植物抗性基因研究

植物抗性基因研究（精选4篇）

植物抗性基因研究 篇1

1 引言

伴随经济增长我国汽车数量猛增, 汽车尾气导致大气中NOx浓度不断升高, 严重威胁到城市居民和动植物健康。汽车尾气污染下植物叶片膜脂过氧化及抗氧化系统会受损, 叶绿素含量降低, 光合作用会减弱, 叶片变色、脱落甚至枯死 (陈华, 2006) 。不同植物种类、习性不同, 在相同生长条件下, 对大气污染物的忍耐力不同 (鲁敏, 2002) 。研究园林植物对汽车尾气的不同忍耐能力, 可以作为交通繁忙地段选择和培育抗污染植物时提供指标, 同时也可为深入探讨大气污染对植物的伤害和植物的抗性机理提供科学依据, 为城市开展抗污绿化、生物净化、环境的生物监测与评价提供科学依据。

2 汽车尾气有害成分简述

根据国民经济和社会发展统计公报, 我国2014年年末民用汽车保有量达到15447万辆, 比上年末增长12.4%。随之而来的是汽车尾气污染问题, 分析显示汽车尾气中主要污染物为NOx、CO、CO2、碳氢化合物、固体悬浮物、铅及硫氧化合物等, 其中NOx是形成光化学烟雾主要凶手, 会产生臭氧、硝酸及其他有机酸脂, 而硝酸是酸雨形成的主要来源 (刘培桐, 1995) 。

3 汽车尾气对植物的影响

植物叶片对汽车尾气污染最为敏感, 李德生 (2007) 用NO2对14种植物进行熏气发现植物在长时间接触浓度较低NO2后生育不良, 长势差, 缺绿, 衰老加速。还发现针阔叶树种叶片受损有所区别, 阔叶树先从叶脉出现坏死斑, 慢慢在叶缘、叶柄等地也出现坏点, 直至整个叶片脱落;针叶树种也从叶片开始受损, 首先出现坏死的是叶片中上部, 逐渐蔓延, 直至整个针叶, 但死后不脱落。

3.1 对植物细胞膜的损伤

细胞膜是植物细胞内部反应与外部环境的界面, 可以调节细胞内外物质交流、信息传递, 也能在污染胁迫下作出反应。植物在逆境条件下首先细胞膜发生变化, 汽车尾气中大量的NO2从植物叶片气孔进入叶片后快速形成NO2-, 与NADPH竞争, 降低了植物光合作用速率, 致使细胞内不断产生活性氧 (ROS) , 从而破坏了系统之间的平衡, 植物细胞中积累大量的O2+、OH-、—OH、H2O2和O2等, 这些活性氧与植物组织中生物大分子发生反应, 导致膜脂过氧化、蛋白质与核酸的氧化修饰、细胞膜的破坏, 致使植物受到伤害, 甚至死亡 (焦健等, 2006) 。

3.2 对光合作用的影响

反应植物生长情况最好的指标是光合作用速率, 很多学者对NOx对植物光合作用的影响进行过研究, 其中Sabarat (1988) 将NO2对植物光合作用的影响机制归纳为以下3个方面: (1) NO2从植物叶片气孔进入叶片后快速形成NO2-, 与NADPH竞争, 降低了植物光合作用速率; (2) NO2自身属酸性, 进入植物细胞后可改变电子传递和光合磷酸化; (3) NO2的转化物Fe-NO自由基复合物, 会对含巯基或组氨酸残基蛋白质中酶的活性产生抑制作用。温达志 (2003) 研究发现, 生长在NO2较高的工业区30种园林植物的净光合速率、蒸腾速率、气孔导度都有一定的下降, 陆耀东 (2003) 对交通繁忙区的39种木本植物进行研究也得出类似结论。

3.3 对叶绿素含量的影响

叶绿素是植物最主要的色素分子, 是植物进行光能吸收、传递以及电子传递过程中必不可少的传递体。大量研究证明汽车尾气会导致植物叶片叶绿素含量下降的现象, 如Sabarat (1988) 对常春藤、燕麦进行为期5d、每天7h的0.5ul/l NO2, 导致植物叶绿素a和总叶绿素含量明显下降。而0.2和0.3ul/l NO2对叶绿素含量却有一定刺激增加作用。陈海燕 (2006) 也得出类似结论:低强度的大气污染, 植物叶绿素含量可能变化不明显甚至有所增加。

4 植物对汽车尾气的应对机制及抗NOx污染植物选择

植物吸收污染物:一是植物根部吸收后经木质部向上运输;二是植物叶、表皮的气孔或角质层吸收大气中的多种化学物质, 包括NO、NO2、SO2、HF、重金属、粉尘等经韧皮部向下运输和分布 (薛较亮等, 2000) 。植物吸收汽车尾气后主要靠持留和去除来净化化学性污染物。持留是指植物截获、吸附和滞留等, 去除包括植物吸收、降解、转化、同化和超同化等 (陶雪琴等, 2007) 。植物的叶片形态 (针阔叶) 、粗糙程度、叶片着生角度和表面分泌物对污染物的持留有很大关系 (Trapp.2001) 。陶雪琴 (2007) 研究发现植物一般经代谢过程或自身的酶等来降解细胞内吸收的N0x, 同时植物也可以经过生理过程将汽车尾气污染物由一种形态转化为另一种形态, 如植物可将空气中的SO2和NOx转化为硫酸盐和硝酸盐, 其正好符合Omasa (2002) 提出的“超同化植物”的概念, 将汽车尾气中的某些成分转化成营养物质源高效吸收与同化, 同时促进自身的生长, 如植物吸收的NO2部分参与植物的生命活动, 部分通过根系排出体外。

植物在城市生态平衡中起着“除污吐新”的作用, 不同植物“吸污抗污”能力不一样, 一些植物对汽车尾气很敏感, 另一些植物在长期的汽车尾气污染下仍生长旺盛, 表现出极强的抗性, 从而达到降解大气污染物的目的 (刘艳菊, 2001) 。因此研究如何防止植物增毒和如何强化植物解毒是利用植物应对汽车尾气污染的关键。

学者在植物的吸污、抗污方面做了大量研究, 陈卓梅 (2007) 在对38种浙江省主要园林植物进行试验时得出:各物种对NO2的抵抗能力差异较大, 常绿植物抗性强于落叶植物, 山茶科和樟科植物抗性强于金缕梅科植物;各物种吸污性也相差很大, 相对吸污能力最强的达404.05%, 最弱的仅0.07%, 以落叶植物吸污能力强于常绿植物。胡羡聪 (2003) 对南方常见树种进行研究得出一般情况下抗污性强的植物光合作用弱、净化能力弱, 但也有些物种表现出抗性较强, 又具较高的净化能力, 如小叶榕、红花夹竹桃、桃花心木等, 这类既有较强抗性又有较强净化能力的植物可多应用于道路繁忙区的绿化。孔国辉 (2003) 筛选出了适宜北方对NOx具有较强抗性的植物种馒头柳、丁香、构树、海棠、金银木、自蜡等, 适宜南方种植的有小叶榕、竹柏、铁冬青、红花油茶、夹竹桃、仪花、密花树等吸污、抗污能力强的植物。赵磊 (2013) 选出适宜中部城市种植的抗NOx污染能力较强的有栾树、广玉兰、女贞、樟树、法国冬青、紫叶李、海桐、桂花、红继木、悬铃木、枇杷、石楠、杜鹃、山杜英等。

5 研究展望

随着汽车保有量急剧上升, 汽车尾气已成为大气污染物的主要来源之一。尽管在前面提到植物能够抗污吸污, 但目前对植物吸污机理研究不够透彻。城市绿地消减汽车尾气的规划设计也未有效开展, 几乎没有成功案例可循。随着我国城市大气问题的日益突出, 城市绿地减污规划设计技术将成为城市园林绿地规划设计的重要内容, 在以后可集中对以下几个方面进行研究。

(1) 汽车尾气中主要物质在植物体内转化机理的研究;

(2) 净化效果影响因素的研究;

(3) 胁迫生境下转基因植物的研究;

(4) 高效净化植物的筛选;

(5) 高效净化植物大范围种植效果研究等。

植物抗性基因研究 篇2

分子标记技术用于小麦赤霉病抗性研究早有报道,研究的抗源主要集中在苏麦3号及其衍生系上。Waldront等RFLP标记技术以苏麦3号/StoaRIL群体研究赤霉病QTL,在苏麦3号染色体3B短臂上发现1个QTL位点,在6B不同区段上发现2个QTL位点[4,5]。Anderson也利用苏麦3号及其衍生系与2个不同的感病亲本配制的重组自交系群体,对抗赤QTL进行定位,发现存在于3BS和6BS的抗赤QTL在2个群体中都能检测到[6]。

该研究拟用覆盖苏麦3号与小麦赤霉病抗性主效QTL紧密连锁的位于3BS和6BS上的SSR标记:Xgwm493、Xwmg533、Xgwm389、barc133、barc147、barc102和Xgwm644、Xgwm133、barc101来筛选黑龙江省农业科学院克山分院高代育种材料,并验证这些与小麦赤霉病QTL紧密连锁的SSR标记在高代育种材料中辅助选择的有效性。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为63份苏麦3号衍生材料(2011年产量鉴定13个株系,F618个株系、F532个株系)。种植于黑龙江省农业科学院克山分院试验地内。行长1 m,行距0.4 m,穴播。

1.2 方法

1.2.1 田间赤霉病抗性鉴定

采用单位花滴注的方法进行接种。小麦花期在从上向下的第5个小穗内注射接种10 μL禾谷镰刀菌孢子悬浮液(1 μL含100个孢子),接种以后弥雾保湿3 d,然后每天喷水1～2次,每个株系接种10～12穗。接种后21 d调查发病情况并统计病小穗率[病小穗率/%=(发病小穗数/总小穗数)×100]。根据病小穗率确定发病级数,根据发病级数判定赤霉病抗性(2级以上为抗病)。

常规病穗分级标准(0～4级)为0级:无病,1级:病部占全穗的1/4以下,2级:病部占全穗1/4～1/2,3级:病部占全穗的1/2～3/4,4级:病部占全穗的3/4以上或全穗枯死。

1.2.2 DNA提取

取成熟籽粒,参照Saghai-maroof等[5]报道的CTAB法进行DNA提取。

1.2.3 SSR分析

PCR反应在PE公司GeneAmpPCR System 9600上进行,反应体积为20 μL。反应混合液包括1×buffer,1.5 mmol·L-1 MgCl2,2.0 mmol·L-1 dNTPs,250 μmol·L-1 SSR引物,50～100 ng模板DNA,1 U Taq酶。反应程序为:94℃2 min,94℃1 min,55℃1 min,72℃1 min,36个循环,72℃5 min。扩增产物电泳6%的聚丙烯酰胺胶检测。

1.2.4 数据统计和分析

根据病小穗率测算严重度,严重度大于2的为中抗,株系定义为抗病株系。

2 结果与分析

2.1 供试材料的抗性鉴定

苏麦3号单花滴注接种后21 d的病小穗率为14.3%,产量鉴定有5份材料病小穗率低于苏麦3号的病小穗率,占产量鉴定材料的38%;F6有8份材料病小穗率低于苏麦3号的病小穗率,占鉴定材料的44%;F5有12份材料病小穗率低于苏麦3号的病小穗率,占鉴定材料的37.5%;由表1可知,63份苏麦3号衍生材料中,抗病材料为25份,占所鉴定材料的39.7%,感病材料为38份,占所鉴定材料的60.3%。感病材料所占的比重较大。

2.2 抗赤霉病分子标记在小麦产量鉴定材料中的检测

用在3BS上与赤霉病主效抗性基因紧密连锁的Xgwm493、Xwmg533、Xgwm389、barc133、barc147和barc102标记对2011年产量鉴定材料进行检测,结果没有扩增出与苏麦3号相同的多肽性条带,说明这13份材料不存在这6个抗性基因。 用 6BS 上的标记Xgwm644、 Xgwm133、barc101进行检测,结果表明:Xgwm644标记扩增出2份与苏麦3号相同的多肽性条带,说明这2份材料存在Xgwm644抗赤霉病基因;Xgwm133标记没有扩增出与苏麦3号相同的多肽性条带,说明这8份材料均不存在Xgwm133抗赤霉病基因;barc101标记扩增出3份与苏麦3号相同的多肽性条带,说明这3份材料存在barc101抗赤霉病基因(见表2)。

注:含有抗性标记的为+;不含此抗性标记的为-。下同。

Note:Containing resistance marker is +;Non-containing resistance marker is -.The same below.

5份抗性材料中有1份能检测到抗性标记,选择的有效率为20%;2份材料在6BS上检测到抗性标记,田间表现为感病。

2.3 抗赤霉病分子标记在小麦F6育种材料中的检测

用在3BS上与赤霉病主效抗性基因紧密连锁的Xgwm493、Xwmg533、Xgwm389、barc133、barc147和barc1026标记对F618份材料分别进行检测(见表3),结果表明:用Xgwm493、Xwmg533、barc133、barc102检测,材料237、238分别扩增出与苏麦3号相同的多肽性条带,说明这2份材料存在这4个抗性基因;用Xgwm389检测,有8份材料扩增出与苏麦3号相同的多肽性条带,说明这8份材料存在此抗性基因;用barc147检测,只有237扩增出与苏麦3号相同的多肽性条带,说明其存在此抗性基因。用6BS上的标记Xgwm644、Xgwm133、barc101分别进行检测,结果显示:用Xgwm644检测,238、274两份材料分别扩增出与苏麦3号相同的多肽性条带,说明这2份材料存在抗赤性基因;用Xgwm133检测,18份材料中没有扩增出与苏麦3号相同的多肽性条带,说明这18份材料均不存在这几个抗性基因;用barc101检测,237、803、804扩增出与苏麦3号相同的多肽性条带,说明这3份材料存在此抗性基因。

8份抗性材料中有6份分别在3BS、6BS上能检测到相应抗性标记,选择的有效率为75%;5份分别在3BS、6BS上检测到抗性标记,田间表现为感病。

2.4 抗赤霉病分子标记在小麦F5育种材料中的检测

用在3BS上与赤霉病抗性连锁的Xgwm493、Xwmg533、Xgwm389、barc133、barc147和barc102标记对F532份材料分别进行检测(见表4),结果表明:Xgwm493没有扩增出与苏麦3号相同的多肽性条带,表明32份材料中不存在Xgwm493抗性基因;Xwmg533、barc133中有8份材料扩增出与苏麦3号相同的多肽性条带,说明这8份材料存在Xwmg533、barc133抗性基因;Xgwm389、barc147中有9份材料分别扩增出与苏麦3号相同的多肽性条带,说明这9份材料存在Xgwm389、barc147抗性基因;barc102中有6份材料扩增出与苏麦3号相同的多肽性条带,说明这6份材料存在此抗赤霉病基因。

12份抗性材料中有8份分别在3BS、6BS上能检测到相应抗性标记,选择的有效率为66.7%;13份材料分别在3BS、6BS上检测到相应抗性标记,田间表现为感病。

3 结论与讨论

小麦赤霉病抗性是受环境影响较大的数量性,对用于分子标记研究的表型鉴定应在相对比较稳定一致的环境中,采用年度间相关系数较高的抗性材料。近年来,对抗源苏麦3号及其衍生系的研究已有许多报道[6,11,12],认为苏麦3号抗病性是由1～2对主效抗赤基因及几处微效基因控制。该试验应用覆盖苏麦3号与小麦赤霉病抗性主效QTL紧密连锁的位于3BS和6BS上的SSR标记对不同世代的材料进行检测结果表明:田间鉴定出的抗病材料中有15份材料在3BS、6BS上能检测到相应抗性标记,说明存在相应的抗性基因,表现出表现型和基因型的统一,其抗性具有相对的稳定性,可以作为生产材料或作为抗性亲本在育种中加以利用;经田间鉴定出的10份抗性材料均在3BS、6BS上未能检测到相应抗性标记,说明这10份材料中不存在相应的主效抗性基因。但在田间表现为抗性,是因为小麦赤霉病是由主效基因+微效基困控制的数量遗传性状,虽然主效基因在遗传中起主要作用,但微效基因的累加达到一定的量时,同样起到主效基因的作用;经田间鉴定出的38份感病材料中有20份材料在3BS、6BS上检测到相应的抗性标记,表明这20份材料中也存在相应的抗性基因,只是由于基因表达过程中受到抑制或基因沉默亦或效应较小等原因在遗传中没有表达而已。在不同抗赤品种中,可能分布着不同的抗赤QTLs,借助于紧密连锁的分子标记可望有效地聚合这些QTLs,培育具有持久稳定的抗赤品种。

参考文献

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植物抗性基因研究 篇3

关键词：镉抗性,植物内生菌,细菌,菌株,Cd2+去除

重金属污染是指由重金属或其化合物造成的环境污染,是最严重、最难治理的环境问题之一,重金属污染的严重性和普遍性早已引起了国内外的广泛关注。镉是生物毒性最强的重金属,被列为五大毒物[镉(Cd)、汞(Hg)、砷(As)、铬(Cr)、铅(Pb)]之首[1,2,3,4,5]。极微量的镉就可对人体造成伤害,它可通过食物链在植物体、动物体、人体内大量富集,具有稳定、积累和不易消除等特点,危害人和动物健康,甚至造成死亡[6,7,8]。由于镉等重金属污染毒理机制和生物效应的复杂性,对重金属污染问题的研究已成为土壤学、环境科学、生态学等的重点、难点和热点。

植物内生菌是指在植物体内完成其生活史的部分或全部,但又不引起任何病症,并与宿主建立互惠共生关系的一类微生物。内生菌普遍存在于目前已研究过的各种高等植物中,它们在植物体内进行生命活动时,能产生多种活性物质,这些物质能对宿主植物的产生巨大的影响。有研究表明,内生菌能促进宿主生长,提高宿主抗逆性,增强宿主竞争力[9]。近年来,研究植物内生菌与植物间的互作,探讨植物内生菌对于环境污染的修复作用及机制,利用植物和其内生细菌来降解环境污染物并应用于生产实践已成为学术界研究的热点。内生菌作为生物防治资源、外源基因的载体和新药的来源,在农业、医药、卫生领域有着巨大的应用潜力[10,11]。

本研究对污灌区野生植物体内的植物内生菌进行分离纯化,采用Cd2+富集方法从中筛选对镉有抗性的菌株,研究其形态、生长特性以及对Cd2+去除情况,以便为进一步探索内生菌与宿主植物的协同作用、提高植物修复效率提供理论支持,为利用植物内生菌处理重金属污染工作奠定基础[12,13,14,15]。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试植物

2010年9月于辽宁抚顺市李石开发区沈抚污灌区采集野生植物:东方蓼、狗尾草、稗草、山莴苣、北柴胡、大花鬼针草等,取样后于48 h内用其根茎健康组织进行植物内生菌的富集和分离。

1.1.2 培养基

分离用培养基:固体牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基。

筛选用培养基:在配制牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基的过程中分别加入Cd Cl2,使培养基中含Cd2+浓度分别为25,50,100,150 mg/L。

1.2 方法

1.2.1 内生菌菌株的分离、纯化

取所采集植株的根、茎分别用流水冲洗干净,用75%酒精浸泡1 min,无菌水冲洗3~4次,0.1%升汞浸泡5 min,无菌水冲洗3~4次。用无菌解剖剪刀或无菌手术刀将根、茎组织切成5~10 mm大小组织块,分别贴于牛肉膏蛋白胨培养基、PDA培养基平板上,同时将最后一遍冲洗的无菌水取适量涂布平板,分别于37℃、28℃环境下培养数天,若无菌水涂布的平板无杂菌生长,则将正常处理的平板上长出的菌落按常规方法纯化后保存备用。

1.2.2 抗镉内生菌菌株的筛选

将已分离纯化的活化内生菌液按5%(V/V)接种量分别接种于含Cd2+浓度为25,50,100,150 mg/L的牛肉膏蛋白胨培养液或PDA培养液中,37℃或24℃,120 r/min条件下振荡培养,将振荡培养后的培养液分别稀释到10-3,10-4,10-5倍涂布在含Cd2+浓度为20 mg/L的相应培养基平板上,挑取单菌落,如此反复得到抗镉内生菌菌株。将已得到的抗镉菌株接种于斜面固体培养基上,置4℃冰箱保存。

1.2.3 Cd2+去除率的测定

采用原子吸收分光光度法测定Cd2+浓度。将培养液4000 r/min离心20 min除去菌体,残留的上清液用于测定Cd2+浓度,以不含菌的含Cd2+培养液为对照[8]。

Cd2+去除率%=[(C0-C)/C0]×100%

其中为C0为Cd2+的初始浓度(mg/L),C为Cd2+的残留浓度(mg/L)。

1.2.4 抗镉内生菌EB12-6菌株的形态学观察

1.2.4. 1 菌落形态

采用稀释涂布法将所分离得到的抗镉内生菌接种于牛肉膏蛋白胨平板培养基上,37℃培养1~2 d,观察其菌落特征。

1.2.4. 2 菌体形态

分别采用单染色法、革兰氏染色法、鞭毛染色法等对抗镉内生菌进行染色观察和描述,同时采用显微镜直接测定法测定菌体大小。

1.2.5 抗镉内生菌EB12-6菌株生长特性的测定

1.2.5. 1 生长曲线的测定

将抗镉内生菌接种于牛肉膏蛋白胨培养液中,置37℃,120 r/min培养,分别于0,4,8,12,24,48,60,72,84,96 h测定OD600值,以未接菌的培养液作为对照。依据所测数据绘制生长曲线。

1.2.5. 2 最适培养温度的测定

将抗镉内生菌接种到牛肉膏蛋白胨培养液中,分别置于12℃、25℃、37℃、45℃、50℃恒温振荡器,120 r/min,培养36 h,测定OD600值。

1.2.5. 3 初始p H值对EB12-6菌株生长的影响

将牛肉膏蛋白胨培养液分别调制p H为4,5,5.5,6,6.5,7,7.5,8,8.5,9,10,分别接种抗镉内生菌,置于37℃,120 r/min振荡培养36 h,分别测其OD600值。

1.2.5. 4 不同装液量对EB12-6菌株生长的影响

将将抗镉内生菌接种于装液量为50,75,100,150m L的250 m L三角瓶中,37℃,120 r/min振荡培养36h,分别测其OD600值。

1.2.5. 5 Na Cl浓度对EB12-6菌株生长的影响

将抗镉内生菌接种于含Na Cl浓度为0.5%,1%,2%,3%,5%,10%的牛肉膏蛋白胨培养液中,37℃,120 r/min振荡培养36 h,分别测其OD600值。

2 结果与分析

2.1 抗镉内生菌株的分离纯化及筛选

经组织分离法分离纯化得到46株植物内生菌,其中23株细菌、23株真菌。经用含Cd2+培养基筛选,得到6株对重金属镉具有抗性的菌株,其中4株真菌(EF12-2、EF12-4、EF12-6、EF12-9),2株细菌(EB12-6、EB12-9)。

2.2 Cd2+去除率的测定

采用原子吸收分光光度法测定已筛选得到的6株内生菌的Cd2+去除效果见表1。由表1可见,2株内生细菌对Cd2+的去除效果较好,去除率均达60%以上,而4株内生真菌的Cd2+的去除作用相对较弱。根据对Cd2+的去除作用效果,最终选取内生细菌EB12-6菌株进行深入的实验研究。

2.3 EB12-6菌株形态特征

EB12-6在牛肉膏蛋白胨固体培养基上的菌落特征是:菌落呈乳白色规则圆形,边缘整齐,表面光滑。EB12-6菌体呈短杆状,长度为0.9~1.25μm,宽度为0.65~0.85μm;无芽孢、荚膜,有鞭毛,革兰氏染色阴性。

2.4 EB12-6菌株生长特性

2.4.1 EB12-6菌株生长曲线

EB12-6菌株生长曲线见图1。由图1可以看出,菌株在0~4 h处于延迟期,4~36 h为对数增长期,36~48 h为稳定期,48~96 h为衰亡期。

2.4.2 温度对EB12-6菌株生长的影响

由表2可见,温度对EB12-6菌株生长影响显著,EB0901菌株在12~45℃时均能良好生长,在10~12℃时生长迟缓,当培养温度超过37℃后,菌株的生长受到明显的抑制,在50℃以上基本不生长,生长适宜温度为25~45℃,最适生长温度为37℃。

2.4.3 初始p H对EB12-6菌株生长的影响

初始p H值对EB12-6菌株生长有明显影响,当p H值为4时,该菌株基本不生长,在p H5~10时均可生长,其中,p H值为6~8时出现生长高峰,在p H值为7.5时,生长最好。EB12-6菌株可在中性偏碱性条件下生长(见表3)。

2.4.4 不同装液量对EB12-6菌株生长的影响

不同装液量对EB12-6菌株生长有一定影响(见表4)。随着装液量的增加,菌体的增长呈下降趋势,即当装液量增加时,菌体生长所需的氧气含量减少,而氧气含量的多少影响菌体的生长,说明EB12-6为好氧菌。

2.4.5 不同Na Cl浓度对EB12-6菌株生长的影响

由表5可以看出,不同Na Cl浓度对EB12-6菌株的生长有较大影响,在Na Cl浓度为0.5%~5%时均可生长,在0.5%~3%时生长良好,当Na Cl浓度大于3%时,菌株生长速度下降,当Na Cl浓度为10%时,菌体几乎不生长。由此可见,EB12-6菌株具有一定的耐盐性。

3 结论与讨论

从污灌区生长的植物体内分离纯化46株植物内生菌,经用含Cd2+培养基筛选得到6株抗镉植物内生菌,其中2株内生细菌、4株内生真菌。6株内生菌的Cd2+去除率不同,内生细菌的抗镉能力较强,均达到60%以上。由此可见,在污灌区生长的植物体内存在有多种内生菌(细菌和真菌),有的内生菌对某些造成污染的因素(如重金属镉)具有抗性,有的则没有,而具有抗性的内生菌其抗性强弱也有差别。

镉抗性细菌菌株EB12-6在p H7.5,37℃,培养36 h,培养基初始Cd2+浓度为20 mg/L条件下,对Cd2+去除率达63.88%,但作为内生菌,当其侵染植物体与植物体共生联合作用时,对环境镉的去除作用效果和作用机理以及该菌株是否对其他重金属如铅、铜、镍、锌也具有一定的抗性,还有待深入研究。

植物抗性基因研究 篇4

甜瓜白粉病是一种广泛发生于甜瓜产区的真菌病害, 在世界各主要栽植区都有报道[1]。当白粉病菌侵染植株后, 植株叶片正反两面、叶柄和茎部都被白色粉状菌体所布满[2]。白粉病病原菌具有增殖快, 传播迅速等特点。如果对病菌防治不力, 常常会使得植株叶片大面积坏死甚至导致整株死亡, 严重影响甜瓜产量和品质。中国甜瓜产区主要的白粉病病原菌为Podosphaera xanthii race 1[3,4,5]。

目前对甜瓜白粉病的防治主要依靠各类化学制剂。然而, 近几年来化学制剂的大量使用, 使得病原菌产生耐药性, 对防治工作造成了极大的困难[6]。甜瓜种质资源丰富, 其中有些品种对白粉病有抗性, 但农艺性状不佳[7]。对这些抗病种质进行发掘与研究, 利用抗性种质进行优良品种的选育, 是甜瓜产业发展的当务之急。目前的育种工作集中在传统杂交方法选育, 但传统的杂交育种耗时费力, 在表型选择上存在局限性, 致使育种工作进展慢[8]。虽然目前甜瓜转基因技术已初具规模[9], 但由于转基因食品安全问题, 依靠转基因技术培育抗性品种的方式目前还有待改进[10]。分子标记辅助育种能够对植物基因型进行直接与准确地检测, 是一种防治甜瓜白粉病病害安全且高效的途径。

开展分子标记辅助育种研究的前提是了解不同抗性品种的遗传规律, 筛选合适的分离群体, 筛选与抗性基因连锁标记。现阶段报道的白粉抗性基因有17个[11,12,13], QTL (quantitative trait loci) 位点有4个[14,15], 其中只有少数抗性基因获得定位, 大部分抗性基因定位还未见报道。此外, 从目前已知的30种抗性品种[4]的研究结果来看, 大部分的抗性品种中的抗性基因还未研究清楚, 因此, 对抗性品种中抗性基因的定位研究工作迫在眉睫。

目前已定位的抗性基因主要集中在甜瓜LGⅡ、LGⅤ和LGⅫ连锁群体上。作者实验室前期工作中已完成了位于LGⅤ的甜瓜白粉病抗性基因Pm-AN的定位[12], 本研究在其基础上对不同甜瓜抗病种质资源进行筛选, 以期获得多态性好、含有非LGⅤ抗性基因的分离群体, 从而进行抗病基因研究。采用χ2测验法, 分析不同分离群体抗、感病植株的分离比, 并结合BSA法和分子标记技术, 进行白粉病抗性基因遗传规律和定位研究, 以期了解几种甜瓜抗性品种所含的抗性基因, 为进一步开展甜瓜白粉病抗性基因定位克隆和抗性甜瓜品种的选育奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料:

14个分离群体为实验室构建保存。用于构Km7、PMR45、WMR29、PI414723、Edisto47, 感病亲本材料哈密瓜K413、“伽师” (JS) 、“皇后” (HH) 均由国家瓜类工程技术研究中心提供。抗性亲本材料红心脆 (HXC) 由新疆哈密瓜研究中心提供。白粉病病原菌P.xanthii race 1采自国家瓜类工程技术研究中心实验田 (新疆昌吉) 。

1.1.2 主要试剂:

CTAB、β-巯基乙醇、PVP40、Tris-HCl、RNase A购自上海生工;用于PCR反应的相关试剂及Marker购自东盛公司;SSR引物由上海生物工程有限公司合成。其余常用试剂均为国产或进口分析纯。

1.1.3 主要仪器:

Tissuelyer-24多样品组织研磨机 (上海, 净信科技) ;TECHNE TC-512 PCR仪 (英国) ;ECP3000三恒电泳仪 (中国北京) 。

1.1.4 培养基:

0.7%的琼脂糖 (含50mg/L的Benzimidazole保鲜剂) , 试剂均购自东盛公司。

1.2 方法

1.2.1 非Pm-AN抗白粉病基因分离群体的初选

种植构建好的14个分离群体各20株幼苗, 然后进行初步筛选。采用叶片法[11]接种甜瓜白粉病病原菌P.xanthii race 1 (每个分离群体随机选择8~12株个体) , 培养皿28℃光照培养箱培养14d后统计结果。参照李荣华等方法[16], 提取各分离群体的单株基因组DNA。用标记CMCTN2和MU12扩增单株, 参照熊丽曼等方法[17]电泳检测筛选含非该基因位点的白粉病抗性基因的分离群体。

1.2.2 白粉病抗性基因遗传关系分析

分别种植分离群体HH×Edisto47×HH♂ (98株) , Y13×HXC F2 (90株) 、K413×PMR45 F2 (96株) 、HXC××JS♀×JS (198株) 以及Km7×K413♀F2 (100株) 。单株接种白粉病病原菌P.xanthii race 1, 28℃光照培养箱培养14d后, 采用χ2测验对分离群体抗、感植株分离比进行统计学分析, 研究各分离群体所含白粉病抗性基因的遗传规律。

1.2.3 白粉病抗性基因初步定位

分别从HH×Edisto47×HH♂、Y13×HXC F2、K413×PMR45 F2、HXC××JS♀×JS和Km7×K413♀F2这5个分离群体中选择抗病感病植株各20株 (不足20株的选15株) , 提取叶片基因组。通过BSA (Bulked Segregation Analysis) 法构建各分离群体的抗病池、感病池。在LGⅡ、LGⅤ和LGⅫ连锁群上选择SSR分子标记, 分别对各分离群体的抗病池、感病池进行PCR扩增和电泳检测, 然后进行白粉病抗性基因位点研究。

1.2.4 初步定位结果的验证

以K413×PMR45 F2分离群体为例, 在初步定位的连锁群上, 扩大标记范围对初步定位结果进行验证。选择位于LGⅡ上的32个分子标记, 对分离群体的抗病池、感病池进行PCR扩增和电泳检测。

2 结果与分析

2.1 非Pm-AN抗白粉病基因分离群体的初步筛选

对14个分离群体分别接种白粉病, 然后统计各分离群体中的个体抗感反应结果 (图1) 。分离群体中K413×PI414723×K413♂和Y22×JS♀×JS的抗性亲本为PI414723和Y22。这两个抗性品种的抗性基因研究较为清楚, 因此在本实验中作为对照来证明采用8~12个样本即可进行初步分析。

分离群体K413×WMR29×K413和K413×XL×K413对白粉病分别表现出全抗病和1株感病。这两个分离群体由于感病株少不利于分析, 因此, 不适于研究抗性亲本WMR29和XL中的抗性基因。分离群体XF4♀×JS×JS♂和JS×XL♀×JS♂对白粉病病原菌表现出全感病, 这可能是由于在杂交构建分离群体的过程中, 这两个群体受到了感病亲本JS遗传背景的干扰, 使得抗性亲本的抗性基因失活。因此, 这两个分离群体也不适用于研究白粉病抗性基因。采用与Pm-AN紧密连锁的SSR标记CMCTN2和MU12对剩余8个分离群体进行单株PCR扩增和初步筛选 (图2) 。

电泳检测结果表明:抗性基因位于LGⅤ的是GM×JS F2, 不在LGⅤ的是K413×Edisto47 F2、HH×Edisto47×HH♂、K413×HXC F2和HXC×JS♀×JS, 不确定的分离群体是K413×PMR45×K413♂和K413×Edisto47 F2 (图2) 。为了研究抗性亲本Edisto47、HXC、PMR45和Km7中的甜瓜白粉病抗性基因, 选择HH×Edisto47×HH♂、Y13×HXC F2、K413×PMR45F2、HXC×JS♀×JS和Km7×K413♀F2这5个分离群体, 扩大分离群体个体数, 进行进一步研究。

2.2 白粉病抗性基因遗传关系分析

分别种植5个分离群体, 接种病原菌, 于28℃光照培养箱培养14d后, 统计分离群体抗病植株、感病植株的分离比, 进行χ2检验。结果如表1所示:以抗性亲本PMR45和Km7分别与感病亲本K413构建的两个F2分离群体均符合单显性基因的遗传规律3:1 (χ2=0.133, P=0.72;χ2=2.07, P=0.15) 。抗性亲本HXC与感病亲本Y13构建的F2分离群体不符合单显性基因的遗传规律。抗性亲本Edisto47与感病亲本HH以及抗性亲本HXC与感病亲本JS分别构建的BC1分离群体不符合单显性基因的遗传分离比1:1, 其中Edisto47构建的群体符合双基因的遗传规律3:1 (χ2=0.122, P=0.73) 。

R表示抗病植株;S表示感病植株;P>0.05。R (resistant plants) ;S (susceptible plants) ;P>0.05.

2.3 白粉病抗性基因定位

对5个分离群体进行SSR标记PCR扩增检测。统计5个分离群体抗病池、感病池电泳检测结果 (表2) 。5个分离群体中, 与K413×PMR45 F2和Km7×K413♀F2这两个分离群体连锁的标记集中在LGⅡ, 推测其白粉病抗性基因位于LGⅡ。抗性亲本HXC可能含有两个抗性基因位点, 位于LGⅤ和LGⅫ。在3个连锁群上所选择的分子标记中没有检测到与分离群体HH×Edisto47×HH♂所含白粉病抗性基因连锁的标记, 这需要扩大标记范围进一步验证。

本实验中发现, 相同抗性亲本, 与不同的感病亲本杂交组合, 分离群体中的抗性基因表现不同。例如, Y13×HXC F2分离群体中连锁的标记集中在LGⅫ, 而HXC×JS♀×JS中连锁的标记集中在LGⅤ。这可能是由于感病亲本Y13 (薄皮品种) 和JS (厚皮品种) 遗传背景相差大, 在杂交构建分离群体过程中对抗性亲本HXC中的抗性基因存在不同的影响, 使其在抗病感病植株分离比以及标记扩增检测中呈现出不同的结果。在构建分离群体研究抗性基因过程中, 亲本材料之间也有很大的区别。抗性亲本HXC中所含的抗性基因较为复杂, 易受微效基因影响, 与感病甜瓜品种杂交后分离后代感病植株多 (分离群体K413×HXC F2、Y13×HXC F2、HXC××JS♀×JS的R:S值分别为3:6;17:73;53:145) 。在杂交组合构建分离群体时, 感病亲本JS中所含有的与白粉病抗病基因相互作用的微效基因对抗性基因有不同的影响。例如在K413×XL×K413中, 9株植株中有1株感病, 而JS×XL♀×JS♂和XF4♀×JS×JS♂全感病。因此在对农艺性状好的新疆优质种JS进行品种改良时, 需要选择抗性基因较为稳定的抗性亲本进行杂交选育, 否则抗性基因无法起到其预期效果。

S代表感病池, R代表抗病池;-代表SSR标记无多态;A代表单一高带;B代表单一低带;H代表杂合。R:resistant pool;S:susceptible pool;-:No polymorphism A:homozygous for high band;B:homozygous for low band;H:heterozygous.

2.4 初步定位结果的验证

扩大标记范围进一步验证K413×PMR45 F2分离群体中的抗性基因是否位于LGⅡ。采用32个SSR标记对分离群体中的抗病池和感病池进行PCR扩增检测。电泳检测结果表明与K413×PMR45 F2分离群体中抗性基因连锁的标记有2-1、2-3、2-6、2-9、2-19、2-20、2-21、2-22、2-23、2-26、2-29、2-31 (图3) 。此外, 加上初步筛选出的CMGA36、CM-BR008、CMAGN16标记这三个标记, 在LGⅡ上一共有15个分子标记与该分离群体中的白粉病抗性基因连锁。这一结果表明其抗性基因位于LGⅡ。

3 讨论

近几年来, 从不同的甜瓜白粉病抗病种质资源中, 陆续发现了不同的抗性基因。研究者对于这些抗性基因的遗传规律存在不同观点, 有些研究学者支持单显性基因、不完全显性基因、双基因理论[14,15], 也有些研究者支持多基因及修饰基因理论[7,18]。2002年已发表的14个甜瓜白粉病抗性基因都是显性基因[19]。本研究中, 以抗性亲本PMR45和Km7分别与感病亲本K413构建的两个分离群体均符合单显性基因的遗传规律。对于不符合单基因孟德尔遗传规律的抗病分离群体, 可能属于以下3种情况: (1) 抗性亲本含有多个抗病因子, 遗传规律复杂。 (2) 白粉病抗性基因遗传中存在偏分离现象, 使得分离比不符合理论值[12]。 (3) 抗性亲本存在修饰基因, 受环境影响有不同表达。本研究中, 由于抗性实验在培养箱中接种、培养, 因此其湿度、光照强度、植株密度以及通风等环境因素与田间不同, 植株长势也不同, 这对分离群体抗性分离比有一定的影响。

目前, 已被定位的甜瓜白粉病抗性基因主要在LGⅡ、LGⅤ和LGⅫ这3个连锁群上[8], 如甜瓜材料PI 414723中的Pm-x[11]和甜瓜材料K7-1中的Pm-2F[8]定位于LGⅡ, 甜瓜材料WMR29中Pm-w、TGR-1551[20]中的Pm-R以及Ano2[12]中Pm-AN定位于LGⅤ。本实验结果表明, 抗性种质PMR45和Km7白粉病抗性基因位于LGⅡ。GM白粉病抗性基因位于LGⅤ。HXC含有两个抗性基因位点, 位于LGⅤ和LGⅫ。这些抗性基因与已报道的抗性基因的关系还需要进一步研究。Mc Creight等认为不同的抗白粉病基因对白粉病不同生理小种的抗性不同, 抗性基因推广利用的范围就有所不同[21]。例如, 有些抗病基因抗性谱较广, 抗病能力强且不易受环境条件影响, 在生产上具有巨大的应用潜力。因此研究多种抗性品种, 筛选出多种抗性基因, 对甜瓜白粉病抗性研究具有重要意义。本实验对4种抗性品种所含抗性基因的遗传规律及其所属连锁群的研究, 为今后PMR45、Km7、GM、HXC中白粉抗性基因精细定位奠定了基础并对于将这些抗性种质资源应用于甜瓜品种改良有一定的理论指导意义。

摘要：目的:研究4种甜瓜白粉病抗性品种对白粉病Podosphaera xanthii race 1的遗传规律, 对相应抗性基因进行定位。方法:采用χ2测验法, 分析不同分离群体抗、感病植株的分离比, 研究其抗性基因的遗传规律。利用BSA (Bulked Segregation Analysis) 法并结合SSR (Simple Sequence Repeat) 分子标记技术, 对甜瓜抗性基因进行定位。结果:①抗性亲本PMR45和Km7符合单显性基因的遗传规律 (χ2=0.133, P=0.72;χ2=2.07, P=0.15) 。抗性亲本Edisto47和红心脆 (HXC) 均不符合单基因遗传规律, 其中Edisto47构建的群体符合双基因的遗传规律 (χ2=0.122, P=0.73) 。②抗性亲本PMR45和Km7的抗性基因定位于LGII。抗性亲本HXC含有两个抗性基因位点, 位于LGⅤ和LGⅫ上。结论:研究了4种白粉病抗性品种所含抗性基因的遗传规律和定位情况, 为甜瓜白粉病抗病基因的定位克隆与分子标记辅助育种奠定了基础。