动物免疫抑制研究

动物免疫抑制研究（通用7篇）

动物免疫抑制研究 篇1

摘要：近年来, 我国的畜牧业中由于盲目使用抗菌药物、饲料中霉菌毒素过多以及免疫抑制性疾病的频频出现, 导致动物的免疫抑制越来越严重, 经常会出现禽畜大量发病的现象, 严重时甚至会造成禽畜的大批死亡, 给畜牧生产带来了极大损失, 严重影响了我国畜牧业的健康发展。为此本文主要分析了动物免疫抑制产生的原因、机理以及消除动物免疫抑制的主要方法, 希望可以给当前的畜牧业生产提供参考。

关键词：动物免疫抑制,机理,研究

1 动物机体免疫抑制的产生原因及机理

动物机体产生免疫抑制的原因很多, 包括内因和外因。在生产实际中, 导致免疫抑制的原因主要有以下几个方面。

(1) 免疫抑制性疾病导致机体免疫抑制。免疫抑制性疾病主要由病毒、细菌和其他致病微生物引起。现已证实的免疫抑制性致病微生物有多种, 引起猪免疫抑制的常见病原有猪圆环病毒2型 (PCV-2) 、猪伪狂犬病病毒 (PRV) 、猪瘟病毒 (CS-FV) 等病毒, 猪肺炎支原体、胸膜肺炎放线杆菌、副猪嗜血杆菌等细菌和附红细胞体等[1], 这些病原主要侵害猪的免疫器官和免疫细胞, 抑制或减弱猪只体液免疫应答和细胞免疫应答, 使猪体抗病能力显著减弱, 健康水平下降, 增加对其他致病微生物的易感性, 导致低致病力的病原体或弱毒疫苗的感染发病。

(2) 饲料霉菌毒素造成机体免疫抑制。霉菌毒素的核心危害是对免疫系统的破坏及对免疫应答的强烈抑制, 可表现为降低T淋巴细胞和B淋巴细胞的活性, 抑制抗体的产生, 降低补体和干扰素的活性, 损害巨噬细胞的活性。

(3) 药物导致机体免疫。抑制长时间、大剂量不合理的使用药物, 常可造成动物机体免疫抑制。如地塞米松等糖皮质激素类药物、氯霉素类药物、四环素类药物和磺胺类药物等常可导致机体免疫抑制。卡那霉素和庆大霉素对T、B淋巴细胞的转化有明显的抑制作用;地塞米松可阻碍浆细胞产生抗体, 引起淋巴组织萎缩, 抑制淋巴细胞及干扰补体参与免疫反应。

(4) 营养因素导致免疫抑制。免疫器官的发育和功能的正常发挥都依赖于均衡的营养, 免疫系统的作用在很大程度上依赖于日粮条件。所以, 无论缺乏常量营养物质 (能量、蛋白) , 还是缺乏必需的微量营养物质 (维生素、矿物质、微量元素和必需氨基酸) , 都会对动物机体免疫系统产生负面影响。

(5) 应激因素导致机体免疫。研究证明, 应激可使淋巴细胞对环境破坏的敏感性升高[2]。慢性应激会使猪长期维持高水平副肾皮质激素, 进而抑制免疫力。在管理不当, 过冷、过热, 断奶、仔猪去势、长途贩运, 母猪生产繁殖等应激状态下, 禽畜体内会产生热应激蛋白等异常代谢产物, 同时某些激素 (如类固醇) 水平也会大幅提高, 进而影响淋巴细胞的活性, 引起明显的免疫抑制, 造成免疫器官不同程度的损伤。

2 缓解和消除动物免疫抑制的措施

(1) 加强饲养管理。搞好圈舍的环境卫生, 控制好环境温度, 加强地面和空气的科学消毒工作, 尤其应搞好产房及幼龄动物圈舍的环境卫生和消毒工作, 防止早期感染免疫抑制性疾病。不同日龄动物要分开饲养, 同时饲养密度要合理, 避免过分拥挤, 减少交叉哺乳, 提高断奶日龄均匀度, 防止应激的产生。饲养时尽量采用“分阶段、全进全出”的饲养模式, 并且在每次转群或出售动物后, 空圈舍严格消毒。保证圈舍良好的通风, 防止有害气体过多损伤动物呼吸道黏膜, 减少支原体、放线杆菌、流感病毒、蓝耳病病毒等可导致动物机体免疫抑制的病原体感染[3]。

(2) 均衡营养。注意均衡动物营养, 提高自身免疫力。特别是加强饲料中能改善动物机体免疫功能的核心营养成分的供给, 防止由于其缺失而造成免疫抑制。提高饲料质量, 保证产生抗体和细胞因子所需的蛋白质, 通过提高禽畜的蛋白质、氨基酸、维生素和微量元素等水平, 避免禽畜营养不良或患有慢性营养消耗性疾病所导致的免疫反应低下, 对疫苗免疫应答降低。

(3) 消除诱因。在畜禽的饲养管理中, 应尽可能的消除或减少各种应激因素;不盲目使用抗菌药物、激素类药物、化学类药物;防止动物饲料霉变, 尽可能地减轻霉菌毒素对动物的影响。

3 总结

免疫抑制疾病在畜牧业生产中广泛存在, 只有加强对免疫抑制疾病的研究, 找出致病原因, 研发更好的治疗免疫抑制疾病的药物, 才能从根本上预防免疫抑制疾病的发生。

参考文献

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动物免疫抑制研究 篇2

1 材料与方法

1.1 动物

雌性普通级昆明种小鼠40只,体重(20±2)g,购于郑州大学医学院实验动物中心,合格证号SCXK(豫)2010-0002。

1.2 仪器

BI-2000医学图像分析系统(成都泰盟科技公司);TDL-40B型低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);DY89-1型电动玻璃匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司);UV-2201紫外-可见分光光度计(日本岛津)等。

1.3 药品及试剂

玉竹饮片购于郑州同盛药业有限公司,经河南中医学院生药学教研室陈随清教授鉴定为百合科植物玉竹Polygonatum odoratum(Mill.)Druce的干燥根茎经加工的饮片。玉竹水煎液;环磷酰胺(江苏恒瑞医药股份有限公司,批号08110921);香菇菌多糖片(湖北广仁药业有限公司,批号080702);植物血凝素(上海伊华医学科技有限公司,批号20085601);瑞氏染液(四川省迈克科技有限公司,批号0908033);柠檬酸钠(天津化学试剂三厂,批号20020228)等。

1.4 样品水煎液及香菇菌多糖溶液的制备

取玉竹饮片50 g,加水煎3次(加水量分别为10,8,6倍量),40 min/次,煎出液合并浓缩至每毫升含1 g饮片;取香菇多糖片0.2752 g,用0.5%羧甲基纤维素钠溶液制成6 g/L的混悬液。储存冰箱中备用。

1.5 方法

1.5.1 巨噬细胞吞噬率、吞噬指数及免疫器官指数的测定

将40只小鼠随机分为四组,每组10只,分别为空白对照组,模型组,玉竹水煎液组,香菇菌多糖阳性对照组。除空白对照组外,其余各组小鼠ip环磷酰胺(Cyclophosphamide,CTX)0.08 g/kg,1次/d,连续3 d。同时ig给药,空白对照组和模型组给予生理盐水,香菇菌多糖阳性对照组给予香菇菌多糖片混悬液0.12 g/kg,玉竹组给予玉竹水煎液12.5 g/kg(1 g饮片浓缩成1 ml),每天给药1次,连续7 d。试验方法参考文献[4],取结果,在显微镜下观察并计算吞噬率及吞噬指数,取小鼠免疫器官称重并计算免疫器官指数[5]。

1.5.2 溶血素及溶血斑形成测定

小鼠分组、造模及给药同1.5.1。实验步骤参考文献[4],以分光光度比色法测定溶血素和溶血空斑的形成情况。

1.5.3 淋巴细胞转化测定

小鼠分组、造模及给药同1.5.1。实验步骤参考文献[4],油镜观察外周血淋巴细胞的转化率。

1.6 统计学处理

用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析,计量资料采用进行表示,行t检验,P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 对环磷酰胺免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能及免疫器官质量的影响

模型组吞噬功能指标及免疫器官指数均明显降低,证明造模成功;与模型组比较,玉竹组及阳性组可明显增强免疫抑制小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬百分率、吞噬指数、胸腺指数及脾脏指数(P<0.01),玉竹组及阳性组在吞噬百分率及吞噬指数上与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

2.2 对环磷酰胺致免疫抑制小鼠溶血素、溶血斑形成及淋巴细胞转化的影响

实验数据表明,模型组与空白对照组的这三个指标比较差异有统计学意义(P<0.01);玉竹组及香菇菌多糖组与模型组的这些指标比较差异有统计学意义(P<0.01),说明玉竹及香菇菌多糖均显著改善这3项指标。与正常组比较,玉竹组在溶血素形成上比较差异有统计学意义(P<0.01),在溶血斑形成及淋巴细胞转化率上作用不显著或有差异。见表2。

*P<0.05,△P<0.01,与正常对照组比较;#P<0.05,★P<0.01,与模型组比较

*P<0.05,△P<0.01,与正常对照组比较;#P<0.05,★P<0.01,与模型组比较

3 讨论

玉竹属于补虚药,研究发现补虚药可以增强机体免疫功能,对于防止机体免疫功能低下及肿瘤、感染性疾病等具有重要的意义[6]。本实验通过对免疫低下小鼠各免疫指标的测定来研究玉竹饮片的药理作用,实验结果显示玉竹饮片对免疫抑制小鼠各指标均起到正相关的作用,且差异显著,说明玉竹饮片能够显著提高小鼠细胞免疫、体液免疫及非特异性免疫功能。本研究表明玉竹能明显对抗环磷酰胺所致的小鼠免疫功能低下,对机体免疫多个环节均有明显促进作用,从理论上证明了玉竹饮片增强免疫作用的药理作用。玉竹组在胸腺、脾脏指数,溶血素、溶血斑形成及淋巴细胞转化率等免疫指数上不及空白对照组或与空白对照组相当,这可能与玉竹组小鼠造模,并且用药时间不够长有关[7,8]。有研究表明,玉竹多糖、玉竹皂苷均具有增强小鼠免疫作用[3],然而玉竹提高机体免疫是否只有这两成成分,或者是更多中化学成分的加和有待进一步研究。

摘要：目的:研究玉竹对免疫功能的影响。方法:将昆明种小鼠分为空白对照组、模型组、玉竹水煎液组及香菇菌多糖阳性对照组,腹腔注射给药环磷酰胺3d造成小鼠免疫抑制模型,同时分别灌胃给药生理盐水及相应药物7d后测定玉竹对小鼠胸腺、脾脏质量、吞噬百分率、吞噬指数、溶血素、溶血斑以及淋巴细胞转化率的影响。结果:玉竹能提高环磷酰胺造成免疫抑制模型小鼠胸腺、脾脏质量、吞噬百分率、吞噬指数,促进溶血素、溶血斑形成,提高淋巴细胞转化率;与模型组相比可提高免疫抑制小鼠各免疫指数,比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:玉竹具有增强免疫作用的功能。

关键词：玉竹,免疫,药理

参考文献

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动物免疫抑制研究 篇3

FTY720是冬虫夏草分离出的活性成分ISP-1[1]，经去除手性中心，改变侧链得到的氨基丙二醇化合物[2]，目前主要用于抑制器官移植所引起的排斥反应[3]，有研究发现，它可用于治疗某些原发性及转移性癌症[4]。本实验对FTY720对小鼠免疫抑制及抗肝移植瘤作用进行研究，从而为临床治疗肝癌后肝移植提供理论基础和实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物与细胞株：实验动物为4周龄雌性清洁级（SPF)C57BL/6j小鼠，购自北京中科院试验动物中心，饲养于山西医科大学试验动物中心。Hepa1-6肝癌细胞购自中国科学院。

主要试剂：FTY720（南京安格医药化工有限公司），RPMI1640培养基、胎牛血清（美国GIBCO公司），兔抗鼠Bcl-2单克隆抗体（编号BAO412，批号20081003）、兔抗鼠Caspase-3单克隆抗体（编号BAO588，批号20081003）、凋亡的原位末端标记（TUNEL）检测试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型建立

Hepa1-6细胞传代3～4次后，取指数生长期细胞，PBS重悬，浓缩为2×107/ml，按0.1 ml/只的量接种于C57BL/6j小鼠腰胁部皮下。当C57BL/6j小鼠移植瘤直径至0.30 cm，将40只成瘤小鼠随机分为4组，分别做如下处理，环孢素组：环孢素10 mg/(kg·d)灌胃；FTY720组：FTY720 3 mg/(kg·d)灌胃[3 mg/(kg·d)为FTY720作为免疫抑制剂的常用剂量[5];5-Fu组：5-Fu 50 mg/(kg·d)灌胃；生理盐水组：0.9%氯化钠注射液1 mg/(kg·d)灌胃。连续灌胃10 d，给药结束次日处死小鼠，剥离瘤体。

1.2.2 外周血T淋巴细胞百分比测定

连续给药10 d，于末次给药后1 h，剪鼠尾取血涂片，自然干燥后，浸入37℃孵育液（已预热30 min）中孵育3 h，自来水冲洗，加1%孔雀绿溶液染色8 s，自来水冲洗，晾干后油镜检查，每只小鼠血涂片标本均查100个淋巴细胞，计算T淋巴细胞的百分比。

1.2.3 胸腺、脾指数测定

连续给药10 d，末次给药后次日称重，麻醉下眼眶放血处死，剥取胸腺、脾，电子天平称重，计算胸腺（脾）指数=[胸腺（脾）重量（mg）/体重（g）]。

1.2.4 肿瘤体积测定

用游标卡尺测定肿瘤最长径（a）和最短径（b），以公式V=π/6ab2计算肿瘤体积。

1.2.5 周围血甲胎蛋白（AFP）测定

处死前，采用摘眼球采血的方法获得血液，用生化法检测AFP的分泌量。

1.2.6 原位细胞凋亡检测

参照TUNEL检测说明书，组织切片逐级脱蜡，水化，蛋白酶K消化后，分别与TUNEL反应混合液及转化剂POD 37℃孵育，DAB显色，对比染色，脱水、透明后封片观察。实验同时设阳性和阴性对照，普通光镜下观察，随机选取5个高倍视野，计数1 000个细胞，计算阳性细胞数占肿瘤细胞的百分比，作为凋亡指数（apoptosis index,AI）。

1.2.7 免疫组化SABC法检测Bcl-2和Caspase-3

切片常规脱蜡至水，滴加3%H2O2室温10 min，蒸馏水洗3 min×3次，微波修复抗原，滴加5%BSA血清封闭液，室温20 min，滴加一抗（兔抗鼠Caspase-3、Bcl-2 IgG),37℃孵育120 min,PBS洗2 min×3次，滴加二抗（生物素标记山羊抗兔IgG),37℃孵育20 min,PBS洗2 min×3次，滴加试剂SABC,37℃反应20 min,PBS洗5 min×4次，DAB显色，蒸馏水洗涤，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片，显微镜观察。在100倍光学显微镜下观察，随机选择5个视野，采用JEOA801D 610图像分析软件测定阳性细胞的平均光密度（OD）值。

1.3 统计学方法

数据以均数±标准差（±s）表示，组间数据比较采用t检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 实验动物数量分析

参加实验的40只小鼠全部进入结果分析，没有脱失。

2.2 各药物组小鼠胸腺、脾指数以及外周血T淋巴细胞百分比的检测

见表1。

与生理盐水组比较，aP<0.05,bP<0.01

表1结果表明，与生理盐水组比较，环孢素组和FTY720组可显著降低小鼠胸腺及脾指数，降低小鼠外周血T淋巴细胞百分比，差异有显著性；而5-氟尿嘧啶组差异无显著性。

2.3 各药物组小鼠瘤体体积、甲胎蛋白及凋亡指数的检测

见表2、图1。

与生理盐水组比较，aP<0.05,bP<0.01

（A：生理盐水组；B:5-氟尿嘧啶组；C：环孢素组；D:FTY720组）

以上结果表明，与生理盐水组比较，5-氟尿嘧啶组和FTY720组可显著减小肿瘤体积、减少甲胎蛋白的分泌量、增加凋亡指数，差异有显著性；而环孢素组差异无显著性。

2.4 各药物组小鼠瘤体Bcl-2及Caspase-3表达的检测

见表3、图2。

与生理盐水组比较，aP<0.05,bP<0.01

（A：生理盐水组；B:5-氟尿嘧啶组；C：环孢素组；D:FTY720组；SP×400)

以上结果表明，与生理盐水组比较，5-氟尿嘧啶组和FTY20组可显著降低Bcl-2的表达，差异有显著性；而环孢素组差异无显著性。与生理盐水组比较，5-氟尿嘧啶组可显著降低Caspase-3的表达，差异有显著性；而FTY720组和环孢素组差异无显著性。

3 讨论

小鼠Hepa1-6肝癌细胞是由C57BL/6j小鼠正常上皮细胞诱导纯化而成，源自C57BL/6j小鼠BW7756肝癌细胞株的一个衍生物，该细胞株低表达MHC类分子和B-7分子，恶性度高而免疫原性弱[6]。另外，本研究以C57BL/6j小鼠为接种对象，保证了肿瘤细胞和荷瘤宿主的同源性，保证肿瘤模型建立的可行性以及消除免疫排斥造成的偏倚。

本实验结果表明，FTY720和环孢素能降低胸腺、脾指数和T淋巴细胞百分比，表明它们具有免疫抑制作用。5-氟尿嘧啶和FTY720能减小肿瘤体积、减少甲胎蛋白的分泌量、增加凋亡指数，表明它们有抗肿瘤作用。

与FTY720组相比，5-氟尿嘧啶组可显著减小肿瘤体积、减少甲胎蛋白的分泌量、增加凋亡指数，差异有显著性（P<0.05），并不表示5-氟尿嘧啶的抗肿瘤作用强于FTY720，机体的抗肿瘤免疫反应主要是细胞免疫，其效应细胞有CTL细胞、自然杀伤细胞和巨噬细胞等。免疫功能低下者，恶性肿瘤的发生率明显增加，免疫抑制作用同时也抑制机体的抗肿瘤作用。本研究所反映FTY720的抗肿瘤作用是免疫抑制作用与抗肿瘤作用共同作用的结果。与环孢素组相比，FTY720组能显著降低小鼠胸腺指数、脾指数以及T淋巴细胞百分比，差异有显著性（P<0.05），而且可显著减小肿瘤体积、减少甲胎蛋白的分泌量、增加凋亡指数，差异有显著性（P<0.05）。由此可见，FTY720在免疫抑制作用方面及抗肿瘤方面都优于单纯免疫抑制剂环孢素。

FTY720能使Bcl-2的表达降低，而不能使Caspase-3的表达显著升高。Bcl-2是一种原癌基因，可以阻断细胞程序化死亡的公共信号传导通路。因此，FTY720的抗肿瘤作用与Bcl-2的表达降低有关。

有研究表明，FTY720免疫抑制作用主要通过阻滞鞘氨醇-1-磷酸盐（S1P）受体起作用，在体内主要经鞘氨醇激酶-2作用转化成单磷酸酯化合物（FTY720-P）发挥作用[7]。FTY720应用于肝移植后患者，能大大改善其存活时间[8]。Kohno等[9]报道，FTY720可诱导加快膀胱癌、乳腺癌和胶质瘤等癌细胞的凋亡。Haruhito等[10]研究发现，FTY720呈剂量依赖性诱导乳腺癌细胞系生长停滞和凋亡。

综上所述，FTY720同时具有免疫抑制作用和抗肿瘤作用。免疫排斥和肿瘤复发是肝癌后肝移植的两大难题，也是肿瘤移植治疗的两大难题。由此可见，FTY720在肿瘤的移植治疗中有广阔的应用前景。

摘要：目的:探讨FTY720的免疫抑制作用及其对小鼠肝移植瘤的抑制作用。方法:小鼠肝癌Hepa1-6细胞按2×106/只的量接种于C57BL/6j小鼠皮下。当C57BL/6j小鼠移植瘤直径至0.30cm,将40只成瘤小鼠随机分为4组,分别用以下药物灌胃10d,环孢素组:环孢素10mg/(kg·d);FTY720组:FTY7203mg/(kg·d);5-氟尿嘧啶(5-Fu)组:5-Fu50mg/(kg·d);生理盐水组:0.9%氯化钠注射液1mg/(kg·d)。检测胸腺、脾指数、外周血T淋巴细胞计数、肿瘤体积、外周血甲胎蛋白、凋亡指数、瘤体Bcl-2和Caspase-3的表达。结果:环孢素组和FTY720组胸腺、脾指数及T淋巴细胞百分比低于生理盐水组(P<0.05,P<0.01);而5-氟尿嘧啶组与生理盐水组比较,差异无显著性(P>0.05);5-氟尿嘧啶组与FTY720组肿瘤体积与甲胎蛋白含量低于生理盐水组(P<0.05,P<0.01),凋亡指数高于生理盐水组(P<0.05,P<0.01);而环孢素组与生理盐水组比较,差异无显著性(P>0.05);5-氟尿嘧啶组和FTY720组小鼠瘤体Bcl-2的表达低于生理盐水组(P<0.05),而环孢素组与生理盐水组比较,差异无显著性(P>0.05);5-氟尿嘧啶组小鼠瘤体Cas-pase-3的表达低于生理盐水组(P<0.01);而FTY720组和环孢素组与生理盐水组比较,差异无显著性(P>0.05)。结论:FTY720同时具有免疫抑制作用和抗肿瘤作用,而其抗肿瘤作用与Bcl-2的表达降低有关。

关键词：免疫抑制作用,抗肿瘤作用,FTY720,Bcl-2,Caspase-3

参考文献

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动物免疫抑制研究 篇4

念珠菌易侵犯呼吸道, 致使肺部念珠菌感染发生增多[2]。支气管、肺念珠菌病的感染系从口腔直接蔓延或经血行播散而来, 多为继发感染, 临床表现为慢性支气管炎、肺炎或类似肺结核的空洞形成, 主要症状包括低热、咳嗽、痰少而粘稠, 或粘液胶质样不易咳出, 有时带血丝甚至咯血。损害扩展时症状加重, 出现高热、胸痛甚至胸腔积液、呼吸困难[1]。本课题组通过建立免疫抑制小鼠肺白色念珠菌病动物模型, 模拟白色念珠菌经口腔直接蔓延所致肺念珠菌病, 研究肺白色念珠菌病的肺部病理改变。

1 材料与方法

1.1 从临床重症病人体内分离、鉴定、纯化白色念珠菌

患者为南阳医专一附院儿科新生儿, 诊断为新生

儿肺炎, 持续发热10 d, 抗生素治疗无效, 遂于当天上午抽血, 用生物梅里埃公司生产的小儿中和抗生素需氧血培养瓶, 放入Bact/ALERK全自动血培养仪 (生物梅立埃中国有限公司生产) 中培养, 经24 h该仪器显示该标本阳性。转种血平皿, 35℃培养24 h可见血平板上长出中等大小、乳白色湿润菌落。涂片革兰染色镜检, 可见厚膜孢子。该真菌芽管试验阳性, 初步鉴定为真菌。进一步鉴定, 科玛嘉念珠菌显色板培养菌落呈绿色, 鉴定为白色念珠菌。后经糖发酵实验发现, 葡萄糖、麦芽糖、蔗糖为阳性, 乳糖阴性;糖同化实验发现, 葡萄糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖为阳性, 乳糖阴性;确定为白色念珠菌。

1.2 用纯化菌种制备菌液

在超净工作台上从血平板上挑取单个菌落, 用灭菌生理盐水在无菌管中制备成2.0×109CFU/mL的菌液。整个过程注意无菌操作, 防止杂菌进入。

1.3 动物分组并制备免疫抑制小鼠

选择昆明种清洁级小鼠 (武汉乔和动物养殖中心提供) 100只, 体重25±3 g, 不分雌雄, 随机分为5组, 每组20只。其中4个组 (80只) 于第1天、第3天、第5天、第7天、第9天给小鼠背部皮下注射环磷酰胺100 mg/kg, 制备免疫抑制小鼠。

1.4 建立免疫抑制小鼠肺白色念珠菌病动物模型

第1组为对照组, 健康小鼠正常条件下气道给菌;第2组为免疫抑制小鼠, 气道接种给菌法接种白色念珠菌;第3组为免疫抑制小鼠, 口饲给菌法接种白色念珠菌;第4组为免疫抑制小鼠, 腹腔注射方式给菌;第5组为免疫抑制小鼠, 尾静脉注射方式给菌。第3天开始5个组同时按不同的方式每天给菌, 菌量为0.01 mL/只。

1.5 制做肺组织切片

于第3天起每天用颈椎脱臼法处死各组小鼠2只, 检查肺脏大小、颜色, 取肺脏用10%的福尔马林固定, 经酒精逆行梯度脱水、二甲苯透明、常规石蜡包埋、德国美康切片机5μm连续切片、HE染色, 用显微镜观察肺组织病理学变化。

2 结果

2.1 给菌后小鼠症状

白色念珠菌感染后小鼠出现行走减慢直至行动困难、精神萎靡不振、相互打斗嬉闹现象减少至消失、嗜睡、钻入笼底垫料内静卧、饮水及饮食不佳、呼吸困难、气喘。

2.2 肉眼观察

对照组健康小鼠出现1例肺部病变;第2组 (免疫抑制小鼠气道接种组) 小鼠口腔、鼻腔粘膜及鼻外周部可见块状白色炎性假膜, 20只小鼠处死后解剖可见全部出现肺脏体积增大、肺切缘呈钝角、颜色苍白、表面多个粟粒状灰白色斑点, 其他内脏无异常。

2.3 镜下观察

第1组对照组健康小鼠肺组织肺泡结构清晰, 肺泡腔内未见渗出, 间隔无增生。第2组小鼠在给菌后第9天处死, 肺组织镜下显示肺泡壁毛细血管高度扩张充血, 肺泡间隔增宽, 间质水肿;肺泡腔扩张, 肺泡上皮增生和空泡变性, 肺泡腔内充满淡红色水肿液。在肺泡壁毛细血管内及肺泡腔内可发现颜色发黑的菌丝、厚膜孢子团状物。肺组织可见灶状坏死及淋巴细胞浸润, 并有单核吞噬细胞吞噬现象。

2.4 死亡情况

第3组、第4组、第5组小鼠在第3天开始出现自然死亡。第3组小鼠处死后解剖可见胃肠胀气, 内有淡黄色乳糜粥样脓性物质;有5只小鼠伴有肺部病理改变。第4组小鼠处死后解剖可见肠管颜色黯淡发黑, 有少量渗出, 并伴有难闻臭味;有3只小鼠伴肺部病理改变。第5组小鼠处死后解剖可见肝脾肿大及肾脏病理改变, 有12只小鼠伴肺部病理改变。

3 讨论

本实验研究发现, 气道给菌法完全模拟了临床病人感染念珠菌性肺炎的感染途径, 避免了其它方法所致的其它脏器的病变, 也避免了小鼠因其它脏器衰竭所致死亡。本实验是抑制了小鼠免疫系统后由呼吸道接种白色念珠菌, 由于属初次感染, 且处死小鼠过早, 所以只能见到肺部炎症反应, 未见到细胞免疫应答所致肉芽肿, 但发现有淋巴细胞浸润, 免疫组化法测定有T细胞参与。

该实验建立了肺白色念珠菌病小鼠模型, 为参与肺白色念珠菌病的细胞因子研究提供了平台, 也为肺白色念珠菌感染机制、致病力、生物学性状、治疗、抗真菌药物的疗效研究提供了平台。

摘要：目的:通过建立免疫抑制小鼠肺白色念珠菌病动物模型, 研究肺念珠菌病病理改变, 探讨念珠菌致肺部病理改变的机制。方法:从临床重症病人体内分离、鉴定、纯化白色念珠菌, 并制备成2.0×109CFU/mL菌液;免疫抑制小鼠后经气道接种法、口饲给菌法、腹腔注射法、尾静脉注射法建立小鼠肺部感染白色念珠菌病模型, 观察小鼠临床症状, 并用颈椎脱臼法处死小鼠, 解剖观察并取材, 经病理切片观察肺部病变。结果:白色念球菌感染后小鼠出现异常行为, 肉眼观肺脏体积增大、肺切缘呈钝角、颜色苍白、表面多个粟粒状灰白色斑点, 镜下可见肺泡壁毛细血管高度扩张充血、肺泡间隔增宽、间质水肿、肺泡腔扩张、肺泡上皮增生和空泡变性、肺泡腔内充满淡红色水肿液。结论:可通过免疫抑制小鼠气道接种白色念珠菌法获取肺白色念珠菌病动物模型, 用于研究肺部白色念珠菌致病理改变的机制。

关键词：免疫抑制,小鼠,白色念珠菌,病理

参考文献

[1]王端礼.医学真菌学实验室检验指南[M].北京:人民卫生出版社, 2005:196-201.

动物免疫抑制研究 篇5

1 传染性法氏囊病(IBD)

1.1 病原学

IBD是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的以感染雏鸡为主的一种急性、热性、高度接触性、免疫抑制性传染病,以法氏囊炎症、坏死、萎缩和法氏囊内淋巴细胞严重损伤为主要特征。IBDV属于双RNA病毒科禽双链RNA病毒属,病毒为球形,无囊膜,单层核衣壳,二十面体立体对称,直径为5~65 nm[1]。IBDV基因组含A、B两个线状双股RNA分子,大小约6.0 kb,编码5种主要蛋白,即VP1~VP5。其中A节段大小为3.2~3.4 kb,编码VP2~VP5;B节段大小为2.8 kb,编码VP1。VP1是与病毒自身复制有关的RNA聚合酶,以基因组连接蛋白(VPg)的形式存在,将A、B 2个节段的末端紧紧相连。VP2和VP3是病毒的主要结构蛋白,其中VP2还是病毒的主要保护性抗原,是IBDV的凋亡因子,基因工程苗主要针对VP2研制[2,3];VP3含群特异性抗原表位及一个次要的中和表位。VP4是与病毒自身蛋白加工有关的蛋白酶,糖皮质激素诱导的亮氨酸拉链可通过VP4诱导抑制Ⅰ型干扰素的表达,并促进IBDV在宿主细胞内增殖[4]。VP5与病毒的释放和宿主体内传播有关。在2个节段的末端均有直接的末端倒置重复序列,对形成茎环二级结构至关重要,毒力的变异也可能与此结构的变异有关[5]。

IBDV有2个血清型,二者抗原相关性小于10%,因此相互交叉保护作用较低。血清1型病毒为鸡源毒株,只对鸡有致病性,鸭和火鸡为亚临床感染。血清1型又分为6个亚型,亚型之间的抗原相关性为10%~70%,有明显差异,这是导致临床上免疫失败的重要原因之一[6],血清2型病毒为火鸡源毒株,尚未发现有致病性。

1.2 致病机理

雏鸡感染IBDV后,病毒在肠道的巨噬细胞及淋巴细胞中复制增殖,随着血流扩散至肝脏和法氏囊,并在法氏囊定居和繁殖,进入部分循环系统,导致初次病毒血症。感染后约11 h,大量病毒从法氏囊释放,随着血液扩散至全身,导致二次病毒血症,并在其他组织中定位。IBDV的靶细胞主要是法氏囊中带有表面免疫球蛋白M(SIg M)的B淋巴细胞,因此通过手术或药物去除法氏囊的鸡对IBDV不敏感。由于病毒在法氏囊内的前淋巴细胞选择性地复制,从而造成免疫抑制;感染鸡因B淋巴细胞受到大量破坏,造成法氏囊萎缩,从而导致体液免疫失败。病毒还与抗体形成免疫复合物,诱导产生趋化因子,引起多种组织的广泛出血和白细胞浸润,以及相应组织的炎性水肿,并造成凝血时间延长[5]。感染雏鸡的法氏囊可增大到正常的5倍大小,水肿并充血,可见条纹;法氏囊的淋巴滤泡坏死或凋亡,鸡死亡时法氏囊可能萎缩;而肾脏通常肿大,并有尿酸盐沉着,肾小球有免疫复合物沉积。某些毒株也损害胸腺、脾脏、盲肠扁桃体及骨髓细胞,致病性越强的毒株损害越大。

2 禽白血病(AL)

2.1 病原学

AL是由反转录病毒科甲型反转录病毒属的禽白血病病毒(ALV)、禽肉瘤病毒(ASV)、禽成髓细胞性白血病病毒(AMV)和Rous肉瘤病毒(RSV)等病毒群引起的禽类多种肿瘤性疾病的统称,以淋巴白血病(LL)最常见。本群病毒又可分为A~J共10个亚型,其中A~D和J亚群为外源性,E亚群为内源性,宿主是鸡,可整合进鸡的染色体中,通常不致病;F、G亚群的宿主为雉;H亚群的宿主为斑鸠;I亚群的宿主为鹌鹑。鸡在临床上常见的为A、B和J亚型[7]。其中A、B亚型最常见,主要引起3月龄以上的鸡发生肿瘤。J亚型于1971年发现,1988年首次从肉鸡中分离获得,近年来我国蛋鸡血管瘤型J亚型白血病发生率明显上升。G.Wang等[8]证实,ALV-J亚型可引起鸡的红细胞增多症。

2.2 致病机理

淋巴细胞在生成数周内细胞分裂活跃,因此作为病毒受体的淋巴细胞更易感。在不同文献中,LL又称淋巴细胞性白血病、淋巴性白血病、淋巴细胞瘤、内脏淋巴瘤和大肝病等[9]。ALV分为外源性和内源性病毒,雏鸡先天性感染外源性非缺陷型ALV时,鸡体对病毒形成免疫耐受,可产生病毒血症,血液含毒量可高达1×109ID50/m L。ALV含有反转录酶,此酶是在病毒复制过程中形成DNA前病毒所必需的;整合到鸡体细胞基因组内的前病毒,在特定条件下细胞癌基因(c-onc)被激活,从而产生肿瘤[5]。缺陷型ALV与外源性非缺陷型ALV共同感染时,可因病毒癌基因(v-onc)不同导致成红细胞增多症、成髓细胞增多症及髓细胞瘤。

3 马立克病(MD)

3.1 病原学

马立克病是由马立克病病毒(MDV)引起的鸡传染性肿瘤性疾病,以外周神经、性腺、虹膜、各种内脏器官、肌肉和皮肤的单核性细胞浸润和肿瘤形成为特征[10]。MDV属于疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科禽疱疹病毒2型,基因组为线状双股DNA,是细胞结合性疱疹病毒,靶细胞为T淋巴细胞。MDV有3个血清型,一般所说的MDV是指1型,为致瘤毒株;2型为非致瘤毒株;3型为火鸡疱疹病毒(HVT),对鸡无致病性,仅对火鸡可致产卵下降[11]。MDV野毒株分为弱毒株(m MDV)和强毒株(v MDV)。1979年R.L.Witter首次分离到超强毒株(vv MDV),1996年又分离到特超强毒株(vv+MDV)。

3.2 致病机理

MDV有与反转录病毒类似的onc基因,与致肿瘤有关[5]。MDV以淋巴细胞为靶细胞,引起淋巴细胞发生变性、坏死、溶解和转化,从而造成感染鸡发生免疫抑制;感染MDV 7 d即可出现早期的免疫抑制,表现为淋巴细胞对Con A和PHA刺激的反应性降低;此时MDV进入淋巴细胞,病毒DNA大量复制并形成核内包涵体,抑制淋巴细胞的正常复制和转录功能[12]。泛素特异性蛋白酶(USP)在MDV复制及其对自然宿主鸡的致病机理中起着重要作用[13]。

4 鸡传染性贫血(CIA)

4.1 病原学

鸡传染性贫血病毒(CIAV)是1979年Yuasa等人首次分离到的,属于圆环病毒科圆环病毒属,是单链环状DNA病毒,只有1个血清型,仅感染鸡,无囊膜。CIAV基因组核酸为单链环状DNA,全长2 298~2 319 bp,内含4~5个21 bp重复序列;病毒可在被感染鸡体内组织器官中复制[5]。CIAV对环境的抵抗力较强,在p H值为3.0的条件下可以保持活性,100℃作用15 min才能使其完全灭活。CIA主要发生于2周龄以内的雏鸡,感染鸡表现为再生障碍性贫血、全身性淋巴组织萎缩及淋巴细胞严重缺失。

4.2 致病机理

不同毒株之间在致病性上有一定差异。雏鸡感染CIAV后,主要侵害骨髓造血组织及胸腺、法氏囊等免疫组织;感染24 h内发生病毒血症,红细胞生成减少,血细胞压积降低;血涂片可见白细胞减少,血液呈水样,凝结缓慢[5];感染6~8 d可引起骨髓的成血细胞和胸腺皮质成淋巴细胞的溶细胞型感染,导致机体严重的淋巴衰竭和骨髓损伤,形成造血功能和免疫功能障碍[12]。CIAV可在MDCC-MSB1细胞、MDCC-BP1细胞和LSCC-1103B1细胞中增殖[1]。随着鸡日龄的增大,抗病力增强。近年来,CIA与IBD混合感染的报道愈发增多。

5 禽网状内皮组织增殖病(RE)

5.1 病原学

禽网状内皮组织增殖病病毒(REV)属于丙型反转录病毒属。自发现RE以来,已分离到30多株REV,均具有相似的抗原性,即属同一个血清型。REV分为3个亚型,亚型1含有A、B、C 3个抗原表位;亚型2含有B抗原表位;亚型3含有A、B抗原表位。REV呈球形,有囊膜,基因组为单股RNA,由60~70 s复合体组成,包括2个30~40 s RNA亚单位。完全复制型REV基因组大小为9.0 kb,缺陷型T株大小仅为5.7 kb。REV含DNA聚合酶及许多多肽,其中有env基因编码的gp90囊膜蛋白和gp20糖蛋白,以及gag基因编码的5种结构蛋白(p12、pp18、pp20、p30和p10,其中p30是主要的群特异性抗原),不同REV的抗血清可互相发生交叉反应[1,5]。

5.2 致病机理

RE在临床上被分为急性网状细胞增生、慢性肿瘤形成和矮小综合征3种病型。REV以淋巴细胞和网状内皮细胞为靶细胞,可严重损害免疫器官,诱发明显的免疫抑制。M.Liang等[14]研究发现,REV可以增强波士杆菌的致病性,造成鸡免疫系统严重紊乱。G.Wang等[15]研究发现:REV感染第7周是淋巴细胞向肿瘤细胞转化的关键时期;REV-JX0927在感染1周左右可诱导网状内皮组织增殖,感染7周以后可诱导淋巴肉瘤;REV对腺胃、肾脏、肝脏、淋巴组织、胰腺、淋巴肉瘤细胞和血管具有高取向性。

6 禽呼肠孤病毒感染(ARI)

6.1 病原学

1954年,J.E.Fahey等人首次从病鸡呼吸道内分离到禽呼肠孤病毒(ARV);1957年,H.S.Olson等人从病鸡滑膜中分离“关节炎病毒”,于1972年被鉴定为ARV。ARV属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属;病毒粒子呈正二十面体立体对称,无囊膜,有双层核衣壳;病毒在细胞浆中复制,常在感染细胞浆中呈晶格状排列。其基因组分为10个片段,70%为双链RNA,30%为单链RNA,有11个血清型[1]。根据致病性可将不同毒株分为3型,1型引发暂时性消化系统紊乱(TDSD),2型引发鸡病毒性关节炎综合征(VAS),3型二者均可发生[5]。

6.2 致病机理

ARV感染在鸡群中普遍存在,常无症状或表现为VAS及TDSD。自然感染后,病毒首先在呼吸道和消化道复制,24~48 h后出现病毒血症,随后向体内各组织器官扩散,以关节腔、腱鞘及消化道的含毒量最高。病毒感染后,细胞可形成合胞体,有胞浆内包涵体。N.Catana等人研究发现,ARV可引起鸡的传染性病毒性腺胃炎。此外,ARV还可引起吸收不良综合征、心包炎、心包积水、肠炎、肝炎、免疫抑制病及呼吸道疾病[1,5]。

7 小结

造成鸡体免疫抑制的原因很多,如药物因素、营养不良、霉菌毒素、细菌感染及病毒感染等;在生产实践中,病毒感染是导致鸡群免疫抑制最为常见且危害最大的因素,常爆发流行,造成巨大的经济损失。掌握鸡常见病毒性免疫抑制病的病原特点及致病机理,对生产中解除免疫抑制、预防和控制此类疫病具有重要意义。

摘要：鸡群发生免疫抑制主要表现为病原易感性增强、免疫应答降低、病原持续感染、疫苗免疫失败等,引起鸡的免疫机能障碍,造成鸡体免疫系统瘫痪,使鸡群对多种疫病的敏感性增加,给养殖户造成困扰并严重危害养鸡业健康发展。文章对鸡常见病毒性免疫抑制病的病原特点及致病机理进行了综述,以期为广大兽医工作者和养殖户提供参考。

动物免疫抑制研究 篇6

1 猪繁殖与呼吸综合症病毒对猪造成免疫抑制的机理

大量研究表明, 猪繁殖与呼吸综合症病毒 (PRRSV) 可与多种病原体发生协同, 研究发现, 猪繁殖与呼吸综合症病毒 (PRRSV) 可增加猪对猪流感病毒 (SIV) 、猪呼吸道副粘病毒、猪呼吸道冠状病毒 (PRCV) 三种病毒易感性。

1.1 PRRSV对机体合成炎性因子的干扰

攻毒试验发现, PRRSV感染的特征之一就是感染猪的肺内炎性银子表达不明显, 尤其表现为Ⅰ型干扰素、白细胞介素-1和肿瘤坏死银子-α合成不足。I型干扰素作为动物非特异性免疫应答的组要组成部分, 具有诱导相关免疫细胞表面产生抗病毒蛋白, 增强免疫活性的功能, 起到抗病毒的作用。研究表明, PRRSV能明显抑制机体产生Ⅰ型干扰素, 导致免疫细胞活性受到限制。Suradhat等检测PRRSV感染猪支气管灌洗液时发现, 白细胞介素-10 (IL-10) 的表达量显著提高, 并认为PRRSV可通过提高外周血单核细胞中IL-10m RNA表达量来参与调节免疫反应。IL-10分泌增多和Ⅰ型干扰素减少则表现为非特异性免疫抑制, 这有利于其他病原微生物对猪群造成感染和传播。

1.2 PRRSV引起肺巨噬细胞死亡

POL等第一次对PRRS对猪的致病机理进行论证的时候发现, 猪巨噬细胞 (PAM和支气管上皮细胞是PRRSV感染宿主的主要靶细胞。PAM和单核细胞对细菌和病毒具有吞噬的作用。并且这种吞噬作用是病毒感染后机体只管重要的免疫应答反应。在体外试验中, 运用PRRSV感染PAM时发现, PRRSV可使培养液中PAM在攻毒后24h内迅速凋亡, PRRSV科研可引起溶解性抑制因子的缺失, 导致巨噬细胞吞噬能力降低。PAM的损伤必然导致机体免疫功能的下降, 为呼吸道继发病原微生物感染创造机会。

1.3 PRRSV对淋巴组织的影响

PRRSV具有嗜巨噬细胞的特性, 淋巴结和脾脏含有大量游离和固定的巨噬细胞。当PRRSV感染猪后首先PAM和肺内皮细胞巨噬崩解, 释放出的病毒借助血液及淋巴循环到全身淋巴结和脾脏。进入淋巴结和脾脏的PRRSV可引起广泛性的血管炎和炎性细胞聚集, 被其他巨噬细胞吞噬, 致使其他巨噬细胞崩解, 最终导致外周淋巴组织器官出现坏死性炎症。由于淋巴结、淋巴小结和副皮质区及脾白髓和红髓都受到广泛性损伤, 致使机体体液免疫和细胞免疫功能损伤。

2 猪圆环病毒Ⅱ型 (PCV2) 对猪造成免疫抑制的作用机理

一般认为, 猪圆环病毒Ⅱ型 (PCV2) 是引起仔猪多系统衰竭综合症 (PMWS) 的主要病原体, 其发生的有平常主要为PCV2使仔猪淋巴组织、肺和肝出现以细胞浸润为特征的炎性病变, 当病变不能进行代偿与修复时, 机体代谢机能出现障碍最终导致PMWS, PMWS组织学上另外的显著特征病变是淋巴滤泡区减小或缺失, 淋巴细胞减少。从组织学病变观察得知, PCV2能导致患病猪发生免疫抑制。

2.1 PCV2对机体淋巴细胞激活及增加抑制

Darwich等通过检测PCV2感染猪血清样品时发现, PCV2可使感染猪的百细胞介素-8和IFN-γ产量与健康猪相比明显下降, PCV2还可诱导单核细胞产生IL-10, 抑制干扰素分泌INFα间接影响树突状细胞进一步发育成熟, 最终导致DC的先天性免疫功能受到影响。PVC2还可在集体中其他单核细胞、巨噬细胞等抗原递呈细胞中存在, 并引起机体对于抗原递呈能力的降低。说明PCV2能抑制感染猪产生炎症反应, 参与免疫调节的细胞因子表达数量的改变使得PCV2感染后淋巴细胞不能有效激活或增殖, 最终破坏免疫功能。

2.2 PCV2对PAM功能的影响

MCneilly等在体外培养的猪PAM中进行Pcv2攻毒, 结果发现PCV2感染后8天可降低PAM主要组织相容性方程基因-Ⅱ类抗原的表达, 导致集体感染免疫反应不能及时启动, 并且, PCV2对巨噬细胞介导的淋巴细胞增生有明显抑制作用。

2.3 PCV2引起患猪淋巴细胞耗竭

PCV2感染猪外周血液中B细胞和T细胞数量较正常猪少, 此为PCV2导致患病猪免疫抑制的另外一个主要原因。PCV2引发PMWS症状出现的根本原因是PCV2感染猪可诱导机体淋巴细胞数量减少, 尤其在感染初期, B细胞和T细胞减少更为显著, 患病猪器官逐渐表现为功能性障碍。研究表明, PMWS患病猪淋巴细胞减少的主要原因是PCV2可抑制淋巴细胞增殖。

2.4 PCV2引起患猪淋巴细胞亚群发生变化

大量研究表明, 自然或人工感染PCV2猪外周血液中的淋巴细胞亚群比例发生变化, Darwich等通过研究进一步证明了PCV2具有降低患病猪外周血液中CD8+细胞和DP细胞比例的作用。CD8+细胞及DP细胞在机体免疫反应中发挥着非常重要的作用, 其减少必将影响机体的免疫应答。

3 霉菌毒素对猪造成免疫抑制的作用原理

霉菌毒素作为霉菌的次级代谢产物, 在自然系中种类繁多, 目前发现300多种有各种毒性作用的霉菌毒素广泛存在于食品和饲料原料中。霉菌毒素对猪的危害主要体现在对猪免疫系统的破坏及对免疫应答的强烈抑制, 主要表现为免疫蛋白和抗体水平的下降、网状内皮系统损伤、细胞介导的免疫功能下降以及免疫器官发育异常等。有研究表明, 黄曲霉毒素和T-2毒素可通过有胸腺组织细胞DNA和RNA结合并抑制其繁殖, 引起胸腺发育不良甚至萎缩。导致胸腺组织中淋巴细胞减少, 且玉米赤霉烯酮可导致免疫器官实质性损伤, 抑制T、B淋巴细胞增殖, 对集体造成免疫抑制。

4 猪场免疫抑制的应对措施

可造成猪发生免疫抑制的因素众多, 包括物理环境因素、化学因素、营养及其他病原微生物等因素, 涉及猪场的挂你、用药和防疫等多哥方面。一般情况下, 当猪场发生免疫抑制时候, 种母猪血清抗体水平下降, 表现为仔猪出生后通过哺乳获得的母源抗体保护力降低或保护时间缩短, 导致仔猪发病率较正常水平高。此外, 发生免疫抑制的怀孕母猪容易感染某些具有胎毒性的病原体如猪瘟病毒。为避免猪发生免疫抑制, 必须做好以下几点:

4.1 提高猪场饲养管理水平

保证猪舍适宜的通风、温度、湿度、养殖密度, 夏季注意通风降温, 冬季将强保温工作, 避免圈舍过于潮湿。保证猪群饮水清洁, 特别是采用地下水饲喂的情况下, 暴雨过后需在饮水中添加适量消毒药。杜绝使用霉变饲料, 在潮湿季节可在饲料中添加脱霉素。保证日粮营养全面和均衡, 适当补充微量元素。尽量为猪群饮食休息提供良好的环境, 避免猪场因应激产生免疫抑制。

4.2 建立严格的微生物安全制度

一般情况下, 猪舍需每周交替使用不同的消毒剂消毒1~2次, 消毒时应保证卫生死角的彻底消毒。猪场尽量避免外来人员进入猪舍, 外来人员进入猪舍必须经消毒、洗澡、更衣、隔离2~5天后方可进入猪舍。猪场内工作人员每次由生活区进入生产区前要经过洗澡、更衣后方可进入猪舍。

4.3 及时隔离或者淘汰重大疫病患猪

定期对猪场进行重大一并抽样检测, 及时预防、发现并处理猪场疾病的发生。当发现猪场有疑似重大动物疫病时, 为防止病原体传播, 应尽早进行隔离或淘汰处理, 并对猪群进行必要的紧急接种和药物预防, 最大限度避免一并所导致的猪场免疫抑制。

4.4 严格执行驯化工作

为防止新引进的猪群携带并传播重大免疫抑制性疾病, 新引进的猪群必须在隔离区饲养2~3个月左右方可与原来的猪群混合饲养, 切混群饲养前必须对新引进的猪群根据猪场实际情况完成疫苗接种, 驯化过程中要密切观察整个猪群健康状况, 如遇发病, 应及时采取有效措施, 带猪群恢复后, 再次开始驯化工作, 严禁缩短驯化时间。

4.5 科学制订免疫程序

猪场应进行血清课题检测3~4次/年, 根据血清抗体检测结果调整或制定猪场免疫程序。在重大一并高发区, 对相应疾病疫苗及时接种。关于PRRS疫苗免疫, 应尽量使用弱毒疫苗免疫, 一般情况下每年接种HP-PRRSV弱毒疫苗4次、口蹄疫4次、猪瘟3~4次。为减少疫苗接种产生的应激, 防止疫苗接种可能产生的免疫抑制, 应尽量避免同时接种多种疫苗, 接种前后在饮水中添加电解多维等。

4.6 科学使用药物

动物肠道黏膜免疫系统研究进展 篇7

1 肠道黏膜免疫系统的组成

肠道黏膜免疫系统按照解剖位置和功能分为诱导部位和效应部位。诱导部位主要是指肠淋巴集结(PP),效应部位包括肠黏膜上皮内淋巴细胞(IELs)和固有层淋巴细胞(LPL)[1]。

1.1 诱导部位

肠淋巴集结是分布于肠系膜对侧肠黏膜或黏膜下,由多个淋巴滤泡聚集成的高度器官化的黏膜相关淋巴组织(MALT),具有典型的二级淋巴器官结构,有确定的B淋巴细胞和T淋巴细胞依赖区。滤泡表面覆有一层滤泡相关上皮(FAE),滤泡相关上皮由微皱褶细胞(简称M细胞)、肠上皮细胞及上皮内淋巴细胞等组成[2],M细胞是滤泡相关上皮中一种特有的抗原转运细胞。淋巴集结内含有大量免疫细胞,主要是B、T淋巴细胞,其中B淋巴细胞主要分布在淋巴滤泡区,当淋巴滤泡受到抗原刺激便形成生发中心。T淋巴细胞主要位于滤泡间区,包括CD4+和CD8+T淋巴细胞。抗原递呈细胞(APC)主要是树突状细胞(DC)、B淋巴细胞和巨噬细胞。滤泡间区有高内皮静脉(HEV),是淋巴细胞进入淋巴集结的通道。由于淋巴集结含各种必需的免疫活性细胞,一般认为淋巴集结是黏膜免疫反应的主要诱导部位。孤立淋巴滤泡在肠黏膜免疫反应中的作用目前还未明确,推测其功能可能是作为黏膜免疫反应的诱导部位。

1.2 效应部位

1.2.1 上皮内淋巴细胞

上皮内淋巴细胞是位于基底膜和上皮细胞间隙的淋巴细胞,约占上皮细胞总数的六分之一。当受到抗原刺激时,上皮内淋巴细胞可通过分泌多种细胞因子或产生不同的细胞毒作用,发挥其抗细菌、病毒等作用。其作用可归纳为以下几点:1)产生细胞因子。上皮内淋巴细胞可分泌γ干扰素(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-2(IL-2),它们在抵御肠道病原体入侵方面发挥着重要作用。2)细胞毒作用。上皮内淋巴细胞与细胞毒T淋巴细胞和NK细胞相似,具有相似的胞内颗粒,如粒酶、丝氨酸酯酶和穿孔素,因此上皮内淋巴细胞具有细胞杀伤作用[3]。3)促进上皮细胞更新生长。上皮内淋巴细胞可以表达细胞生长因子的受体。上皮内淋巴细胞在细胞生长因子、IL-7和IL-2的刺激下,可上调IL-7受体[4]。此外,上皮内淋巴细胞还可通过细胞毒活性以及释放肿瘤坏死因子、γ干扰素,抵抗感染和衰老的上皮细胞,从而使上皮细胞迅速更新。4)上皮内淋巴细胞可抑制黏膜的过敏反应。

1.2.2 固有层淋巴细胞

固有层淋巴细胞是位于黏膜固有层内的一群淋巴细胞。主要由B淋巴细胞和T淋巴细胞组成。固有层T、B淋巴细胞数量相当。固有层中的B淋巴细胞转化为浆细胞后可分泌Ig A,后经胞饮作用进入杯状细胞,最后被分泌到肠腔,起着局部黏膜免疫作用。除了有分泌Ig A的B淋巴细胞及浆细胞外,还有分泌Ig M、Ig G和Ig E的B淋巴细胞[5]。固有层淋巴细胞的功能主要有:1)辅助与抑制功能。固有层CD4+T淋巴细胞能促进Ig A的合成,CD8+T淋巴细胞则可抑制免疫球蛋白合成;2)促进细胞因子的合成。经离子霉素和豆蔻酰佛波醇乙酯(PMA)激活的固有层淋巴细胞可表达高水平的IL-5 mRNA,还可表达高水平的IL-2、IL-4、IFN-γ等细胞因子;3)细胞毒T淋巴细胞功能。诱导固有层淋巴细胞的活性,产生细胞毒T淋巴细胞。

2 肠道黏膜免疫系统抗原的摄取、处理和递呈

2.1 M细胞对抗原的转运

2.1.1 M细胞的分布与结构特点

M细胞又称微皱褶细胞或膜上皮细胞,位于黏膜淋巴小结的滤泡上皮中,是滤泡相关上皮中一种特有的抗原转运细胞,是一种特化的扁平上皮细胞。M细胞的发现可追溯到19世纪20年代,K.Kumagai发现了M细胞的存在。19世纪70年代,R.L.Owen等[6]将此类细胞称为微皱褶细胞,并对其结构特征以及其与淋巴集结内淋巴细胞的关系进行了详细描述。M细胞广泛分布于小肠淋巴滤泡圆顶区之上,一般认为,M细胞来源于分化完全的滤泡吸收细胞。M细胞与邻近上皮细胞间可通过桥粒紧密连接,形成上皮屏障,将肠道内抗原物质与上皮下的淋巴组织隔开,其顶部面对黏膜腔,基底膜向顶部呈穹隆状突起,形成口袋,口袋内充满T、B淋巴细胞及少量巨噬细胞。

2.1.2 M细胞对抗原的转运

M细胞的主要功能及特点有以下三点:1)摄取和转运颗粒性抗原,包括蛋白质和颗粒物,如病毒、细菌、小的寄生虫及微球体;当黏膜表面的抗原与M细胞结合后,M细胞可将其吞入,形成吞饮小泡,被转运至上皮下淋巴组织。抗原由抗原递呈细胞呈递给T、B淋巴细胞,产生抗原特异性B淋巴母细胞,其在生发中心增殖后,通过血流迁移到远处的黏膜和腺体组织,分化成熟为浆细胞,浆细胞随即产生分泌型Ig A。因此,跨越M细胞转运抗原是启动肠黏膜免疫应答的最重要的第一步,M细胞起着“第一信息通道”的作用。2)M细胞黏附和吸收肠腔内的抗原具有选择性,这保证了机体对病原体发动黏膜免疫应答,而对食物和正常菌群不产生免疫应答。3)在M细胞“口袋”上方的基顶膜内侧有少量多泡状内体,胞质内缺乏溶酶体,也无含酸性磷酸酶的结构,M细胞弯窿内的淋巴细胞可以和肠腔中的抗原接触,抗原在转运中也不会被降解,因此M细胞黏附的抗原通常能引起较强的分泌型免疫应答。

2.2 抗原递呈细胞对抗原的摄取、处理和递呈

巨噬细胞和树突状细胞是两种专职抗原递呈细胞,可表达MHCⅡ类分子。在黏膜免疫系统中,巨噬细胞分布于整个黏膜相关淋巴组织的黏膜上皮下的浅表层。巨噬细胞可吞噬和杀灭多种病原微生物并处理凋亡损伤的细胞,是机体非特异性免疫的重要组成部分。在免疫应答过程中,巨噬细胞摄取外源性抗原物质进入细胞内后,经酶降解,与MHC-Ⅱ类分子结合形成抗原肽-MHCⅡ类分子复合物,在细胞表面供免疫活性细胞识别,因此巨噬细胞是一种重要的抗原递呈细胞。树突状细胞能将活的共生菌从肠腔转运到肠系膜淋巴结,肠道树突状细胞能保持共生菌数天,这使得树突状细胞能选择性诱导Ig A的产生,以帮助黏膜阻止共生菌的入侵。载有共生菌的树突状细胞被肠系膜淋巴结限制在黏膜淋巴组织,这样就可以确保针对共生菌特异的Ig A免疫反应局限在肠黏膜,而不激发系统免疫反应[7]。此外,覆盖在肠道黏膜表面的上皮细胞也作为非专职抗原呈递细胞参与黏膜抗原的摄取、处理、递呈。

3 肠道黏膜免疫的效应因子———SIg A

3.1 SIg A的结构与特点

Ig A有2个相互独立的体系,即血清型Ig A和分泌型Ig A。此外,根据分布和分子形式又可将其分为Ig A1和Ig A2两个亚型,血清型Ig A属于Ig A1类,分泌型Ig A属于Ig A2类。黏膜免疫所产生的Ig A主要为分泌型Ig A(SIg A)。分泌型Ig A由2个Ig A2、J链分子和分泌片段(SC)构成。人SIg A由Ig A与肠上皮细胞分泌的SC结合而成;鼠SIg A由Ig A与肝细胞和胆管上皮细胞合成的SC结合形成。SIg A结构稳定,能够耐受肠道局部p H值、温度等理化环境的变化及蛋白酶的消化。同时,SIg A的合成转运也受抗原和肠固有层Ig A分泌细胞的影响。Ig A分泌细胞在黏膜淋巴滤泡中发育,多沿上皮层分布,弥散分布于黏膜下层。小肠黏膜尤其是十二指肠的Ig A分泌细胞数量最多。Ig A的可结晶片段既不亲细胞,也不通过胎盘,即使在聚合状态下也不与补体片段3b结合,因此与炎性细胞、炎症介质无关,不通过激活补体等途径杀伤抗原,局部肠道黏膜免疫一般不会引起局部损伤,这对于黏膜免疫具有重要意义。

3.2 SIg A的功能

3.2.1 抗感染作用

研究表明,SIg A能够抗病毒、中和毒素及其他生物活性抗原,具有广泛的免疫保护作用,但其最主要的保护作用是阻止细菌对上皮细胞表面的黏附。黏附是病原体入侵机体的第一步,对于病原体致病作用是非常重要的,SIg A可抑制并阻断病原体对黏膜的黏附,如SIg A能阻断禽流感病毒A的黏附[8]。此外,SIg A可有效中和黏膜上皮内毒素、酶等有害物质;SIg A不需要补体就可与呼吸道、消化道等部位黏膜表面的病毒形成免疫复合物排出。SI-g A与病原微生物抗原结合形成复合物后,又可刺激呼吸道、消化道等黏膜中的杯状细胞分泌大量黏液,“冲洗”黏膜上皮细胞,阻止微生物黏附。此外,SIg A与补体、溶菌酶的协同作用还具有杀菌作用。研究发现,二聚/多聚体Ig A与SC结合后可以更有效地保护小鼠免遭呼吸道细菌感染。推测可能是,SC通过糖基将抗体有效地固定于黏膜表面,从而影响细菌定植。

3.2.2 抗肿瘤作用

SIg A不仅能抗细菌、病毒及中和毒素,而且在肿瘤的发生中也起着重要作用。研究表明,肠黏膜中含85%以上的Ig A分泌细胞,而小肠恶性肿瘤组织中Ig A分泌细胞的数量极少。相关资料认为,有些肿瘤细胞能产生某种抑制因子,抑制Ig A分泌细胞进入癌组织。因此,有人提出从组织中分离出Ig A抗体的特异性部分,在体外或体内直接作用于肿瘤细胞,该技术已被应用于肿瘤的治疗[9]。

3.2.3 促进天然抗菌因子的抗菌作用

SIg A可有效增强乳铁传递蛋白及乳过氧化物酶系统对几种黏膜病原体的抗菌作用;可通过黏膜淋巴组织增强抗原依赖性细胞作用,从而提高对病原的直接杀伤能力;SIg A还可以与分泌物中的抗菌物质如乳铁传递蛋白、溶菌酶协同,共同杀灭抗原。

3.2.4 抗过敏和其他作用

SIg A的免疫排斥机制可消除Ig G及Ig E的炎性抗体介导的过敏反应。SI-g A对随食物摄入的抗原及从空气吸入的某些抗原具有封闭作用,使抗原游离于分泌物中,利于排除,或者使抗原物质限制于黏膜表面,不能进入机体,避免某些超敏反应如食物过敏、湿疹及外源性支气管哮喘的发生。

4 黏膜免疫的应用、存在的问题及发展趋势

4.1 黏膜免疫的应用

黏膜免疫因具有简易安全的特点而备受国内外免疫学家的关注,尤其是黏膜免疫不会造成动物明显的应激反应,特别适合大规模动物传染病的预防。因此,近十年来围绕黏膜免疫途径特别是消化道免疫进行了大量研究。与注射免疫相比,黏膜免疫具有自身的优势。第一,口服疫苗可在黏膜局部产生特异性抗体反应,来有效阻止病原微生物的入侵甚至将其杀灭和清除体外。第二,通过口服或滴鼻接种疫苗,可以使机体全部的黏膜获得抵御相应传染病的免疫保护力。如,通过鼻黏膜接种进行黏膜免疫简便易行,疫苗经鼻黏膜部丰富的毛细血管吸收后直接进入体循环,可免受胃肠道酶的破坏和肝脏对疫苗的消除效应,有利于提高生物利用度和血疫苗浓度[10,11,12]。另外,鼻黏膜接种可极大地减少疫苗用量,也使疫苗不良反应的概率大大降低。第三,黏膜免疫也能产生很高的血清抗体效价,甚至能诱导细胞毒T淋巴细胞活性。第四,与传统的注射接种疫苗相比,口服、滴鼻疫苗的接种方法比较方便,对专业人员的监督需求最少,不需要灭菌的注射器和针头就可以完成,而且没有注射器提供和丢弃及费用的问题,免疫的不良反应小,安全性好。

4.2 存在的问题

绝大多数病原体都是通过黏膜途径感染人或动物。因此,黏膜免疫系统是机体抵抗感染的第一道防线。然而,许多经黏膜感染的病原体通过不同的策略来逃避,甚至利用黏膜免疫系统感染机体,同时复制自己。接种疫苗是目前最有效和最经济的预防感染的方法。然而,对于一些经黏膜感染的病原体,如人类免疫缺陷病毒(HIV)、单纯疱疹病毒-2(HSV-2),并没有研制出有效的疫苗。由于黏膜免疫系统的复杂性,黏膜疫苗的研发受很多因素的制约,如疫苗抗原难以突破黏膜障碍层、黏膜固有的耐受倾向导致微弱的免疫反应及缺乏安全有效的佐剂。

疫苗经过消化道时易降解,与系统免疫相比需要更多的抗原量。如何使用少量的抗原而有效诱导黏膜免疫,提高黏膜免疫力是目前亟需解决的问题。此外,还有待阐明如下几个方面问题:1)肠相关淋巴组织(GALT)摄取肠腔内抗原的机制;2)GALT趋向耐受或是趋向保护性免疫反应的调节机制;3)DC在肠道黏膜免疫系统中的作用。这些机制的阐明将会为口服黏膜疫苗的开发及过敏性或自身免疫性疾病的治疗提供更多的思路和方法。

4.3 发展趋势

目前,只有少数的黏膜疫苗被应用于临床,如脊髓灰质炎疫苗、轮状病毒疫苗和流感病毒疫苗。这些口服的或滴鼻的疫苗相对于注射疫苗接种方便,非专业人员可自我接种,这一点在大规模接种以应对突发的传染病时有很大的优越性,同时能减少注射针管和针头的使用,最重要的是疫苗免疫反应更接近于真实的感染引起的免疫反应,从而能更有效地预防相应的传染病。

尽管黏膜疫苗的前景被大多数研究者所看好,但现在的黏膜疫苗研究还远滞后于现实的需要,主要的原因在于对黏膜免疫系统的研究和病原与此系统的相互作用的理解并不深入,毫无疑问类似的基础研究将会大大促进黏膜疫苗研发的进展。同时,新型、安全、有效的黏膜免疫佐剂和投递介质的研究也会促进黏膜疫苗研发的进程。

摘要：肠道黏膜免疫系统是机体抵御肠道病原体感染的第一道防线。近年来,关于兔、大鼠、小鼠等实验动物肠道黏膜免疫的研究已比较深入,家畜、家禽,甚至鱼类的肠道黏膜免疫也有许多报道,这说明肠道黏膜免疫越来越受到重视。文章综述了肠道黏膜免疫系统的组成及其抗原的摄取、处理和递呈,SIgA分子的结构与功能,黏膜免疫的应用前景,并对存在的问题进行了探讨。

关键词：肠道,黏膜免疫,组成,SIgA,应用前景,研究进展

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