表型检测方法

表型检测方法（精选7篇）

表型检测方法 篇1

摘要：目的 分析比较氯唑西林 (CLO) 、三维试验、改良Hodge试验三种AmpC酶表型的检测方法, 总结其临床应用价值。方法 选取我院2008年12月2010年12月筛选的198株革兰阴性杆菌, 以AmpC基因聚合酶链反应 (PCR) 检测结果作为金标准, 设为对照组, 分别采取氯唑西林 (CLO) 、三维试验、改良Hodge试验, 分别设为观察组A、B、C, 观察对比其检测结果。结果 三组检出阳性率比较存在明显差异 (P<0.05) , 具有统计学意义。以观察组C参照对照组的符合率最高, 明显高于其它两组 (P<0.05) , 具有统计学意义。结论 CLO对于AmpC酶表型的检测的敏感度与符合率均较低, 采取改良Hodge试验的敏感度与特异性均良好, 符合率最高, 属于AmpC酶表型的检测中较为简便、快速、有效的手段, 具有重要的临床实用意义。

关键词：氯唑西林 (CLO) ,三维试验,改良Hodge试验,AmpC酶表型

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取我院2008年12月～2010年12月应用头孢西丁进行初筛试验后筛选出的满足AmpC酶表型筛选条件的198株革兰阴性杆菌, 以AmpC基因聚合酶链反应 (PCR) 检测结果作为金标准, 设为对照组, 分别采取氯唑西林 (CLO) 、三维试验、改良Hodge试验, 分别设为观察组A、B、C, 并与PCR检测结果作对比, 观察三种检测方法的阳性率、敏感度及特异性。

1.2 检测方法

1.2.1 初筛与制备本院应用头孢西丁进行初筛试验, 对临床选

取的198株革兰阴性菌采取纸片扩散法进行AmpC酶的表型筛选, 经纸片扩散法检测显示FOX抑菌圈直径在18 mm内, 则认为满足AmpC酶表型筛选条件。将初筛的菌株经过夜培养后的纯分离菌落置于5 mL的肉汤中接种, 然后放置在35℃下的孵箱进行4h的培养, 再以离心半径为9.2 cm, 速度为2000 r/min进行20 min的离心试验, 然后去除上清液, 把沉淀物进行5～7次的反复冻融, 再以离心半径为9.2 cm, 速度为12000 r/min, 进行20 min的离心试验, 取上清液选作酶的粗提取物[1]。

1.2.2

观察组A (氯唑西林 (CLO) 检测) 观察组B (三维试验) 观察组C (改良Hodge试验)

1.2.5

对照组 (PCR试验) 对初筛的菌株进行多重PCR检测, 并将其产物进行测序, 将其结果与Blast进行比对, 此检测我院暂无法开展, 需送到市人民医院协助检测。

1.3 统计学方法

本组检验的数据均经卡方软件V1.61版本检验, 以P<0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1

三组检测结果比较

2.2 AmpC基因扩增、测序的结果

198株革兰阴性杆菌中, PCR检测AmpC基因扩增为阳性有81株, 阳性率为40.9%, 其中弗劳地枸橼酸杆菌5株 (6.2%) 、肺炎克雷伯菌15株 (18.5%) 、鲍曼不动杆菌30株 (37.0%) 、阴沟肠杆菌31株 (38.3%) 。81株AmpC基因扩增为阳性的菌株经双向测序后, 将其结果与Blast进行比对, 5株弗劳地枸橼酸杆菌为CMY-2型AmpC酶, 15株肺炎克雷伯菌为DHA-1型AmpC酶, 31株阴沟肠杆菌为EBC型AmpC酶, 81株AmpC基因扩增为阳性的菌株中, 其核苷酸序列与相应的AmpC酶的同源性均在98%以上。

注:与为对照组相比, 差异显著, *P<0.05;为与A组相比, 差异显著, #P<0.05;为与B组相比, 差异显著, △P<0.05

3 讨论

本研究显示, AmpC酶进行表型筛选, 对比其他的表型筛选法, 以PCR试验为金标准, 改良的Hodge试验符合率最高, 其敏感度与特异性也优势突出。在选取的198株革兰阴性菌中, 对于30株鲍曼不动杆菌与31株阴沟肠杆菌采取改良Hodge试验的A mpC酶的敏感性的符合率存在显著差异, 肠杆菌科的细菌在Hodge试验中的敏感性及其符合率较高, 分别为100%和93.5%, 而鲍曼不动杆菌的敏感性及其符合率偏低, 仅为33.3%和60.0%, 因此, 在本研究中的三组A mpC酶表型检测方法中, 改良Hodge试验对于鲍曼不动杆菌的有效性仍需要进一步考究[2]。综上所述, CLO对于AmpC酶表型的检测的敏感度与符合率均较低, 采取改良Hodge试验的敏感度与特异性均良好, 符合率最高, 属于AmpC酶表型的检测中较为简便、快速、有效的手段, 具有重要的临床实用意义。

参考文献

[1]侯伟伟, 蒋燕群.三种Amp C酶表型检测方法比较[J].检验医学, 2010, 25 (2) :122-124.

[2]李轶, 蒋燕群, 汤瑾, 等.大肠埃希菌、克雷伯菌中质粒AmpC酶的流行分布[J].检验医学, 2006, 21 (5) :517-520.

表型检测方法 篇2

1 材料与方法

1.1 实验菌株

2012年3月-2014年3月本院门诊和住院患者各种标本分离出105株葡萄球菌(剔除同一病人相同标本重复分离株),所有菌株均经迪尔公司DL-96微生物分析系统鉴定到种,其中金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,SA)49株,凝固酶阴性葡萄球菌(Coagulase-negative staphylococci,CNS)56株,包括表皮葡萄球菌29株,溶血葡萄球菌12株,中间葡萄球菌9株,耳葡萄球菌1株,其他葡萄球菌5株。质控菌株:ATCC29213作为阴性对照,ATCC43300(R)为耐药对照菌株。

1.2 仪器迪尔公司DL-96半自动微生物分析系统。

1.3 培养基和药敏纸片

MH琼脂、30μg的头孢西丁(FOX)纸片为Oxiod公司产品,MH琼脂平板购自郑州安图,微量肉汤法为珠海迪尔公司产品葡萄球菌属鉴定和药敏一体板条(DL96-STAPH上)的头孢西丁微量肉汤孔(CFX4μg/ml)和苯唑西林(OXA)微量肉汤稀释孔,浓度分别为0.25μg/ml、0.5μg/ml、2.0μg/ml、4.0μg/ml。

1.4 方法

1.4.1 头孢西丁纸片扩散法检测MRS:

按CLSI[4]推荐的Kirby-Bauer法进行,菌液浓度0.5麦氏浊度。判定标准:金黄色葡萄球菌抑菌圈直径≤21mm=mecA阳性,≥22mm=mecA阴性;凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径≤24mm=mecA阳性,≥25mm=mecA阴性。

1.4.2 微量肉汤稀释法检测MRS:

取纯培养单个菌落配制成规定浓度菌液,加入到各个反应孔中包括CFX孔(头孢西丁耐药试验孔),OXA孔,上述四个浓度。36℃培养18~24h,次日观察CFX孔和OXA微稀释孔的生长情况,CFX孔只要有生长即判定为MRS;OXA的MIC>0.25μg/ml(CNS),MIC>0.5μg/ml(SA)判定为MRS。

2 结果

2.1 各表型检测MRS的发生率3种方法所获得的结果经χ2检验,P>0.05,差异无统计学意义。见表1。

2.2 表型检测方法比较

以头孢西丁纸片扩散法检测MRS为标准,其他2种微稀释法检测MRSA和MRCNS的结果分别见表2、表3。

3 讨论

CLSI推荐检测mecA基因最简便的方法头孢西丁纸片扩散法操作方便,在其检测过程中易受到菌液接种浓度、孵育温度和时间等诸多因素的影响。本文通过对比试验结果显示3种检测方法结果无显著性差异,商品化苯唑西林微量肉汤稀释法和头孢西丁微量法可以代替头孢西丁纸片扩散法。并且头孢西丁微量法和头孢西丁纸片扩散法敏感性和特异性达为100%,而苯唑西林微量稀释法与该两种方法的符合程度亦非常高,这与有关研究相符[5]。可用于常规工作中自动分析仪检测,使该检测结果可以与常规药敏结果一同检出,节约了人力物力,精简了检验流程,需要注意的是微量肉汤稀释法菌株须为纯培养,菌液浓度要适宜,否则会造成假阳性。

本文中,49株金黄色葡萄球菌有28株产生mecA基因,占55.1%,而56株凝固酶阴性的葡萄球菌中,41株产生mecA基因,占73.2%,显示了很高的分离率,这与有关报道相似[6]。提示对葡萄球菌进行mecA基因检测具有无可置疑的重要意义。研究证明葡萄球菌PBP2、PBP4与苯唑西林耐药密切相关,头孢西丁对葡萄球菌中携带有mecA基因的PBP2a有很好的诱导作用,而苯唑西林对葡萄球菌中携带有mecA基因的PBP2a的诱导作用很弱[7]。本实验结果显示,头孢西丁纸片扩法和头孢西丁微量法较苯唑西林微稀释法高,符合以上观点。

综上所述,通过对耐甲氧西林葡萄球菌微量肉汤稀释法的探讨,显示葡萄球菌产mecA基因率很高,自动化生化、药敏一体化板条上的苯唑西林微量肉汤稀释孔和头孢西丁微稀释孔能代替头孢西丁纸片法检测MRS,为指导临床正确使用抗生素提供参考,减少MRS治疗的失败。

参考文献

[1]黄明菊,王才明,吴永芳,等.耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的调查研究〔J〕.中华现代医学杂志,2003,13(9):111-113.

[2]Murakami K,Minamide W,Wada K,et al.Identificationof methicil-lin-resistant strains of staphylococci by polymrtase chain reaetion〔J〕.J Clin Microbiol,1991,29(10):2240-2244.

[3]郭志娟,冯静,卫胡静.三种方法检测甲氧西林葡萄球菌方法的评价〔J〕.实用医学杂志,2006,13(20):3581-3582.

[4]CLSI.Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing;Eightteenth Informational Supplement〔S〕.M100-S18,2008.

[5]郭志娟,冯静,卫胡静.三种方法检测甲氧西林葡萄球菌方法的评价〔J〕.实用医学杂志,2006,13(20):3581-3582.

[6]吕火祥,沈蓓琼,潘立勇,等.1997-2001年耐甲氧西林葡萄球菌临床分离率及耐药性分析〔J〕.检验医学,2004,19(3):220-224.

表型检测方法 篇3

1 资料与方法

1.1 病例

2003年1月～2011年10月在大连医科大学附属第一医院确诊的MM患者118例。年龄34～88岁,平均62.9岁,男女比例为1.23︰1.00。选择15例非MM的健康献髓者为对照组。MM的诊断参照《血液病诊断及疗效标准》[1]。

1.2 标本

治疗前取骨髓血2 m L,肝素抗凝。

1.3 主要仪器与试剂

流式细胞仪为美国BD公司,型号为FACS Vantage SE;所有单克隆抗体FITC、PerCP、PE标记的同型对照,CD138、CD33、CD7、CD38、CD20、CD13、HLA-DR、CD9、CD117、CD56、CD19、CD16、CD34、CD22、lambda、kappa均购自美国BD公司;标准红细胞裂解液购自美国BD公司。

1.4 实验方法

按照多色直接标记方法进行染色。每个上样管加入骨髓血50μL及3种荧光标记抗体各20μL,抗体组合为:(1)CD45-PerCP/IgG1-FITC/IgG2a-PE;(2)CD45-PerCP/CD138-FITC/CD33-PE;(3)CD45-Per CP/CD7-FITC/CD38-PE;(4)CD45-PerCP/CD20-FITC/CD13-PE;(5)CD45-PerCP/CD9-FITC/CD117-PE;(6)CD45-PerCP/CD56-FITC/CD19-PE;(7)CD45-PerCP/CD16-FITC/CD34-PE;(8)CD45-PerCP/lambda-FITC/Kappa-PE;(9)CD45-PerCP/CD22-FITC/HLA-DR-PE。

室温避光孵育15 min,加入红细胞裂解液孵育10 min,用PBS洗2遍,管内补足0.5 m L PBS,1 h内上机检测。

1.5 流式细胞仪分析

应用CELLQUEST软件,采集10 000个细胞的信息。通过CD45/SSC设门,根据CD45表达的强度和细胞颗粒性的大小,选取CD45表达阴性或弱阳性而颗粒性SSC值比有核红细胞大的幼稚细胞群进行免疫表型分析。

1.6 判断标准

结果判断以细胞表面抗原表达≥20%、CD34表达≥5%为阳性。

1.7 统计学方法

采用SPSS 17.0软件进行统计学分析,样本率的比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

CD45/SSC设门后可将骨髓细胞分为成熟淋巴细胞群、单核细胞群、髓细胞群、幼稚细胞群及有核红细胞群。与对照组骨髓细胞相比,MM患者骨髓中存在一群表型异常细胞,比例为5.18%～86.09%。这群细胞在CD45/SSC二维点图上的特点:CD45表达阴性或弱阳性而颗粒性SSC值比有核红细胞大,可通过SSC的荧光强度区别于有核红细胞。选定这群细胞为骨髓瘤细胞,对其进行单独免疫表型分析(见附图)。

本研究中MM细胞免疫表型特点:表达CD138108例(91.53%),CD38 112例(94.92%),CD117 52例(44.07%),CD56 85例(72.03%),CD33 30例(25.42%),CD13 21例(17.80%),CD9 35例(29.66%),Lambda 47例(39.83%),Kappa 36例(30.51%),HLA-DR 74例(62.71%),CD34 3例(0.03%),CD192例(0.02%),CD20 7例(0.06%),其他抗体均不表达。与对照组相比,MM组患者CD56、CD117、CD138的表达明显高于对照组正常浆细胞(P<0.05);而MM组CD19表达明显低于对照组(P<0.05)。CD38、CD33、CD13、HLA-DR、CD20等抗体的表达,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)(见附表)。

注:1)与对照组相比,P<0.05;2)与对照组相比,P>0.05

3 讨论

临床上,多依据形态学检查和免疫学方法检测血清及尿中的异常单克隆免疫球蛋白(M蛋白),结合溶骨性或广泛骨质疏松等[1]临床表现诊断MM。然而,MM细胞存在灶性分布的特性,部分疑似病例标本浆细胞比例难以达到诊断标准,而且成熟的MM细胞在形态学上与浆细胞相似,难以确切鉴别。近年来,随着流式细胞术技术的迅速发展以及单克隆抗体的广泛使用,流式细胞术免疫分型应用于MM的诊断和鉴别诊断成为可能。本研究118例患者骨髓免疫表型特征:CD45阴性或弱阳性,高表达CD138、CD38、CD117、CD56,不表达CD19,与文献报道[2,3]基本相符。可见,应用多参数流式细胞术检测细胞表面CD138、CD38、CD56、CD19的异常表达能够鉴别正常和恶性浆细胞[4]。

CD138(Syndecan-1)是黏附分子跨膜黏结蛋白聚糖家族成员,它的表达对控制骨髓瘤细胞生长和转移具有重要作用,而且可以作为肿瘤患者的预后因子。有研究表明,CD138可表达于患者骨髓和外周血浆细胞,但在骨髓造血前体细胞或淋巴细胞上无表达,可以作为分离细胞的相对特异性标志[5,6],CD138+/CD38++可作为识别浆细胞的特异性标志[7]。本研究中CD138在MM细胞和正常浆细胞上均有表达,但是MM细胞表达水平高于正常浆细胞。随着MM细胞凋亡,CD138表达逐渐缺失,可将CD138作为监测肿瘤细胞数量变化的标志。高水平的血清可溶性CD138和低水平的细胞表面CD138是MM预后不良的因素之一[8]。

本研究发现,CD56抗体在大多数MM细胞上有表达,但是在正常浆细胞上却未见表达,与文献报道基本一致[9,10]。可以将其作为鉴别正常浆细胞与骨髓瘤细胞的重要指标之一[11]。但是,本例中仍有33例患者不表达CD56,因此不能因为CD56阴性就排除MM的诊断。CD56属于免疫球蛋白超家族的成员,是介导造血细胞黏附的黏附分子之一,与骨髓瘤细胞和骨髓基质细胞的相互作用有关。有学者认为,CD56与MM病程的进展和恶性程度密切相关,可作为早期预测病程进展及预后的指标[12]。CD19是B细胞的主要标志,本组中118例MM患者仅有2例表达CD19,阳性率仅为0.02%,而对照组正常浆细胞的表达率达到93.33%,可见根据CD19表达水平,并结合CD56的表达,可用于鉴别正常与恶性浆细胞,前者CD19+CD56-,后者CD19-CD56+。

CD117(c-kit)是一种由c-kit原癌基因编码的跨膜蛋白受体,其配体为干细胞因子(SCF),被认为是肿瘤的相关标志,也可作为靶向信号传导抑制剂酪氨酸酶抑制剂应用的选择性标志。本研究发现其表达阳性率在不同的MM患者中不同,与肿瘤细胞的比例呈正相关,肿瘤细胞的比例越高,表达阳性率也越高;而在正常浆细胞中表达为阴性。本研究中CD38在MM细胞和正常浆细胞上表达强度较高,与文献报道一致[13,14]。有研究[15]通过CD38/SSC设门来提高MM细胞的识别,进而提高其检出率。但是,CD38在髓系、B淋系前体细胞以及成熟的淋巴、单核、粒细胞均有不同程度的表达,需要结合这些细胞的特异性标志进一步区别于MM细胞。Lambda、Kappa是浆细胞的标志。本组研究中,Lambda和Kappa的表达率分别是39.83%和30.51%,且高表达多见于瘤细胞>70%的MM患者骨髓细胞中。可见,当瘤细胞比例较高时,可以通过Lambda和Kappa的表型特征作为MM的辅助诊断指标。

表型检测方法 篇4

关键词：乙肝患者,流式细胞仪,外周血,T淋巴细胞亚群

乙肝是由乙肝病毒 (HBV) 所引起的, 在世界范围内流行, 我国是HBV感染流行区, 乙肝已是我国最重要的公共卫生问题之一[1]。乙肝病毒不会直接对肝脏造成损害, 而是通过诱发机体免疫反应间接损害。在肝细胞损害中有着决定性作用的是细胞免疫, 通过T细胞对患者抗原激活和识别产生趋化因子和调节因子, 进而影响病程及预后[2]。我们选择流式细胞仪和基因芯片技术对不同亚型的乙肝患者外周血淋巴细胞进行检测, 分析其相关性和正常健康患者的比较, 探求一种科学的检测方法, 为乙肝诊治提供依据。现将有关情况汇报如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2011年7月—2012年3月来我院进行肝病检查治疗的患者120例, 其中慢性乙型肝炎患者 (CHB) 、肝炎肝硬化患者 (LC) 、慢性重型肝炎患者 (SH) 各30例, 正常健康患者30例作为对照组。患者的诊断均符合我国制定的病毒性肝炎诊断和预防标准[3], 肝病患者中, 男42例, 女48例;患者的年龄在17岁~68岁之间, 平均年龄 (38.2±18.5) 岁。对照组中, 男患者17例, 女患者13例;患者的年龄在20岁~72岁之间, 平均年龄 (39.6±20.5) 岁。2组性别、年龄以及病程方面均没有显著性差异 (P>0.05) , 具有可比性。所有患者均在知情且自愿的情况下参与此次研究。

1.2 方法

选择美国BD公司FACSCalibur流式细胞仪对患者进行外周血淋巴细胞 (主要是CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+) 检测, 采用杭州博赛基因诊断有限公司研制生产的试剂进行HBV基因型别、HBV P区204、552位点、HBV C区1762、1764位点变异的检测, 同时检测白细胞介素、HBV-DNA、抗核抗体、免疫球蛋白Ig G、Ig A、Ig M, 转氨酶等实验室指标, 并观察患者以上指标与临床的相关性。

在患者入院后的次日清晨抽取空腹静脉血, 并采用2 m L的EDTA抗凝血进行保存, 选择分层液的密度梯度进行离心, 将制备好淋巴细胞的悬液在6 h内进行分析。在试管中加入120μL抗体及50μL抗凝全血, 3 s振荡摇匀, 在室温下避光放置约20 min后加入1 m L的溶血素, 振荡摇匀后在室温下放置10 min, 避光, 进行4 min离心, 1 200转/min, 弃上清液, 并加入1 m L的PBS, 进行1 200转/min离心, 弃上清液, 并加入400μL的PBS上机进行检测, 分析数据。HBV-DNA的检测采用聚合酶链式反应 (PCR) 进行, 每次设立每毫升浓度为107、106、105、104等4个标准品, 还要设立阴性、强阳性、临界阳性以空管等对照。

1.3 观察指标

用流式细胞仪进行CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+检测, 观察数据, 得出计数, 将其与对照组计数进行比较。乙肝病毒脱氧核糖核酸 (HBV-DNA) 的检测中, 灵敏度100拷贝/m L在1.0×103拷贝/m L以上为阳性, 观察患者与对照组之间的差异。

1.4 统计学方法

使用SPSS15.0统计学软件进行数据统计, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHB患者外周血T淋巴细胞亚群的比较

CHB患者的T淋巴细胞亚群较对照组而言有所减少, 2组比较差异具有显著性 (P<0.05) 。见表1。

2.2 LC患者外周血T淋巴细胞亚群的比较

LC患者的T淋巴细胞亚群低于对照组患者, 2组比较差异具有显著性 (P<0.05) 。见表2。

2.3 SH患者外周血T淋巴细胞亚群的比较

SH患者的T淋巴细胞亚群较明显少于对照组患者, 2组比较差异具有显著性 (P<0.05) 。见表3。

3 讨论

HBV是一种非细胞毒性的病毒, 其进入机体之后会引起一系列较复杂的免疫反应, 而患者机体会针对HBV编码的各种抗原成分而产生强弱不等的免疫应答, 与感染HBV不同的临床结果之间有密切的关系。在感染HBV和肝脏损伤的过程中, T细胞反应强度将决定病毒在急性的感染后是被清除还是潜伏背景下继续存在, 后者可能会导致患者肝癌的发生。所以, 对患者使用流式细胞术进行检测可以及时了解乙肝感染状况和免疫情况, 为临床诊断治疗提供了很大的帮助。

FCM可以测量患者染色细胞的荧光强度, 是从单细胞分析及分选基础上发展起来的, 对化学、物理等性质进行快速检测, 如密度、大小、DNA、RNA、内部结构、蛋白质等[4]。随着荧光色素化学、单克隆抗体技术的发展, 流式细胞术已成为现代技术杂交体。正常免疫学正在不断涉足其他领域, 相应的流式细胞学以其灵活、定量、快速等特点在免疫学研究中得到广泛的应用, 也在不断地改进和完善[5]。它不仅补充了荧光显微镜的功能, 还兼具二者的优点, 进而在各个方面发挥着重要的作用。在肝病研究中, 它可以动态检测患者辅助诱导性T细胞和抑制杀伤性T细胞比值变化, 进而判定细胞免疫平衡状态;其次, 流式细胞术可以对患者肝组织细胞DNA含量的变化进行检测, 从而对恶性肿瘤进行早期预测;急性重症肝炎患者在早期多伴有T淋巴细胞活化, 对患者T细胞活化状态进行检测, 可以预测肝坏死;对患者不同发病时期的细胞因子分泌状态进行研究检测, 观察患者细胞因子在肝病发展中的变化。在我们的研究中发现, CHB、LC、SH患者的外周血淋巴细胞CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+较正常患者而言有明显减少, 差异非常显著。

综上所述, 流失细胞仪具有高准确性、高灵敏度、高重复性等优点, 其操作简单、使用安全、清洁无毒, 对环境不会带来危害, 为疾病诊治提供准确的依据, 值得在临床上推广使用。

参考文献

[1]刘妍, 许智慧, 刘立明, 等.我国患者多重耐药乙肝病毒感染的基因型和表型特点[J].解放军医学杂志, 2012, 37 (6) :539-543.

[2]叶红珍, 李志勇.不同类型HBV感染人群T细胞对HBV抗原蛋白免疫应答的差异分析[J].免疫学杂志, 2013, 29 (11) :984-987.

[3]刘金涛.自身抗体在临床自身免疫性肝病中的作用和诊断意义[J].中国免疫学杂志, 2013, 29 (6) :669-672.

[4]丁宁, 黄丽利, 刘妍, 等.乙肝患者HBV特异性细胞毒T淋巴细胞的分析[J].解放军医学杂志, 2011, 36 (4) :361-364.

表型检测方法 篇5

1.1材料

本项目于2013年1月~2013年12月期间, 以灭菌棉签蘸取采集西藏林芝地区不同藏猪养殖场及散养藏猪腹泻物, 作为细菌分离病料。

1.2药品试剂

1.3仪器设备

2方法

2.1细菌分离培养

将采集的腹泻物样品无菌接种于普通琼脂培养基, 而后挑去单菌落依次接种于麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝琼脂培养基上, 置37℃恒温培养箱中培养20h, 观察结果。

2.2药敏试验

吸取分离后细菌普通肉汤培养基100μl涂布于普通琼脂平板上, 将兽医临床常用的14种敏纸片, 每3个药敏纸片等距离贴于一个琼脂平板表面, 倒置平皿37℃培养20 h观察、记录结果。

2.3抑菌结果的判定

抑菌结果判定标准见表3。

2.4 16S rR NA甲基化酶的基因检测

2.4.1模板DNA的提取用质粒提取试剂盒提取纯培养物DNA, 水煮作为模板待用。采用Primer 5设计16S rR NA甲基化酶基因1对特异性引物:rmtA。

2.4.2 16S rR NA甲基化酶[1]基因PCR检测方法PCR反应总体系为50μl, 其中包括dd H2O 36.5μl、10×Buffer 5μl、d NTP 4μl、Easy Taq酶0.5μl、上下游引物各1μl、模板2μl。反应条件:94℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 退火30 s, 72℃延伸45 s, 扩增30个循环, 最后72℃延伸7 min。反应结束后, 取6μl PCR产物, 用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测。

3结果

3.1分离培养与鉴定

在普通琼脂平板上经过37℃培养20 h, 生长良好, 圆形突起、光滑、湿润、半透明灰白色单个菌落明显[2]。见图1。

挑取普通琼脂平板上典型的单个菌落分别接种到麦康凯琼脂培养基和伊红美蓝琼脂培养基上, 37℃培养20 h, 在麦康凯琼脂平板及伊红美蓝琼脂平板上分别形成红色菌落和带金属闪光的菌落[2]。可判定为大肠杆菌。见图2、图3。

挑取麦康凯琼脂培养基上生长的单个、红色菌落接种于营养肉汤培养基中进行纯培养, 置于空气浴震荡培养箱中37℃培养20 h。见图4。

3.2药敏试验结果

经过药敏试验发现, 本次分离的大肠杆菌对诺氟沙星、阿奇霉素、复方新诺明极敏感;对氯霉素、头孢唑林、链霉素、丁胺卡那霉素、四环素、庆大霉素、头孢西丁高度敏感;呋喃妥因中度敏感;而对万古霉素、青霉素、红霉素耐药。见图5、图6。

3.3生化实验结果

对藏猪源细菌经生化试验鉴定, 参考5种埃希菌的生化反应[3], 可确定两株藏猪源细菌是埃希氏菌属大肠杆菌。见表4。

3.4基因检测实验结果

检测所用的引物中, 全部检测出P基因, 检出率100%。猪源大肠杆菌对氨基糖苷类药物不敏感, 存在耐药基因。见图7。

4讨论

4.1藏猪源大肠杆菌的耐药性

目前, 滥用抗生素问题在人类使用上得到了一定的控制, 但是在动物身上大量使用抗生素的情况依然非常严重, 特别是大动物、家畜, 对人类健康的威胁不容小视[4]。共生菌株耐药性逐渐引起公众的关注, 因为这类耐药菌株能够不断扩散, 将耐药基因从动物传播给人[5,6], 关于大肠杆菌对抗生素的耐药性问题, 早已在世界范围内引起了重视[7,8]。

所分离得到的菌株均表现出了耐药, 这说明在藏区藏猪临床上也存在大量使用抗生素、或不规范使用抗生素的现象。并在基因检测中全部检验出P基因, 所以确定其存在耐药基因。在临床上应分离病原并开展药敏试验, 以针对性地选择药物, 从而减少或延缓细菌耐药性的产生。

4.2避免耐药性的产生建议

4.2.1改善饲养管理、优化环境卫生肠道中的大肠杆菌大多为正常菌群, 属于条件致病菌。所以必须加强藏猪的饲养管理。比如, 加强通风换气, 减少藏猪圈舍内的有害气体等。

空气、饮水、饲料均是大肠杆菌的主要传播媒介, 应优化环境卫生, 比如对粪便的及时定期消毒等。特别是猪大肠杆菌病引起的仔猪黄痢、仔猪白痢和猪水肿病[9]等的粪便及圈舍的处理。处理方法有很多种, 如:生物热消毒或使用新洁尔灭、百毒杀等。同时, 加强对藏猪圈舍外环境的消毒, 比如, 对进出养殖场的设备、车辆、人员的控制、消毒, 以及定期灭鼠、灭蝇、灭蚊。对于散养藏猪还可以采取一定的隔离措施, 比如, 建立栅栏。

4.2.2减少用药导致的耐药性产生若藏猪已经发生大肠杆菌病, 应该采用多种抗生素交叉、联合使用, 按照相关规定合理使用抗生素, 以达到提高疗效降低毒性、延缓和避免抗药性产生的目的[10]。

4.2.3加强乡镇一级基层兽医工作人员的培训基层兽医工作人员是牲畜疾病预防及生病牲畜的直接用药指导。因此加强基层兽医工作人员对相关知识的学习, 普及相关医疗知识, 合理使用抗菌药。以及用药时严格掌握适应症、适当的剂量和疗程, 严格按照相关药品使用说明书使用药物, 是减少大肠杆菌耐药性产生的一个重要途径。

4.2.4加强药政管理相关行政管理部门必须根据相应法律法规加强抗生素生产、销售、广告、使用的管理, 控制新抗菌药的标准, 加强抗菌药物的质量监督, 大力整顿兽药市场。大肠杆菌耐药性是一个复杂的、持续进化的过程, 必须长期与此做斗争。

参考文献

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[9]宣长和, 马春全, 陈志宝.猪病学 (第3版) [M].北京:中国农业大学出版社, 2010.

表型检测方法 篇6

关键词：阴沟肠杆菌,超广谱β-内酰酶(ESBLs),AmpC酶,表型筛选试验

阴沟肠杆菌是一种重要的条件致病菌。近年来,随着广谱抗生素、肾上腺皮质激素、免疫抑制剂、肿瘤化疗药物的广泛使用及各种侵入性诊疗手段的增加,已成为院内感染越来越重要的病原体。阴沟肠杆菌中某些菌株在获得新的头孢菌素及氨曲南的耐药性后,继而又获得对碳青霉烯类、氟喹诺酮类及其他抗生素的耐药,因其高度耐药性、多重耐药性,造成这些被感染人群极高的死亡率,且其感染率呈逐年上升趋势,因而引起临床的高度重视。及时了解阴沟肠杆菌的耐药现状,可为该菌感染的治疗制定合理的用药方案,控制临床感染提供重要依据。革兰阴性菌的耐药问题主要是由于产生了ESBLs[1]与AmpC酶,这两种酶于20世纪80年代相继有报道,随后产酶株的检出越来越多,主要导致了耐药菌的交叉感染,成为严重的耐药问题。

阴沟肠杆菌作为一种两类酶均能产生的细菌,已倍受重视。阴沟肠杆菌是人体的条件致病菌,主要存在于呼吸道与消化道,随着院内广谱抗菌药的广泛应用及患者基础疾病的存在,免疫抑制剂、激素类药物的使用导致患者免疫力低下而出现阴沟肠杆菌的异位定植或引起菌群失调,出现的感染以长期、反复、多部位、多重耐药为特征且不易治愈,这无疑升高了院内感染率。现国内外对阴沟肠杆菌的研究甚多,从耐药性分析,检测方法及其比较,到临床应用及对策都有报道。现ESBLs与AmpC酶的检测方法已基本成熟,本研究通过对阴沟肠杆菌产β-内酰胺酶(主要是ESBLs与AmpC酶)的监测,了解临床上耐三代头孢的阴沟肠杆菌耐药的主要原因及ESBLs与AmpC酶于此类耐药中出现频率,即其流行情况,并同时统计这些耐药菌对其他抗生素的耐药情况,现报道如下。

1材料

1.1 菌株

收集2009年1月-2010年2月本院(义乌中心医院)来自各种标本对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌45例。大肠埃希菌标准菌株ATCC25922 1株。质控株为经VITEK确认产ESBLs的肺炎克雷伯菌1株。

1.2 药敏纸片

头孢西丁(FOX)、头孢吡肟(FEP)。

1.3 其他

生理盐水、克拉维酸粉剂、氯唑西林粉剂、血平板、MH平板等。

2方法

表型筛选试验[2]:(1)实验方法:按照K-B法的要求,新分离的纯菌种配成0.5McFarland密涂于血平板(ф=90mm)上,两对角分别贴上CZA、CTX和IPM、AMS。CZA、CTX与IPM间距25mm为佳 ,而与AMS间距20mm 为佳,35℃培养24h后,判断结果。(2)结果判断:①ESBLs阳性:CZA、CTX与AMS之间协同受AMS影响侧抑菌环直径-不受AMS影响侧>5mm;②AmpC酶阳性:CZA、CTX与IPM之间拮抗&受IPM影响侧抑菌环直径-不受影响侧>5mm;③ESBLs阳性+ AmpC酶阳性(1)+(2);④突变高产AmpC酶:三代头孢无抑菌圈而对IPM敏感 。

3结果

3.1 表型筛选试验结果

45株阴沟肠杆菌中表现为单产ESBLs的有35株,占77.78%;没有单产AmpC酶;表现为同时产两种酶的有10株,占22.22%;结果阴性即不产这两种酶的有3株(头孢硝噻吩纸片确定β-内酰胺酶试验阳性),占6.67%,45株阴沟中AmpC酶阳性的共有13株,占28.89%。

3.2 药敏统计结果

统计本院检出阴沟肠杆菌有264株,其中对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌有171株,占64.77%。这171株对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌耐药谱广泛,体外实验对亚胺培南敏感率为97.66%,头孢替坦敏感率为27.49%,复方新诺明为22.81%,其余氨基糖甙类、喹诺酮类等抗生素均高度耐药,而对氨苄西林与头孢唑啉呈全部耐药。而本实验的33株三代头孢耐药的阴沟肠杆菌的药敏情况,基本与总的统计结果符合,这些阴沟肠杆菌体外实验对亚胺培南敏感率为100.00%,而其他均呈现高度耐药甚至全部耐药。

4讨论

ESBLs是一种丝氨酸蛋白酶,Bush分类属Group 2,而Ambler分类属Class A ,主要由质粒介导少数由染色体介导,往往具有多重耐药性,常见于肺克、大肠、阴沟等菌中。能灭活三代头孢菌素等β-内酰类抗生素和氨曲南,不能水解头霉素类,能被克拉维酸等酶抑制剂抑制,但不能被氯唑西林所抑制。VITEK对产ESBLs细菌检出率敏感性为99.5%,特异性为100%[3]。本研究表试验结果45株阴沟肠杆菌中表现为产ESBLs 42株,占93.33%。

AmpC酶Bush分类属Group 1,而Ambler分类属Class C,主要由染色体介导少数由质粒介导,常见于阴沟,产气肠杆菌等菌。AmpC酶能被β-内酰类抗生素诱导,属诱导酶,它不能被克拉维酸等酶抑制剂抑制,但能被氯唑西林抑制。本试验结果33株阴沟肠杆菌中表现为产AmpC酶8株,占17.78%。

表型筛选检测方便且快速,为NCCLS所推荐,此方法为检测ESBLs的可靠方法,但检测AmpC酶结果易受多种因素影响,比如细菌本身对亚胺培南的诱导敏感性(有报道显示29.2%为组成性高产AmpC酶而64.2%为诱导性高产AmpC酶)等使结果不易判读。根据实验结果显示我院对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌主要产ESBLs,这与文献[4]阴沟肠杆菌以产AmpC酶为主不符,可能存在地区差异。

我院对三代头孢耐药的阴沟肠杆菌占67.32%,较文献[5]阴沟肠杆菌对三代头孢耐药率为40%～60%稍高。本实验对三代头孢耐药菌株进行了常规药敏结果统计示此类菌对亚胺培南敏感率为97.66%,与1994-2001年中国ICUG耐药性监测研究发现对阴沟肠杆菌体外活性最好的是亚胺培南(95%)相符,而头孢替坦敏感率为27.49%,复方新诺明为22.81%,其余氨基糖甙类、喹诺酮类等抗生素均高度耐药,无临床应用价值。一般三代头孢菌素应用越早、越普遍的地区,细菌产ESBLs比例越高[7],ESBLs主要由质粒介导,很容易在细菌间传递扩散,导致对抗生素耐药细菌的广泛传播,及治疗选药的困难,多资料显示治疗产两种β-内酰酶的细菌所引起的感染,应首选碳青霉烯类抗生素[4,7],而产某一种的可考虑应用复合制剂或联合用药[8]等。实验室可注意分离菌株的耐药情况对两种酶进行测定,同时对临床加以指导从而避免滥用抗生素而出现高耐药的诱导产酶菌对临床治疗带来困难,通过合理用药达到疗效同时延缓昂贵广谱抗生素的应用,减轻患者经济负担等,做到最大限度的节省人力、物力达到最有效治疗,尽量避免多重耐药的发生。

参考文献

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表型检测方法 篇7

1资料与方法

1.1一般资料:选取我院2010年1月至2015年3月收治的80例基底细胞样型乳腺癌患者作为观察对象。所有患者均为女性,年龄22~76岁,平均年龄(45.3±4.2)岁。经手术取病理标本,用10%中性福尔马林将标本固定,采用石蜡封闭,检测80例标本的ER、PR、HER-2三阴者,以及其CK5/6以及EGFR表达。

1.2方法:采用免疫组化SP法检测80例基底细胞样型乳腺癌标本的ER、PR以及HER-2、CK14、CK5/6,均按照试剂盒说明书进行染色。采用pbs作阴性对照,阳性对照为已知阳性组织,其中CK14是细胞质阳性,ER和PR是细胞核阳性,CK5/6以及EGFR是细胞膜阳性。将随机选择的7例病理标本进行荧光原位杂交法进行检测,其EGFR基因检测试剂盒按照使用说明书使用,其中EGFR呈桔红色,CEP7为绿色,两种比值>2∶1,则表明EGFR出现扩增。

1.3观察指标:观察基底细胞样型乳腺癌的结构特征、生长方式以及淋巴结转移情况。

1.4统计学分析:本研究数据以SPSS20.0软件进行分析,计量资料以(±s)表示,比较以t检验;计数资料的比较经χ2检验,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1基底细胞样型乳腺癌病理特征主要表现为肿瘤细胞呈实性巢状以及缎带状形状,其中,有21例浸润性生长、59例肿瘤周边推挤式生长。肿瘤细胞膜不清晰、呈椭圆或圆形、具有较少的细胞质、核浆比例高、异型性较大、常见核分裂象以及细胞凋亡。

2.2 80例患者中,EGFR阳性表达率为76.3%(61/80)、CK5/6阳性表达率为78.8%(63/80)。EGFR阳性表达可见图1。

2.3 80例患者中出现淋巴结转移的有34例,转移率占42.5%;出现EGFR基因扩增的患者有5例,占71.4%,且出现EGFR基因扩增的患者,其淋巴结转移率更高。选择的7例患者中进行EGFR的荧光原位杂交法检测,有5例EGFR基因扩增,有6例出现EGFR蛋白过表达,5例基因扩增者均存在EGFR蛋白过表达,另外1例EGFR蛋白未过表达的也没有出现基因扩增。也就是说,出现EGFR基因扩增的患者其淋巴结转移率相对于没有出现基因扩增的患者要高(P<0.05),且EGFR蛋白表达与EGFR基因扩增之间没有直接的相关性(P>0.05)。具体情况见表1。

3讨论

基底细胞样型乳腺癌是一种具有独特的生物学、病理学特征的新型乳腺癌[2]。根据相关研究表明,认为乳腺癌的起因源于腺上皮细胞,该疾病具有较难的预后性[3]。在医学研究中,相关研究人员根据癌基因与受体的蛋白表型进行预后治疗。随着医学技术的不断进步和完善,对其基因进行分型,主要研究出基底细胞样型、腔A型、腔B型、HER2过表达型以及正常乳腺样型。其中基底细胞样型的诊断是最为复杂的,在一些乳腺癌患者中可以发现EGFR基因扩增[4]。在本研究中,我们在80例患者中选择了7例进行荧光原位杂交法检测,发现有5例存在EGFR基因扩增,且出现EGFR基因扩增的患者其淋巴结转移率也相对较高,也就是说乳腺癌早期转移中,EGFR受体为其提供了有利条件。总之,底细胞样型乳腺癌在临床上,具有较为特殊的组织形态特点以及免疫组化特征,是一种新型的乳腺癌亚型,具有EGFR基因扩增的患者,其淋巴结转移率更高。

摘要：目的 探讨分析基底细胞样型乳腺癌病理形态特征以及免疫表型与分子病理检测的相关性。方法 选取我院收治的基底细胞样型乳腺癌患者80例作为观察对象,对其进行免疫组化CK5/6以及EGFR检测,并从中选择7例为进行荧光原位杂交检测。观察患者的病理特征以及免疫表型与分子病理检测的关系。结果 80例患者中,EGFR阳性表达率为76.3%(61/80)、CK5/6阳性表达率为78.8%(63/80)。出现EGFR基因扩增的患者其淋巴结转移率相对于没有出现基因扩增的患者要高(P<0.05),且EGFR蛋白表达与EGFR基因扩增之间没有直接的相关性。结论 底细胞样型乳腺癌在临床上,具有较为特殊的组织形态特点以及免疫组化特征,是一种新型的乳腺癌亚型,具有EGFR基因扩增的患者,其淋巴结转移率更高。

关键词：基底细胞样型乳腺癌,免疫表型,分子病理

参考文献

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