免疫检测方法（共12篇）
免疫检测方法 篇1
猪瘟(classical swine fever,CSF)是给养猪业造成巨大经济损失的病毒传染性疫病。1984年,猪瘟被国际动物卫生组织(OIE)列为A类动物传染病,即为必须上报OIE的传染病之一[1]。通过严格的防控措施,美国、加拿大等部分国家宣布成功地消灭了猪瘟,但世界范围内仍有猪瘟爆发流行的报道。养猪在我国是畜牧业传统支柱产业,猪瘟的危害仍旧十分严重。建立有效的检测猪瘟病毒(CSFV)的方法对于该病的防制和科学研究具有重要的意义。目前,全球性公认的猪瘟的诊断方法是从可疑的病料提取病原体——CSFV,然后在易感的猪源细胞上进行培养分离。随着分子生物学技术的迅速发展和人们对CSFV研究的深入,Real-time PCR、ELISA技术等新的诊断方法不断涌现[2,3],并已应用于CSFV的抗原检测和病原特性研究,但这些方法却不能用于CSFV感染组织器官和细胞的抗原定位与直观判断。为更好地探讨CSF的发生、发展规律及致病机理,研究以猪瘟阳性血清为一抗、荧光素FITC标记的羊抗猪IgG为二抗,建立了检测CSFV的间接免疫荧光(indirect immunofluorescence assay,IFA)法,以期为研究CSFV在感染细胞中的抗原定位和动态分布提供有效的检测手段。
1 材料与方法
1.1 病毒和细胞
猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),均由西北农林科技大学动物医学院预防兽医学平台鉴定、保存;猪血管内皮细胞(EC),由西北农林科技大学动物医学院预防兽医学平台传代、保存。
1.2 主要试剂和仪器
猪瘟阳性血清和猪瘟阴性血清,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所唐青海副研究员馈赠;荧光素(FITC)标记的羊抗猪IgG,由Southern Biotech公司产品;高糖DMEM干粉, Gibco 公司产品;胎牛血清(FBS),购自杭州四季青公司;荧光倒置显微镜,日本Nikon公司产品。
1.3 细胞及病毒的培养
从液氮中取出冻存的EC管迅速放入37 ℃水浴中快速融化;将冻存管中的细胞液迅速倒入新的培养皿或培养瓶中,加入适量含有10% FBS的DMEM培养基,混合均匀,放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养;18～24 h后常规换液1次,减少DMSO对细胞的伤害,以后按生长状态和密度适时传代或换液;将病毒液经过适当稀释,加入到培养板的相应孔中,100 μL/孔,37 ℃吸附1 h;补加维持液,在37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养。
1.4 IFA试验的建立
1.4.1 抗CSFV抗体最适工作浓度的确定
用十字交叉法,选择荧光清晰、明亮且稀释度最大的抗体稀释度,即为抗CSFV的阳性血清(一抗)及FITC标记的羊抗猪IgG(二抗)的最适工作浓度。同时设阴性对照、空白对照及样本自发荧光对照。一抗设立的稀释梯度为1∶50,1∶100,1∶200,1∶500;二抗设立的稀释梯度为1∶20,1∶50,1∶100,1∶500。
1.4.2 特异性试验
制备长成单层的EC培养板,分别接种CSFV、PCV、TGEV,37 ℃ 吸附1 h;补加细胞维持液至100 μL/孔,继续在37 ℃、5%CO2 恒温箱中培养24～72 h;并设正常细胞对照,然后进行间接免疫荧光试验。一抗和FITC标记的羊抗猪IgG 均按照最适工作浓度稀释,检测是否有交叉反应发生,以确定本方法的特异性。
1.4.3 空白对照试验
以PBS 代替一抗,进行间接免疫荧光试验,观察二抗本身有无非特异性反应。同时设阳性对照。
1.4.4 样本自发荧光对照试验
向新的96孔板和接毒的96孔板分别滴加100 μL PBS后直接置于荧光显微镜下,观察是否存在自发荧光。同时设阳性对照。
1.4.5 抑制试验
在固定其他条件的基础上,先将FITC标记的羊抗猪IgG 荧光抗体与过量的CSFV 一抗作等量混合,37 ℃避光作用1 h;再加在样本上进行荧光抗体染色,然后置于荧光显微镜检查样本是否有荧光出现。同时设阴、 阳性对照及空白对照。
1.4.6 敏感性试验
用PBS将猪瘟阳性血清按1∶50,1∶100,1∶200,1∶500,1∶1 000,1∶2 000进行稀释,滴加到细胞培养板孔中进行间接免疫荧光试验,以出现明显荧光的最大抗体稀释度为其检测的灵敏度。
1.4.7 重复性试验
取相同批次的细胞培养板,相同批次的CSFV阳性血清及荧光二抗,在相同条件下,不同时间进行IFA试验,观察荧光强弱是否改变,检测本方法是否具有良好的重复性。
2 结果
2.1 抗CSFV抗体最适工作浓度
通过荧光显微镜观察,当二抗稀释度为1∶500时,无论一抗稀释度多大,均无荧光或为很弱的荧光;二抗在其他3个稀释度下,一抗稀释度为1∶50和1∶500时,荧光较一抗稀释度为1∶100和1∶200弱,而在一抗稀释度为1∶200、二抗稀释度为1∶50时,荧光最强(见193页彩图1);因此,可以确定一抗稀释度为1∶200、二抗稀释度1∶50为最适工作浓度。
2.2 特异性试验结果
2.2.1 交叉试验结果
接种PCV、TGEV的细胞无特异性荧光,正常不接毒的细胞也无特异性荧光,而接种CSFV的细胞有明显特异性荧光。说明建立的IFA法与其他病毒感染无交叉反应,具有特异性。
2.2.2 空白对照试验结果
用PBS代替一抗,进行IFA,结果没有发现特异性荧光或为弱荧光,而阳性对照有明显特异性荧光,说明抗原与二抗之间无非特异性反应。
2.2.3 样本自发荧光对照试验结果
将所做的样本自发荧光对照试验置于荧光显微镜下观察,均无特异性荧光,而阳性对照试验有明显特异性荧光,说明样本本身并不发荧光。
2.2.4 抑制试验结果
抑制试验组、阴性对照组、空白对照组均无荧光,而阳性对照有特异性荧光。
2.3 敏感性试验结果
结果表明,在抗体稀释度为1∶1 000时有清晰可见的荧光,而在1∶2 000时有很微弱的荧光。
2.4 重复性试验结果
对相同批次、相同方案、相同条件、不同时间、相同判定结果进行的IFA检测,结果基本一致或只有微小变化。
3 讨论
3.1 IFA法的优越性
与检测CSFV的其他常规方法相比,IFA法不仅可以特异、直观地检测抗原,而且可以用已知抗原检测抗体,具有简单、快速、特异、直观、经济等优点,因而得到了广泛的应用[4]。采用试验建立的IFA法对CSFV进行检测,结果表明,CSFV感染EC细胞后,病毒主要分布于细胞质中,这和许保疆等[5]于2010年用建立的单克隆抗体IFA法检测CSFV的结果是一致的。本试验建立的方法以猪瘟阳性血清作为一抗,试验材料来源更方便,而且成本低、易得到,因此作为一种实验室检测方法更具有实用性,为CSFV感染的实验室诊断及CSFV在感染细胞中的定位和动态分布提供了有效的试验检测手段。
3.2 IFA法的最优条件建立
研究应用抗CSFV的阳性血清为一抗,FITC标记羊抗猪IgG为二抗,通过优化最佳工作条件,建立了一种检测细胞中CSFV的IFA法, 得出了IFA法最佳工作条件:接种病毒后细胞的培养时间为72 h,一抗稀释度为1∶200、二抗稀释度为1∶50。特异性试验结果表明,所建立的方法特异性良好。通过敏感性试验测定了IFA法中抗体稀释度在1∶1 000时具有明显荧光,而在1∶2 000时荧光很弱。在此方法初步建立的基础上,在不同时间段进行了多次试验,结果表明,本方法具有很好的重复性。用本方法检测CSFV具有敏感、特异、简便、快速、经济等优点,可用于CSFV在EC上的感染和定位研究。
4 问题与展望
试验结果表明,所建立的IFA法可以直观、方便、经济、特异地检测出CSFV,并具有良好的特异性和重复性。该方法的建立也为其他不致细胞病变病毒的研究提供了很好的借鉴。但是依然存在一些不足,如对于不同来源、不同批次的猪瘟阳性血清,即一抗,可能会得出不同的结论,因此在应用不同批次的猪瘟阳性血清进行IFA检测之前应进行预试验。
参考文献
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免疫检测方法 篇2
污水中大肠杆菌的酶联免疫检测方法研究
以城市污水处理厂二沉池出水为检测目标,比较了夹心法和直接法2种酶联免疫反应方式,分析包被抗体和酶标抗体浓度、菌液预处理等因素对检测灵敏度的影响,确定了ELISA的最佳工作条件.结果表明,检测大肠杆菌的线性区间为10CFU/mL～6×104CFU/mL,最低检测限达到10CFU/mL.与传统检测方法相比,该技术具有操作简单,节省时间和费用,反应灵敏度高等优点.
作 者：席海燕 蔡强 何苗 施汉昌 XI Hai-yan CAI Qiang HE Miao SHI Han-chang 作者单位：清华大学环境科学与工程系环境模拟与污染控制国家重点联合实验室,北京,100084刊 名：环境科学 ISTIC PKU英文刊名：CHINESE JOURNAL OF ENVIRONMENTAL SCIENCE年，卷(期)：26(5)分类号：X830.2关键词：大肠杆菌 快速检测 ELISA 污水处理厂
基于免疫的网络安全风险检测 篇3
关键词 网络安全 免疫系统 安全防控 检测流程 分析
中图分类号：TP393 文献标识码：A
0前言
网络安全检测技术存在两种格式形态，包括静态和实时动态调控。其中，静态处理结合既定目标存在的安全隐患和事件演变效应进行等级设定。此类方案可以将传统网络控制的诱导因素实现大面积挖掘，并同期处理评估细则；然而处于受攻击状态下的网络同步更新速率有所不殆，灵活的智能适应效率由此下滑。关于这部分研究工作，目前尚未有任何部门完成突破目标，相关经验积累更是严重欠缺。
1我国免疫系统网络安全风险检测现状论述
人体免疫系统属于某种免疫组织和器官混合搭配形成的架构基础，其主体功能是将自体和非自体元素进行区分，主要是借由人体内部各类淋巴细胞实现，其间如若抗原与调控细胞临界点环境稳定效果超出既定阈值范围，免疫系统内部活性元素剧增，抗体滋生能效会呈线显性效应，抗体浓度开始逐渐扩散。如果抗原抵抗能力有所不足并出现消散状态，某种活性元素释放力度会产生一定的阻碍回应，令免疫系统回转至稳定形态。
按照人体免疫系统内部抗体支撑能度和病原入侵力度进行对应联系，有关技术人员制定某种实现免疫安全风险检测的模型工具，并对不同要素个体进行宏观管制，包括抗体、免疫细胞等数学机理在内。结合免疫系统的原理内容分析，包括自体耐受限度和免疫记忆功能等，进行数学模型塑造；同时在此种理论基础上完善抗体浓度网络安全风险检测和定量计算模型素质。在使用该种制备方案环节中，技术人员可以将不同情境之中的风险指标和强度要求提炼，维持对应措施的指导价值地位。这种分析措施证明网络安全风险实施在线检测技术是存在某种有效介质突破口的，探索过程之中需要联系网络与免疫机理进行长期配对校验，有关细微调控节点的提炼工作需要投入更多集中精神。
2模型仿真流程拆解与透析
结合某地网络攻防环境试验机理进行监控驱动装置搭建，被控网络结构会对不同端口进行服务流程区分，经过网络环境内部攻击行为类别规划，流程中主要采取32位源地址信息和16位协议标志形成创新二进制抗原队列。正常状况中，因为网络运行环节中的跳跃反应不大，所以对未成熟细胞耐受期就可以认定为1；在函数匹配环节中采用某种连续对应原则对外部物理限制因素进行验证，并限制系统内部免疫细胞仿真延展能度。细胞克隆体延展环节中的细胞比例系數要做到尽量满足扩散需求，这样尽管存在外部物理因素的限制影响，有关比例系数也可暂定为数值1。然而对于抗原更新周期的选择，需要保证流程中不存在丢包隐患基础上实现大幅度提升，这样就能够提供免疫细胞合理的识别处理时限，维持后续操作的有效渗透价值。
经过系统性的验证流程分析，模型计算得出的风险值与既定网络共同面临的攻击强度存在必要的匹配效用特征，这就说明关于网络风险的实际状况反映要求已经基本达成。配合系统在网络攻击后的性能质量以及波动效果观察，技术人员在后期试验中将网络风险等级标准化为7个层次。试验流程中发现这样某种规则原理，当风险等级逐步提升时，系统性能会出现同步下降反应。为合理鉴定模型控制功能的延伸地位，技术人员针对不同攻击连锁反应标本进行多次验证；为了进一步稳固模型疏导性能，可以实现针对性的对比处理，这种对象比较措施已经成为现下网络安全评估模型改造的必要渗透途径。
实时定量的风险检测手段在固定网络安全防治工程中得到一定程度的响应。例如：在整体免疫控制环节中如果风险隐患过于突出，可以选取危险端口即时关闭手段，将处于高风险阶段的不同服务项目收回，必要时可以直接将主机关闭。这样能够确保当网络系统处于入侵危机状态时，系统稳定地位能够落实，而不致于产生崩溃结果，影响经济效益的收取规模。
3结语
按照免疫系统网络制备安全和风险积极抗拒效应进行同步验证分析，目前既有网络安全防控技术将生物免疫系统中相关抗体浓度实现扩展处理，并将转化后的数据直接应用在网络风险检测流程当中；在同期阶段中依托抗体浓度延展效应进行网络风险预控模型改造。此类手段能够很好地适应目前网络技术调控标准需求，因此实现应用价值比较广阔。
参考文献
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免疫检测方法 篇4
关键词：变异病毒,变形病毒,免疫机制,检测模型
计算机病毒是计算机技术和以计算机为核心的社会信息化进程发展到一定阶段的必然产物,自从第一例计算机病毒出现以来,随着计算机技术、网络技术的迅猛发展,计算机病毒也日益猖獗,极大的危害着计算机安全、信息安全。
病毒发展到今天已经有成千上万种,但是变异、变形病毒占了一半多。单纯的靠传统病毒检测方法诸如校验和法[1]的缺点是:对文件的变化太敏感,又不能区分正常程序引起的变动,而频繁误报警,能检测已知病毒,不能有效地检测出已知病毒的变异、变形病毒(未知病毒);行为检测法的缺点是:误报警也较高,而且实现时有一定的难度;感染试验法是一种简单使用的检测病毒方法,由于病毒检测工具落后与病毒的发展,当病毒检测工具不能发现病毒时,如果不会用感染试验法,便束手无策。
由于计算机病毒检测中遇到的问题与生物免疫系统极为相似,所以模拟使用免疫机制的人工免疫系统是解决该问题的一个方向。文中通过分析变异、变形病毒的特点,借鉴生物免疫系统高度并行、高度准确的识别非自体细胞的特性等,建立一种基于免疫机制的改进的病毒检测模型,在该模型中针对变异、变形病毒的检测主要采取两个措施:首先,对检测体采取特殊的变异策略;其次,建立变异检测器库。
1 基本知识介绍
1.1 计算机病毒
通常所说的“计算机病毒”,实际上应该被称作“为达到特殊目的而制作和传播的计算机代码或程序”,后者被称为“恶意代码”。从广义上讲,凡是人为编制的,干扰计算机正常运行并造成计算机软硬件故障,甚至破坏计算机数据的可自我复制的计算机程序或指令集合都是计算机病毒[2]。
1.2 变形病毒介绍与分析
计算机病毒代码本身对自己进行一些特殊的代码处理,对病毒代码做出一些等效处理,病毒的代码形态发生了变化,但是病毒代码的功能没有任何影响,这样的新产生病毒称为原始病毒的变形病毒[3]。表1举例对比分析病毒Win98.BlackBat代码变形前后的变化。
通过对比发现变形后的代码是在原代码的基础上进行的修改,同时添加新的代码。事实上这些新添加的代码都是垃圾代码,没有任何实质性的作用,对程序的功能也没有影响。
1.3 变异病毒介绍与分析
计算机病毒有若干可选的功能(例如:加密方法、感染类型、破坏性质、触发时间等),这些功能与被感染的系统环境有关,每一个可选功能的组合就构成一个新的病毒,新病毒与原始病毒的病毒代码是一致的,但是病毒功能有变化,所有的新病毒都称为原始病毒的变异病毒[3]。
1.4 免疫机制
计算机病毒检测中遇到的问题与生物免疫系统[4,5,6,7](Biological Immune System:BIS)遇到的问题极为相似,BIS使用一系列免疫机制有效解决了该问题,其中免疫机制包括:自体耐受、识别、抗体多样性、细胞的生存周期等。
2 模型的建立
2.1 问题域
定义[8]:问题状态空间Ω={0,1}l,l为自然数,程序特征集合PΩ,程序特征没有特定的内容,包括一切可以用来表示程序的静态和动态特征。定义[8]:自体集合,即正常程序特征集合SelfP;非自体集合,即感染病毒程序特征集合NoselfP。满足:Self∪Noself=P,Self∩Noself=Φ。病毒检测系统的目的就是区分模式:给定一个输入模式I,I∈P,系统通过检测确定这个模式是自体还是非自体。检测器集合如式(1),其中Ab为抗体,age为年龄,count是亲和力,max＿age是检测器的最大年龄,Z+为正整数集合。检测器集合分为未成熟检测器集合,成熟检测器集合、记忆监测器集合和变异检测器集合。未成熟监测器是还没有进行自体耐受的检测器,通过自体耐受的未成熟检测器就成为成熟监测器,而成熟监测器被激活后就进化成记忆检测器。未成熟检测器集合如式(2),其中是耐受期。成熟监测器集合如式(3),λ到max＿age就是成熟检测器的生存周期,ε是成熟检测器的激活门限值。记忆检测器如式(4),变异检测器集合如式(5),δ是变异检测器的激活门限值,fmatch是长度为l的串自检的匹配函数,匹配时值为1,不匹配时值为0,同时也表示x.Ab与y之间的亲和力,本模型中采用r连续位匹配规则计算亲和力如式(6)。
2.2 模型体系架构
病毒的处理过程用虚线表示,具体模型如图1所示。
变异、变形病毒的检测过程体现了该模型的改进之处,具体如下:
(1)抗原首先刺激记忆检测器,如果激活某个记忆检测器表示检测到一种已知病毒,就对该记忆检测器进行变异,产生一些变异体加入到初始变异检测器集合中,初始变异检测器再经过自体耐受,耐受成功的变异检测体保留下来进入变异检测器集合。集合代数描述为
其中:Cb(O,Cb(t-1)Cb,分别表示t、t-1时刻的变异检测集合,Cdead(t)表示检测器老化,Cprod(t)是对t轮开始时的变异检测器集合所有元素年龄加1,Cmature(t)表示耐受成功的变异检测器集合如式(7)和式(8)所示。faber(x)变异函数,fsucc成功耐受过程函数名,M(t-1)表示t-1时刻的记忆检测器集合,Ag(t-1)表示t-1时刻的抗体集合;
(2)不能激活记忆检测器的抗原刺激成熟检测器,如果某一个成熟检测器被激活表示检测到一种未知种类的病毒,该成熟检测器就进化成一个记忆检测器,同时对该检测器进行变异,产生的变异体加入到初始变异检测器集合,耐受成功后再加入到变异检测器集合中。记忆检测器比成熟检测器具有更低的激活门限值。集合代数描述与(1)中的描述基本类似,唯一不同之处是在式(10)中,其中T(t-1)表示t-1时刻的成熟检测器集合。
(3)不能被成熟检测器识别的抗原刺激变异检测器集合,如果某变异检测器能够识别抗原,就表示检测到一种变异或者变形后的未知病毒,同时该检测器进化为记忆检测器,成熟检测器比变异检测器具有较低的激活门限值。集合代数描述是Cb(t)=Cprod(t)-Cdead(t)-Cmatch(t),其中:Cmatch(t)表示进化为记忆检测器的集合。
记忆检测器是实现二次应答的免疫细胞,当病毒多次攻击系统时,记忆检测器能够很快识别病毒,执行免疫功能。但是当记忆检测器在一段时间T内都没有识别(遇到)病毒,系统即认为该病毒已经被系统永久克服,则系统自动将该记忆检测器退化为成熟检测器,加入到成熟检测器集合中。
2.3 检测器具体变异策略
通过前面对变异、变形病毒的分析知道,虽然病毒可以千变万化,但是每一种“同族”病毒的主体构造和原理基本相同。因此要想更好的检测变异变形病毒,对检测器采取的变异策略是:如果某个记忆检测器Ab∈{x|x.age=0∧x∈Mb}或者某个成熟检测器Ab∈{x|age=max＿age-1∧x∈Tb}与抗原具有r位匹配,则该检测器变异产生子代时,这r个位置上的值保持不变,其余l-r位随机变异。这样确保了子代抗体至少具有与父代抗体相同的抗原亲和力,从而不仅可以检测出原来抗原,还可以检测出原抗原的变异、变形抗原。
3 实验及结果分析
由于本模型的目的是解决单个主机中的病毒检测,所以没有采用分布式的结构(模型中加入通信机制就可以形成一个分布式的系统)。在试验中采用了一台计算机进行具体试验,内存大小为1.00 Gbit,CPU是酷睿双核1.60 GHz,操作系统环境是WindowsXP;试验中检测器的长度l=24,其中这24个字符是从26个英文字母和0～9共36个字符中选取的;用了120个自体,这些自体也是24个字符的字符串,是在重要的系统文件中提取出来的,这些系统文件都是可执行文件,包括.com,.exe;抗原也是由24个字符组成的病毒特征码,由如:WIN32.KRIZ.4250、CAW.1531、CAW.1525等40个病毒特征码(包括变异、变形特征码)组成,匹配函数采用连续位匹配。
对检测性能的衡量最基本的方法是通过检测率、否定错误率以及肯定错误率来衡量。在本试验中,先从这40个特征码中选择了10个特征码(抗原)进行检测,把其余的病毒特征码(前10个病毒的变异或变形病毒特征码)和120个自体混合起来对其检测,引入变异检测库与不引入变异检测库各自对比关系如图2所示。
通过以上对比分析,在引入变形检测器库后,对那些看起来像病毒但又不能直接下结论的,再通过变异检测器检测后下结论,这样提高了识别效率,也降低了肯定错误率和否定错误率。
4 结束语
提出的病毒检测模型改进之处是:不仅对检测器采取了特殊有效的变异策略,而且建立了变异检测器库,这样不仅能够检测出已知病毒,而且可以检测出已知病毒的变异变形病毒,同时降低了肯定错误率和否定错误率。此外检测器死亡机制及检测器间的转换可以限制各个检测器集合的大小,仅仅保留一个各自最优秀的集合,这在对时间性能要求较高的病毒检测系统是很重要的因素。
参考文献
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免疫检测方法 篇5
摘 要：目的：分析患者输血前血源性的e传染病的感染情况。方法：采用ELISA法对拟输血的患者进行输血前乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)、丙型肝炎病毒抗体(抗-HCV)、人类免疫缺陷病病毒抗体(抗-HIV)及梅毒螺旋体抗体(抗-TP)四项与输血相关的血源性的传染病病毒标记物检测。结果：19 587例患者中HBsAg、抗-HCV、抗-HlV、抗-TP阳性率分别为11.52%、0.68%、0.24%、2.26%，总阳性率为14.7%。结论：患者输血前检测输血免疫全套可以避免和预防医院感染及交叉感染，降低职业暴露的危险，加强医护人员的自我保护，减少因输血引起的医疗纠纷。
关键词：输血;HbsAg;抗-HCV;抗-HIV;抗-TP
输血是临床上治疗和抢救患者常用治疗手段之一，但输血也存在感染相关传染病的风险，由此带来的医疗纠纷近年来时有发生，安全输血逐渐受到人们的重视。6月卫生部发布了《临床输血技术规范》，要求对有输血可能的患者进行输血免疫全套检查，包括HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP。文章对四川省南充市中心医院19 587例拟输血患者行输血免疫全套检测，有助于了解输血前患者的感染情况，对减少患者医院内感染及交叉感染，防止出现医疗纠纷，保证医疗安全有着非常重要的意义，现报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料：选取～在我院住院的拟输血者19 587例，其中男9 878例，女9 709例，标本均予术前或首次受血前采集测定。
1.2 试剂与方法：HBsAg、抗-HCV、抗-HIV试剂由郑州安图绿科生物科技有限公司提供，抗-TP由珠海丽珠生物公司提供，TPPA试剂由日本株式会社提供。均采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定血清HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP。HBsAg、抗-HCV，阳性需复查试验。抗-HIV阳性标本需送南充市疾控中心确诊，抗-TP阳性标本用TPPA确认。
1.3 仪器：奥地利产Anthos酶标仪、Anthosav1洗板机。
2 结果
19 587例拟输血者中HbsAg、抗-HCV、抗-HlV、抗-TP阳性率分别为11.52%(2 256例)、0.68%(133例)、0.24%(47例)、2.26%(442例)，总阳性率为14.70%(2 878例)。
3 讨论
输血作为一种特殊而有效的方法已经广泛应用于临床治疗，但是随之产生的问题是由输血引起的血源性医院感染。随着临床用血及血液制品的不断增加，因血液而感染艾滋病、丙型肝炎、乙型肝炎、梅毒等疾病给社会稳定和经济发展造成了严重影响。近年来，随着《献血法》、《血液制品管理条例》等一系列法律、法规的`颁布实施，献血者筛查的加强和完善，临床检测技术的提高，血液质量有了很大的提高，有效预防和抑制了经血液途径传播的疾病。但是由于“窗口期”以及“漏检率”的客观存在，仍然有血源性医院感染的可能。患者在输血前是否已被感染，应与输血感染进行鉴别，已避免医疗纠纷的发生。据统计，我国输血后乙肝感染率为0.1%、丙型肝炎为0.2%～0.4%、HIV为0.0001%[1]。本研究显示，我院患者在手术及输血前输血免疫全套检测中所患传染病总阳性率为14.7%，说明有相当部分患者在入院前就已感染了传染性疾病，拟输血前检查显的尤为重要。我国是HBV感染高发国家，我国现有HbsAg携带者约1.2亿人，HBV感染人数超过7亿人，本次检测统计HBsAg的阳性率为11.52%，说明乙型肝炎病毒仍是血液检测不合格的重要原因[2]。丙型肝炎病毒(HCV)主要经血液传播，其携带者是输血中最具潜在危险性的传染源。本研究显示抗-HCV检出阳性率为0.68%，低于全国水平。血液是传播HIV的重要途径之一。据WHO统计，全球HIV感染者约5%～10%为经血液感染，因此预防输血传播HIV，对预防和控制艾滋病传播具有重要意义[3]。本次检测抗-HIV为0.24%，呈逐年上升趋势，检测率虽低，仍不能忽视。梅毒是由梅毒螺旋体感染引起的性传播疾病，也是血液传播疾病之一。近年来，我国梅毒发病率呈逐年上升的趋势，本次检测梅毒的阳性率为2.26%。
明确患者是否为医源性感染，需与输血前行相关检查，并可作为分析原因和处理医疗纠纷的依据。可使医护人员及时发现潜在的传染源，提前采取有效的防护措施，加强自我保护，严格器械消毒和灭菌，避免自身感染和交叉感染。同时可使患者对自己输血前的检验结果有一个明确的认识，对是否因输血而引起的血源性疾病有一个清晰的界定，明确责任，以避免或减少因输血而引起的医疗纠纷。
4 参考文献
[1] 张洪翡.安全输血的因素分析与对策[J].临床输血与检验,,22(2):302.
[2] Fu Sheng Wang.Current status and prospects of studies on human genetic alleles associated with hepatitis B Virus infection[J].World J Gastroenterol,,9(4):641.
免疫检测方法 篇6
关键词：免疫层试纸 检测 食品安全
中图分类号：TS207.3文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）14-0030-02
1 食品安全监测技术研究情况概述
食品安全对于社会和谐具有非常重要的影响，如果爆发食品安全问题，就会造成严重的社会不良反响从而严重社会的稳定发展。然而我国在过去开放式经济发展背景下，我们生活环境受到了严重影响，特别是环境污染的危害已经深入到生活的方方面面，并且是食品安全重要的潜在危害，比如农药残留超标等。除此之外食品添加剂使用超标，存储条件不完善等，都容易造成严重的食品安全问题。
对此国际上对于食品安全的重视程度越来越高，国家在应对食品安全的检测技术方面也给予了大力支持，特别是在早期防控和快速检测这两个方面发展很快，对于我国而言，在食品安全检测方面不仅面临着检测任务重，时间急的困难，同时还存在着检测设备昂贵，对于送测样品需要提前做出更加完善的准备，检测时间长等问题，这些都会要求食品安全监测技术需要具备快速检测的功能。
2 免疫层析试纸检测技术概述
在上个世纪八十年代，免疫层析技术就已经在欧美等发达国家采用，其技术原理主要是根据毛细管层析作用，在硝酸纤维素薄膜上将抗原和抗体进行结合，在这种特异性结合的前提下，通常需要高度显微镜才能够看出，但是通过层析试纸技术，就能够通过创新的标记材料，让这种特异性反应能够在肉眼下看出，或者通过紫外光和红外光线来分辨，如今经过数十年的发展，用于免疫层析试纸的标记材料开始不断创新，而且有关针对标记材料的检测设备也进行了大力创新，从传统通过肉眼进行半定量检测模式转变成通过检测仪器快速读取定量方式，这有效的提升了检测速度，同时也提升了检测的精度。
免疫层析试纸主要是由样品垫、结合垫以及硝酸纤维素膜以及T线也就是检测线和C线又叫做质控线、吸水垫以及PVC底板等模块构成，具体如图1所示。下面就通过分析胶体金免疫层析试纸条的工作原理来说明具体的检测技术。目前针对免疫层析技术主要分为双抗夹心法以及竞争法两种模式。对于双抗夹心法来说，主要是将样品放到样品垫上，然后试纸条中的毛细管就会吸收这个样品中的抗原，并经过通过胶体金材料标记过得抗体结合垫，并在这个结合垫上进行反应，此时继续层析会衍射到T线，此时抗原又会被T线上的抗体所吸引，而过量的金标抗体会继续层析，此时又进一步被C线中的抗体捕捉，这时候就会出现C线和T线同时变红，于是就可以证明是阳性。如果T线不变，但是C线变红，这实际上也说明呈阴性。如果C线没有变化，那就表示这个试纸条检测效应消失。竞争法模式的显色效果和双控夹心模式属于对立面。
3 免疫层析试纸技术研究进展
3.1 检测模式
目前这种技术根据检测模式来划分主要有单检检测和多检检测两种模式。下面就对这两种技术进行简要分析：第一，单检技术。在检测试纸条上只有一条T线和C线就是所谓的单检查技术。这种技术检测准确，灵敏度高，呈现假阳性可能性极低，这种检测技术主要针对少量人员的检测。
第二就是多检测技术，这种技术主要是纸质条上含有两条或者两条以上的T线，但是只有一条C线。那么这种技术就能够在同一个纸条上进行多种检测，因此有效提升检测效率，同时也能够节约相应的检测材料，不过在检测灵敏度方面就相对欠缺，特别是当有害物质浓度较为稀薄时，就很难被检测出来。
3.2 试纸外型
免疫层析技术经过多年的发展，其试纸条的形状也开始呈现多元化的发展趋势，既有双层析通道也有十层析通道，并且能夠在同一个纸条上获得两种或者以上的有害物质。第一，双向层析试纸。这是由梁新苗设计的一种更方便放样的一种新型试纸条类型。这种外形同时还有效节约了相关材料，并对葫芦科病毒有很强的检测能力。且还具备操作方法简单，灵敏度高，检测准确度高的优势。
第二，十通道免疫层析试纸。这种技术是建立在一个试纸槽技术基础上，这个试纸槽含有十个试纸盘，然后在试纸槽中间增加一个引流片，从而保证样品液能够均匀进入到试纸槽之内，于是就能够实现均匀的层析效应。这种检测方式不但具有单通道试纸技术的优势，同时一次性还能够测试多种，所以有效提升了测试效率。
3.3 检测手段
这种技术的核心就是生物技术，并在食品检测方面的应用取得了极大的成功，而随着免疫层析技术的不断发展，再加上融入其他先进的科学知识，如光电传感器的应用，以及自动化技术的使用等，能够从之前的定性检测，逐渐发展到现在的定量检测，有效提升了检测效率和精确度。
4 目前免疫层析试纸技术应用现状
当前免疫层析技术的应用非常广泛，比如在临床检测诊断方面，就可以利用免疫层析检测技术来实现对乙型肝炎病毒的检测，还能够对口蹄疫病毒以及禽流感病毒等进行科学检测。而在食品安全层面，免疫层析试纸技术则能够对食品中潜在的有毒物质进行全面的检测，而且检测方法简单，成本也相对比较低廉。
目前针对免疫层析试纸的广泛应用在定量问题方面还有一定的瓶颈，由于传统的试纸仅仅能够提供半定量的检测，不过这已经比传统的试纸只能够进行定性检测已经取得了重要成绩。但是这种半定量的检测模式，显然还不能够成为当前免疫层析试纸未来的发展，因为从技术突破来看，定量的层析试纸技术才是最终的发展目标，也是当前研究的重要内容。如今在国内外，有关免疫层析试纸条技术应用较为成熟的产品是胶体金免疫层析试纸条。这种标记技术还不能够做到全定量，而在生物技术和纳米科技以及光电技术的持续发展基础上，新型的标记材料会不断涌现，这对于定量检测的最终研究提供了重要的技术基础，而定量检测技术的成功研发，必将为食品的安全监测提供强大的技术保障。
参考文献
[1]周思，肖小华，李攻科.食品安全快速检测方法的研究进展[J].色谱，2011（07）.
[2]李康，应美蓉，盛慧萍，桑丽雅.胶体金免疫层析技术在真菌毒素快速检测中的应用[J].食品安全质量检测学报，2013（02）.
[3]王静，王淼.我国食品安全快速检测技术发展现状研究[J].农产品质量与安全，2014（04）.
免疫检测方法 篇7
1材料和对象
1.1乙肝免疫复合物乙肝免疫复合物用酵母表达基因重组乙型肝炎疫苗(HBsAg,深圳生物工程公司出品,10μg:1ml/支)与高效价人乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG,华兰生物工程公司出品,200IU:2ml/支)按照1μg:10IU的比例配制的抗原抗体复合物。
1.2细胞免疫反应实验刺激物HBsAgMHCⅠ多肽,由北京赛百胜公司合成,溶于二甲基亚砜溶液,阳性对照刺激物:ConA(Sigma公司产品)。
1.3细胞免疫检测试剂和仪器淋巴细胞分离液和购自华美生物工程公司;1640培养基、胎牛血清为Sigma公司产品;IFN-yElispot检测试剂盒购自为Mebtech公司;Elispot自动检测仪为美国GE公司产品;
1.4研究对象:为乙型肝炎病毒慢性无症状携带者20人,男女各10人,签署知情同意书作为研究志愿者,首先经过全面体检,排除其它疾病,。
2实验方法
2.1乙肝免疫复合物注射时间和剂量:患者分为两组,每组10名患者,乙肝免疫复合物分别以HBsAg量5μg/次和10μg/次给受试志愿者进行腹部皮下注射,分别于免疫后1周、2周、4周抽静脉血10ml;按照淋巴细胞分离液说明书方法分离制备淋巴细胞悬液并计数,调整细胞浓度为5×106/ml,每孔加入0.1ml;阳性对照为ConA(浓度为1μg/ml),空白对照为不加细胞的培养基;检测孔为HBsAgMHCⅠ多肽(浓度为2μg/ml),阴性对照孔无刺激物。加样后的反应板于37℃5%CO2孵箱培养20～24小时后上机检测IFN-γ的细胞频数(SFC),计算法为:斑点数=刺激孔斑点数-对照孔斑点数[2]。
2.2检测结果判定:检测孔阳性标准:①对照孔SFC≤5时,样本孔SFC≥10;②对照孔5
3结果
3.1乙肝免疫复合物在免疫后不同时间的细胞免疫应答如图所示,免疫接种后,5μg/次剂量组IFN-γSFC在各个时间节点上均显著低于10μg/次剂量,两组相比有显著统计学差异;两组检测值均在两周是SFC最多,因此,乙肝免疫复合物选择10μg/次剂量是免疫效果最强,而在免疫后两周时检测最敏感。
4讨论
检测细胞免疫反应的方法许多,其中Elispot方法是国际公认的最为可靠的方法之一,具有较高的敏感性、特异性和稳定性,可重复性好,操作简单易行,而且在检测抗原特异性效应细胞数量的同时,也能反映其免疫功能强弱[1]。因此,可以作为乙肝免疫复合物免疫反应中检测细胞免疫反应的检测方法。
因为乙肝免疫复合物分子量大,首先应该被抗原提成细胞摄取、提成抗原给T细胞,才能完成细胞免疫;[2]而多肽刺激物直接刺激CD8+T细胞分泌IFN-7发挥抗病毒的作用。不同的刺激物浓度对检测水平有影响,比较的结果,终浓度2μg/ml时,反应达到稳定水平,作为继续研究的最佳检测实验条件。通过本研究初步建立了乙肝免疫复合物注射后慢性乙肝病毒携带者细胞免功能研究的基本检测方法。
摘要：目的:构建乙肝免疫复合物作为治疗性乙肝疫苗的细胞免疫功能检测方法并摸索最佳试验条件。方法:选择乙肝病毒携带者10人,用酶联免疫斑点实验方法检测外周血淋巴细胞分泌IFN-γ的细胞频数(SFC);探索最佳实验条件。结果:该方法用于免疫复合物作为治疗性疫苗治疗乙肝病毒携带者的免疫功能检测,最佳免疫剂量为10μg组;初次注射后4周患者的SFC开始下降。结论:检测淋巴细胞分泌IFN-γ的细胞频数(SFC)的酶联免疫斑点实验方法可以作为乙肝免疫复合物作为治疗性乙肝疫苗治疗乙肝病毒携带者的细胞免疫功能检测,并且证明其有良好的重复性。
关键词：免疫复合物,乙肝疫苗,细胞免疫,检测方法
参考文献
[1]尚小英,庞学雯,张华刚,等。酶联免疫斑点法检测抗原特异的CTL免疫应答实验条件的优化,中华微生物学和免疫学杂志,2002,6,23~25
免疫检测方法 篇8
我国规定生活饮用水中2, 4-D限量为0.03 mg/L[7], 检测方法为GC-ECD法[8];还制定了食品中2, 4-D的限量[9]和GC-ECD和HPLC-MS的检测标准[10,11]。目前, 国内外的2, 4-D残留检测方法绝大多数为GC-ECD或HPLC-UV检测。GC法不仅需要对样品进行预处理, 而且需要衍生化, 较为繁琐;HPLC-UV检测成本相对较低, 但是对于痕量检测, 紫外检测器的定性能力不足, 必须消除基质的干扰, 其可靠性不如MS检测器。HPLC-MS定性准确, 灵敏度好, 但设备昂贵, 同时必须考虑基质效应对目标分子离子化效率的影响。总之, 仪器检测方法不仅仪器昂贵, 检测费用高, 样品前处理方法繁琐, 并且需要专业的技术人员操作, 而近些年来新兴起的免疫学分析技术在这方面具有很大的发展前景。
1 免疫学检测方法
免疫分析法 (IA) 是利用抗体对目标检测物抗原进行特异性识别的特性, 从而达到定性和定量分析的分析技术。
1.1 酶联免疫吸附分析法 (ELISA)
酶联免疫吸附测定是将抗原或抗体吸附在固相载体表面, 通过加入酶标抗体或抗原, 进行抗原抗体反应, 形成酶标免疫复合物, 洗涤后, 游离的酶标抗体或抗原被洗掉, 再加入酶底物与免疫复合物结合显色, 进而进行定性或定量测定。
于基成等[12]通过活化酯法和混合酸酐法合成2, 4-D-BSA和2, 4-D-OVA, 再分别采用UV法和间接ELISA法进行鉴定。结果是2种方法合成的完全抗原中2, 4-D和蛋白质的偶联比分别为24∶1和17∶1, 抗血清效价为1.28×104~2.56×104, 成功合成了2, 4-D的完全抗原。许艇等[13]制备了2, 4-D特异性多克隆抗体, 用间接ELISA法检测抗血清效价和竞争性ELISA法检测2, 4-D。结果2, 4-D与BSA和OVA的偶联比率分别为32∶1和18∶1, 抗血清效价>6.4×105, 在优化条件下2, 4-D检测限达37 ng/m L。李会娜等[14]也做了相关研究, 获得的抗血清效价达1.6×105, 2, 4-D检测限达50ng/m L, 李会娜等[15]随后又用该方法测定了地下水、蔬菜和原粮等样品中的2, 4-D含量。检测样品中的2, 4-D含量变异系数<15%, 样品回收率误差在<15%。上述方法抗体对2, 4-D的检测灵敏度不高, 影响因素可能是抗体对2, 4-D与载体蛋白之间的连接键的亲和力强于对2, 4-D的亲和力;或2, 4-D与载体蛋白偶联过程中改变了2, 4-D分子中的电子云排布, 出现新的空间构象, 从而产生了一些针对这些空间构象特异性抗体。因此, 若要提高2, 4-D的检测灵敏度, 需改变免疫原的合成方法或者制备高特异性的单克隆抗体。王升吉等[16]通过改良EDC法, 最终获得的2, 4-D类农药多克隆抗体对目标检测物2, 4-D、2, 4-Dbutyl ester灵敏度与上述方法相比确有提高, 抑制中浓度 (I50) 、检测限 (I20) 分别为2, 4-D 179.80、1.09 ng/m L;2, 4-D butyl-ester 3 010.00、1.53 ng/m L。余若祯等[17]制备了小分子环境污染物的多克隆抗体, 优化了抗原合成的多种反应条件, 得到了多种结合比的2, 4-D-BSA完全抗原。首次通过balb/c小鼠的免疫试验评价不同结合比完全抗原的免疫性能。随后余若祯等[18]又采用自行制备的2, 4-D单克隆特异性抗体, 建立了水中2, 4-D的间接竞争ELISA检测方法。采用添加乙醇的反应缓冲体系削弱样品基质效应对检测结果的干扰。但是平行样品测定数据之间的变异系数较大, 需要进一步改进检测方法。龚芳等[19,20,21]在成功获得了特异性好、亲和力较高的鼠源抗2, 4-D多克隆抗体血清之后, 又通过杂交瘤细胞技术成功获得了高敏感性、高亲和力和高特异性的2, 4-D单克隆抗体, 其筛选出的3株特异性高的杂交瘤细胞1F11、2A12、2G12单抗亚型均为lg G1型, 对2, 4-D的IC50分别为801、1 332、1 564 ng/m L。2, 4-D单克隆抗体相比多克隆抗体灵敏度大大提高。陆欢等[22]采用产自美国的水样专用2, 4-D试剂盒检测青椒和番茄中残留的2, 4-D, 从8种有机溶剂中筛选出基质干扰最小的乙酸乙酯作为萃取剂。灵敏度为1.782 ng/m L, 加标回收率在74%以上。随后, 魏茂琼等[23]也采用该试剂盒以直接竞争性ELISA法测定蔬菜中2, 4-D残留量。并将该方法与UPLC-MS法进行比较, 2种检测方法的灵敏度分别可以达到1.739、3.000μg/kg。2, 4-D试剂盒的问世不仅简化了检测的操作步骤、提高了检测效率, 并且其灵敏度远远高于仪器分析方法, 非常经济实用, 适合大批量样品检测。
1.2 化学发光免疫分析技术 (CLIA)
化学发光免疫分析是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应结合的新型免疫测定技术。
张静[24]首次获得鸡卵黄抗2, 4-D多克隆抗体, 并用自制的10, 10′-二烯丙基-3, 3′-二氨基-9, 9′双吖啶标记抗2, 4-D鸡卵黄抗体, 建立了2, 4-D的双抗夹心化学发光免疫分析新方法, 2, 4-D测定的线性范围为7.5×10-10~7.5×10-8g/m L, 检测限为2.04 ng/m L, 土壤样品中的2, 4-D含量为24.48 pg/m L, 回收率在96%~101%之间。CLIA技术具有特异性强、灵敏度高、线性范围宽、仪器简单、操作方便、无放射性污染等优点, 完全能够满足样品中2, 4-D快速检测的要求。
1.3 酶联荧光免疫分析技术 (ELFIA)
酶联荧光免疫分析技术是在酶联免疫吸附技术基础上发展起来的将酶系统与荧光免疫分析结合的快速检测技术。它是利用理想的荧光底物代替生色底物, 实现了提高检测灵敏度, 扩大测量范围以及减少试剂用量。
余宇燕等[25]采用活化酯法合成人工抗原2, 4-D-BSA, 通过免疫新西兰白兔获得抗血清2, 4-D-Ig G, 再用异硫氛酸荧光素 (FITC) 标记, 得到荧光抗体。采用双抗夹心荧光免疫分析法通过考察抗原抗体的结合反应的抑制活性来反映抗体与标记抗体对2, 4-D的竞争结合能力。用方阵滴定方法对双抗夹心荧光法中抗体和标记抗体的工作浓度进行筛选和确定。其线性范围为0.2~10.0μg/L, IC50=2.28, 检测限IC20=0.089μg/L。该法制备的荧光抗体仅对2, 4-D具有特异性识别能力, 而对其他类似物的交叉反应率都较低。
1.4 胶体金层析技术 (GLCA)
胶体金层析技术是以胶体金作为示踪标记物应用于免疫反应的新型免疫标记技术。王宝芹[26]通过优化2, 4-D胶体金探针的最佳偶联条件, 制备出2, 4-D胶体金试纸条, 能够在1~2 min内出线, 从而得到一种快速检测2, 4-D的方法, 检测限为10.0 ng/m L;还制备出不同2, 4-D抗体标记的磁性探针和2, 4-D-OVA标记的荧光探针, 探讨出磁性探针最佳优化条件, 得到检测限为260 mg/m L。在此基础上将磁性微球换成金磁微粒, 得到检测限达30.907 ng/m L。利用胶体金试纸条原理, 初步探究了制备金磁试纸条的方法。金磁标记的层析试纸条既具有胶体金的光学性质, 能够通过肉眼直接进行定性分析, 又具有磁性微粒的磁性, 可以通过检测磁信号进行定量分析, 大幅度提高了检测的灵敏度, 方法更简捷、效果更直观, 并且无需昂贵仪器检测, 适用于2, 4-D样品的快速检测、临场检测以及高通量检测。
1.5 免疫传感器技术
免疫传感器的结构与传统的生物传感器相似, 可分为生物敏感膜、换能器和信号数据处理器3个部分, 其中生物敏感膜的构建是决定免疫分析的关键。当待测物与分子识别元件特异性结合后, 所产生的复合物通过信号转换器转变为可以输出的电信号、光信号, 从而达到分析检测的目的。
蔡强等[27]以EDC作为交联剂, 制备偶联物 (2, 4-D-BSA以及2, 4-D-PLL) , 以2, 4-D∶偶联物=1∶16制备兔抗血清。采用丝网印刷工艺制备电极, 通过酶促反应检测还原电流的原理研制出安培型免疫传感器, 并将该传感器与传统的间接竞争ELISA法进行比较。该方法2, 4-D的检出限达到1.69 ng/m L, 线性区间1.69~30 000 ng/m L, 适合饮用水中2, 4-D的检测要求。时巧翠[28]将亚铁氰化钾溶液包埋于脂质体中, 脂质体中的亚铁氰化钾溶液, 通过戊二醛溶液的作用, 与2, 4-D免疫抗体溶液交联。采用自制MWNT′s修饰的石墨电极插入脂质体—抗体—吡咯溶液中, 通过方波伏安法测定电流值。应用该法检测尿样中2, 4-D, 其线性范围在0.05~2.50 mg/L之间, 检出限为15.4μg/L。免疫传感器具有灵敏度高、仪器简单、方法灵活多样等优点, 但是自制设备之间往往存在差异。
1.6 纳米金技术
纳米金技术是以纳米金为免疫标记物的检测技术, 其本质是蛋白质等高分子被吸附到纳米金颗粒表面的包被过程。钟菲菲等[29]利用静电吸附作用, 将2, 4-D抗体固定在由自组装L-半胱氨酸和静电吸附纳米金修饰的金电极表面, 制备出无试剂型的免疫传感器, 通过交流阻抗技术考察了电极的电化学特性。2, 4-D的检测范围为1~5 000 ng/m L, 检出限为0.5 ng/m L。该方法提高了2, 4-D抗体的固定量, 增强了传感器的灵敏度和稳定性。鲁哲[1]采用压电间接竞争免疫法来检测2, 4-D, 通过使用纳米金作二抗标记物以放大响应信号, 2, 4-D检出限为13.0 ng/m L, 该传感器再生性较好, 可重复使用9次以上且其灵敏度没有明显降低;之后也采用自组装技术与免疫竞争技术相结合, 构建安培型生物免疫传感器, 检测2, 4-D。通过在电极上进行竞争免疫反应, 用纳米金标记的羊抗鼠lg G抗体将信号进一步放大, 提高检测灵敏度, 使用交流伏安法进行检测。2, 4-D检出限为0.1 ng/m L。以纳米金为标记物的免疫分析快速检测技术具有简单、快速、灵敏度高、特异性强、样品用量少等优点。
2 展望
免疫检测方法 篇9
目前, 高效液相色谱法[12,13,14]、液相色谱-串联质谱法[5,15,16,17]等仪器分析方法被广泛应用于阿维菌素的残留分析, 但样本前处理繁琐、费时、费力、成本高, 且需专业人员操作, 很难满足对样本进行现场、批量、快速检测的需要[1,2,3,4,5]。而酶联免疫方法具有灵敏度高、设备成本低、特异性好、操作简便快速、可实现大量样本的批量检测等特点, 有利于检测工作的广泛开展。目前, 在阿维菌素的酶联免疫分析方面, 王硕等[18]进行了阿维菌素半抗原的合成及多克隆抗体的制备研究;Shi W等[19]研究报道了牛肝组织中阿维菌素、伊维菌素、依立菌素的多残留检测间接竞争ELISA;杨君宏等[20]建立了一种检测牛组织中阿维菌素类药物残留的间接竞争ELISA方法;赵卫东等[21]运用酶联免疫法建立定量检测动物源性产品中阿维菌素残留的方法;但目前尚未有在蔬菜残留检测中应用酶联免疫方法的报道。为了给现场监控农药残留提供科学参考, 该文拟建立一种灵敏、快速地检测蔬菜中阿维菌素残留的酶联免疫吸附方法[1,2,3,4,5]。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
供试材料为6~8 周龄雌性Balb/c小鼠 (清洁级, 由北京勤邦生物技术有限公司实验动物室提供) 。
仪器有KS-Ⅱ振荡器 (上海跃进医疗器械厂) ;QL-901漩涡混合器 (海门市其林贝尔仪器制造有限公司) ;8010S匀浆机 (上海斯伯明仪器设备有限公司) [1,2,3,4,5];Anke TDL-40B低速离心机 (上海安亭科学仪器有限公司) [1,2,3,4,5,6,7];微量移液器 (单道20~200、100~1 000 μL, 多道20~300 μL, 美国Thermo公司) [1,2,3];2000SBL电子天平 (美国Setra公司) ;DSY-Ⅲ氮吹仪 (北京金科精华苑科技有限公司) ;MK3 酶标仪 (美国Thermo公司) ;DHP -600 生化培养箱 ( 天津市中环实验电炉有限公司) ;均质器。
试剂有阿维菌素标准品 (纯度≥99%) 、重铬酸吡啶、羧乙基羟胺、N, N-二甲基甲酰胺 (DMF) 、碳化二亚胺 (EDC) 、N-羟基琥珀酰亚胺 (NHS) 、卵清蛋白 (OVA, 购自美国Sigma公司) 、牛血清白蛋白 (BSA) ;其他常规化学试剂 (分析纯, 购自北京化学试剂公司) [1,2,3,4,5,6]。
1.2 试验方法
1.2.1 合成半抗原。1氧化:取2.0 g阿维菌素溶解于40 m L吡啶中, 加0.8 g重铬酸吡啶于60 ℃反应3 h, TLC检测, 基本反应完全, 抽滤, 蒸干滤液, 乙酸乙酯溶解, 柱层析纯化, 得到酮基阿维菌素。2缩合:将得到的酮基阿维菌素用乙醇溶解, 取0.42 g羧乙基羟胺用4 m L水溶解后加入到乙醇溶液中, 加适量三丁胺催化, 60 ℃搅拌4 h, 检测, 原料基本反应完全, 蒸干乙醇, 水-乙酸乙酯萃取, 得到粗产物, 二氯甲烷与石油醚1∶2 重结晶, 得到半抗原产物。
1.2.2 制备人工抗原。1制备免疫原:取半抗原5 mg溶解于1 m L DMF中, 用0.2 m L水将30 mg EDC和30 mg NHS充分溶解, 再将其加入半抗原溶液中, 室温下搅拌24 h, 得到反应液 Ⅰ[1,2,3,4,5];用3.8 m L PBS (p H值7.2) 充分溶解50 mg BSA, 将反应液Ⅰ逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中[1,2,3,4,5], 于室温下搅拌24 h, 用0.01 mol/L PBS 4 ℃透析3 d, 透析液每天换3次, 可得免疫原, 分装, 保存于-20 ℃条件下, 备用。2制备包被原:将BSA替换为OVA, 其余步骤同1。
1.2.3 制备酶标单克隆抗体。按照常规方法免疫Balb/c小鼠制备腹水抗体, 用饱和硫酸铵法纯化后备用[1,2,3,4,5,22]。采用过碘酸钠氧化法[1,2,3,4,5,23], 单克隆抗体用辣根过氧化物酶标记, 合成酶标单克隆抗体。
1.2.4 直接竞争酶联免疫方法的建立。将包被原包被在96孔酶标板上, 100 μL/孔, 放置于4 ℃条件下过夜;倾去板中溶液, 用PBST洗涤3 次, 加入封闭液, 200 μL/孔, 于37 ℃温育2 h;洗涤3 次, 加入系列浓度的阿维菌素标准溶液[1,2,3,4,5], 100 μL/孔, 再加入酶标单克隆抗体溶液, 50 μL/孔, 于25 ℃避光反应0.5 h;洗涤4~5 次后加入底物液A液 (过氧化脲) 50 μL/孔和B液 ( 四甲基联苯胺) 50 μL/孔, 25 ℃ 显色15min, 加入2 mol/L H2SO4终止液50 μL/孔[1,2,3], 设定酶标仪于450 nm处测定没空吸光度值 (OD值) 。
1.2.5 绘制标准曲线。采用直接竞争ELISA方法建立标准曲线。分别选择0、1、3、9、27、81 μg/L阿维菌素标准品, 以0 μg/L时的OD值为B0值, 其他质量浓度的OD值为B值, 以标准品质量浓度的对数值为横坐标, 百分吸光度值 (B/B0) 为纵坐标, 用RIDASCREEN软件分析[1,2,3,4], 绘制标准曲线。
1.2.6 样本前处理方法的建立。在50 m L聚苯乙烯离心管中加入 (1.00±0.05) g已均质的样本, 再加入甲醇4 m L, 用涡旋仪涡动5 min, 混匀;3 000 g 20~25 ℃ (室温) 条件下离心5 min;取上层澄清液于1~10 m L玻璃试管中, 于50~60 ℃水浴氮气流下吹干[1,2,3];加入复溶工作液1 m L[1,2,3,4,5], 用涡旋仪涡动30 s, 混匀;取100 μL, 待测。
1.2.7 ELISA方法技术性能的评价。①敏感性试验。通过测定20次标准曲线的IC50, 统计其平均值和浮动范围;并测定20个空白样本[1,2], 求出其B/B0在标准曲线上对应浓度的平均值和标准差 (S) [1,2,3,4,5], 方法检测限。②添加回收试验。以5、10、20μg/kg阿维菌素标准品分别对空白白菜、黄瓜、胡萝卜样本进行添加回收试验, 每个浓度做5个平行, 用3个批次的试剂测定, 分别计算回收率和批内、批间变异系数。ELISA测定的准确度以回收率表示, 精密度以变异系数表示。③特异性试验。选择与阿维菌素具有类似结构和类似功能的药物埃普菌素、伊维菌素、多拉菌素进行交叉反应性检测。计算公式如下:交叉反应率 (%) =A/B×100, 式中A、B分别表示引起50%抑制的阿维菌素质量浓度、引起50%抑制的其他药物质量浓度, 单位均为μg/L[1,2,3,4,5]。
2 结果与分析
2.1 标准曲线的建立
以标准品质量浓度的对数值为横坐标, Logit (B/B0) 为纵坐标, 建立标准曲线, 如图1 所示。将图1 转换后可知, 在1~81 μg/L范围内, Logit (B/B0) 与标准品质量浓度对数的线性关系良好, 如图2 所示, 得回归方程Y=-2.103 1X+1.247 2, R2=0.999 0, IC50为4.1 μg/L。
2.2 敏感性试验
统计20 次标准曲线的IC50平均值为5.6 μg/L[1,2,3,4,5], 浮动范围为3.9~6.0 μg/L;20 个空白样本的B/B0在标准曲线上对应添加量的平均值和标准差如表1 所示。经综合考虑, 该方法对蔬菜样本的检测限为5.0 μg/kg。
2.3 添加回收试验
如表2 所示, 对蔬菜样品的加标回收率范围为74.8%~105.6%, 可见方法准确度较高[1,2,3,4,5];批内变异系数范围、 批间变异系数范围分别为7.5%~12.4%、8.8%~13.2%, 均小于15%, 可见方法精密度 (重复性) 良好。
2.4 特异性试验
如表3 所示, 选用的抗阿维菌素单克隆抗体与埃普菌素有130.6%的交叉反应, 与伊维菌素、多拉菌素的交叉反应分别为33.1%、<10%。阿维菌素与伊维菌素、埃普菌素之间有一定的交叉反应[1,2,3,4], 因此该方法还可以同时用于检测伊维菌素、埃普菌素。
3 结论与讨论
该研究成功制备出阿维菌素单克隆抗体, 初步建立了蔬菜中阿维菌素检测的酶联免疫吸附法。该方法的IC50浮动范围、对蔬菜的检测限分别为3.9~6.0、5.0μg/kg;样本添加回收率、变异系数分别为74.8%~105.6%、7.5%~13.2%, 检测时间45 min, 省时、省力、省成本, 适合于快速筛选大量样本中残留的阿维菌素[1,2,3,4,5,24,25,26,27,28]。
免疫检测方法 篇10
1 资料与方法
1.1 一般资料:
本组选择在2013年7月至2014年7月, 通过临床检查确诊为肿瘤的患者50例, 进行肿瘤标志物进行筛查是阴性, 其中男性28例, 女性22例, 年龄在32~66岁, 平均年龄49岁。肺癌21例, 胃癌14例, 肝癌15例。选取健康的志愿者50名, 其中男性27名, 女性23名, 年龄36~69岁, 平均年龄52.5岁, 经过检查健康状况良好, 经过其同意可以进行接下来的检测。获得的样品均当天采集后进行离心处理。
1.2 双夹心免疫吸附试验步骤
1.2.1 制备过程:
将鼠的抗肝素酶单克隆抗体包被于p H值为9.6的Na2CO3-Na HCO3的缓冲溶液中, 从中取出50μL的液体置于96孔酶标板中, 在4℃条件下放置18 h, 并用p H值为7.4的磷酸缓冲溶液反复冲洗干净, 置于有20 g/LBSA的磷酸盐缓冲液进行96孔酶标板封闭1 h, 随后反复冲洗3~5次后, 处于4℃环境下保存待用。
1.2.2 反应过程:
在96孔酶标板中分别加入200μL的血清样品, 相同血清样品重复做三个, 在室温环境下放置2 h, 随后反复冲洗5次后, 在向其中加入兔的抗肝素酶多克隆抗体100μL, 处于室温环境下放置2 h, 反复冲洗5次。将100μL稀释到20000倍的HRP标记羊抗兔Ig G置于酶标板微孔中, 在室温环境下放置1 h, 最后加入TMB显色底物50μL放置半个小时, 随后用硫酸100μL结束反应进程。在D450 nm及D603 nm条件下应用酶标仪进行检测。
1.2.3 酶联免疫吸附试验方法及其作用原理。
(1) 酶联免疫吸附试验的基本原理:酶和相应的抗体及抗抗体分子进行共价结合, 共价键的结合特点就是不影响及改变抗体的免疫学性质, 对生物学性质也不产生妨碍。被酶标记抗体可以和被吸附在相应载体上的抗原抗体进行连接。在上述溶液中加入底物, 酶可以使底物的没有颜色的还原型的供氢体转变成有颜色的氧化型的状态, 呈现出颜色的变化来反应体系的进程。为此可观察反应体系的颜色变化来判断免疫反应是否发生。在反应体系中, 呈现出的颜色深浅程度和样品中的抗体抗原的量有关, 相应的抗原抗体量多, 反应的颜色就较深。这种颜色深浅的变化可以通过酶联免疫吸附试验的检测仪器来定量测定检测[2]。 (2) 酶联免疫吸附试验, 在免疫技术中应用广泛, 其常用方法有双抗体夹心法及间接法, 双抗体夹心法主要应用于分子量大的抗原检测, 间接法多用于特异性抗体的测定。双抗体夹心法主要分为四个步骤, 首先要进行特异性的抗体和载体想结合, 反复洗涤去除杂质, 然后加入需要检测的样品, 并使之平衡一段时间, 目的是使样品中的抗原和相应的抗体结合上, 同样需要洗涤掉未结合的抗体以及杂质等。第三步需要加入酶标物, 使上述免疫结合物的抗原和酶标物进行连接, 同样进行洗涤的步骤清除杂质。酶量和样品中的要进行检测的物质量有关系。最后将底物反应变成有色的物质, 并根据颜色的深浅程度对进行定量判断[3]。
1.4 统计学处理:
选用SAS统计软件分析处理实验数据, 对每个样品的3个重复实验计算平均值及标准偏差, 对稳定性进行评估。分析健康患者血清D值的状况, 肿瘤患者血清D值的状况, 对两组的血清肝素酶的水平进行对比, 比较其差异水平, 确定此种方法对血清肝素酶的检测对辅助肿瘤的临床价值。
2 结果
对每个样品平行测定三次进行平均值的计算, 并计算微孔间的标准差都<0.019, 且相对标准偏差也要<9.0%, 从统计结果来看检测方法稳定, 可靠。经过数据处理:50名健康志愿者的血清肝素酶的D值呈现正态分布趋势, 其平均值是0.094, 处于95%置信区间内其范围在0.067~0.106。50例肿瘤的患者, 血清肝素酶的D值也呈现正态分布趋势, 平均值是0.178, 处于95%置信区间内其范围在0.152~0.191。经两组数据进行比较, 存在显著性差异, 通过对血清肝素酶D值的检测, 肿瘤患者的D值要比健康志愿者的D值明显增高。
3 讨论
肝素酶和肿瘤的产生及变化有着密切的关系, 尤其肿瘤处于转移阶段的患者体内肝素酶的水平和肿瘤的动态变化息息相关。为此, 对肿瘤患者血清肝素酶的有效检测, 可以辅助肿瘤的诊断, 用于评价其恶化程度。但就目前的研究状况来说, 因为血清中的肝素酶的存在量很低, 而且又存在特异性的免疫性质, 反应性好的抗体价格很高, 限制了此种方法的发展。现在, 在国内及国外市场上并没有相应的检测试剂盒, 相关的研究报道也很少见。因此, 研究一个可以有效的检测血清肝素酶的办法对肝素酶的发展起到很重要的作用[4]。搭建灵敏度高, 重现性好的酶联免疫吸附试验第一个需要解决的问题就是筛选出适合的抗体, 本研究综合考虑了实验准确率及成本的因素, 最终筛选出用鼠抗肝素酶单克隆抗体及兔抗肝素酶多克隆抗体, 并采用双抗体夹心法进行先关研究, 最后得到的结果稳定好, 重现性也较好。和别的检测方法比较, 此种检测方法具有材料选择简便, 操作简单的优点, 而且定量精准, 可以影响定量的因素少, 对于免疫组化及原位PCR等方法, 会因为选取的部位不同, 选取的样品大小不一或是人为的一些因素对检测的结果影响很大, 此两种方法需要在患者的身体上得到肿瘤的样本或是一些癌症组织, 进行这样的处理给患者的身体及心理上造成很大影响, 产生较大负担。采取双抗体夹心法不仅不会给患者带来身体上的伤害及心理上的负担, 还在准确及重现性上体现出自身方法的优点。最重要的是双抗体夹心方法操作简单易学, 可以动手完成也可以用仪器机械化完成, 更有利于肿瘤的筛查。本组对50例肿瘤患者的血清肝素酶水平进行检测, 其水平值显著高于健康志愿者的血清肝素酶水平值, 这一结果和国外对血清肝素酶水平的研究结果趋势相同, 这一结果可以在一定程度上说明可以选择血清肝素酶代替组织肝素酶的检测。
酶联免疫吸附试验是到目前为止使用最广的一项技术, 特异性的将抗原抗体相结合, 并使之酶的催化底物进行有效的结合起来, 检测血清中微量的肝素酶, 在操作的过程中需要对样品进行采集、保存, 准备相应的试剂, 随后进行加样品, 显色比色等步骤, 如果其中一个步骤出现人为的操作问题都会影响结果的准确性。显色这一步骤对酶联免疫吸附的方法得到的结果影响较大。目前来讲, 常用的测定显色物质是四甲基联苯胺及过氧化氢, 在辣根过氧化物酶的作用下, 产生颜色的变化。所以, 目前把研究重点放在肿瘤患者血清肝素酶水平上的研究是十分有意义的, 可以评估患者肿瘤的变化情况, 为临床的诊断提供了很好的参考和有力的依据。
参考文献
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[3]尹利民.动力学法在酶联免疫吸附试验定量检测中的应用[J].检验医学与临床, 2012, 9 (7) :852-853.
免疫检测方法 篇11
【关键词】 HBsAg；HBV
【中国分类号】 R67.18【文献标识码】 B【文章编号】 1044-5511（2012）02-0141-01
乙肝表面抗原（HBsAg），核心部分含有核心抗原即HBcAg，e抗原即HBEAg及乙肝病毒的脱氧核糖核酸即HBV-DNA、脱氧核糖核酸多聚酶即DNA-P［1］。人感染乙肝病毒后，血液内常有大量的表面抗原剩余下来，形成表面抗原血症。表面抗原本身不是完整的乙肝病毒，而是乙肝病毒的外壳，它本身没有传染性但有抗原性，它只是乙肝病毒感染的标志之一。它可以表示过去感染过乙肝病毒，或者目前正在受到乙肝病毒的感染。为此我们对慢性HBV感染人群以HBsAg浓度及自然史进行分组检测，采用捕捉法酶联免疫吸附试验(ELISA)和流式细胞术(FCM)分别测定血清双特异性免疫复合物及淋巴细胞亚群，以了解低浓度HBsAg人群的临床特征及宿主免疫功能。
1.一般资料
选择在我院接收检测的慢性乙肝病毒感染者124份的检测病理资料，男84例，女40例，年龄16-65岁，其中低浓度HBsAg血清标本36份（A组），高浓度HBsAg血清标本共68份(B组），另收集健康体检者乙肝病毒血清学标志物(HBV M)全阴性标本20份作为对照(C组)。上述所有受检者无其他类型肝炎病毒和HIV感染史，A组、 C组及B组的非活动期和免疫耐受期HBV感染者无保肝、 降酶、 免疫调节剂和抗病毒药物应用史，B组的免疫活动期HBV感染者在治疗前采集标本或近半年内无免疫调节剂及抗病毒药物应用史，血清标本置于-20℃保存待测， EDTAK2抗凝静脉血标本在2 h内测定。
2.检测方法
取EDTAK2抗凝外周血100 μL分别加入10 μL CD3FITC/CD16+56PE/CD19PC5、 CD4FITC/CD8PE/CD3PECy5和同型对照抗体进行标记，经孵育、溶血、洗涤后由专业人员在流式细胞仪上进行CD3+、 CD3+CD4+、 CD3+CD8+、 CD3-CD19+、 CD16+56+百分率测定，CD4+/CD8+比值通过CD3+CD4+、 CD3+CD8+计算获得。血清TCIC阳性率及(A)值、 淋巴细胞亚群结果比较分别采用两样本的χ2检验或精确概率法和t检验。
3. 结果
低浓度HBsAg血清标本36份中，32例分布于非活动期，呈低浓度表现达9个月-6年，平均1.6年，其中2例免疫耐受期患者HBV DNA分别达1011copies/L和107copies/L，2例免疫活动期患者中，1例HBV DNA达109copies/L， 1例HBV DNA达106copies/L，ALT在50-70 U/L之间，32例非活动期患者中，2例HBsAg/抗HBc阳性，2例HBV DNA达106copies/L；未发现低浓度HBsAg家族聚集现象及职业差别。血清标本TCIC测定结果：aP<0.05, cP<0.05 vs非活动期; bP<0.01, dP<0.01 vs B组；外周血标本淋巴细胞亚群测定结果：aP<0.05, bP<0.01 vs非活动期； cP<0.05, dP<0.01 vs C组.
4.讨论
日常生活中常会遇到一些非常健康的人在查体中发现乙肝表面抗原阳性，便以为自己得了乙肝，心情非常沮丧，而其周围的人也非常紧张，害怕自己被传染，尤其是未婚青年更为自己的前途担忧。事实上，单凭乙肝表面抗原阳性是不能断定其有无传染性的，而主要取决于病毒在肝内的复制程度。如果病毒的复制很活跃，大量的病毒颗粒釋放到血液中去，这个人的血液就有很强的传染性。反映乙肝病毒复制的指标很多，如HBsAg，HBV-DNA、抗-HBclgM等，最简单的方法就是查一下乙肝五项指标。如果HBsAg、HBeAg和抗HBc三项阳性（即为大三阳），其血液就有高度传染性；如果抗-HBe阳性，其血液的传染性就较低。
一般来说，HBsAg阳性者可以和正常人一样参加工作、学习和社交活动，他们对周围的同志不构成明显的威胁。HBsAg阳性携带者结婚前最好先查一下本人的HBeAg和抗-HBe，如果抗-HBe阳性，说明传染性较低，可以结婚；如果HBeAg阳性，就要再查对方的血清，如果是抗-HBs阳性，说明对方对乙肝病毒已有免疫力，不会再感染。如果对方HBsAg、抗-HBs和抗-HBc都是阴性，则可注射乙型肝炎病毒灭活疫苗，待体内产生保护性抗体后再结婚。
把患者血清稀释2-12倍后，与已知浓度的表面抗体相混合，产生凝集反应的最高值便为表面抗原滴度。从这里可以看出，稀释数愈大而出现凝集时，说明血清中表面抗原含量愈多。血清中HBsAg含量与传染性成正变关系，但非肯定的一致关系。高滴度的HBsAg可作为有传染性的参考指标。临床可根据乙肝表面抗原滴度的高低估计患者传染性的大小。滴度越高，e抗原（HBeAg）、脱氧核糖核酸聚合酶（DNAP）、乙肝病毒脱氧核糖核酸（HBV-DNA）阳性的可能性越大，传染性也越强。 肝炎的严重程度和HBsAg的滴度间没有必然的内在联系，譬如相同的HBsAg携带者，既可见于慢性活动性肝炎，也可见于肝硬化甚至肝癌。有些无症状HBsAg携带者，肝功正常，HBsAg滴度往往很高，而在一些重型肝炎肝功能严重损害，HBsAg滴度却较低，有时甚至是阴性。
通过测定3组人群淋巴细胞亚群发现：低浓度HBsAg组非活动期的CD3+CD8+低于高浓度HBsAg组非活动期的CD3+CD8+(P<0.05)，CD4+/CD8+则相反(P<0.01)；低浓度HBsAg组非活动期的各淋巴细胞亚群与C组无统计学意义，而高浓度HBsAg组各分期中部分或全部的淋巴细胞亚群与C组存在显著性差异(P<0.01或P<0.05)；结果提示, 低浓度HBsAg组非活动期也存在免疫耐受现象，我们认为属于低剂量耐受(低浓度HBsAg)，而高浓度HBsAg组免疫耐受期存在的耐受现象［2］应属于高剂量耐受(高浓度HBsAg)，高浓度HBsAg组非活动期、 免疫活动期则存在免疫功能紊乱现象。综上所述, 低浓度乙型肝炎表面抗原人群是慢性乙型肝炎病毒感染、传播过程中形成的一个特殊的群体，低浓度低浓度乙型肝炎表面抗原的产生并较长时间的存在不仅与机体本身的免疫复合物形成和清除能力低下有关，还与慢性乙型肝炎病毒低抗原浓度诱导机体淋巴细胞产生完全或不完全的免疫耐受有关，而且还可能与慢性乙型肝炎病毒的分子生物学机制有关，检测低浓度乙型肝炎表面抗原人群免疫耐受产生的机制及免疫耐受的打破对慢性乙型肝炎病毒的感染、传播，清除及预防具有重要的临床学意义。
参考文献
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免疫检测方法 篇12
1 材料与方法
1. 1 材料选择卫计委全国血站系统免疫检验2014 年室间质量评价血清20 份, 不定量临床检验中心定值参比血清2NCU/ml和4 NCU/ml以及无偿献血血清200 份。
1. 2 方法将免疫金标试纸加样区浸于待检血液样本中, 持续10 s后观察试纸颜色的变化, 当出现2 条红线代表阳性, 而出现1 条红线代表阴性, 其中对于阴性标本的观察需要超过30 min[2]。ELISA试剂分为间接ELISA和双抗原夹心法ELISA种, 操作步骤均严格按照相应的试剂使用说明书进行[3]。在整个操作和检测中要保证相应的洁净标准, 操作器械、操作员、操作室都要进行必要的消毒工作后才能开始检测试验。
1.3观察指标[4]观察指标为室间质量评价血清、2 NCU/ml血清、4 NCU/ml血清以及无偿献血血清的三种不同检测方法相应检测状况。
1. 4 统计学方法采用SPSS15.0 统计学软件进行统计分析。计数资料以率 (%) 表示, 采用 χ2检验。P<0.05 表示差异具有统计学意义。
2 结果
对于室间质量评价血清、2 NCU/ml血清、4 NCU/ml血清以及无偿献血血清, 使用双抗原夹心ELISA法其阳性率分别为100%、100%、100%、0 ;使用金免疫层析试验其阳性率分别为95%、100%、90%、1% ;间接ELISA法其阳性率分别为90%、90%、90%、2%。双抗原夹心ELISA法相对于其他方法更为准确, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。
3 讨论
艾滋病是当前几种治疗非常棘手的病症之一, 人们对于该病症的重视程度也是非常高的。因为艾滋病在当前并没有一个有效的治疗方式, 并且该病症具有传染性, 在患上该病后不仅会极大地影响到患者的正常生活和工作, 最为重要的就是该病症最终的致死率非常高, 所以当前社会对艾滋病的预防和治疗是非常重视的。因此唯有对艾滋病进行有效的发现并诊断确认才能更好的将患病者隔离开来, 帮助降低其传染范围。艾滋病的传播途径有母婴传播、血液传播和性传播这3 种[5]。因此经过诊断确认之后通过对其相应传播方式进行良好的预防就能在最大程度上减少艾滋病的传染。但首先在这之前对艾滋病的准确判断是非常重要的, 因此选择一个准确的检测方式能在最大程度上帮助对艾滋病进行迅速的判定最终达到良好的预防效果。而本院所采用的室间质量评价血清20 份, 2 NCU/ml血清、4 NCU/ml血清、无偿献血血清200 份使用三种方式进行检测。最终使用双抗原夹心ELISA法对室间质量评价血清、2 NCU/ml血清、4 NCU/ml血清以及无偿献血血清的阳性率检测最为贴近实际状况, 与其他方式的检测结果比较, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。
在检测中使用的免疫金标试纸、ELISA试剂等都是进行抗HIV结果检测中必不可少的试剂, 通过其发生的颜色反应进行相应的测定。虽然上述三种方法都能在极大程度上检测出抗HIV结果, 但是作为医学唯有准确才是每一个医护人员所不断追求的, 尤其是面给像艾滋病这样危害极大的病症, 任何疏忽和判断不准确都将会给人们带来极大程度的伤害, 一旦患上艾滋病对于任何患者来说都是一件残酷的事实, 所以准确的检测和判断是非常有必要的。
通过以上三种检测免疫检验方式对相应的血清进行了检验, 可以看出使用双抗原夹心ELISA法的准确率是最高的, 也就是说通过以上实验数据来看运用双抗原夹心ELISA法将能最为准确的将其体内抗HIV结果反映出来。对于任何病症, 医护人员都想要达到更好的治疗效果, 所以相较而言能达到检测效果更为精确的双抗原夹心ELISA法值得进行临床推广运用。
摘要：目的 对比分析三种不同免疫检验方法对抗人类免疫缺陷病毒 (HIV) 结果检测的可靠性。方法 对卫计委全国血站系统免疫检验2014年室间质量评价血清20份, 不定量临床检验中心定值参比血清2 NCU/ml和4 NCU/ml以及无偿献血血清200份分别使用双抗原夹心酶联免疫吸附实验 (ELISA) 法、金免疫层析试验、间接ELISA进行相应检测, 将数据记录并分析对比其结果。结果 使用双抗原夹心ELISA法对于室间质量评价血清、2 NCU/ml血清、4 NCU/ml血清以及无偿献血血清其阳性率分别为100%、100%、100%、0, 相对于其他方法更为准确, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。结论 以上三种检测方法 , 双抗原夹心ELISA法的准确度最高, 结果更加可靠, 值得进行广泛的临床推广运用。
关键词：免疫检验方法,双抗原夹心酶联免疫吸附实验法,抗人类免疫缺陷病毒,可靠性
参考文献
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