桑椹、太子参、人参等补益类中药材中,并作为此类中药材的质量控制指标[15,16]。但由于受到核酸结构稳定性及研究关注的侧重,传统认为这类物质并非人体所需,且经过胃肠道消化后吸收进入体内的均不再是具有生物活性的单体小分子,从而限制了核酸类成分的研究与开发。

特别是近年来的研究证实,植物miRNAs结构稳定,能跨物间“穿梭”;丹参、地黄、米碎花等中药中的一些miRNAs均可以通过水煎口服、吸收进入血内,并具有一定的药理活性和组织靶向性[17,18,19]。张辰宇等[20]最新研究表明,来源于金银花的miR-2911可以以进食的方式完整进入动物体内,并且能直接作用于流感病毒,通过抑制流感病毒PB2和NS1基因表达,进而抑制流感病毒的复制来达到治疗流感的目的。因此,miRNAs可能是不同于次生代谢产物的、很重要的一类新的中药药效物质,但此方面的研究目前还几乎没有开展。

本研究以地黄miRNA为模版,在喂食地黄的小鼠全血中通过高通量测序检测获得2个全新的地黄miRNA,且均具有高度表达(拷贝数10为中度表达,10以上为高度表达)。采用荧光定量PCR,确证了上述地黄miRNA可在种间“穿梭”,通过饮食途径、消化吸收进入体内。并进一步通过靶基因预测并经GO与KEGG pathway分析判定,地黄miRNA主要参与MAPK信号通路、细胞内吞、神经营养因子信号通路、轴突传递及癌症相关等信号通路的生物学过程,可对金属离子跨膜运输、神经-内分泌、炎症介质及相关癌症发生、肿瘤增殖等多个转录因子具有调控作用,提示地黄miRNA具有潜在的药效作用,可能是地黄中一类新型的药效物质。然而,地黄miRNA具体调控人体疾病的靶向基因和分子机制还需要进一步的研究证实。更进一步,植物miRNA作为外源性基因进入体内需要考虑类似于转基因食品安全性的问题;由于其药效靶标的多样性,是否会对机体的正常功能产生影响,以及其药效作用的确认还有待于进一步的实验论证。

摘要：目的:筛选地黄microRNAs(miRNAs)类药效物质及其靶基因功能分析。方法:采用高通量测序法,测定地黄、空白小鼠和喂食地黄匀浆液小鼠肝组织及血浆中miRNAs的表达丰度,并与Gene Bank上的植物microRNA数据库比对,结合荧光定量PCR验证,鉴定吸收进入体内的地黄miRNAs,以人类mRNA为靶标,采用Target Scan与MiRanda预测地黄miRNAs的靶基因,并通过GO与KEGG分析靶基因的相关功能。结果:共鉴定出2个地黄miRNAs可吸收进入体内,其主要在生化过程、细胞成分和分子功能3大区域发挥作用,并影响肿瘤、代谢、炎症等相关信号通路。结论:miRNAs可能是一类新型的中药药效物质。

关键词：地黄,miRNAs,@靶基因功能,中药鉴定

@靶基因功能 篇2

关键词：金雀异黄素,雌二醇,雌激素受体,转录调控

植物中有各种抗炎抗肿瘤作用的活性物质[1],大豆异黄酮是已知的植物雌激素,在预防和治疗肿瘤、心血管疾病、骨质疏松症和绝经后综合征等方面的作用已经得到广泛认可[2]。金雀异黄素化学名为4,5,7三羟基异黄酮,性状是淡黄色树枝状针晶粉末,熔点(mp)297~298℃ , 溶于常用的有机溶剂 , 几乎不溶于水,溶于稀碱中呈黄色。金雀异黄素(又称染料木素)是来源于豆类植物和齿状植物的异黄酮类化合物,可通过影响一系列的细胞信号通路, 发挥广泛的预防和治疗肿瘤作用[3,4,5]。金雀异黄素是一种强力的酪氨酸蛋白激酶和拓扑异构酶抑制剂, 通过抑制以上两种酶的活性,达到对癌基因的调控,从而实现多途径抑制肿瘤的生长转移[6]。金雀异黄素 (Genistein)增加性激素结合球蛋白合成, 从而降低激素生物利用度,降低雌激素依赖细胞增殖活性,减少激素相关肿瘤的发生。但金雀异黄素水溶性很低,直接服用不利于人体吸收[7], 能否降低雌激素的生物利用度 , 抑制雌激素调控的靶基因表达目前还不明确。金雀异黄素抗癌研究已经成为全球热点, 并已取得很大进展[8]。本文通过报道基因及实时定量PCR实验证实金雀异黄素能够和雌二醇竞争乳腺癌细胞表面的雌激素受体(ER),并抑制ER调控靶基因的表达,现将结果报道如下:

1 材料与方法

1.1 材料

乳腺癌细胞系MCF7购自北京协和细胞库。雌二醇(纯度99%)购自北京四环制药厂;金雀异黄素(纯度98%)购自Sigma公司;DMEM培养基及Real Mastermix(SYBR Green)购自天根公司 ;反转录试剂盒购自Invitrogen公司;Fugene 6转染试剂为Roche Diagnostics公司产品;双报告基因荧光素酶检测试剂盒为Promega公司产品。

1.2 方法

1.2.1实验分组实验分为五组:单纯DMEM培养基不加药组;雌二醇组(10 ng/m L);金雀异黄素5 ng/m L+雌二醇组;金雀异黄素10 ng/m L+雌二醇组;金雀异黄素20 ng/m L+雌二醇组。

1.2.2报告基因检测将乳腺癌细胞MCF7接种于24孔板,按“1.2.1”项下分组条件处理细胞,培养至对数生长期后,按照Fugene 6转染试剂说明将2.0μg报告基因质粒p TAL-SEAP-ERE和校正质 粒p SV-β-gal(10 ng) 转染至乳腺癌细胞MCF7细胞中 , 继续培养36 h,收集细胞按照双报告基因检测试剂盒说明检测荧光素酶活性,每组3个复孔,每次数据重复3次。

1.2.3 Real-time PCR将乳腺癌细胞MCF7细胞接种到6孔板中,按“1.2.1”项下分组条件处理细胞,48 h后收集细胞加入1 m L Trizol,按照Invitrogen反转录试剂盒说明反转录合成c DNA第一链。采用Light Cycler实时定量PCR系统(Roche公司产品)进行Real-timePCR。Real-time PCR引物按照文献合成[9,10]。GREB1上游引物:5'-CAAAGAATAACCTGTTGGCCCTGC-3',下游引物 : 5' -CCAGTTGT -TGGCACTTCGG -3';PDZK1上游引物 :5' -AGAAATGGCCTCCACCTTCA AC-3', 下游引物5′-ACGGGCCCTCTAGACTCGAG-3'。GAPDH引物购自Takala公司。PDZK1和GREB1基因的扩增条件为:95°C预变性2 min;95°C变性10 s,60°C退火10 s, 72°C延伸10 s, 共45个循环 ;72°C延伸5 min。用GAPDH的定量值对待测基因的定量值进行均一化,进而得到待测基因的相对表达量。

1.3 统计学方法

应用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析, 计量资料数据用均数±标准差(±s)表示,两组间比较采用t检验;以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 金雀异黄素对 ERE 报告基因转录的抑制作用

加入雌二醇后,ERE报告基因的转录活性较不加药组提高约5倍,提示乳腺癌细胞MCF7细胞表面有ER表达 , 乳腺癌细胞MCF7细胞能够对雌激素产生应答;随着金雀异黄素浓度的增高,ERE报告基因的转录活性逐渐下降, 金雀异黄素20 ng/m L+雌二醇组和雌二醇组比较差异有统计学意义(P < 0.05或P <0.01), 说明金雀异黄素能够和雌二醇竞争乳腺癌细胞MCF7细胞表面的ER, 并抑制雌二醇的转录激活效应。见表1。

注:t 值和 P 值为与雌二醇组比较;“-”表示无数据

2.2 金雀异黄素对 ER 靶基因 PDZK1 和 GREB1 转 录的抑制作用

为了确定金雀异黄素是否影响ER靶基因的转录,本研究采用Real-time PCR法检测了ER靶基因PDZK1和GREB1 m RNA水平。结果显示 ,随着金雀异黄素浓度的增高,PDZK1和GREB1的转录水平逐渐下降, 金雀异黄素20 ng/m L+雌二醇组和雌二醇组PDZK1和GREB1 m RNA水平差异均有高度统计学意义(P < 0.01),该结果和报告基因实验结果一致,说明金雀异黄素可以拮抗雌激素调控的靶基因表达。 见表2。

注:t 值和 P 值为与雌二醇组比较;“-”表示无数据

3 讨论

金雀异黄素是来源于植物并有与雌激素相似结构的植物雌激素(phytocstrogen),其雌激素的调节作用引起广泛关注。目前植物雌激素作为激素替代药物、抗癌药物以及食品添加物和补充物应用[11]。大豆异黄酮是大豆产生的天然植物雌激素,其化学结构和雌二醇非常相似,而生物学活性却只有雌二醇的1/10万。近年研究证实,异黄酮的抗肿瘤效应主要是通过两种途径完成的, 一种是ER依赖性, 一种是ER非依赖性。在ER依赖途径中,异黄酮能够和雌激素竞争细胞表面的ER,进而拮抗雌激素调控的靶基因转录。在ER非依赖途径中, 大豆异黄酮可以通过抑制酪氨酸蛋白激酶和拓扑异构酶发挥抗肿瘤作用。酪氨酸激酶及拓扑异构酶是细胞内重要的功能酶,很多参与细胞增殖及DNA损伤修复的功能蛋白均是它们的作用底物,抑制酪氨酸激酶和拓扑异构酶的活性,可以阻断细胞的生长激动信号,造成DNA损伤,促使细胞走向凋亡[12,13,14]。

@靶基因功能 篇3

最近许多研究表明, mi RNAs在多种肿瘤如乳腺癌[2]、肝癌[3]、直肠癌[4]、食管癌[5]、卵巢癌[6]、子宫内膜癌[7]中异常表达, 在宫颈癌中也出现异常表达[8], 在肿瘤的发生发展和转移中作为抑癌基因或癌基因起重要的作用[1,2,3,4,5,6,7]。但目前对mi RNA的具体作用机制认识有限, 准确预测mi RNA的靶基因并正确认识mi RNA及其靶基因的相互作用是研究mi RNA作用机制的关键。

大多数mi RNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中[9,10]。mi RNA-195和mi RNA-497属于mi RNA-15/107组群, 种子序列为AGCAGC[11], premi RNA-195处于pre-mi RNA-497 3'端下游的209 bp位置, 两者均位于人类染色体17p13.1, 是一个高度保守的基因簇, 而在人类17号染色体上有多种肿瘤抑制基因, 这些基因在癌症中常表现为缺失[12,13]。已有研究证明, mi RNA-497和mi RNA-195均有肿瘤抑制功能[14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24]。而目前针对mi RNA-497-195簇对宫颈癌作用的研究尚少。

本文旨在研究mi RNA-497-195簇在宫颈癌中的表达情况并预测其靶基因和对预测的靶基因进行生物信息学分析。为进一步研究mi RNA-497-195簇在宫颈癌发生发展中的作用及可能的分子机制并寻找可预测宫颈癌前病变及宫颈癌发展的生物标志物提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

宫颈石蜡组织标本收集于广西壮族自治区人民医院病理科, 患者入院时间为2010年3月~2012年3月。选择12份宫颈组织标本用于mi RNA芯片检测, 包括3份宫颈鳞状细胞癌 (squamous cell carcinoma, SCC) 组织、3份宫颈高度鳞状上皮内病变 (high grde squmous intrepithelil lesion, HSIL) 组织、3份宫颈低度鳞状上皮内病变 (ligh grde squmous intrepithelil lesion LSIL) 组织及3份正常宫颈组织, 患者一般资料情况见表1。选择60份宫颈组织标本 (20份宫颈癌组织、20份HSIL组织、10份LSIL组织和10份正常宫颈组织) 用于mi RNA-497和mi RNA-195表达的验证及表达相关性分析, 患者一般资料情况见表2。标本均由病理科医生复核, 所有宫颈癌患者在术前均未接受过放化疗及其他治疗, 正常宫颈组织来自因子宫良性病变切除的子宫。该研究已获得医院伦理委员会同意。

注:HSIL:高度鳞状上皮内病变;LSIL:低度鳞状上皮内病变

注:HSIL:高度鳞状上皮内病变;LSIL:低度鳞状上皮内病变

1.2 mi RNA芯片检测

组织RNA抽提采用Recover AllTMTotal Nucleic Acid Isolation (Ambion, Austin, TX, US) , 根据生产厂商提供的标准操作流程进行, 抽提所得总RNA经电泳质检合格后备用。mi RNA芯片杂交所用芯片为Agilent human mi RNA (8*15K) V12.0芯片 (覆盖866个人类相关mi RNA以及89个人类病毒相关mi RNA) 。芯片杂交实验及后续结果分析在上海伯豪芯片生物技术有限公司完成。实验样品RNA采用Agilent mi RNA芯片配套的试剂盒 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US) , 按照标准操作流程对样品中的mi RNA分子进行荧光标记及样品的杂交实验。

1.3 实时定量PCR (real-time RT-PCR)

RNA抽提使用Quanto Bio Total RNA Isolation Kit进行, 利用Quanto Bio逆转录系统采用加尾法进行c DNA第一条链的合成, 反应条件为37℃、1 h (TIANGEN公司) ;以第一链c DNA为模板, 利用SYBR Green PCR Master Mix进行PCR扩增, 反应在20μL的体系中进行。扩增条件:95℃15 min, 1个循环;95℃10 s, 40个循环;60℃32 s, 40个循环 (TIANGEN公司) 。U6sn RNA作为实验的内参基因。mi RNA相对表达量为2-△△Ct;△Ct= (Ctmi RNA-CtU6) 。相关引物见表3。

1.4 mi RNA-497和mi RNA-195生物信息学分析

应用mirecords数据库 (http://mirecords.biolead.org/) 进行靶基因预测, 此数据库集成了Pic Tar、mi Randa、DI-ANA-micro T和Target Scan S等mi RNA靶标预测工具, 取至少被4个软件同时预测的基因作为预测的靶基因, 用DAVID数据库 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) 对预测的靶基因进行GO (gene ontology) 注释描述和分类, 使用KEGG公共数据库对靶基因进行信号转导通路富集分。通过Fisher Exact Test计算P值, 以P<0.05为显著性阈值得到基因集合具有统计意义的的高频率注释、信号转导及疾病通路。

1.5 统计学方法

芯片结果采用Agilent Microarray Scanner进行扫描, 用Feature Extraction software 10.7读取数据, 最后采用Gene Spring Software 11.0进行归一化处理。采用Significance Analysis of Microarrays (SAM) 和t检验 (t-test) 进行差异表达基因分析, 差异倍数为2倍及以上 (即≥2或≤0.5) 、P<0.05为有意义的mi RNA。利用SPSS 12.0统计学软件进行数据分析, 采用Spearman进行mi RNA-497与mi RNA-195的相关性分析, 以r>0.3, P<0.05为存在相关性。

2 结果

2.1 mi RNA-497和mi RNA-195在宫颈癌组织中的表达

2.1.1 基因芯片结果

芯片分析结果显示, 与正常宫颈组织比较, mi RNA-497和mi RNA-195在宫颈癌和HSIL中表现为下调, 见表4。利用real-time RT-PCR检测60份宫颈组织标本中Micro RNA的表达, 结果示mi RNA-497和mi RNA-195在宫颈癌组织和HISL中表现为低表达。见图1。

注:HSIL:高度鳞状上皮内病变;倍数改变:与正常宫颈组织比较, 各mi RNAs在宫颈癌或HSIL组织中表达的倍数变化

2.1.2 mi RNA-497和mi RNA-195在宫颈癌组织中的表达相关性分析

将60份宫颈癌组织标本的realtime RT-PCR用于mi RNA-497和mi RNA-195表达相关性分析, 发现二者在宫颈组织中的表达呈显著正相关 (r=0.983, P<0.05) 。见图2。

2.2 mi RNA-497和mi RNA-195生物信息学分析

2.2.1 mi RNA-497和mi RNA-195靶基因预测

利用mirecords数据库对mi RNA-195靶基因进行预测, 此数据库集成了Pic Tar、mi Randa、DI-ANA-micro T和Target Scan S等的mi RNA靶标预测工具, 结果发现同时由4个软件预测到的靶基因mi RNA-497有914个, mi RNA-195有1037个, 两者重合的靶基因有710个。将这些预测的靶基因利用DAVID数据库进行GO及信号通路的富集分析。

2.2.2 mi RNA-497和mi RNA-195预测靶基因的GO注释描述及GO分类富集分析

按照基因的不同生物学功能, GO将基因的功能详细划分为以下3个方面:分子功能、生物学过程和细胞组件。通过GO注释描述得到mi RNA-497和mi RNA-195预测靶基因的GO分子功能注释信息和预测靶基因的GO生物学过程注释信息。选取P<0.01的注释信息。结果发现, 预测靶基因GO分子功能分析结果中mi RNA-497有31项, mi RNA-195有29项, 两者重合的注释信息有25项。预测靶基因GO生物学过程分析结果, mi RNA-497有153项, mi RNA-195有188项, 两者重合的有130项。可见两者预测靶基因功能大量重合, 且分别富集于细胞周期调控、生物学过程调控、转录调控、基因表达、及核苷酸代谢过程等生物学过程, 以及蛋白结合、核酸结合、蛋白激酶活性、连接酶活性等分子功能 (P<0.01) 。见表5、6。

2.2.3 mi RNA-497和mi RNA-195靶基因集合的信号转导通路富集分析

通过DAVID数据库对mi RNA-497和mi RNA-195集合进行基于KEGG的Pathway富集分析, 选取P<0.05的信号通路。预测靶基因总信号通路mi RNA-497有21个, mi RNA-195有34个, 两者重合的信号通路有18个, 可见mi RNA-497和mi RNA-195靶基因集合的信号转导通路大量重合, KEGG通路分析涉及癌症通路、p53信号通路、Gn RH信号通路、细胞外因子信号通路等信号传导通路及直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、慢性粒细胞性白血病、非小细胞肺癌等疾病通路 (P<0.05) 。见表7。

3 讨论

Micro RNA (mi RNA) 是发现于真核细胞中一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码单链小RNA分子。mi RNA能通过与靶标m RNA的完全或不完全互补配对、降解靶m RNA或抑制靶m RNA翻译的机制, 在转录后水平调控基因的表达, 在细胞的增殖、凋亡、分化、代谢以及个体发育和病毒感染等方面都发挥着重要的作用。研究显示, mi RNA在肿瘤组织中异常表达, 对不同肿瘤组织特定mi RNA表达水平的研究有利于阐明肿瘤的发生发展机制, 更为肿瘤的诊断和治疗提供了理论依据。大多数mi RNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中。研究已经显示mi RNA-195在多种肿瘤组织和细胞中表现为下调并如胃癌[14]、肝癌[15]、膀胱癌[16]、食管癌[17]、胶质瘤[23]等与肿瘤的生长、侵袭和转移有关。在某些肿瘤中, mi RNA-195被鉴定为肿瘤抑制因子[14,15,16,24]。mi RNA-497也在不同的肿瘤中表现为下调, 如乳腺癌[19]、肺癌[20]、宫颈癌[18]、直肠癌[21]、前列腺癌[22]等。已有学者将mi RNA-497和mi RNA-195作为一个基因簇进行研究, 如Furuta等[3]、Li等[12]、Flavin等[13], 他们分别发现mi RNA-497和mi RNA-195在肝癌、乳腺癌和卵巢癌中表现出肿瘤抑制功能, 是潜在的肿瘤抑制基因。说明在研究mi RNA-497和mi RNA-195对宫颈癌发生和发展的影响时, 也有必要将两者作为一个基因簇来研究。本研究通过基因芯片技术发现, 与正常宫颈组织比较, 宫颈癌组织中有15个mi RNAs表达为上调, 10个mi RNAs表达为下调 (<0.5倍) , 其中, mi RNA-497和mi RNA-195表现为下调。经q RT-PCR证实mi RNA-497和mi RNA-195在宫颈癌组织中为明显低表达, 与芯片检测结果一致, 并发现两者在宫颈组织中的表达水平高度相关。mi RNA-497和mi RNA-195均位于17号染色体, 而在人类17号染色体上有多种肿瘤抑制基因, 这些基因在癌症中常表现为缺失。Luo等[18]研究发现, mi RNA-497的异常表达与宫颈癌的不良预后有关。mi RNA-497-195基因簇与宫颈癌发生和发展的关系目前研究较少。下一步研究可通过转染技术使宫颈癌系过表达mi RNA-497和mi RNA-195, 来观察其对宫颈癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响[25], 来证明mi RNA-497-195基因簇对宫颈癌的抑制作用。

目前mi RNA家族已是基因表达调控网络中重要组成部分, 可能参与多条信号传导通路的调控。mi RNA靶基因的确定是研究mi RNA生物学功能的关键, 对靶基因的功能分析有助于对mi RNA作用机制的理解。生物信息学预测显示, mi RNAs能调节超过30%的蛋白编码的基因[26], 单个mi RNA能作用于许多靶基因调节生物过程。利用生物信息学方法对mi RNA-497和mi RNA-195的靶基因进行预测, 发现两者靶基因大量重合。对靶基因集合进行功能富集分析和信号转导通路富集分析发现, mi RNA-497和mi RNA-195预测靶基因的功能大量重合, 并分显著富集于细胞周期调控、生物学过程调控、转录调控、基因表达及核苷酸代谢过程等生物学过程, 以及蛋白结合、核酸结合、蛋白激酶活性、连接酶活性等分子功能 (P<0.01) ;KEGG通路分析涉及癌症通路、p53信号通路、Gn RH信号通路、细胞外因子信号通路等信号传导通路及直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、慢性粒细胞性白血病、非小细胞肺癌等疾病通路 (P<0.05) 。几个mi RNA-497和mi RNA-195的靶基因在某些肿瘤中已得到验证。Furuta等[3]筛选出mi RNA-497-195的直接靶基因CCNE1、CDC25A、CCN3、CDK4、BTRC, 发现mi RNA-497-195在肝癌中的表达与CCNE1、CDC25A、CCN3、CDK4、BTRC的表达呈负相关, 通过si RNA抑制肝细胞癌中这些靶基因的表达, 发现肝细胞癌出现了G1期生长抑制。

@靶基因功能 篇4

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

肝癌细胞株Hep G2 由广东省医学科学院医学研究所细胞中心保存。RPMI 1640、DMEM培养基和胎牛血清(Hyclone公司),Trizol试剂(美国Invitrogen公司),转染试剂Lipofectamine 2000(Invtrigen公司),一抗1∶1 000,二抗1∶5 000(美国Southern Biotech公司),体外侵袭实验装置(美国BD公司),Transwell侵袭小室(美国Millipore公司)。

1.2 生物信息学分析

Target Scan [http://www.targetscan.org/],pic Tar [http://pictar.org/],mi Randa [http://www.microrna.org/microrna/]3 种生物学软件分析mi R-10b可能调控的靶基因,选取HOXD10 为目的基因。引物及mi R-10b序列由广州锐博生物科技有限公司合成。

1.3 试验方法

肝癌细胞用DMEM、RPMI 1640 完全培养基传代培养,收集对数生长期的细胞进行实验。细胞瞬时转染,选择Hep G2 细胞脂质体转染mi R-10b mimics24h用QPCR检测。PCR分析m RNA表达量,通过逆转录- 聚合酶链反应(RT-PCR)方法克隆非翻译区(3'-UTR) 引物序列为:HOXD10- 正向引物:5'-CCGAAGTGCAGGAGAAGGAA;HOXD10- 负向引物:5'-GTGTAAGGGCACCTCTTCTTTCTG,测序正确后常规方法转染Hep G2 细胞,同时在细胞内检测HOXD10 表达量。Western blot分析:用BCA法。体外细胞侵袭实验:细胞转染mi R-10b后Hep G2 接种至侵袭装置,培养24 h后经吉姆萨染色对穿膜细胞计数。

1.4 统计学方法

所有实验数据用SPSS 13.0 统计软件包进行分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,进行正态性分析及独立样本t-test,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HOXD10 在3 种肝癌细胞中表达及构建高表达mi R-10b

Huh-7 细胞,Hep G2 细胞,SMMC-7721 细胞HOXD10 基因经PCR比较基础表达量2-ΔΔCT分别是1.00、228.71 和1.55,见表1、图1。蛋白分析Hep G2细胞灰度计算值是930.22,Huh-7 是406.00,SMMC-7721 是249.00,见图2。通过基因和蛋白实验结果筛选出表达量高的Hep G2 细胞符合下一步实验要求。mi R-10b逆转录后表达量为(9 772.22±437.99),与阴性对照组比较,P <0.05,差异有统计学意义,说明构建高表达mi R-10b成功,见表2、图3。

(±s)

1:Hep G2细胞;2:Huh-7细胞;3:SMMC-7721细胞

2.2 转染后HOXD10 在肝癌细胞中基因及蛋白表达

Hep G2 肝癌细胞中转染mi R-10b的HOXD10实验组与阴性对照组,在基因水平和Western blot分析蛋白水平HOXD10 基因表达量2-ΔΔCT分别是(1.24±0.23)和(1.00±0.02),P >0.05 差异无统计学意义。见表3、图4。在蛋白分析Hep G2 细胞灰度计算值分别是1 968.742 和653.492,蛋白水平表达降低,见图5。

2.3 体外细胞侵袭实验

体外细胞侵袭实验穿膜细胞计数结果显示:Hep G2 转染mi R-10b过表达后(112.38±11.27),与阴性对照组(75.25±6.35) 比较细胞侵袭能力增加(P <0.05)。见表4。

注:NC:过表达mi R-10b的阴性对照组;mi R-10b组:过表达mi R-10b组;mi R-10b组与NC组比较,t =-35.705,P =0.000

未处理组:Hep G2;NC:过表达mi R-10b的阴性对照组;mi R-10b:过表达mi R-10b组

注:NC:过表达mi R-10b的阴性对照组;mi R-10b组:过表达mi R-10b组;mi R-10b组与NC组比较,t =6.245,P =0.220

未处理组:Hep G2;NC:过表达mi R-10b的阴性对照组;mi R-10b:过表达mi R-10b组

1:未处理组;2:阴性对照组;3:mi R-10b组

注:未处理组:Hep G2;NC:过表达mi R-10b的阴性对照组;mi R-10b组:过表达mi R-10b组;F =6.726,P =0.006 组间差异有统计学意义,mi R-10b组与NC组比较,P =0.043

3 讨论

mi RNA在转录后基因表达和生物行为发展过程起着重要调控作用,大多数人类癌症与mi RNA发挥抑癌基因或癌基因作用有关[3]。肿瘤发生在染色体易变位点上,即染色体上易发生丢失、移位或重复的部位,是微小RNA表达异常与某些肿瘤关系密切的原因[4]。肝细胞癌中2 号染色体短臂发生突变,而mi R-10b恰位于该突变部位。Ma等[5]发现mi R-10b高表达和肿瘤细胞的血管侵袭相关;特异性增加mi R-10b表达量可促进肿瘤细胞的侵袭。Laderio等[6]报道109 例肝脏样本肝细胞癌29 例、肝良性病变局灶性结节性增生5 例,癌旁组织93 例,其中mi R-10b表达量显著高于良性病变和未发生肿瘤病变的肝脏组织,同时把mi R-10b看做肝脏肿瘤细胞侵袭性、转移的相关因素;说明在肝癌组织中mi R-10b表达上调,可抑制某些靶基因表达而发挥癌基因作用。HOXD10 基因同样位于2 号染色体,是细胞分化、个体发育生长的关键基因位点[7]。受到mi R-10b及其他多种负性调控作用,HOXD10 在多数恶性肿瘤表达缺失,从而增强肿瘤细胞的侵袭能力[8]。Myers等[9]研究表明持续表达的HOXD10 基因,对乳腺肿瘤细胞新生血管的生成起到一定的抑制作用。Carrio等[10]在HOXD10 抑制脑胶质瘤细胞的侵袭和转移研究中同样发现,高表达HOXD10 可以抑制新生毛细血管形成,从而抑制正常脑细胞向肿瘤细胞分化,因此,HOXD10 被认为是抑癌基因。上调mi R-10b可以抑制m RNA编码HOXD10 翻译过程,导致增加有潜在转移性质的基因RHo C,并且发现随着进展期乳腺癌肿瘤侵袭程度增加,HOXD10 表达却逐渐消失[11]。HOXD10 过表达可以抑制RHo C蛋白的表达,进而可以阻止mi R-10b诱导的肿瘤细胞发生侵袭转移[12]。Liao等[13]试验60 例不同肝细胞肝癌TNM分期中mi R-10b表达情况与肝癌细胞转移能力相关,得出mi R-10b负调控HOXD10 在转录后水平通过HOXD10 相关基因Rho C/u PAR/MMPs促进肝癌细胞转移和侵袭。

总结分析得出实验采用微小RNA瞬时转染方法,可以提高mi R-10b基因在转染细胞Hep G2 细胞中的表达量,在靶基因基础表达量高的前提下,通过RT-PCR和Western blot方法研究在肝癌细胞中HOXD10 基因和蛋白的表达情况, 结果发现HOXD10 在m RNA水平变化小而蛋白水平表达是降低的,说明mi R-10b是通过转录后翻译阶段来调节靶基因的表达,该靶基因可能起到抑制癌基因作用,过表达mi R-10b增加了Hep G2 细胞侵袭能力。mi R-10b过表达与肝细胞癌的侵袭关系密切,为进一步研究肝癌细胞的多种生物学特征提供实验依据。

摘要：目的 探讨micro RNA-10b(mi R-10b)及其靶基因同源异性盒基因HOXD10在肝癌细胞中的表达及转染mi R-10b对肝癌细胞侵袭性能力的影响。方法 分析HOXD10基因在3种肝癌细胞株Huh7、Hep G2、SMMC-7721中的基础表达量,筛选出HOXD10基础表达量高的Hep G2作为后续研究对象。设计合成外源性mi R-10b序列,用脂质体瞬时转染肝癌细胞株,设置mi R-10b转染组、无关序列转染组(阴性对照组)和未处理组(对照组)。用RT-PCR及Western blot检测肝癌细胞转染mi R-10b后HOXD10基因及蛋白表达量的变化,细胞侵袭实验研究转染mi R-10b对肝癌细胞侵袭能力。结果 在基因水平和Western blot分析蛋白水平HOXD10基因表达量2-ΔΔCT分别是(1.24±0.23)、(1.00±0.02),P>0.05差异无统计学意义。在蛋白分析Hep G2细胞灰度计算值是值分别是653.492和1 968.742,蛋白水平表达降低。HOXD10基因在肝癌细胞株Hep G2的表达量显著高于Huh7和SMMC-7721;mi R-10b成功转染Hep G2后,HOXD10基因表达水平与对照组比较无明显变化,但HOXD10蛋白表达量与对照组比较下降及侵袭性也增强。结论 mi R-10b可能通过抑制靶基因HOXD10表达发挥作用,促进肝癌细胞的侵袭。