靶基因预测

靶基因预测（共6篇）

靶基因预测 篇1

宫颈癌是常见的妇科恶性肿瘤之一, 全球每年约有50万的新发病例, 约30万的死亡病例。近年来国内外报道宫颈癌发病呈年轻化趋势。目前已知宫颈癌的发生与高危型HPV感染有关。但是研究发现, 单一的高危HPV感染不足以引起宫颈癌, 遗传因素和免疫因素在宫颈癌的发生中也起了重要作用[1]。研究宫颈癌的发生发展机制, 更有效地诊断和治疗宫颈癌, 是当今医学的研究热点。

最近许多研究表明, mi RNAs在多种肿瘤如乳腺癌[2]、肝癌[3]、直肠癌[4]、食管癌[5]、卵巢癌[6]、子宫内膜癌[7]中异常表达, 在宫颈癌中也出现异常表达[8], 在肿瘤的发生发展和转移中作为抑癌基因或癌基因起重要的作用[1,2,3,4,5,6,7]。但目前对mi RNA的具体作用机制认识有限, 准确预测mi RNA的靶基因并正确认识mi RNA及其靶基因的相互作用是研究mi RNA作用机制的关键。

大多数mi RNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中[9,10]。mi RNA-195和mi RNA-497属于mi RNA-15/107组群, 种子序列为AGCAGC[11], premi RNA-195处于pre-mi RNA-497 3'端下游的209 bp位置, 两者均位于人类染色体17p13.1, 是一个高度保守的基因簇, 而在人类17号染色体上有多种肿瘤抑制基因, 这些基因在癌症中常表现为缺失[12,13]。已有研究证明, mi RNA-497和mi RNA-195均有肿瘤抑制功能[14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24]。而目前针对mi RNA-497-195簇对宫颈癌作用的研究尚少。

本文旨在研究mi RNA-497-195簇在宫颈癌中的表达情况并预测其靶基因和对预测的靶基因进行生物信息学分析。为进一步研究mi RNA-497-195簇在宫颈癌发生发展中的作用及可能的分子机制并寻找可预测宫颈癌前病变及宫颈癌发展的生物标志物提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 一般资料

宫颈石蜡组织标本收集于广西壮族自治区人民医院病理科, 患者入院时间为2010年3月~2012年3月。选择12份宫颈组织标本用于mi RNA芯片检测, 包括3份宫颈鳞状细胞癌 (squamous cell carcinoma, SCC) 组织、3份宫颈高度鳞状上皮内病变 (high grde squmous intrepithelil lesion, HSIL) 组织、3份宫颈低度鳞状上皮内病变 (ligh grde squmous intrepithelil lesion LSIL) 组织及3份正常宫颈组织, 患者一般资料情况见表1。选择60份宫颈组织标本 (20份宫颈癌组织、20份HSIL组织、10份LSIL组织和10份正常宫颈组织) 用于mi RNA-497和mi RNA-195表达的验证及表达相关性分析, 患者一般资料情况见表2。标本均由病理科医生复核, 所有宫颈癌患者在术前均未接受过放化疗及其他治疗, 正常宫颈组织来自因子宫良性病变切除的子宫。该研究已获得医院伦理委员会同意。

注:HSIL:高度鳞状上皮内病变;LSIL:低度鳞状上皮内病变

注:HSIL:高度鳞状上皮内病变;LSIL:低度鳞状上皮内病变

1.2 mi RNA芯片检测

组织RNA抽提采用Recover AllTMTotal Nucleic Acid Isolation (Ambion, Austin, TX, US) , 根据生产厂商提供的标准操作流程进行, 抽提所得总RNA经电泳质检合格后备用。mi RNA芯片杂交所用芯片为Agilent human mi RNA (8*15K) V12.0芯片 (覆盖866个人类相关mi RNA以及89个人类病毒相关mi RNA) 。芯片杂交实验及后续结果分析在上海伯豪芯片生物技术有限公司完成。实验样品RNA采用Agilent mi RNA芯片配套的试剂盒 (Agilent technologies, Santa Clara, CA, US) , 按照标准操作流程对样品中的mi RNA分子进行荧光标记及样品的杂交实验。

1.3 实时定量PCR (real-time RT-PCR)

RNA抽提使用Quanto Bio Total RNA Isolation Kit进行, 利用Quanto Bio逆转录系统采用加尾法进行c DNA第一条链的合成, 反应条件为37℃、1 h (TIANGEN公司) ;以第一链c DNA为模板, 利用SYBR Green PCR Master Mix进行PCR扩增, 反应在20μL的体系中进行。扩增条件:95℃15 min, 1个循环;95℃10 s, 40个循环;60℃32 s, 40个循环 (TIANGEN公司) 。U6sn RNA作为实验的内参基因。mi RNA相对表达量为2-△△Ct;△Ct= (Ctmi RNA-CtU6) 。相关引物见表3。

1.4 mi RNA-497和mi RNA-195生物信息学分析

应用mirecords数据库 (http://mirecords.biolead.org/) 进行靶基因预测, 此数据库集成了Pic Tar、mi Randa、DI-ANA-micro T和Target Scan S等mi RNA靶标预测工具, 取至少被4个软件同时预测的基因作为预测的靶基因, 用DAVID数据库 (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) 对预测的靶基因进行GO (gene ontology) 注释描述和分类, 使用KEGG公共数据库对靶基因进行信号转导通路富集分。通过Fisher Exact Test计算P值, 以P<0.05为显著性阈值得到基因集合具有统计意义的的高频率注释、信号转导及疾病通路。

1.5 统计学方法

芯片结果采用Agilent Microarray Scanner进行扫描, 用Feature Extraction software 10.7读取数据, 最后采用Gene Spring Software 11.0进行归一化处理。采用Significance Analysis of Microarrays (SAM) 和t检验 (t-test) 进行差异表达基因分析, 差异倍数为2倍及以上 (即≥2或≤0.5) 、P<0.05为有意义的mi RNA。利用SPSS 12.0统计学软件进行数据分析, 采用Spearman进行mi RNA-497与mi RNA-195的相关性分析, 以r>0.3, P<0.05为存在相关性。

2 结果

2.1 mi RNA-497和mi RNA-195在宫颈癌组织中的表达

2.1.1 基因芯片结果

芯片分析结果显示, 与正常宫颈组织比较, mi RNA-497和mi RNA-195在宫颈癌和HSIL中表现为下调, 见表4。利用real-time RT-PCR检测60份宫颈组织标本中Micro RNA的表达, 结果示mi RNA-497和mi RNA-195在宫颈癌组织和HISL中表现为低表达。见图1。

注:HSIL:高度鳞状上皮内病变;倍数改变:与正常宫颈组织比较, 各mi RNAs在宫颈癌或HSIL组织中表达的倍数变化

2.1.2 mi RNA-497和mi RNA-195在宫颈癌组织中的表达相关性分析

将60份宫颈癌组织标本的realtime RT-PCR用于mi RNA-497和mi RNA-195表达相关性分析, 发现二者在宫颈组织中的表达呈显著正相关 (r=0.983, P<0.05) 。见图2。

2.2 mi RNA-497和mi RNA-195生物信息学分析

2.2.1 mi RNA-497和mi RNA-195靶基因预测

利用mirecords数据库对mi RNA-195靶基因进行预测, 此数据库集成了Pic Tar、mi Randa、DI-ANA-micro T和Target Scan S等的mi RNA靶标预测工具, 结果发现同时由4个软件预测到的靶基因mi RNA-497有914个, mi RNA-195有1037个, 两者重合的靶基因有710个。将这些预测的靶基因利用DAVID数据库进行GO及信号通路的富集分析。

2.2.2 mi RNA-497和mi RNA-195预测靶基因的GO注释描述及GO分类富集分析

按照基因的不同生物学功能, GO将基因的功能详细划分为以下3个方面:分子功能、生物学过程和细胞组件。通过GO注释描述得到mi RNA-497和mi RNA-195预测靶基因的GO分子功能注释信息和预测靶基因的GO生物学过程注释信息。选取P<0.01的注释信息。结果发现, 预测靶基因GO分子功能分析结果中mi RNA-497有31项, mi RNA-195有29项, 两者重合的注释信息有25项。预测靶基因GO生物学过程分析结果, mi RNA-497有153项, mi RNA-195有188项, 两者重合的有130项。可见两者预测靶基因功能大量重合, 且分别富集于细胞周期调控、生物学过程调控、转录调控、基因表达、及核苷酸代谢过程等生物学过程, 以及蛋白结合、核酸结合、蛋白激酶活性、连接酶活性等分子功能 (P<0.01) 。见表5、6。

2.2.3 mi RNA-497和mi RNA-195靶基因集合的信号转导通路富集分析

通过DAVID数据库对mi RNA-497和mi RNA-195集合进行基于KEGG的Pathway富集分析, 选取P<0.05的信号通路。预测靶基因总信号通路mi RNA-497有21个, mi RNA-195有34个, 两者重合的信号通路有18个, 可见mi RNA-497和mi RNA-195靶基因集合的信号转导通路大量重合, KEGG通路分析涉及癌症通路、p53信号通路、Gn RH信号通路、细胞外因子信号通路等信号传导通路及直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、慢性粒细胞性白血病、非小细胞肺癌等疾病通路 (P<0.05) 。见表7。

3 讨论

Micro RNA (mi RNA) 是发现于真核细胞中一类长度约为22个核苷酸的内源性非编码单链小RNA分子。mi RNA能通过与靶标m RNA的完全或不完全互补配对、降解靶m RNA或抑制靶m RNA翻译的机制, 在转录后水平调控基因的表达, 在细胞的增殖、凋亡、分化、代谢以及个体发育和病毒感染等方面都发挥着重要的作用。研究显示, mi RNA在肿瘤组织中异常表达, 对不同肿瘤组织特定mi RNA表达水平的研究有利于阐明肿瘤的发生发展机制, 更为肿瘤的诊断和治疗提供了理论依据。大多数mi RNA基因以单拷贝、多拷贝或基因簇的形式存在于基因组中。研究已经显示mi RNA-195在多种肿瘤组织和细胞中表现为下调并如胃癌[14]、肝癌[15]、膀胱癌[16]、食管癌[17]、胶质瘤[23]等与肿瘤的生长、侵袭和转移有关。在某些肿瘤中, mi RNA-195被鉴定为肿瘤抑制因子[14,15,16,24]。mi RNA-497也在不同的肿瘤中表现为下调, 如乳腺癌[19]、肺癌[20]、宫颈癌[18]、直肠癌[21]、前列腺癌[22]等。已有学者将mi RNA-497和mi RNA-195作为一个基因簇进行研究, 如Furuta等[3]、Li等[12]、Flavin等[13], 他们分别发现mi RNA-497和mi RNA-195在肝癌、乳腺癌和卵巢癌中表现出肿瘤抑制功能, 是潜在的肿瘤抑制基因。说明在研究mi RNA-497和mi RNA-195对宫颈癌发生和发展的影响时, 也有必要将两者作为一个基因簇来研究。本研究通过基因芯片技术发现, 与正常宫颈组织比较, 宫颈癌组织中有15个mi RNAs表达为上调, 10个mi RNAs表达为下调 (<0.5倍) , 其中, mi RNA-497和mi RNA-195表现为下调。经q RT-PCR证实mi RNA-497和mi RNA-195在宫颈癌组织中为明显低表达, 与芯片检测结果一致, 并发现两者在宫颈组织中的表达水平高度相关。mi RNA-497和mi RNA-195均位于17号染色体, 而在人类17号染色体上有多种肿瘤抑制基因, 这些基因在癌症中常表现为缺失。Luo等[18]研究发现, mi RNA-497的异常表达与宫颈癌的不良预后有关。mi RNA-497-195基因簇与宫颈癌发生和发展的关系目前研究较少。下一步研究可通过转染技术使宫颈癌系过表达mi RNA-497和mi RNA-195, 来观察其对宫颈癌细胞增殖、迁移和凋亡的影响[25], 来证明mi RNA-497-195基因簇对宫颈癌的抑制作用。

目前mi RNA家族已是基因表达调控网络中重要组成部分, 可能参与多条信号传导通路的调控。mi RNA靶基因的确定是研究mi RNA生物学功能的关键, 对靶基因的功能分析有助于对mi RNA作用机制的理解。生物信息学预测显示, mi RNAs能调节超过30%的蛋白编码的基因[26], 单个mi RNA能作用于许多靶基因调节生物过程。利用生物信息学方法对mi RNA-497和mi RNA-195的靶基因进行预测, 发现两者靶基因大量重合。对靶基因集合进行功能富集分析和信号转导通路富集分析发现, mi RNA-497和mi RNA-195预测靶基因的功能大量重合, 并分显著富集于细胞周期调控、生物学过程调控、转录调控、基因表达及核苷酸代谢过程等生物学过程, 以及蛋白结合、核酸结合、蛋白激酶活性、连接酶活性等分子功能 (P<0.01) ;KEGG通路分析涉及癌症通路、p53信号通路、Gn RH信号通路、细胞外因子信号通路等信号传导通路及直肠癌、前列腺癌、甲状腺癌、黑色素瘤、慢性粒细胞性白血病、非小细胞肺癌等疾病通路 (P<0.05) 。几个mi RNA-497和mi RNA-195的靶基因在某些肿瘤中已得到验证。Furuta等[3]筛选出mi RNA-497-195的直接靶基因CCNE1、CDC25A、CCN3、CDK4、BTRC, 发现mi RNA-497-195在肝癌中的表达与CCNE1、CDC25A、CCN3、CDK4、BTRC的表达呈负相关, 通过si RNA抑制肝细胞癌中这些靶基因的表达, 发现肝细胞癌出现了G1期生长抑制。

本研究显示, mi RNA-497和mi RNA-195在宫颈癌组织中为低表达, 生物信息学分析显示mi RNA-497和mi RNA-195靶基因功能大量重合并富集于大量的生物学功能及与癌症相关的信号通路。对mi RNA-497和mi RNA-195靶基因及信号传导通路的分析有助于对宫颈癌的发生机制的认识, 为进一步研究mi RNA-497-195基因簇在宫颈癌发生、发展过程中的机制提供理论依据和实验基础。

靶基因预测 篇2

微小核糖核酸(microRNA,简称miRNA)是一类特殊的非编码单链小分子RNA,由19~25个核苷酸组成。大量研究证实,miRNA可通过碱基互补配对的方式识别靶mRNA而阻碍其翻译,从而在生物生理、发育、代谢以及疾病发生、发展、转归过程中起着广泛而超乎想象的作用,现已作为药物干预的新靶点而成为生物医学研究的热点[2,3]。特别是近年来的研究证实,植物miRNAs结构稳定,能跨物间“穿梭”。丹参、地黄、米碎花等中药中的一些miRNAs均可以通过水煎口服、吸收进入血内,并具有显著的生物活性和组织靶向性[4,5,6]。因此,miRNAs可能是不同于次生代谢产物的、很重要的一类新的中药药效物质,但此方面的研究目前还几乎没有开展。

地黄(Rehmannia glutinosa Libosch)为玄参科地黄属Rehmannia Libosch.ex Fisch.et Mey多年生草本植物,是著名的“四大怀药”之一,具有滋阴清热、补血止血等功效,为清热凉血要药,用于温热病热入营血,身热口干、舌绛或红等症状,为多种方剂配伍要药及中成药的主要原料。现代研究表明,其主要含有梓醇、地黄苷、红景天苷等化学成分[7],具有抗炎和神经保护等多种药理活性[8,9,10]。但这些研究发现与其“清热凉血”的主治功效尚相去甚远,尚不能阐明其药效物质基础及作用机制。因此,本研究采用高通量测序的方法,从miRNA角度揭示地黄的药效物质基础,探讨地黄核酸类物质对机体生理功能的影响,拓展现有以次生代谢成分为主体的药效物质研究模式,为目前药效物质尚不明确的中药研究提供一种有益的尝试,也为具有我国特色的中药miR-NA新药研发提供依据。

1 材料

1.1 实验动物与药材

雄性清洁级ICR小鼠,体质量18~22 g,由浙江省实验动物中心提供,实验动物许可证号:SCXK(浙)2014-0001。地黄:采自河南焦作,经浙江中医药大学俞冰副教授鉴定为R.glutinosa R.Brown新鲜块根。

1.2 实验仪器与试剂

Hiseq 2500高通量测序仪:Illumina,USA;Bioanalyzer 2100生物分析仪:Agilent,USA;Qubit 2.0核酸定量仪:Life technologies,USA;荧光定量PCR仪:BIO-RAD,USA。RNA质检试剂盒:Agilent,USA;总RNA纯化试剂盒:LC Science,USA;动物RNA纯化试剂盒:LC Science,USA;Trizol reagent:Invitrogen,USA;高通量测序试剂盒:Illumina,USA。

2 实验方法

2.1 样品制备

实验分3组,地黄原植物组、空白组和喂食地黄组。其中,空白组和喂食地黄组,每组各5只小鼠。取2 g新鲜采集的地黄块根迅速置-80℃冰箱冻存,用于后续的地黄miRNA提取。另取50 g新鲜采集的地黄块根,在冰浴中碾磨,制成1 g生药/m L浓度的匀浆。将地黄匀浆灌胃给予小鼠(预先禁食12 h),按10 g生药/kg体质量给药(相当于临床等效剂量)。分别于灌胃后1 h,随机挑选5只喂食地黄的小鼠,取血分离血浆置于-80℃保存。同时,分别于上述各时间点随机取5只小鼠作空白对照,分离制备血浆,进行后续高通量测序。

2.2 miRNA c DNA文库构建及高通量测序[11]

采用Illumina试剂盒,将总RNA样品经富集、纯化,c DNA合成及PCR扩增后,获得小RNA文库,经文库质量检测合格后上机进行高通量测序分析。测序所得35个核苷酸及以下序列存在很多无用信息,需要通过去接头序列、低质量序列、污染及进行序列统计等过程来完成初级分析,然后与美国国家生物技术信息中心Gene Bank上玄参科植物RNA数据作为查询库,滤除非miRNA的小核酸序列,最后只保留16~30个核苷酸的高质量miRNA序列。对于剩余序列,则分别截取完全一致的RNA匹配序列位点上游或下游各300个核苷酸的序列,用RNAfold软件进行二级结构预测。当候选miRNA位于二级茎环结构的臂上,并满足miRNA的判断要求,则确认为地黄特有的miRNA。

经过质量控制程序处理和一系列非目标序列过滤处理后,分别构建地黄miRNA文库、喂食地黄小鼠血浆miRNA文库及空白小鼠血浆miRNA文库,用于后续数据分析。

2.3 地黄药效miRNAs的Q-PCR验证[12]

筛选喂食地黄与不喂食地黄小鼠血浆中的差异miRNA,并与地黄miRNA作比对,获得通过喂食进入血液的地黄miRNA,即地黄药效miRNA。采用荧光定量PCR法,检测地黄miRNA、喂食地黄小鼠血浆miRNA和空白小鼠血浆miRNA的表达丰度,验证小鼠体内检出的地黄miRNA。

2.4 miRNA靶基因预测及其功能分析

使用Target Scan、miRanda两款软件对筛选出的miRNAs分别进行靶基因预测。对两款软件预测出的靶基因分别按照每款软件的评分标准进行筛选。Target Scan算法中去除context score percentile小于50的靶基因,miRanda算法中去除最大自由能(Max-Energy)大于-10的靶基因。最后取交集作为目标miR-NAs的最终靶基因。最后对各个miRNA的靶基因分别进行Gene Ontology(GO)和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)pathway分析,构建miRNA与靶基因的网络信号图。

3 实验结果

3.1 样本保守miRNA的鉴定及地黄新miRNA的发现

依据miRNA基因在动植物中广泛保守这一特性,按照生物信息分析流程,将地黄、小鼠全血样本高通量测序获得的原始数据与miRBase数据库及相关基因组序列比对,筛选分析后获得样本已知miRNA及全新的miRNA基因共357个。进一步分析鉴定喂食地黄与不喂食地黄小鼠血浆中的差异miRNA,并与地黄miRNA作比对,从上述差异miRNA中筛选得到2个地黄miRNA,见表1。进一步采用Q-PCR法,验证上述2个miRNA在地黄及喂食地黄小鼠血浆中的表达丰度,最终鉴定出2个地黄miRNA(表1中的miR2118、miR5290),可在地黄及喂食地黄小鼠血浆中稳定表达,见图1。

定位:成熟miRNA在前体中的定位;LM:成熟miRNA的长度;LP:前体序列的长度。

3.2 药效microRNA的靶基因预测及其功能分析

对上述鉴定所得的2个地黄miRNAs采用Target Scan与MiRanda软件,以人类mRNA为靶标,进行靶基因预测,共预测得到这2个地黄miRNA可能调控的3604个靶基因,并进一步对这些靶基因经GO分析,可知鉴定所得的2个地黄miRNA可能调控的靶基因的宏观功能范畴。发现这些靶基因主要在生化过程、细胞成份和分子功能三大区域发挥功能,见图2,参与转录调控、生物大分子合成代谢调控、磷酸化反应及胞内蛋白激酶级联反应、蛋白质转运及胞内离子运输等重要的生物学过程,发挥金属离子通道活化调控、跨膜转录因子活化、离子通道活化调控、胞内蛋白激酶信号传导等生物学功能。

KEGG通路数据库可提供生化物质相互转化所有可能的代谢途径,通过Pathway显著性富集能确定差异表达基因参与的最主要生化代谢途径和信号转导途径[13]。采用DA-VID程序对2个地黄miRNA进行预测靶基因的生物学通路KEGG分析,以Pvalue of Fisher’s Exact Test<10-3为基准,筛选出地黄miRNA主要参与的8条信号通路,分别是慢性骨髓白血病、MAPK信号通路、神经胶质瘤、细胞内吞、神经营养因子信号通路、轴突传递、癌症相关信号通路、Hedgehog信号通路等,见图3。其中,图4为MAPK信号通路示意图(灰色标记部分为miRNA可能干预的靶点),是地黄药效miRNA抗炎效应的主要作用通路。利用cytoscape软件绘制MAPK信号通路的miRNAs-gene网络结构图,见图4,利用结构图论的方法对网络中miRNA在网络中的调控地位进行评价,评价的标准以miRNA在网络中的度(Degree)来衡量,度表示网络中的miRNA调控靶基因的数目,度越大代表miRNA调控的靶基因越多,在网络图中miR2218、miR5290的度基本相当,均为核心miRNAs(中间黑色节点代表miR-NA,周围淡灰色代表gene,灰色边代表miRNA对gene有调节作用。)。其主要作用靶标mRNA见图5。

1-12.生化过程;13-20.细胞成分;21-30.分子功能

由图3~5可知,地黄miRNA主要参与MAPK信号通路、细胞内吞、神经营养因子信号通路、轴突传递及癌症相关等信号通路,主要涉及细胞凋亡、炎症介质及下丘脑-垂体-肾上腺轴的神经内分泌调节过程,进而负责调节糖、脂肪、蛋白质三大营养物质及水盐代谢。临床实践证明,生地黄主要用于治疗消渴(糖尿病)、高血脂等代谢性疾病,以及脑缺血等神经性损失疾病,而这些疾病的机制均与以中枢神经系统为核心的神经免疫内分泌系统紊乱有关。因此,笔者推测地黄miRNA可能是其发挥抗血糖、神经保护作用的物质基础。

3讨论

核酸是细胞最基本和最重要的生物大分子。早在15年前国外学者即已开始着手核酸药物的大规模筛选和合成,并主要用于治疗肿瘤和HIV等病[14]。而核酸类成分(如虫草素、香菇太生、腺嘌呤)也是很多中药的活性成分,其广泛存在于冬虫夏草、香菇、灵芝、桑椹、太子参、人参等补益类中药材中,并作为此类中药材的质量控制指标[15,16]。但由于受到核酸结构稳定性及研究关注的侧重,传统认为这类物质并非人体所需,且经过胃肠道消化后吸收进入体内的均不再是具有生物活性的单体小分子,从而限制了核酸类成分的研究与开发。

特别是近年来的研究证实,植物miRNAs结构稳定,能跨物间“穿梭”;丹参、地黄、米碎花等中药中的一些miRNAs均可以通过水煎口服、吸收进入血内,并具有一定的药理活性和组织靶向性[17,18,19]。张辰宇等[20]最新研究表明,来源于金银花的miR-2911可以以进食的方式完整进入动物体内,并且能直接作用于流感病毒,通过抑制流感病毒PB2和NS1基因表达,进而抑制流感病毒的复制来达到治疗流感的目的。因此,miRNAs可能是不同于次生代谢产物的、很重要的一类新的中药药效物质,但此方面的研究目前还几乎没有开展。

本研究以地黄miRNA为模版,在喂食地黄的小鼠全血中通过高通量测序检测获得2个全新的地黄miRNA,且均具有高度表达(拷贝数10为中度表达,10以上为高度表达)。采用荧光定量PCR,确证了上述地黄miRNA可在种间“穿梭”,通过饮食途径、消化吸收进入体内。并进一步通过靶基因预测并经GO与KEGG pathway分析判定,地黄miRNA主要参与MAPK信号通路、细胞内吞、神经营养因子信号通路、轴突传递及癌症相关等信号通路的生物学过程,可对金属离子跨膜运输、神经-内分泌、炎症介质及相关癌症发生、肿瘤增殖等多个转录因子具有调控作用,提示地黄miRNA具有潜在的药效作用,可能是地黄中一类新型的药效物质。然而,地黄miRNA具体调控人体疾病的靶向基因和分子机制还需要进一步的研究证实。更进一步,植物miRNA作为外源性基因进入体内需要考虑类似于转基因食品安全性的问题;由于其药效靶标的多样性,是否会对机体的正常功能产生影响,以及其药效作用的确认还有待于进一步的实验论证。

摘要：目的:筛选地黄microRNAs(miRNAs)类药效物质及其靶基因功能分析。方法:采用高通量测序法,测定地黄、空白小鼠和喂食地黄匀浆液小鼠肝组织及血浆中miRNAs的表达丰度,并与Gene Bank上的植物microRNA数据库比对,结合荧光定量PCR验证,鉴定吸收进入体内的地黄miRNAs,以人类mRNA为靶标,采用Target Scan与MiRanda预测地黄miRNAs的靶基因,并通过GO与KEGG分析靶基因的相关功能。结果:共鉴定出2个地黄miRNAs可吸收进入体内,其主要在生化过程、细胞成分和分子功能3大区域发挥作用,并影响肿瘤、代谢、炎症等相关信号通路。结论:miRNAs可能是一类新型的中药药效物质。

高血压靶器官损害可预测糖尿病 篇3

意大利一项研究表明, 在接受治疗的高血压患者中, 初始左室肥大 (LVH) 和颈动脉粥样硬化 (CA) 为新发糖尿病的显著预测因素, 且独立于初始代谢水平、抗高血压治疗及其他显著协变量。论文于7月23日在线发表于《欧洲心脏杂志》 (Eur Heart J) 。

此项研究共纳入4176例基线未伴糖尿病的高血压患者, 并进行了≥1年的随访 (中位3.57年) 。患者平均年龄为 (58.7±8.9) 岁, 男性占58%。以左室质量指数 (LVMi) ≥51定义LVH, 以内中膜厚度>1.5mm定义CA。

结果显示, 随访期间共有393例 (9.4%) 患者出现糖尿病;在初始伴LVH或CA的患者中糖尿病发生率较高 (P<0.0001) 。Cox回归分析显示, 初始存在LVH或CA与糖尿病高风险具有相关性 (HR=1.30和1.38, P值均为0.03) , 并且独立于所用降压药类型和数量、初始收缩压、体质指数、空腹血糖、糖尿病家族史和β-阻滞剂治疗 (P值均<0.0001) 。临床前心血管疾病标志物之一或二者均出现可使糖尿病发生机率升高63%或64% (P值均<0.002) , 独立于显著的混杂因素。

靶基因预测 篇4

1 资料与方法

1.1 一般资料

Trizol试剂、lncRNA提取试剂、荧光定量RT-PCR试剂盒、SYBRGreenⅠ荧光染料购自美国Invitrogen公司。标本收集:60例胰腺癌组织及癌旁组织标本, 来源于2012年6月-2014年12月于我院行手术治疗的患者, 术前未行放疗或化疗, 术后病理确诊为胰腺癌的肿瘤组织 (T) 和癌旁正常组织 (N) 的液氮冻存标本。标本采集均经过患者家属同意并签属知情同意书, 并经医院伦理委员会审核通过。

1.2 总RNA的提取与RT-qPCR

经Trizol试剂 (Invitrogen公司) 抽提组织总RNA, 焦磷酸二乙酯 (DEPC) 水复溶后, 用核酸蛋白分析仪测定总RNA浓度, 根据A260/A280比值和1.5%非变性琼脂糖凝胶电泳RNA条带完整性鉴定总RNA质量。取2ng总RNA加入逆转录试剂盒 (Invitrogen公司) 进行逆转录反应, 得到cDNA溶液, 加80μlDEPC稀释后, 置-20℃保存。用SYBRGreenIPCR检测试剂盒对5μlcDNA溶液进行荧光定量PCR, MAP3K14引物序列:上游为5’-ATTTGCTCCT-GCTCCTCCAGA-3’, 下游为5’-CCAGCCTCCTC-CCAGTCTTTC-3’;PPP3CB引物序列:上游为5’-AAAGAGCTCTCTTCCCTCTTGCG-3’, 下游为5’-CTGTGAATGTGGGAAGGTGCATTG-3’;D APK1引物序列:上游为5’-GGTTCTCGCTCTT-GTTGCGTG-3’, 下游为5-TACTGACGGAA-ACACTGGCGG-3’;内参照GAPDH引物序列:上游为5’-GTGCTGAGTATGTCGTGGAG-3’, 下游为5’-GTCTTCTGAGTGGCAGTGAT-3’;PCR反应条件为:95℃预变性2min;然后95℃变性110s, 60℃退火30s, 70℃延伸30s, 共40个循环;解链曲线分析:95℃1min, 55℃30s;然后缓慢升温至95℃, 升温速率为0.2℃/s, 最后得到扩增曲线图和解链曲线图。本研究采用2-△△Ct法分析目的lncRNA的相对表达水平, 以上具体操作依试剂盒说明书进行。

2 结果

长链非编码RNAMAP3K14、PPP3CB、DAPK13种基因在胰腺癌及胰腺癌旁组织中均有表达, 其基因的表达量详见表1。三组基因在胰腺癌组织的基因表达量两两比较有差异 (P<0.01, F=32.37) , 在胰腺癌旁组织的表达两两比较差异显著 (P<0.01, F=296.6) , 三组基因在胰腺癌组织中的表达水平均低于在各自的胰腺癌旁组织的表达水平, 其中DAPK1基因在胰腺癌及癌旁基因中表达量最高。

3 讨论

胰腺癌是世界上恶性程度及死亡率最高的常见肿瘤之一, 由于其起病隐匿, 临床上缺乏有效的早期诊断手段及有效的治疗方案[3,4], 尽管手术切除能够起到一定程度的治疗作用, 但是胰腺癌患者的5年生存率仍然低于5%[5], 目前在这方面的临床研究及肿瘤实验学有较大的进步, 但胰腺癌的预后仍然不尽如意[6];因此, 寻找高特异性的早期分子标志物, 进一步深入研究胰腺癌的发生发展机制对于胰腺癌的早期诊断、治疗意义重大。

注:三组基因在胰腺癌及癌旁组织的基因表达量比较有统计学意义 (P<0.05) 。三组基因在胰腺癌组织的基因表达量的相互比较差异显著 (P<0.01) , 其中DAPK1的表达量最高;在胰腺癌旁组织中的表达量相互比较差异显著 (P=0.000) , 其中DAPK1的表达量最高。

笔者利用荧光定量RT-PCR技术检测长链非编码RNAMAP3K14、PPP3CB、DAPK13组基因在60例胰腺癌及胰腺癌旁组织中均有表达 (P<0.05) , 且在胰腺癌组织的表达水平低于胰腺癌旁组织 (P<0.05) ;而Tahira等的研究也发现MAP3K14、PPP3CB、DAPK1三组基因在胰腺导管腺癌 (PDAC) 肿瘤组织和非肿瘤组织中存在表达差异, 这说明笔者检测的结果与Tahira等的研究一致;Tahira等发现胰腺导管腺癌 (PDAC) 或转移癌的发生与胰腺组织中基因间区lncRNA的丰度有相关性, 提示这类转录产物与胰腺癌的生物进程、恶性转化和转移有潜在的关系, 而在笔者的检测结果中发现三组基因在胰腺癌组织及癌旁组织两两对比差异显著 (P<0.05) , 其中DAPK1基因在胰腺癌组织及癌旁组织中表达水平最高, 且在胰腺癌组织中表达低于癌旁组织, 说明DAPK1基因可能与胰腺癌的发生发展、生物进程、恶性转化和转移有潜在的关系, 是胰腺癌的一种可能的抑癌基因。

近年研究表明, lncRNA与人类多个肿瘤发病关系密切, 可在多个水平广泛参与基因表达调控网络的构成, 调控肿瘤发生、发展, 并与肿瘤的侵袭、转移及患者预后密切相关[7,8], 然而, DAPK1是否在胰腺癌的发生发展中也扮演着重要的角色, 是否是胰腺癌高特异性的早期分子标志物, 仍有待深入探讨。

摘要：目的:筛选并明确胰腺癌特异相关长链非编码RNA (lncRNA) 在胰腺癌及癌旁组织中的表达差异, 并对其进行初步分析。方法:采用实时定量逆转录聚合酶链反应 (RT-qPCR) 检测筛选验证胰腺癌特异相关长链非编码RNA MAP3K14、PPP3CB、DAPK1 3种靶基因在60例胰腺癌组织及配对癌旁组织表达差异最强的目标lncRNA, 为胰腺癌特异相关lncRNA的功能研究做铺垫。结果:长链非RNA MAP3K14, PPP3CB, DAPK1在各自的胰腺癌及癌旁组织中的表达水平均有意义 (P=0.000, t=17.32;P=0.000, t=15.045;P=0.013, t=34.55) ;在胰腺癌组织的表达量两两比较有差异 (P<0.01, F=32.37) , 三组基因在胰腺癌旁组织的表达水平两两比较差异显著 (P<0.01, F=296.6) , 其中DAPK1基因在胰腺癌及癌旁基因中表达量最高。结论:三种长链非编码RNA在胰腺癌及癌旁组织中明确表达, 其中DAPK1基因表达量最高, 说明DAPK1与胰腺癌的发生发展有关, 且在胰腺癌组织中表达低于癌旁组织, 说明DAPK1是胰腺癌一种可能的抑癌基因。

关键词：胰腺癌,长链非编码RNA,筛选验证

参考文献

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[7]邵永富, 蒋孝明, 等.长链非编码RNA在消化系统肿瘤发生中的作用〔J〕.中国细胞生物学学报, 2013, 35 (9) :1357.

靶基因预测 篇5

1 朝阳地一区金矿矿体特征

朝阳地Ⅰ区金矿大地构造位置位于中朝准地台 (Ⅰ2) 、内蒙地轴 (Ⅱ21) 、围场拱断束 (Ⅲ23) 、张三营中断凹 (Ⅳ27) 的北部, 康保~围场近东西向断裂构造的南部边缘, 该断裂在围场东部分支为两条, 其中一条从朝阳湾至兴聚德, 一条从矿区南通过, 两条构造到老府并为一条。北与多伦复背斜、棋盘山中凹陷 (Ⅳ12) 相邻。

矿体主要分布于角闪斜长片麻岩次级构造裂隙带 (F1、F2) 中。勘查区共圈定出工业金矿体4个, 编号为 (1) 、 (2) 、 (3) 、 (4) 。其中 (1) 号矿体是本区的主矿体, 金矿体严格受舒缓波状压性构造裂隙带控制。

金矿体矿石类型主要为含金蚀变岩型金矿石。按结构构造可分为硅化 (黄铁矿) 细脉浸染型、稀疏浸染型和条带状 (黄铁矿) 蚀变岩型。按蚀变类型又分为硅化含金蚀变岩型 (黄铁绢英岩型) 、含金蚀变角闪斜长片麻岩型 (片麻状黄铁绢英岩型) 。

1.1 (1) 号矿体

为本区的主矿体, 分布于4线至29线, 在1~29线为隐伏矿体。矿体长780m, 延深370m, 厚度0.46m~1.96m, 平均厚度0.96m, 呈脉状, 局部具膨缩现象。矿体总体走向46°, 倾向北西, 倾角平均75°。金平均品位3.46×10-6。

1.2 (2) 号矿体

位于5线至2线间, (1) 号矿体的东侧30m~50m处。1线至3线间地表未出露, 为隐伏矿体。矿体长度160m, 延深260m, 厚度0.55m~0.75m, 平均厚度0.69m, 矿体呈透镜状, 沿走向和倾向上品位和厚度变化较大。矿体走向46°, 倾向北西, 平均倾角70°。金平均品位3.40×10-6。

1.3 (3) 号矿体

为隐伏矿体。位于6~17线, (1) 号金矿体西20m处。矿体长度440m, 厚度为0.14~0.68m, 平均厚度为0.43m。矿体走向50°, 倾向北西, 倾角75°, 金平均品位7.06×10-6。

1.4 (4) 号矿体

为隐伏矿体。位于25~29线。长度80m, 厚度为0.43m, 总体走向50°, 倾向北西, 平均倾角71°, 金平均品位3.83×10-6。

2 控矿因素

2.1 地层

矿区内出露地层主要为太古界单塔子群 (Ardn) 变质岩系及新生界第四系全新统 (Q4) 松散堆积物。

太古界单塔子群 (Ardn) 变质岩系大面积分布于详查区内, 岩性为角闪斜长片麻岩、角闪斜长变粒岩、混合岩化角闪斜长片麻岩;局部为斑状、条带状混合岩、混合花岗岩。片麻理产状:走向30°~75°, 倾向北西, 倾角45°~60°。本区金矿体赋存于角闪斜长片麻岩的构造裂隙蚀变带中。经化验测试, 角闪斜长片麻岩的Au、Cu、Pb、Zn元素含量大大高于该区背景值, 为成矿提供了主要物质来源。

2.2 构造

受康保~围场~赤峰近东西向深断裂构造的影响, 矿区内发育着次级构造裂隙, 这些构造裂隙和主构造近于平行, 而且靠近北东方向构造较发育。矿区与成矿关系密切的大的构造裂隙带有2条, 即F1、F2。

F1构造裂隙带由长度大小不等的几十条裂隙组成, 构造裂隙带中间一条规模较大, 为本区的主要裂隙构造, 其它为派生的次级裂隙构造 (统称为F1构造裂隙蚀变带) , 沿主构造两侧平行排列。F1构造裂隙带地表为碎裂岩、糜棱岩和蚀变带, 带中夹有大小不等的角闪斜长片麻岩岩块, 走向北东, 倾向西, 倾角51°~81°;长2200m, 宽30m~165m。为压扭性构造。 (1) (2) 矿体即产于该构造裂隙带中。

F2构造裂隙带位于正沟一带, 地表岩石全为糜棱岩化。长90m, 宽0.2m~1.0m, 糜棱岩带内有不同的蚀变, 蚀变较弱。走向50°, 倾向西, 倾角71°。 (3) 矿体即产于该构造裂隙带中。

2.3 岩浆岩

受深大断裂带控制, 详查区内岩浆活动强烈。区内岩浆岩最主要的为华力西期石英闪长岩, 岩体多呈北东向展布。

岩体为深成侵入体, 呈岩基状产出。岩体和变质岩之间界线不明显, 岩体中见片麻岩捕虏体, 属于重熔型 (S型) 岩体。

3 矿化蚀变特征

角闪斜长片麻岩为金矿体的主要围岩, 其内发育有较大规模的构造裂隙带, 沿构造裂隙带发育有不同程度和类型的蚀变。从内到外主要有硅化、钾长石化、黄铁矿化、绢云母化、绿泥石化、萤石化和碳酸盐化等。

围岩蚀变垂直矿体走向由矿体到围岩大致可分为, 硅化~黄铁矿化、绢云母化~黄铁矿化、绿泥石化~钾化~碳酸盐化等三个带, 金矿体主要发育在硅化、绢云母化两个带中。

3.1 硅化

硅化表现为不同时代的石英晶体混杂在岩石中。石英是金和含金矿物的载体, 在成矿过程中, 具有多期形成的特点。可分为早、中、晚三期, 早期 (成矿期前硅化石英) 乳白色石英, 规模最大, 奠定了含金矿脉的总体轮廓。成矿前的硅化多表现为大小不等的石英脉体, 有的呈断块、角砾状, 被成矿期石英或矿脉穿切交代;中期 (成矿期) 灰~烟灰色石英多呈块状集合体或细粒浸染状散布于绿泥石、绢云母等蚀变矿物间, 与矿化关系密切, 多与金属硫化物矿物呈镶嵌、包裹、连生状态。晚期 (成矿期后) 灰白色石英, 硅化作用较弱, 仅以一些微脉或锥状体发育于蚀变岩的裂隙或晶洞内, 也常形成细脉穿切交代前述各种蚀变矿物。

3.2 绢云母化

绢云母化无论是在围岩 (角闪斜长片麻岩、混合岩化角闪斜长片麻岩) 中, 还是在矿化蚀变带内, 绢云母交代斜长石普遍存在 (面型蚀变) 。绢云母交代斜长石多沿矿物解理或裂隙形成网状、浸染状或脉状, 往往保留长石的假象。

3.3 钾化

钾化呈不规则多边形包裹在石英脉中或嵌于石英脉或蚀变岩边部形成红色脉壁。各种形式的交代早期以钠质交代为主, 中期钠质、钾质并重。有限的“岩汁”或“熔浆”转而向围岩 (变质岩) 中的构造裂隙进行强烈的交代和充填, 沿构造裂隙形成了一些不规则的钾长石英脉和钾化带。

3.4 绿泥石化

绿泥石化在矿区内发育普遍、延续时间长, 与成矿关系密切。在含矿围岩中, 角闪斜长片麻岩中的暗色矿物普遍被绿泥石交代。矿石中绿泥石交代黑云母、角闪石呈假象, 也常有绿泥石与微粒石英、微粒磁铁矿、赤铁矿等蚀变矿物共生, 并出现绿泥石交代斜长石的现象。在矿化蚀变带中, 石英与绿泥石共生, 并伴有金属硫化物、萤石等矿物彼此嵌布, 形成矿化石英绿泥岩, 为矿石的重要类型之一。

3.5 碳酸盐化

碳酸盐化表现为蚀变带普遍有方解石细脉或微脉存在, 常与绿泥石、萤石等共生或穿切交代其他矿物, 是较为晚期的热液活动产物。

3.6 黄铁矿化

黄铁矿多呈黄色, 中粒~中细粒或细脉状、团块状, 细粒浸染状分布于构造蚀变岩中, 按其晶体特征可划分四个阶段:第一阶段为黄白色, 粗粒自形晶, 呈团块状分布于石英细脉中, 与早期石英同期生成;第二阶段为浅黄铜色, 中粗~中细粒自形~半自形立方体, 呈条带状、细脉状或浸染状分布于蚀变岩中;第三阶段为铜黄色、深黄色, 细粒~粉末状他形晶, 呈细小脉体沿蚀变岩小裂隙充填或贯入;第四阶段为黄色, 他形晶, 常与方铅矿、闪锌矿、黄铜矿共生, 呈显微细脉或网脉状, 沿早期黄铁矿晶隙、裂隙及石英细小裂隙分布。

4 矿床成因

根据矿床地质特征, 矿石矿物组合, 该矿床为含金蚀变岩型混合岩化-重熔交代热液矿床, 受构造裂隙控制。

矿床成因与变质岩有关。金元素主要来自变质岩, 另有少量的岩浆岩成分的加入。

矿床的形成兼有充填和交代作用两种方式, 以充填作用为主。

4.1 金矿成矿时期

矿床的成矿作用, 成矿时期为晚古生代或古生代末期, 北部的蒙古板块向南俯冲, 与华北地台发生碰撞, 在强大热流影响下, 使原来的变质岩再次变质, 局部混合岩化。板块碰撞是本区导致金矿的成矿过程起决定作用的地质营力。通过各种热水溶液使金及其它成矿组分从含矿热水溶液使壳源的含金源岩活化, 沿构造裂隙富集形成金矿床。

4.2 成矿过程

原来的变质岩经再次变质, 局部遭受混合岩化, 其本质是各种形式的碱质交代和硅铝酸盐交代以及硅质交代。早期以钠质交代为主, 中期钠质、钾质并重, 后期则硅质的充填作用增强, 这些交代或贯入是多期的, 这个过程带入的是K、Na、Si, 而带出的是Fe、Mg、Ca, 在“岩汁”或“熔浆”沿断裂上升时, 携带了一定量的富碱质及含矿卤素的热水溶液, 与混合岩化过程中从围岩本身中获得的水溶液以及渗入围岩中的天水组成混合溶液。在高温强碱的作用下, 通过熔融、扩散、渗透的方式, 溶液不断从变质岩中萃取大量的Au和其它成矿组分, 组成金硫络阴离子和碱金属络合物, 从而导致原来的变质岩石含金贫化, 含金量下降, 这些含矿的聚集造成了局部地段金的富集。

5 找矿标志

(1) 太古界迁西群变质岩系为金矿床的成矿母岩, 也是初始矿源层。

(2) 太古界迁西群变质岩系中北东向展布的裂隙构造带是金矿床的容矿、配矿构造。

(3) 硅化、绢云母化、绿泥石化、黄铁矿化、钾长石化、萤石化和碳酸盐化是寻找金矿床的重要标志。

6 靶区预测

围场朝阳地一带有着良好的成矿地质条件:

1) 太古界单塔子群变质岩, 岩性为角闪斜长片麻岩、角闪斜长变粒岩、混合岩化角闪斜长片麻岩、斑状、条带状混合岩, 局部还有混合花岗岩。上述变质岩既为含矿母岩又为矿源层, 广泛分布于该区域的中部和西部。

2) 区域构造发育, 主要表现为断裂构造。

断裂构造属基底主干断裂。作为两个Ⅰ级构造单元分界线的康保-围场-赤峰至上地幔的深大断裂, 总体走向近东西, 自大兴永-朝阳地西侧转向北东东, 由王家营东沟延伸出省, 其产生于晚太古界, 以后各次大的地壳运动, 都有继承性活动, 直至燕山运动末期结束。

朝阳地一带正处于该断裂带上。该断裂导控岩体, 岩体又加剧断裂活动, 从而造成了华力西期的岩浆活动。区域构造运动和岩浆活动对成矿作用起到了至关重要的控制作用, 为本区的成矿提供了矿源通道和场所。

3) 区域内岩浆活动强烈, 岩体多呈近东西向和北东向展布, 主要有华力西期角闪辉石岩、华力西期二长花岗岩、石英闪长岩体等, 充分显示了该区域岩浆活动的广泛性和频发性。

综上, 围场朝阳地一带不局限于朝阳地Ⅰ区金矿床1处。在其外围尤其在其北东方向的温珠沟、西南方向的头道沟一带有着很好的找矿前景, 是下一步寻找金矿床的靶区。

摘要：围场朝阳地一带目前已发现金矿床一处, 现详查施工已基本结束。从成矿条件、矿体矿化特征、围岩蚀变、矿床成因及找矿标志均有一定规律性。研究该区金矿成矿规律, 对指导该区域金矿找矿有着重大指导意义。

关键词：矿体特征,控矿因素,矿化蚀变特征,矿床成因,找矿标志,靶区预测

参考文献

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[4]武汉地质学院地球化学教研室编.地球化学.地质出版社, 1979.8

靶基因预测 篇6

1 材料与方法

1.1 材料和试剂

肝癌细胞株Hep G2 由广东省医学科学院医学研究所细胞中心保存。RPMI 1640、DMEM培养基和胎牛血清(Hyclone公司),Trizol试剂(美国Invitrogen公司),转染试剂Lipofectamine 2000(Invtrigen公司),一抗1∶1 000,二抗1∶5 000(美国Southern Biotech公司),体外侵袭实验装置(美国BD公司),Transwell侵袭小室(美国Millipore公司)。

1.2 生物信息学分析

Target Scan [http://www.targetscan.org/],pic Tar [http://pictar.org/],mi Randa [http://www.microrna.org/microrna/]3 种生物学软件分析mi R-10b可能调控的靶基因,选取HOXD10 为目的基因。引物及mi R-10b序列由广州锐博生物科技有限公司合成。

1.3 试验方法

肝癌细胞用DMEM、RPMI 1640 完全培养基传代培养,收集对数生长期的细胞进行实验。细胞瞬时转染,选择Hep G2 细胞脂质体转染mi R-10b mimics24h用QPCR检测。PCR分析m RNA表达量,通过逆转录- 聚合酶链反应(RT-PCR)方法克隆非翻译区(3'-UTR) 引物序列为:HOXD10- 正向引物:5'-CCGAAGTGCAGGAGAAGGAA;HOXD10- 负向引物:5'-GTGTAAGGGCACCTCTTCTTTCTG,测序正确后常规方法转染Hep G2 细胞,同时在细胞内检测HOXD10 表达量。Western blot分析:用BCA法。体外细胞侵袭实验:细胞转染mi R-10b后Hep G2 接种至侵袭装置,培养24 h后经吉姆萨染色对穿膜细胞计数。

1.4 统计学方法

所有实验数据用SPSS 13.0 统计软件包进行分析。计量资料以均数±标准差(±s)表示,进行正态性分析及独立样本t-test,P <0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HOXD10 在3 种肝癌细胞中表达及构建高表达mi R-10b

Huh-7 细胞,Hep G2 细胞,SMMC-7721 细胞HOXD10 基因经PCR比较基础表达量2-ΔΔCT分别是1.00、228.71 和1.55,见表1、图1。蛋白分析Hep G2细胞灰度计算值是930.22,Huh-7 是406.00,SMMC-7721 是249.00,见图2。通过基因和蛋白实验结果筛选出表达量高的Hep G2 细胞符合下一步实验要求。mi R-10b逆转录后表达量为(9 772.22±437.99),与阴性对照组比较,P <0.05,差异有统计学意义,说明构建高表达mi R-10b成功,见表2、图3。

(±s)

1:Hep G2细胞;2:Huh-7细胞;3:SMMC-7721细胞

2.2 转染后HOXD10 在肝癌细胞中基因及蛋白表达

Hep G2 肝癌细胞中转染mi R-10b的HOXD10实验组与阴性对照组,在基因水平和Western blot分析蛋白水平HOXD10 基因表达量2-ΔΔCT分别是(1.24±0.23)和(1.00±0.02),P >0.05 差异无统计学意义。见表3、图4。在蛋白分析Hep G2 细胞灰度计算值分别是1 968.742 和653.492,蛋白水平表达降低,见图5。

2.3 体外细胞侵袭实验

体外细胞侵袭实验穿膜细胞计数结果显示:Hep G2 转染mi R-10b过表达后(112.38±11.27),与阴性对照组(75.25±6.35) 比较细胞侵袭能力增加(P <0.05)。见表4。

注:NC:过表达mi R-10b的阴性对照组;mi R-10b组:过表达mi R-10b组;mi R-10b组与NC组比较,t =-35.705,P =0.000

未处理组:Hep G2;NC:过表达mi R-10b的阴性对照组;mi R-10b:过表达mi R-10b组

注:NC:过表达mi R-10b的阴性对照组;mi R-10b组:过表达mi R-10b组;mi R-10b组与NC组比较,t =6.245,P =0.220

未处理组:Hep G2;NC:过表达mi R-10b的阴性对照组;mi R-10b:过表达mi R-10b组

1:未处理组;2:阴性对照组;3:mi R-10b组

注:未处理组:Hep G2;NC:过表达mi R-10b的阴性对照组;mi R-10b组:过表达mi R-10b组;F =6.726,P =0.006 组间差异有统计学意义,mi R-10b组与NC组比较,P =0.043

3 讨论

mi RNA在转录后基因表达和生物行为发展过程起着重要调控作用,大多数人类癌症与mi RNA发挥抑癌基因或癌基因作用有关[3]。肿瘤发生在染色体易变位点上,即染色体上易发生丢失、移位或重复的部位,是微小RNA表达异常与某些肿瘤关系密切的原因[4]。肝细胞癌中2 号染色体短臂发生突变,而mi R-10b恰位于该突变部位。Ma等[5]发现mi R-10b高表达和肿瘤细胞的血管侵袭相关;特异性增加mi R-10b表达量可促进肿瘤细胞的侵袭。Laderio等[6]报道109 例肝脏样本肝细胞癌29 例、肝良性病变局灶性结节性增生5 例,癌旁组织93 例,其中mi R-10b表达量显著高于良性病变和未发生肿瘤病变的肝脏组织,同时把mi R-10b看做肝脏肿瘤细胞侵袭性、转移的相关因素;说明在肝癌组织中mi R-10b表达上调,可抑制某些靶基因表达而发挥癌基因作用。HOXD10 基因同样位于2 号染色体,是细胞分化、个体发育生长的关键基因位点[7]。受到mi R-10b及其他多种负性调控作用,HOXD10 在多数恶性肿瘤表达缺失,从而增强肿瘤细胞的侵袭能力[8]。Myers等[9]研究表明持续表达的HOXD10 基因,对乳腺肿瘤细胞新生血管的生成起到一定的抑制作用。Carrio等[10]在HOXD10 抑制脑胶质瘤细胞的侵袭和转移研究中同样发现,高表达HOXD10 可以抑制新生毛细血管形成,从而抑制正常脑细胞向肿瘤细胞分化,因此,HOXD10 被认为是抑癌基因。上调mi R-10b可以抑制m RNA编码HOXD10 翻译过程,导致增加有潜在转移性质的基因RHo C,并且发现随着进展期乳腺癌肿瘤侵袭程度增加,HOXD10 表达却逐渐消失[11]。HOXD10 过表达可以抑制RHo C蛋白的表达,进而可以阻止mi R-10b诱导的肿瘤细胞发生侵袭转移[12]。Liao等[13]试验60 例不同肝细胞肝癌TNM分期中mi R-10b表达情况与肝癌细胞转移能力相关,得出mi R-10b负调控HOXD10 在转录后水平通过HOXD10 相关基因Rho C/u PAR/MMPs促进肝癌细胞转移和侵袭。

总结分析得出实验采用微小RNA瞬时转染方法,可以提高mi R-10b基因在转染细胞Hep G2 细胞中的表达量,在靶基因基础表达量高的前提下,通过RT-PCR和Western blot方法研究在肝癌细胞中HOXD10 基因和蛋白的表达情况, 结果发现HOXD10 在m RNA水平变化小而蛋白水平表达是降低的,说明mi R-10b是通过转录后翻译阶段来调节靶基因的表达,该靶基因可能起到抑制癌基因作用,过表达mi R-10b增加了Hep G2 细胞侵袭能力。mi R-10b过表达与肝细胞癌的侵袭关系密切,为进一步研究肝癌细胞的多种生物学特征提供实验依据。

摘要：目的 探讨micro RNA-10b(mi R-10b)及其靶基因同源异性盒基因HOXD10在肝癌细胞中的表达及转染mi R-10b对肝癌细胞侵袭性能力的影响。方法 分析HOXD10基因在3种肝癌细胞株Huh7、Hep G2、SMMC-7721中的基础表达量,筛选出HOXD10基础表达量高的Hep G2作为后续研究对象。设计合成外源性mi R-10b序列,用脂质体瞬时转染肝癌细胞株,设置mi R-10b转染组、无关序列转染组(阴性对照组)和未处理组(对照组)。用RT-PCR及Western blot检测肝癌细胞转染mi R-10b后HOXD10基因及蛋白表达量的变化,细胞侵袭实验研究转染mi R-10b对肝癌细胞侵袭能力。结果 在基因水平和Western blot分析蛋白水平HOXD10基因表达量2-ΔΔCT分别是(1.24±0.23)、(1.00±0.02),P>0.05差异无统计学意义。在蛋白分析Hep G2细胞灰度计算值是值分别是653.492和1 968.742,蛋白水平表达降低。HOXD10基因在肝癌细胞株Hep G2的表达量显著高于Huh7和SMMC-7721;mi R-10b成功转染Hep G2后,HOXD10基因表达水平与对照组比较无明显变化,但HOXD10蛋白表达量与对照组比较下降及侵袭性也增强。结论 mi R-10b可能通过抑制靶基因HOXD10表达发挥作用,促进肝癌细胞的侵袭。