兽药免疫检测研究

兽药免疫检测研究（精选5篇）

兽药免疫检测研究 篇1

农兽药残留危害人们的生活健康,是食品安全检测的关注焦点。基于特异性抗体的酶免疫分析方法作为一种简便、快速和灵敏的检测方法,在近年来的食品安全检测中起到越来越重要的作用。采用酶免疫试剂盒、胶体金试纸条高通量、快速筛选阳性样品后,再用仪器确证的方法得到检验监测单位的普遍认可。已成功应用的检测产品有克伦特罗、莱克多巴胺试剂盒和试纸条等。其他如孔雀石绿、苏丹红、呋喃西林、恩诺沙星等快速检测产品也已投放市场,推广使用还需要一定时间的验证。然而一个不争的事实就是,对于检测如磺胺类、氟喹诺酮类、有机磷类、拟除虫菊酯类等有害物质时,使用单残留试剂盒并不比直接使用仪器具有优势。特别是检测农残的快速检测产品目前还不成熟,稳定性和假阳性等问题还未能很好解决。因此,如何同时检测一类药物,真正降低检测成本,并保证检测的准确性是目前农兽药的快速多残留检测的一种新趋势。

实现一类药物的多残留检测的基本思路是针对一类药物的共性结构设计并合成半抗原,由半抗原偶联载体蛋白制备全抗原,通过免疫动物制备抗体,利用抗体对一类药物的识别作用,建立多残留检测酶免疫分析方法[1,2,3]。

1 农兽药的多残留现状

近年来,食品安全问题一直是困扰民生的焦点问题,而农兽药残留是制约食品安全的首要因素。2000年开始,广东省开展食品本底水平和污染监测项目,截至2005年的监测结果显示:蔬菜甲胺磷、敌百虫和敌敌畏检出率分别为7.95%、3.03%和2.65%,水果有机磷农药水胺硫磷检出率为10%,新鲜食用菌有机磷农药内吸磷检出率为8.33%,茶叶有机磷农药三氯杀螨醇检出率为5%,蔬菜氨基甲酸酯农药和拟除虫菊酯农药残留检出率为1.47%、17.17%,水果拟除虫菊酯农药检出率为20%。尽管国家加强了农药使用的监控力度,但是农药中毒事件和对外贸易摩擦仍时有发生。2008年1—2月,中日贸易过程中发生的“毒饺子”事件(有机磷农药中毒事件),使中国食品在日本市场遭受重创。而兽药方面主要是一些抗生素和兴奋剂的危害,如磺胺类、氟喹诺酮类、肾上腺素兴奋剂等。直到2009年2月初,广东仍有瘦肉精中毒事件发生,导致6~10人中毒。2009年6月1日,中华人民共和国食品安全法正式实施,表明了国家维护食品安全的力度。有了法律法规的约束作用,仍然不可缺少检测方法的支持。针对目前农兽药品种繁多,多残留现状严峻,开展多残留检测研究,尤其是能实现快速、高通量、现场筛查的免疫分析法的研究非常重要。

2 免疫分析法在各类农兽药多残留检测上的应用

农兽药多残留酶免疫分析法的基本原理是根据待测一类药物的共性结构或共有结构特征,设计并合成突出其结构特征的半抗原,半抗原偶联大分子蛋白质作为全抗原并免疫动物,通过细胞融合获得杂交瘤细胞,收集并纯化杂交瘤细胞分泌的类特异性抗体(或称宽谱特异性抗体、广谱特异性抗体),利用抗体建立酶免疫吸附测定(ELISA)、免疫胶体金(GICA)等免疫分析法。

2.1 拟除虫菊酯

拟除虫菊酯(Pyrethroids)农药是20世纪70年代研发的一类仿生杀虫剂,具有化学性质稳定,不易光解,无特殊臭味及安全系数高,使用浓度低,触杀作用强,灭虫速度快等优点。目前其酶免疫分析检测方法的研究已经开展比较多。Pullen等[4]直接采用氯菊酯的水解产物氯菊酸作半抗原,分别制备了具有不同交叉反应率的单克隆抗体和多克隆抗体,初步探索了2种抗体的类特异性。结果发现单克隆抗体可检测类型Ⅰ(菊酯类)拟除虫菊酯,对类型Ⅱ拟除虫菊酯(氰菊酯)没有交叉反应;而多克隆抗体既可检测类型Ⅰ拟除虫菊酯,又可检测类型Ⅱ拟除虫菊酯。Mak等[5]利用菊酸和间苯氧基苄醇合成的半抗原与甲状腺球蛋白结合制备Ⅱ型菊酯的免疫原并免疫动物获得多克隆抗体。由该抗体建立的ELISA方法检测氯氰菊酯、百树菊酯、氨氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯和氟胺氰菊酯的IC50值为6~205 ng/mL,而对Ⅰ型菊酯无交叉反应。国内在这方面的研究包括有李志茹[6]、骆爱兰等[7]、杨挺等[8]、祝金凤[9]的报道。其中祝金凤设计合成了能模拟Ⅱ型菊酯类农药特征结构的半抗原(RS)-α氰基-3-苯氧基苄基(RS)-cis,trans-2,2-二甲基-3-羧基-环丙烷羧酸酯,用活泼酯法制备人工抗原,免疫新西兰大白兔获得抗Ⅱ型菊酯类农药的广谱特异性抗体。该抗体对5种Ⅱ型菊酯有识别作用,对氯氰菊酯和三氟氯氰菊酯的灵敏度较高,间接竞争ELISA方法的检测限分别为11.7 ng/mL和48.5 ng/mL。

2.2 氨基甲酸酯

氨基甲酸酯类农药(Carbamate)具有杀虫谱广、用药量少、药效快等特点,目前对其检测主要采用高效液相色谱法和酶抑制法等,酶免疫多残留检测的研究报道很少。孙覃[10]合成了半抗原6-(苯氧基羰基)氨基-1-己酸并成功制备了芳基-N-甲基氨基甲酸酯类杀虫剂的通用抗体,抗体检测混灭威、灭除威、灭杀威、甲萘威的IC50值为0.47、0.65、1.08、0.53μg/m L,其中混灭威在自来水、土壤以及青菜中的添加回收率分别为101.6%、87.7%和90.4%。

2.3 有机磷

有机磷农药(Organophosphorus)通常是指磷(膦)酸酯、硫逐磷酸酯、磷酰胺酯类有机磷化合物。对于有机磷农药的多残留检测通常采用的是制备类识别特异性的抗体的途径。已有的报道都是针对二甲氧基(硫代)磷酸酯或二乙氧基(硫代)磷酸酯两大类有机磷农药的研究。自从1988年Sudi等[11],首先提出建立有机磷农药多残留检测的酶联免疫的方法后,国内外已有不少利用类特异性多克隆抗体建立二甲氧基(硫代)磷酸酯或二乙氧基(硫代)磷酸酯两大类有机磷多残留检测的报道[12,13,14,15,16,17]。Jang等[18]制备了O,O-二乙基-O-(5-羧基-2-氟苯基)硫代磷酰酯作为通用半抗原,偶联蛋白质作为人工抗原免疫小鼠,通过细胞融合体外培养杂交瘤细胞,获得单克隆抗体,并首次利用单克隆抗体建立了间接竞争ELISA的方法用于有机磷多残留检测是一个突破。该方法对4种含有二乙氧基有机磷农药的IC50值在0.1~0.3μg/m L,克服了利用多克隆抗体建立的方法特异性较差的困难。梁颖等[19]设计了3个含二甲氧基二硫代磷酸酯共有结构的半抗原,制备出3个单克隆抗体,并建立ELISA方法,检测马拉硫磷、乐果、亚胺硫磷、杀螟硫磷、倍硫磷可以达到限量标准,印证了Jang采用单克隆抗体建立多残留检测方法的可行性。同时,还首次作了实际样品的检测,探讨了异源包被原对提高检测灵敏度的作用。

2.4 氟喹诺酮

氟喹诺酮(Fluoroquinolones)类药物是一系列新型氟取代的喹诺酮类衍生物,广泛用于畜禽和水产养殖业。由于该类药物本身带有羧基活性基团,方便于酶免疫分析方法的应用。蔡勤仁等[20]利用碳二亚胺法合成恩诺沙星人工抗原,免疫BALB/c小鼠并采用杂交瘤技术制备了类特异性单克隆抗体,与恩诺沙星、环丙沙星、麻保沙星、沙拉沙星、达氟沙星的交叉反应率为27.4%~110.8%,检测限为0.13 ng/m L。魏东[21]利用活泼酯法制备了沙拉沙星人工抗原,免疫动物得到抗血清,并建立FQNS多残留检测方法。该方法对沙拉沙星、诺氟沙星、环丙沙星和恩诺沙星的检测限为19.1~26.2 ng/m L。兔肉中4个药物在0.5~2 000.0 ng/m L范围内的平均添加回收率为85%。李振华[22]采用达氟沙星偶联牛血清蛋白的人工抗原制备的兔多克隆抗体能识别达氟沙星、恩诺沙星、沙拉沙星、氧氟沙星、诺氟沙星和洛美沙星,交叉反应率为22.7%~111.2%。王战辉等[23]采用环丙沙星直接偶联牛血清蛋白作为免疫原免疫动物并制备得到宽谱特异性抗体单克隆抗体,该抗体建立的方法检测12个氟喹诺酮的交叉反应率在35%~100%,最低检测限都可以达到最高限量检测要求。

2.5 磺胺

磺胺(Sulfonamides)类药物是一类具有广谱抗菌活性的化学品,广泛应用与人和动物细菌性疾病的治疗和预防。该类药物的酶免疫多残留检测分析研究已经比较多。1991年,Sheth等[24]用化学方法合成了3种具有磺胺母核结构的半抗原TS、CS、NS,以磺胺噻唑衍生物TS偶联蛋白作为免疫原,制备了广谱特异性抗体。Muldoon等[25]以对氨基苯磺酸作为半抗原偶联载体蛋白后免疫动物,通过杂交瘤技术制备的单克隆抗体能很好识别游离药物,检测磺胺硝苯、磺胺吡啶、磺胺噻唑的IC50值分别为1.41、22.80、322.00 ng/m L。ZHANG Hong-yan等[26]等设计并合成了5个对氨基苯磺酸衍生物作为半抗原,其中用对氨基苯甲酸作为手臂的半抗原偶联KLH后免疫新西兰大白兔得到的抗体最佳。利用其建立的异源直接竞争ELISA方法检测11个磺胺类药物的IC50值均小于100 ng/m L,其中磺胺异唑、磺胺噻唑、磺胺甲氧嘧啶、磺胺甲氧哒嗪、磺胺吡啶和磺胺甲噻二唑可以满足最高残留限量的要求,牛奶样品中药物的添加回收率为104%~131%。吕芳[27]以含五元杂环的磺胺类药物为研究对象,制备了族特异性单克隆抗体,建立的间接竞争ELISA方法,检测磺胺噻唑、酞磺胺噻唑、琥珀酰磺胺噻唑、磺胺甲噁唑及四者等浓度混合物的检测限分别为14.40、6.30、18.20、33.90、4.63 ng/m L。

3 展望

目前,农兽药多残留免疫分析法的应用仍处于不成熟的阶段。限制其使用的因素,一是抗药物抗体的类特异性,二是免疫分析法本身的稳定性和灵敏度。前者是开发农兽药多残留免疫分析法的关键。目前的研究成果往往存在抗体谱宽足够但特异性不强或谱宽较窄但特异性较好的情况,真正能达到谱宽合适且特异性较好、检测一类药物的灵敏度相对一致的成果极少。而后者,检测方法的稳定性和灵敏度,是开发相应检测试剂盒产品的制约因素。目前的研究主要集中在制备类特异性抗体的层面上,涉及检测方法和试剂盒开发的研究较少。试剂盒的开发可见于一些专利,市面上销售的试剂盒极少,更多的是处于实验室研究阶段。

尽管农兽药多残留免疫分析法仍不成熟,但作为低成本、高通量、快速检测的一种检测方法,适应全面保证大众食品安全的时代需要,加上国家在这方面的投入,该方法有良好的发展前景。实际上,对于上述的限制因素已有一些研究报道[25,26,27,28]。对于抗体的类特异性,笔者认为:一是可以结合计算机模拟[29~30]等手段设计突出检测对象共性结构的半抗原,二是可以考虑用自制的树枝状大分子骨架定点、定量连接半抗原构成全抗原。结合这两者可以有针对性的设计合理的抗原,并使用这些抗原制备多克隆抗体或单克隆抗体。后续通过试验比较抗体的抗药物谱宽和特异性,选择谱宽和特异性都较佳的抗体用于检测方法的建立和检测产品的开发。对于检测方法的稳定性和灵敏度,笔者认为可以借鉴开发成功的单残留检测试剂盒的缓冲溶液体系,同时考虑多个药物提取液的优化问题以提高检测方法的稳定性;而灵敏度方面可以结合纳米技术,如量子点技术的应用,使检测灵敏度有数量级的提高。

兽药免疫检测研究 篇2

小分子环境污染物的免疫检测技术及其研究进展

针对小分子环境污染物免疫检测技术的现状,介绍了免疫检测技术原理、特点和研究开发步骤.综述了该技术的.基本检测形式、抗原的设计与合成、抗体的制备和关键技术问题以及最新技术的分类发展和应用现状.

作 者：余若祯 何苗 施汉昌 钱易 作者单位：清华大学环境科学与工程系环境模拟与污染控制国家联合重点实验室,北京,100084刊 名：环境工程 ISTIC PKU英文刊名：ENVIRONMENTAL ENGINEERING年，卷(期)：23(3)分类号：X5关键词：免疫检测 半抗原 环境污染物

兽药免疫检测研究 篇3

1. Qu ECh ERS方法的起源

Qu ECh ERS方法是一种新型药物多残留的样品制备方法, 因具有快速、简单、廉价、有效、可靠、安全的特点而得名。2002年, Qu ECh ERS方法第一次由美国农业部东部地区研究中心首席科学家Lehotay及博士后Anastassiades在意大利罗马举行的第四届欧洲农药残留工作组会议上提出。此方法一经发现就受到各国农残分析者的普遍关注, 发展十分迅速, 现已成功地用于多种食品中的数百种农、兽药残留的分析。Qu ECh ERS方法包括3个步骤:首先, 高湿的样品 (干燥的食品需加水) 用有机溶剂 (乙腈、乙酸乙酯或丙酮) 萃取, 同时加入盐 (硫酸镁、氯化钠或缓冲试剂) 以促使溶剂和水的相分离;其次, 混合体系经过振摇和离心后, 取部分有机相与吸附剂混合, 利用分散固相萃取进一步净化;最后, 混合物离心后所得上清液被直接用于分析或浓缩或溶剂交换。Qu ECh ERS方法主要适用于不含脂肪 (<2%) 的食物, 此方法很灵活, 可根据分析物、基质、仪器和分析者的偏好对净化剂、盐量、水含量和吸附剂等作改进, 改进的方法也适用于含中等或高脂的食物, 如鱼、虾等水产品。Qu ECh ERS方法是利用吸附剂填料与基质中的杂质相互作用, 吸附杂质, 从而达到除杂、净化的目的。Qu ECh ERS方法中吸附剂是加到萃取剂中。Qu ECh ERS方法降低了吸附剂的成本, 避免了样品非均匀的影响。

2. Qu ECh ERS方法的优化

2.1. 提取剂的选择

提取剂的选择是Qu ECh ERS方法的关键点之一。在农兽药多残留分析中, 常用的提取溶剂有丙酮、乙腈和乙酸乙酯。然而丙酮的水溶性强, 不使用非极性溶剂很难实现丙酮和水的分离;乙酸乙酯和水不互溶, 因其极性小于乙腈, 故出现极性大的分析物不易提取而极性小的脂肪、油脂等被共萃出来的问题。相对于乙酸乙酯和丙酮, 用乙腈不会萃取出很多的油性物质。加盐到乙腈中, 通过盐析作用使乙腈和水分层, 而乙腈与非极性溶剂 (如正己烷) 形成明显的分界面, 为下一步去除油性共萃物提供了可能。相对于丙酮, 使用乙腈可以在分配步骤后用无水硫酸镁等干燥剂除去有机相中残留的水。经过对它们提取多类兽药残留的稳定性及效果作对比试验, 表明乙腈是萃取水产品中兽药残留的最适合溶剂。目前报道的Qu ECh ERS方法基本也都是采用乙腈作提取剂。

2.2. 脱水剂的选择

Mg SO4和Na2SO4是常用的脱水剂。Mg SO4具有大的吸水容量, 能明显减少水相, 从而促进兽药在有机相中的分配和两相的分层。在萃取/分配步骤中, Mg SO4水合作用是一个强放热过程, 可使萃取液变热, 达到40℃~45℃, 这有利于萃取。Na2SO4能形成水合物, 在水中的溶解能力较Mg SO4低, 吸水能力稍低。Na Cl也被用作脱水剂, 但对兽药的萃取效果不理想, 可联合使用Na Cl和Na2SO4。Na Cl能除去水溶性好的极性干扰物, 从而提高净化效果以及回收率。经过对比试验我们发现检测水产品中的多兽药残留使用Na Cl和Na2SO4作为脱水剂最好。

2.3. 净化剂的选择

净化剂的选择是Qu ECh ERS方法检测水产品中多兽药残留的重中之重。乙二胺-N-丙基硅烷 (PSA) 、氨基 (-NH2) 吸附剂和中性氧化铝都具有弱的阴离子交换能力, 都是通过氢键和化合物作用, 可除去脂肪酸、部分有机酸、糖和色素。与-NH2吸附剂和中性氧化铝相比, PSA除基质共萃物效果最好, 这是因为PSA同时含有一级和二级胺, 使其结合能力最强。原始Qu ECh ERS方法选择单一使用PSA作为吸附剂, 获得了较好的结果。C18吸附剂常被作为Qu ECh ERS方法的净化剂。C18吸附剂是在硅胶基质上接有十八烷基, 具有较高的相覆盖率和碳含量, 对非极性物质有较高的容量, 对油脂的去除效果十分显著。其还可除去其他一些非极性杂质。经过实验发现PSA作为检测水产品时的净化剂是最合适的, 但是对于四环素类药物的提取效果一直不好, 仅能作为粗筛用, 随着Qu ECh ERS方法的不断改进和成熟, 为了达到更好的净化效果, 净化过程需要综合使用多种净化剂、甚至多次净化。

3. Qu ECh ERS方法的优点

(1) 回收率高, 对磺胺类、沙星类兽药残留的回收率介于75%~100% (大部分大于95%) 之间;

(2) 精确度高 (重现性小于5%) , 用内标法进行校正;

(3) 分析时间短, 能在30~40min完成6个预先称重的样品测定;

(4) 溶剂使用量少, 污染小且不使用含氯化物溶剂;

(5) 操作简便, 无需较高技能或培训便可很好地完成;

(6) 使用很少的玻璃器皿, 如:烧杯, 容量瓶, 分液漏斗等;

(7) 方法十分严格, 在净化过程中有机酸均被去除;

(8) 所需空间小, 在小型实验室便可完成;

(9) 提取剂加入容器后立即密封, 使其与工作人员的接触机会少;

(10) 所耗费的溶剂价格低廉;

(11) 样品制备过程中所使用装置简单。

由于Qu ECh ERS方法具有其独特的性能和快速、简易、价廉的优点, 已经引起了全世界分析化学家的关注;但我国在这方面的研究起步较晚, 相关的深入研究不多。目前, 关于Qu ECh ERS技术仍然主要集中在食品中农药残留分析中的应用, 在兽药残留分析中的应用研究相对较少, 尤其在水产品中磺胺类和四环素类药物残留检测中的应用更少。

4. Qu ECh ERS方法在水产品兽药残留分析的应用

由于Qu ECh ERS方法具有以上诸多特点, 所以被不断改进并用于动物源性食品中的兽药残留检测。Qu ECh ERS方法在兽药残留检测方面的应用比农药残留的少, 但也取得了令人满意的成果。因为目前水产品中兽药残留检测的方法已经非常成熟, 因而研究出适合检测水产品的Qu ECh ERS方法成为检测水产品中兽药残留的关键, 水产品作为一种高蛋白、高脂肪的动物源性食品, Qu ECh ERS方法应该随之改进优化。若试样前处理不好, 则会对检测产生较大干扰。在使用Qu ECh ERS方法前处理时, 通常需要优化提取剂、净化剂及其用量, 从而达到较好的效果。采用Qu ECh ERS和液相与飞行时间质谱LC-TOF-MS联用的方法分析虾中的13种常用抗生素和兽药。对比4种样品处理方法, 包括两种SPE方法、MSPD方法和Qu ECh ERS方法。样品经两种SPE方法处理后, 萃取液较浑浊;经MSPD处理后得到澄清萃取液, 但分析物的回收率较低, 大多数低于40%;而Qu ECh ERS方法处理, 可以排除基质干扰, 回收率58%~133%, 且检测限0.06~7μg/kg。用该方法成功分析了12种虾样, 可用于虾中这些分析物的超痕量检测。本人经过多个对比实验发现使用PSA提取样品在加入正己烷进行祛除色素等杂质时效果不是很好, 下层溶液好歹有一些颜色, 磺胺类药物在不使用psa时回收率略高;沙星类药物在不使用氯化钠时回收率较高, 四环素类药物由于较易于样品中的蛋白质脂肪结合, 较难提取, 仅能作为粗筛用。研究建立了水产品中四环素类、磺胺类、喹诺酮类兽药的QuEChERSUPLCMS/M S快速检测方法。分别对液相色谱条件、质谱条件、提取溶剂、净化方法、吸附剂的选择及用量等样品前处理条件进行了优化研究。

5. 结语

Qu ECh ERS方法具有简便、快速、廉价等优点, 非常符合现代检测的要求。我国作为养殖水产品的大国, 对于水产品检测的Qu ECh ERS方法需求较为迫切。根据水产品高蛋白高脂肪的特点、对其不断地改进, 目前已在水产品种多兽药残留分析中获得高的回收率。目前检测水产品中孔雀石绿、结晶紫、磺胺类、沙星类药物残留的Qu ECh ERS LC-MS (/MS) 方法已经逐渐普及, 但是水产品中的常用抗生素四环素类药物的提取效果还不是很好。相信随着科技的进步和检测手段的不断发展Qu ECh ERS方法将更加成熟, 这个问题将很快得到解决。

参考文献

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[2]易军, 李云春, 弓振斌.食品中农药残留分析的样品前处理技术进展[J].化学进展, 2002, 14 (6) :415-424.

[3]李莉, 江树人, 潘灿平, 等.分散固相萃取-气相色谱-质谱方法快速净化测定枸杞中12种农药残留[J].农药学学报, 2006, 8 (4) :371-374.

[4]仉文升, 李安良.药物化学[M].北京:高等教育出版杜.1999.

[5]刘敏, 端裕树, 宋苑苑, 等.分散同相萃取-液相色谱-质谱检测蔬菜水果中氨基甲酸酯和有机磷农药[J].分析化学, 2006, 34 (7) :941-945.

[6]胡西洲, 程运斌, 胡定金.Qu ECh ERS法测定蔬菜中有机磷类农药多残留分析[J].中国测试技术, 2006, 32 (3) :132-133.

兽药免疫检测研究 篇4

代谢组学诞生于20世纪末,由英国伦敦帝国大学吉尔·尼克森教授创立[3],之后得到迅速发展并渗透到多个领域,如疾病诊断、医药研制开发、营养食品科学、毒理学、环境学、植物学等与人类健康护理密切相关的领域,为生命科学的发展提供了有力的现代化实验技术手段。代谢组学的主要研究是各种代谢路径的底物和产物的小分子代谢物。其样品有尿液、 血浆或血清、唾液、脑脊液、精液等生物体液,以及细胞提取物、细胞培养液和组织等。

从某种意义上来说,机体内的每项生命活动都会受代谢产物的调节和影响。因此,研究代谢组学可以了解及探索各项生命活动的整体代谢状况,从而帮助人们更好地理解生命的活动。

本文就代谢组学平台组成及近年来在兽药检测中的应用作一综述,目的是使人们进一步认识到代谢组学及其技术在兽药检测分析中的重要性,同时为兽药的新药选择、药物毒性评价、不良反应监测等提供一定导向性。

1代谢组学平台简介

目前,常用的代谢组学分析平台主要为: 核磁共振谱( NMR) 技术、气相质谱( GC - MS) 联用技术、液相质谱( LC - MS) 联用技术和代谢物芯片,它们都具有样品需求量小、预处理简单、高通量性等特点。

1. 1 NMR技术

NMR技术主要是利用核磁共振技术和模式识别方法对生物体液和组织进行系统测量和分析,对完整的生物体( 而不是单个细胞) 中随时间改变的代谢物进行动态跟踪检测、定量和分类,然后将这些代谢信息与病理生理过程中的生物学事件关联起来,从而确定发生这些变化的靶器官和作用位点,进而确定相关的生物标志物[4]。

NMR技术从最初的一维氢谱发展到碳谱、氮谱、 磷谱和二维核磁共振谱等高级谱图,核磁共振技术解析分子结构的能力也越来越强,进入20世纪90年代以后,发展出了依靠核磁共振信息确定蛋白质分子三级结构的技术,使得蛋白质分子结构的精确测定成为可能。

NMR技术在代谢组学中的应用越来越广泛,它具有如下优点: 无损伤性,不破坏样品的结构和性质; 可在一定的温度和缓冲范围内进行生理条件或接近生理条件的试验; 与外界特定干预相结合,研究动态系统中机体化学交换、运动等代谢产物的变化规律; 试验方法灵活多样。

1. 2 GC - MS联用技术

GC - MS联用技术是利用气相色谱作为质谱的进样系统,使复杂的化学组分得到分离; 利用质谱仪作为检测器进行定性和定量分析,主要是用于定性和定量分析沸点较低、热稳定性好的化合物。GC - MS联用技术综合了色谱法的分离能力和质谱的定性长处,可在较短时间内对多组分混合物进行定性分析。

GC - MS联用技术的优点在于可以选用高灵敏、 通用性或专一性强的检测器,检测限一般为 μg /kg级,并且分析时间短,备受代谢组学研究者的青睐,常用于动植物和微生物的代谢指纹分析。它能够提供较高的分辨率和检测灵敏度,并且有可供参考、比较的标准谱图库,可以方便地得到待分析代谢组分的定性结果,但是GC - MS联用技术不能直接得到体系中难挥发的大多数代谢组分的信息[5]。

1. 3 LC - MS联用技术

LC - MS联用技术的基本原理与GC - MS联用技术类似,但它是利用液相色谱作为质谱的进样系统的。目前,LC - MS联用技术已经被广泛地应用在生物样品分析中,主要可解决如下几方面问题: 不挥发性化合物分析测定,极性化合物的分析测定,热不稳定化合物的分析测定,大分子量化合物( 包括蛋白质、多肽、多聚物等) 的分析测定[5]。

LC - MS联用技术经济实用,适用于那些热不稳定、不易挥发、不易衍生化和分子质量较大的物质。 质谱多通道监测的功能和色谱卓越的分离能力,使LC - MS联用技术对检测样品的浓度和纯度要求,与NMR技术相比明显降低,甚至对含量极低的物质,也能通过优化质谱的扫描模式给出可视化响应。同时, LC - MS联用技术又有较好的选择性和较高的灵敏度,得到了越来越广泛的应用。液相色谱技术强大的分离能力和高灵敏度使人们认识到它也可以用于生物体液指纹谱[6]。

2代谢组学平台在兽药检测中的研究应用

2. 1 NMR技术

J. K. Nicholson等[7]最早将NMR技术与模式识别技术结合起来检测代谢表型中的动态变化,用于药物毒理标示物的研究,由J. M. Nicholson等人主持的、 五大医药公司参与的Consortium for Metabonomic Tox- icology ( COMET) 项目是利用代谢组学方法预测化学品毒性最有影响和代表性的研究,该研究利用NMR技术分析了约150种药物( 或化学品) 对啮齿动物尿液、血液和部分组织代谢的影响,证明代谢组学方法应用于研究药物毒理的可行性和稳定性,并建立了用于临床前候选化合物的肝脏和肾脏毒性预测筛选的专家系统[8 - 9]。

L. Li等[10]利用NMR技术研究中药制品黑顺片对雄性大鼠的毒理效应,结果发现: 尿液中的牛磺酸和三甲胺氧化物与对照组相比明显减少,而柠檬酸盐戊酮异二酸琥珀酸盐和马尿酸盐的含量相对增加; 此外,毒性效应具有剂量依赖性和积累效应。

李建新等[11]以生物核磁共振结合模式识别技术和主成分分析法探讨雷公藤甲素口服给药对大鼠尿液内源性代谢产物的影响,结果发现,大鼠尿液的代谢物谱与雷公藤甲素对肾脏造成损害作用密切相关。

姚凤云等[12]利用NMR技术分析畜禽抗感染主导药物———盐酸恩诺沙星的制备及结构确证,结果表明,盐酸恩诺沙星的体外抑菌效果与恩诺沙星一致, 即成为酸式盐后没有对恩诺沙星的抑菌效果产生影响。

李金贵等[13]利用X射线粉末衍射( XRD) 和核磁共振氢谱(1H NMR) 技术研究了青蒿素- β - 环糊精包合物的表征,结果表明,不同剂量青蒿素预防鸡感染柔嫩艾美耳球虫指数均低于160,说明其防治效果不佳。

雷红涛等[14]利用甲硝唑与琥珀酸酐反应,合成半抗原甲硝唑半琥珀酸酯,再用1H NMR技术进行鉴定,结果表明,成功合成全抗原,为进一步制备甲硝唑抗体治疗鸡、火鸡组织滴虫病及牛毛滴虫等病奠定了基础。

2. 2 GC - MS联用技术

GC - MS联用技术发展已相当成熟,应用相对较多。L. M. He等[15]通过该方法对饲料中的莱克多巴胺( RAC) 和克伦特罗( CLB) 进行检测,其最低检测限RAC为4 μg /kg,CLB为2 μg /kg,可进行确证性检测及消除应用高效液相色谱方法可能带来的假阳性。

刘琪等[16]应用GC - MS联用技术测定动物组织及尿液中克仑特罗残留,分析了操作中衍生化、质谱参数的设定、溶剂的干扰、进样及谱库的检索等因素对测定结果的影响,结果表明,所建立的方法达到了缩短检验周期、降低检测成本的目的。

R. W. Fedeniuk等[17]利用GS - MS联用技术检测发现,牛血清中17β - 雌二醇和17β - 三氨乙基胺水平可达到pg /m L级,其检测水平分别为5 ~ 500, 25 ~ 500 pg / m L,从而展现了GS - MS联用技术对检测激素水平的敏感性和特异性均较高。

彭莉等[18]利用气相色谱法测定牛奶中氯霉素的残留量,结果表明,回收率、批间变异系数、检测限和定量限均达到了欧盟的规定要求,适合牛奶中氯霉素残留分析。

田苗[19]利用GC - MS联用技术建立了猪组织( 肉组织、肝脏和肾脏) 中10种 β - 兴奋剂类兽药残留量的检测方法,结果显示,10种 β - 兴奋剂类兽药的检出限、回收率和精密度等技术指标能满足国内外对 β - 兴奋剂类兽药残留量的检测要求。

2. 3 LC - MS联用技术

P. Scherpenisse等[20]利用LC - MS联用技术检测孔雀石绿( MG) 在鱼体内代谢后其代谢产物白孔雀石绿( LMG) 水平,结果表明,检测范围达0. 11 ~ 0. 18 μg / kg,检测效果明显高于其他检测方法。

P. Scherpenisse等[21]再次运用LC - MS联用技术对鳟鱼、鲑鱼和罗非鱼等水产品中的兽药间氨苯酸乙酯甲磺酸盐( tricaine mesilate) 进行检测,其检测限达0. 50 ~ 0. 68 μg /kg,表明此种方法可用于部分水产品低水平兽药残留的检测,也证明了LC - MS联用技术对低剂量浓度样品检测的敏感性较强。

乔华林[22]运用高效液相色谱- 质谱联用技术, 通过优化前处理选择合适的色谱条件,实现了向水产品中添加痕量阿维菌素、氯霉素和硝基呋喃类兽药后,代谢物多组分的同时检测。

孙雷等[23]建立了猪肉组织中7种氟喹诺酮类药物残留检测的高效液相色谱- 串联质谱方法,结果表明,该方法特异性强、回收率高、变异系数小、检测限和定量限低。

李勇[24]运用液相色谱- 串联质谱的方法检测了蛋鸡服用兽药喹烯酮后,血浆、肝脏和肉组织中内源性代谢物的作用。张丽芳等人利用该技术测定鸡组织中喹啉类兽药残留标示物喹啉- 2 - 羧酸和3 - 甲基- 喹啉- 2 - 羧酸的残留含量。

曹莹等[25 - 26]运用液质联用仪先后对中兽药中非法添加的氟喹诺酮类药物及禽蛋中苏丹红的含量进行检测,结果表明,该方法特异性强、回收率高、检测限和定量限效果较灵敏。

3结语

兽药免疫检测研究 篇5

目前酶联免疫吸附法 (ELISA) 因其具有的灵敏度高, 重现性好, 检测成本低, 操作简单, 样品处理量大等特点, 已成为国内应用最广泛的兽药及违禁添加快速检测方法之一。它是将抗原结合到某种固相载体表面 (酶标板) , 让受检药物和酶标抗原与固相载体上的抗原反应一段时间后, 洗去多余的酶标抗原和杂质, 加入底物显色, 根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高, 可以极大的放大反应效果, 从而使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA检测对反应条件要求严格, 在检测过程中每一个步骤都有可能对检测结果产生较大影响, 致使同一批次的样品重现性不好或者出现假阴性、假阳性, 这影响到检测结果的准确性, 对此要采取一些相应的预防措施, 以提高检测结果的准确性。

1 ELISA试剂盒的保存

光照的影响试剂盒储存和反应时, 均应避免直接暴露在阳光下, 底物液和部分标准品对光敏感。试剂盒储藏时要在2~8℃温度条件下保存, 忌冷冻, 未使用完的试剂盒应注意把板条放入铝箔袋封口, 并放入干燥剂小袋, 以避免板条受潮失效。

2 检测前准备工作

2.1 检测室温度

试剂盒最佳的检测温度应在20~40℃之间, 温度过高或过低都会降低酶的活性, 而酶活性的降低会影响测量的准确性。试剂盒打开后, 在室内温度下至少平衡半小时, 如果室温低于20℃须在25℃的培养箱中回温。回温后于室温25℃±2℃使用, 使用时应避免阳光直射, 空调或风扇直吹。

2.2 溶液配制

在整个实验中所使用的水均需是蒸馏水。在配制样品提取液和洗涤液时一定要用蒸馏水或去离子水, 不可使用矿泉水或自来水, 否则, 里面的金属离子会对检测结果产生干扰。

2.3 移液枪的使用

加样的枪头需使用一次性的, 微量枪头清洗不干净, 很容易有药物残留, 重复使用会造成交叉污染。检测员在使用八道移液器时, 在吸取时按至第二停点, 将吸头没入试剂液面下2~3 mm, 轻缓松开按钮回原点, 慢慢提出吸头并在容器壁上停靠一下, 以去除多余试剂, 轻按按钮至第一停点, 排出液体, 保持手势不动, 再次将吸头没入试剂液面稍停片刻按至液面下2~3 mm, 轻缓松开按钮回原点, 此即为“吸二打一”式加样, 避免加样时产生气泡, 导致加样不均。加试剂时, 移液器要保持垂直;吸头有试剂时, 移液器不能平放或者倒置, 避免污染移液器, 进而污染其他试剂和样品。

3 检测仪器对检测结果的影响

3.1 酶标仪的影响

仪器每年均需要检定, 以保证仪器的准确性。酶标仪在使用前需预热30 min, 在室温条件下测定, 室温低于15℃时, 需使用加热等方式使室温保持25℃左右, 以确保酶标仪的正常运行。

3.2 微量移液器的影响

微量移液器需每年进行检定, 检定合格方可使用。微量移液器要有机相、水相分开, 贴上标签。在量取不同溶剂需更换枪头, 避免交叉使用造成污染;试剂从试剂瓶中吸出后, 不能再放回瓶中, 防止试剂污染。

4 检测员的操作对检测结果的影响

对于ELISA试剂盒来说, 检测员的熟练度对结果影响很大。检测人员上岗前需进行相关培训, 需具备基本的检测质控知识。熟练掌握ELISA检测方法的原理, 试验检测的目的, 检测员需保持认真负责的工作态度, 在实验前熟读试剂盒说明书, 对试验中的注意事项、重点难点加以标注, 特别要注意:标准品或抗体是否需要稀释、孵育温度是25℃还是37℃、酶标二抗、抗体工作液、底物液、终止液的加样顺序和时机 (试剂顺序加反通常会造成酶标板不显色, 使实验失败) 、酶标仪检测波长是双波长还是单波长。

5 关键点控制

5.1 样品前处理

样品前处理需根据试剂盒说明, 不同的样品种类有不同的处理方式。有些检测项目需要氮气吹干的方式浓缩富集药物, 在实际操作中, 除非试剂盒说明要求吹至尽量干, 否则只要吹干即可。某些样品 (肝脏样品) 剩余一些油脂很难吹干, 这些油脂干扰可以通过下一步的正己烷溶解去除。氮吹时间过长会造成药物损失严重, 回收率降低, 所以在氮吹时应随时查看吹干情况, 吹干后应尽快加溶剂复溶。

5.2 加样

不管什么试剂, 加样前均需摇匀, 加样时需将处理好的样液加在孔板底部, 避免加在孔壁上部。

5.3 洗板

洗板是关系到实验成败的关键步骤。ELISA通过洗板去除未结合抗原抗体和酶标记物, 同时也可以去除非特异性吸附的蛋白质干扰及样本中的部分杂质干扰。

手动用排枪洗板时需注意, 要垂直悬空加入液体, 吸打液体速度不能过快, 以免液体溅出, 造成交叉污染, 按照规定的洗涤液体积进行洗板, 注意不要出现孔间相溢现象。洗液尽量不要满溢或加到板孔外面, 若洗液不小心加到外面, 需用洁净无毛屑的滤纸沾干, 避免板底不洁净, 造成酶标仪读数出现误差。

5.4 孵育

孵育、显色过程中要在恒温箱里避光进行, 以保持温度的稳定。显色时间、温度需按试剂盒的规定来操作, 加完试剂后将微孔板从室温放入恒温箱时, 孔内温度从室温升至恒温箱温度需要一定时间, 尤其在室温比较低的状态下, 这段升温时间可能比较长。通常是将微孔板一放入恒温箱就开始计时, 这样就容易造成实际测定时孵育时间不够, 导致弱阳性样品测不出来。若温度相差大时, 可以适当延长孵育时间2~5 min。孵育时应盖封口膜, 否则会使孔内反应液蒸发, 导致孔板难以彻底洗净影响检测结果。

5.5 显色

底物液过期或配制时间过长也是影响实验结果的重要因素。尽可能在使用前配制底物液, 底物液禁止接触金属物品。加完底物液后的孵育时间依各孔颜色而定, 若反应时间到了, 但酶标板各孔颜色普遍较浅, 可继续显色5~10 min。

5.6 酶标仪判读结果

ELISA试剂盒内显色剂多为TMB (3, 3, 5, 5, -四甲基联苯胺) , TMB颜色底物显色后, 随着时间的延长, 颜色会逐渐消退, 因此显色并终止反应后必须尽快读数, 以免影响检测结果。测定波长一般为450 nm, 有的厂家会设有参比波长630 nm, 使用双波长可以消除试样的背景吸收干扰和混浊干扰。

综上所述, 尽管ELISA法操作简单, 但可能影响检测结果的因素也较多。故在实验操作中, 需严格按照试剂盒操作步骤操作, 同时做好室内质控、室间比对, 以严谨的工作态度对待每一份样品, 避免或减少影响因素的干扰, 力求结果准确, 为进一步加强畜产品质量监管提供可靠的数据支持。

摘要：酶联免疫吸附法 (ELISA) 因其具有的灵敏度高, 重现性好, 检测成本低, 操作简单, 样品处理量大等特点, 已广泛应用于兽药残留及违禁添加药物的快速检测。ELISA虽然操作简单, 但试验操作中各环节对试验的检测结果影响较大, 如不注意, 很可能导致显色不全、重现性不好、假阳性或假阴性的结果。本文对影响ELISA试验的常见因素进行分析并总结出解决方法, 以提高检测的准确性。