检测方法的建立论文

检测方法的建立论文（精选12篇）

检测方法的建立论文 篇1

布鲁菌病是由布鲁菌属的细菌引起的急性或慢性人兽共患传染病。布鲁菌( Brucella) 可感染羊、牛、猪及鹿等经济动物,也可感染人类,导致重大的经济损失和严重的公共卫生问题。近年来,全国布鲁菌病发病呈逐年上升趋势,疫情较重的省份主要集中在华北地区和西北地区,而山西省疫情回升尤为突出,解放后,山西省曾发生过4 次大流行,人间、畜间布鲁菌病都呈现逐年上升趋势,给养殖业造成重大的经济损失,严重危害人类健康和社会稳定。传统的检测方法耗时较长,且对于实验室操作人员存在很大危险,因此找到一种敏感、快速、准确检测方法,从而为防疫部门提供有效防控措施和科学决策具有十分重要意义。

1材料

1. 1 菌株

标准菌株:猪种布鲁菌、牛种布鲁菌、羊种布鲁菌,均购自中国兽医药品监察所。对照菌株:大肠杆菌、马流产沙门杆菌、克雷伯杆菌,均由中国动物卫生与流行病学中心提供;疑似布鲁菌病的血液样品,由吉林出入境检验检疫局检验检疫技术中心协助采集。

1.2主要试剂

RNase A、DL - 2 000 Marker、Mg Cl2( 25 mmol/L) 、蛋白激酶K、Taq DNA聚合酶( 5 U/m L) 、2. 5 mmol/L d NTP混合液、6 × Loading Buffer、CTAB / Na Cl,均购自宝生物工程( 大连) 有限公司; 溶菌酶、DNA提取试剂盒,均购自北京天为时代科技有限公司; Tris碱、无水乙醇、Na2EDTA、琼脂糖、HCl、Tris饱和酚、异戊醇、Triton X - 100、溴化乙锭、十二烷基硫酸钠( SDS ) 、2 - 巯基乙醇、氯仿,购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

2 方法

2. 1 引物设计与合成

从NCBI基因库网站的Gen Bank数据库中查找布鲁菌的基因组序列( 登录号为JF918757) ,选取布鲁菌膜外蛋白BSCP31 基因的特异性保守区段,大小为1 817 bp,设计PCR引物,引物由宝生物工程( 大连) 有限公司合成。引物序列: 上游引物P1 ( 20 bp)5' - GCCATCTCAGTTCGGATTGC - 3'; 下游引物P2( 19 bp) 5' - CAGCGCCTTCGGGTAAAAC - 3'。

2. 2 模板DNA的提取

将试验用各菌株分别接种于TS液体培养基中,37 ℃ 培养36 ~ 48 h; 振荡、摇匀后吸取1. 5 m L菌液置2 m L离心管中,10 000 r/min离心1 min; 弃上清液,按DNA提取试剂盒说明书操作,提取细菌DNA于- 20 ℃冰箱中保存,备用。

2. 3 PCR反应体系的建立

采用50 μL反应体系: 上、下游引物( 20 μmol/L) 各1 μL、200 μmol / L d NTP 4 μL、10 × Buffer 5 μL、1. 5 μmol / L Mg2 +3 μL、Taq DNA聚合酶0. 25 μL、3 nmol / L DNA模板1 μL、无菌三蒸水34. 75 μL,最后用已灭菌的超纯水补至终体积为50 μL。同时以水代替模板DNA作为空白对照。

2. 4 PCR反应程序的确定

经优化,PCR反应程序为: 94 ℃ 预变性2 min;94 ℃ 变性45 s,55 ℃ 退火30 s,72 ℃ 延伸1 min,共35 个循环; 最后72 ℃ 再延伸10 min,4 ℃ 保存。取5 μL的PCR产物,用1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测。

2.5 PCR特异性的测定

分别取牛种布鲁菌、羊种布鲁菌、猪种布鲁菌、大肠杆菌、马流产沙门杆菌、克雷伯杆菌制备相应的模板DNA,按照建立的布鲁菌PCR检测方法分别进行PCR扩增,并通过琼脂糖凝胶电泳分析结果。

2. 6 PCR敏感性的测定

对牛种布鲁菌模板DNA进行10 倍系列稀释,使各稀释度1 μL模板DNA的含量分别为150 pg、15 pg、1. 5 pg、150 fg、15 fg。按照建立的布鲁菌PCR检测方法,对各稀释度的模板DNA进行PCR扩增,并通过琼脂糖凝胶电泳分析结果。

2. 7 PCR重复性和稳定性的测定

分别以相同批次培养的牛种布鲁菌、羊种布鲁菌和猪种布鲁菌提取的DNA为模板,进行6 次PCR扩增,检测所建立的布鲁菌PCR方法的重复性。分别以不同批次培养的牛种布鲁菌、羊种布鲁菌和猪种布鲁菌提取的DNA为模板,进行6 次PCR扩增,检测所建立的布鲁菌PCR方法的稳定性。

3 结果与分析

3. 1 DNA提取结果

本试验分别对各菌株的DNA进行提取,并用分光光度计分别检测其OD值,结果OD260/ OD280值均在1. 60 ~ 1. 75 之间。PCR扩增产物经0. 8% 琼脂糖凝胶电泳检测( 100 V恒压1. 5 h) ,结果见图1。

M.DL-2 000 Marker;1.牛种布鲁菌;2.羊种布鲁菌;3.猪种布鲁菌;4.大肠杆菌;5.马流产沙门杆菌;6.克雷伯杆菌。

由图1 可知,6 种细菌的DNA条带均清晰可见,无拖尾现象,亮度达到了预期效果,说明本试验提取的DNA含量较高,没有受到RNA和蛋白质污染。

3. 2 PCR扩增结果

本试验对牛种布鲁菌的DNA进行PCR扩增,同时以水作为空白对照,PCR扩增产物经1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测( 90 V恒压1 h) ,结果见图2。

由图2 可知,目的条带出现在250 ~ 500 bp之间,且偏向500 bp处,目的条带大小为384 bp,这与预期结果一致,而空白对照泳道未出现扩增条带。

M.DL-2 000 Marker;1.牛种布鲁菌PCR扩增结果;2.空白对照。

3. 3 PCR特异性试验结果

大肠杆菌、马流产沙门杆菌和克雷伯杆菌与布鲁菌的交叉反应较多,因此本试验分别提取牛种布鲁菌、羊种布鲁菌、猪种布鲁菌、大肠杆菌、马流产沙门杆菌和克雷伯杆菌的DNA进行PCR扩增试验,其产物经1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测( 90V恒压1 h) ,结果见图3。

M.DL-2 000 Marker;1.牛种布鲁菌;2.羊种布鲁菌;3.猪种布鲁菌;4.大肠杆菌;5.马流产沙门杆菌;6.克雷伯杆菌。

由图3 可见,牛种布鲁菌、羊种布鲁菌、猪种布鲁菌的扩增条带出现在250 ~ 500 bp之间,且靠近500 bp处,即384 bp,而大肠杆菌、马流产沙门杆菌和克雷伯杆菌均未出现相应DNA的PCR扩增产物,即均呈阴性。

3. 4 PCR敏感性试验结果

对牛种布鲁菌模板DNA进行10 倍系列稀释,共稀释5 个浓度,按照建立的布鲁菌PCR检测方法,对这5 个稀释度的模板DNA分别进行PCR扩增,并用1. 5% 琼脂糖凝胶电泳检测( 90 V恒压1 h) ,结果见图4。

由图4 可见,牛种布鲁菌的DNA稀释100 倍时仍有清晰的扩增条带出现,而高于此稀释倍数未出现扩增条带。

3. 5 PCR重复性和稳定性试验结果

本试验首先对相同批次的布鲁菌培养物进行PCR扩增,重复6 次,试验结果均相同; 然后,再对不同批次的布鲁菌培养物进行PCR扩增,重复6 次,试验结果也均相同。说明本试验建立的布鲁菌PCR检测方法的重复性和稳定性较理想。

M.DL-2 000 Marker;1.150 pg;2.15 pg;3.1.5 pg;4.150 fg;5.15 fg。

4 讨论

布鲁菌是人畜共患病的病原菌,给人类健康及畜牧业发展造成了极大危害,受污染的乳制品和肉制品等已成为布鲁菌病重要的传染源,如何快速检测布鲁菌,对于布鲁菌病防治具有重要意义。

随着分子生物学技术的发展和完善,A. Feketi等[1]最早进行了布鲁菌PCR检测方法的探索,首先对布鲁菌编码43 ku外膜蛋白( OMP) 基因进行PCR扩增,然后又对布鲁菌BCSP31、16SrRNA、OMP2b等基因展开了PCR扩增方法的研究,之后成功地用于布鲁菌病的特异性诊断和临床实践应用中。1995年,唐浏英等人设计了多组引物对布鲁菌36 ku的OMP31 基因进行扩增,结果表明,不同引物的敏感性存在差异( 10 fg ~ 100 pg) 。邱昌庆等[2]对牛奶中的布鲁菌进行PCR扩增检测,结果表明,灵敏度为50 cfu / m L。G. G. Baily等[3]选取牛种布鲁菌的31 ku外膜蛋白基因的核苷酸保守序列设计5 个引物B1 ~B5,并以5 个引物的不同组合进行PCR扩增试验,结果表明,B4 和B5 为最佳配对引物。李玉兰等[4]用此对引物对6 个种的布鲁菌DNA进行扩增,结果表明,此对引物特异性良好,可检出的布鲁菌DNA最低敏感值为0. 95 pg。

在本试验中,根据编码牛种布鲁菌膜外蛋白BSCP31 基因核苷酸序列设计1 对PCR引物,经PCR反应条件的优化和反应程序的确定,成功扩增出了预期的384 bp目的基因片段,PCR敏感性试验结果显示最低可检测到1. 5 pg。本试验结果与G. G. Baily等[3]、李玉兰等[4]的研究结果相近,说明本试验设计的引物所扩增出的384 bp核苷酸保守序列具有较高的同源性。可见,本试验所建立的布鲁菌PCR检测方法具有特异性强,敏感性高,操作简单、方便、快速的特点,对布鲁菌的快速检测具有重要的实用意义。

摘要：为了研究快速检测布鲁菌的通用PCR体系,试验从GenBank数据库中查到布鲁菌的基因组序列(登录号为JF918757),并选取布鲁菌膜外蛋白BSCP31基因的特异性保守区段,设计了1对PCR引物,对PCR扩增条件进行优化。结果表明:能够扩增出牛种、羊种、猪种布鲁菌模板DNA的384 bp目的基因片段,而对大肠杆菌、马流产沙门杆菌、克雷伯杆菌均呈阴性,最低检出浓度为1.5 pg/μL,对同批和不同批的菌株进行6次PCR扩增,重复性和稳定性较好。说明试验所建立的布鲁菌PCR检测方法具有较高的特异性、敏感性和稳定性。

关键词：布鲁菌,PCR,BSCP31基因,鉴定

检测方法的建立论文 篇2

目的 建立人呼吸道合胞病毒(hRSV)荧光PCR(FQ-PCR)检测方法,并确定其最低检出限.方法 针对hRSV N基因相对高度保守的序列,采用引物和探针设计软件Primer Express v2.0,设计1对特异性引物和1条TaqMan荧光探针,组装成荧光PCR检测试剂.以此试剂检测345份咽拭子样品,与ELISA法检测hRSV IgM抗体比较,确定最低检出限.结果 该方法的`最低检出限是传统的病毒滴度测定的104.79倍.与IgM抗体检测法相比,对于感染早期患者具有更高的检出率.结论 建立的hRSV FQ-PCR检测方法具有简便、快捷的特点,适用于hRSV感染的早期诊断.

作 者：范行良 盛慧英 田新贵 陈翊  作者单位：范行良(中国药品生物制品检定所疫苗三室,北京,100050)

盛慧英,田新贵,陈翊(广州市儿童医院中心实验室,广州,510663)

刊 名：中国生物制品学杂志  ISTIC英文刊名：CHINESE JOURNAL OF BIOLOGICALS 年，卷(期)：2007 20(8) 分类号：Q93 R373.1 关键词：人呼吸道合胞病毒   荧光聚合酶链反应   病毒滴定  

★ 荧光定量PCR检测干旱胁迫下长春花Crlea基因的相对表达

检测方法的建立论文 篇3

关键词：ELISA 莱克多巴胺 间接非竞争法 低检出限

中图分类号：S859.8 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）02-0015-06

1 材料与实验方法建立

1.1 试剂

莱克多巴胺人工偶联牛血清白蛋白抗原（RAC-BSA），莱克多巴胺小鼠单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠二抗，牛血清白蛋白（BSA），均由北京奥博森提供。磷酸二氢钾，十二水合磷酸氢二钠，氯化钠，氯化钾，碳酸钠，碳酸氢钠，一水合柠檬酸，吐温-20，二甲基亚砜，30%双氧水，硫酸，以上试剂均为国产分析纯试剂。

试剂配制：

精确称取氯化钠4.0000g、十二水合磷酸氢二钠 1.4500g、氯化钾0.1000g和磷酸二氢钾0.1000g，混合后用超纯水溶解并定容至500mL，得到磷酸盐缓冲液（PBS），该磷酸盐缓冲液的pH值为7.4，磷酸盐缓冲液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下。

精确称取碳酸钠0.3975g和碳酸氢钠0.7425g，混合后用超纯水溶解并定容至500mL，得到碳酸盐缓冲液（CBS），该碳酸盐缓冲液的pH值为9.6，碳酸盐缓冲液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下。

精确称取一水合柠檬酸2.5514g和十二水合磷酸氢二钠9.1951g，混合后用超纯水溶解并定容至500mL，得到底物缓冲液，该底物缓冲液的pH值为5.0，底物缓冲液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下。

精确称取牛血清白蛋白（BSA）1g，用PBS定容至100mL，得到BSA封闭液，BSA封闭液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下。

取500ml PBS溶液，加入250μL吐温-20，得到PBST洗液，PBST洗液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下。

精确称取3，3’，5，5’-四甲基联苯胺（TMB） 0.0100g，溶于2mL二甲基亚砜中，得到TMB底物液，TMB底物液过0.22μm微孔滤膜除菌，并保存在4℃下。

分别取质量百分比浓度为10%的双氧水溶液21μL、底物缓冲液10mL和TMB底物液200μL，临用前混合，得到显色液。

称取98g浓硫酸，缓慢倒入200mL蒸馏水中，冷却至室温定容至500mL，得到2mol/L的硫酸终止液。

称取氯化钠2g，用蒸馏水溶解并定容至100mL，得到2%氯化钠。

吸取浓盐酸2mL，用蒸馏水溶解并定容至100mL，得到2%（V/V）盐酸。

按体积比2%氯化钠：2%盐酸：甲醇=1：1：8混合，得到样品酸性提取液。

1.2 仪器

恒温干燥箱，酶标仪，4℃冰箱。

1.3 实验方法建立

（1）酶标板吸附能力均一性检测：见表1

若酶标板每个孔内活性位点不均匀，会导致实验结果差异，平行不好，所以首先检查所使用的酶标板的均一性。随机选取六块酶标板，每块酶标板再随机选择四个酶标孔，以CBS为缓冲液将抗原蛋白稀释到2μg/mL，并加入到酶标孔内，每孔加入100μL，加盖放入4℃冰箱孵育24h（以上步骤称为包被），倒出孔内液体，甩干，向每个酶标孔内加入300μLPBST洗涤液，震荡摇匀，倒出孔内液体，甩干，重复洗涤四次，拍干（以上步骤称为洗板），拍干后向每个酶标孔内加入 300μLBSA封闭液，并放入37℃恒温箱中孵育90min（该过程称为封闭）；封闭结束后，重复洗板过程，以PBS缓冲液将抗体蛋白稀释到1μg/mL，并加入到酶标孔内，每孔加入100μL，并放入37℃恒温箱中孵育20min，反应结束后重复洗板过程，以PBS为缓冲液将酶标二抗稀释到1μg/mL，并加入到酶标孔内，每孔加入100μL，并放入37℃恒温箱中孵育20min，反应结束后重复洗板过程，拍干后向孔内加入显色液100μL/孔，放入37℃恒温箱中孵育15min，充分显色。反应结束后向孔内加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，酶标仪波长设定为450nm，在5min之内测定每孔的吸光值，同时作空白实验，以空白作参比；（整个过程称为间接ELISA试验）。

根据吸光值可知其中一块酶标板不合实验要求，之后实验中不能使用。其他五块酶标板板间变异系数小于10%符合ELISA实验的要求。

（2）抗原抗体最佳反应浓度选择（棋盘试验）：见表2

用PBS缓冲液（pH=7.4）将抗原配制成0.05μg/mL、0.1μg/mL、0.2μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、5μg/mL、10μg/mL；用pH=7.4的PBS为缓冲液将抗体配制成1.67μg/mL、1.43μg/mL、1.25 μg/mL、1.11μg/mL、1μg/mL，用间接ELISA方法做各浓度的正交试验，并选出吸光值接近1.000对应的的抗原-抗体浓度。

从上表可以看出，在抗原浓度为5μg/mL，抗体浓度为1.67μg/mL时吸光值为1.003，所以选择抗原浓度为5μg/mL，抗体浓度为1.67μg/mL为最佳浓度。

（3）包被温度及时间的选择：见表3

选择三种不同包被条件：4℃下包被24小时、37℃下包被3小时、4℃下包被12小时后37℃包被1.5小时，在三种条件下包被最适浓度抗原，并做间接ELISA实验，选出显色较好的条件。

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结果表明：三种方法无明显差别，考虑操作方便，选用4℃下包被24小时的方法。

（4）包被缓冲液的选择：见表4

以pH=9.6、pH=7.4、pH=5.2三种不同的缓冲液，在4℃下24小时条件下包被抗原，并做间接ELISA实验，选出显色较好的条件。

结果表明：pH=5.2的缓冲溶液不适合该抗原包被，由于酸度过高，不能达到该蛋白质等电点，包被效果不好，所以选择pH=9.6的CBS缓冲溶液包被该抗原。

（5）封闭液选择：见表5

用1%BSA、3%BSA、1%明胶、3%明胶、1%脱脂奶粉五种不同封闭液，封闭包被好的酶标板，并做ELISA实验，选出板内差异小的封闭液。

结果表明：1%BSA和3%BSA的封闭效果较好，明胶的重复性不好，脱脂奶粉显色略高，且封闭后不易保存，所以选用1%BSA做封闭液。

（6）酶标二抗反应浓度的选择：见表6、图1

用PBS为缓冲液将酶标二抗配制成0.1μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、 4μg/mL并做间接ELISA实验，选择吸光值在1.000附近的浓度。

结果表明：随二抗浓度的增大吸光值随之增大，在浓度1.00μg/mL时，吸光值增大的幅度很缓慢，说明浓度为1.00μg/mL的二抗已经可以和孔中的一抗充分结合，为了节约试剂，所以选择1.00μg/mL作为二抗的最佳浓度。

（7）抗体反应时间的选择：见表7、图2

分别选择15min，30min，45min，60min，75min五个不同反应时间，做ELISA实验。

一抗在30min时反应完全，在30分钟之后增加反应时间，吸光值无明显变化，所以选择30min为反应时间。

（8）酶标二抗反应时间的选择：见表8、图3

分别选择15min，30min，45min三个不同反应时间，做ELISA实验。

二抗在30min时反应完全，在30分钟之后增加反应时间，吸光值无明显变化，所以选择30min为二抗反应时间。

（9）显色反应时间的选择：见表9、图4

分别选择10min，20min，30min，40min四个不同的显色反应时间做ELISA实验。

吸光度值在20min时最高，20min之后随时间增加吸光值逐渐下降，所以选择20min为最佳显色时间。

综上所述，所建立的的ELISA方法是以pH=9.6的CBS为缓冲液将抗原蛋白稀释到5μg/mL，并加入到酶标孔内，每孔加入100μL，加盖放入4℃冰箱中孵育24h，倒出孔内液体，甩干，用每孔300μL 的PBST洗涤液洗板四次，拍干。后向每个酶标孔内加入300μL 1%BSA封闭液，放入37℃恒温箱中孵育90min，封闭结束后，重复洗板过程四次，拍干。以pH=7.4的PBS为缓冲液将抗体蛋白稀释到1.67μg/mL，并加入到酶标孔内，每孔加入100μL，放入37℃恒温箱中孵育30min。反应结束后重复洗板过程三次，拍干。以pH=7.4的PBS为缓冲液将酶标二抗稀释到1μg/mL，并加入到酶标孔内，每孔加入100μL，并放入37℃恒温箱中孵育30min。反应结束后重复洗板过程三次，拍干。向每个孔内加入显色液100μL，放入37℃恒温箱中孵育20min，充分显色。反应结束后向孔内加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪波长于450nm处，在5min之内测定每孔吸光值。

1.4 实验步骤

（1）酶标板的制备：

以pH=9.6的CBS缓冲液将抗原蛋白稀释到5μg/mL，加入酶标孔内，每孔加入100μL，加盖放入4℃冰箱中孵育24h，倒出孔内液体，甩干，用每孔300μL的PBST洗涤液洗板四次，拍干。后向每个酶标孔内加入100μL1%BSA封闭液，并放入37℃恒温箱中孵育90min，封闭结束后，重复洗板过程四次，拍干，待用。

（2）标准曲线的绘制：见表10、图5、图6

以11ng/mL、4.4ng/mL、2.2ng/mL、1.1ng/mL、 0.44ng/mL、0.11ng/mL、0.044ng/mL、0.011ng/mL、0ng/mL九个不同浓度的莱克多巴胺溶液为标准系列，分别将九种溶液先与3.34μg/mL的抗体溶液等体积混合，并放入37℃恒温箱中孵育10min，再以100μL/孔加入到已经制备好的酶标板中，并放入37℃恒温箱中孵育30min。反应结束后重复洗板过程三次，拍干。将1μg/mL的二抗加入到酶标孔内，每孔加入100μL，并放入37℃恒温箱中孵育30min。反应结束后重复洗板过程三次，拍干。向每个孔内加入显色液100μL，放入37℃恒温箱中孵育20min，充分显色。反应结束后向孔内加入终止液50μL/孔，轻轻振荡混匀，酶标仪波长设定为450nm，在5min内测定每孔的吸光值，并以LogC为横坐标，LnA/（A。-A）为纵坐标，（C为标准溶液的浓度、A为各标准溶液所测吸光度、A。为空白吸光度）绘制系列莱克多巴胺标准液的工作曲线；同时作空白实验，以空白作参比。

该标准曲线的回归方程为：

y=-0.5356x-0.4146，相关系数R2=0.9799；IC50=0.108

（3）样品的前处理方法优化

方法一：称取2.0g阴性猪肉样品至50mL离心管中，加入不同浓度莱克多巴胺标准品，震荡混匀。加入4mL样品酸性提取液，震荡，用0.02mol/LNaOH溶液调pH值至7～8之间，以3000转/min离心5分钟，取上清液按标准曲线的制作方法分析。结果见表11。

结果表明：方法一不能有效的提取出样品中的莱克多巴胺。

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方法二：称取2.0g阴性猪肉样品至50mL离心管中，加入不同浓度莱克多巴胺标准品，震荡混匀。加入4mL甲醇，混匀，超声波提取5min，5000转/min离心2分钟，取上清液1mL，用氮吹仪吹干，用PBS复原至1mL按标准曲线的制作方法分析。结果见表12。

结果表明：方法二能较好的提取出样品中的莱克多巴胺。

方法三：称取2.0g阴性猪肉样品至50mL离心管中，加入不同浓度的莱克多巴胺标准品，震荡混匀，加入4mL甲醇，混匀，超声波提取5min，5000转/min离心2分钟，取上清液1mL，加入正己烷出去油脂，弃去上层正己烷，用氮吹仪吹干甲醇，用PBS复原至1mL按标准曲线的制作方法分析，结果见表13。

结果表明：方法三能提取出样品中的莱克多巴胺，但是提取效果不理想。

综合方法一、二、三的提取效果，选用方法二处理样品：称取2.0g阴性样品至50mL离心管中，震荡混匀。加入4mL甲醇，混匀，超声波提取5min，5000转/min离心2分钟，取上清液1mL，用氮吹仪吹干，用PBS复原至1mL按标准曲线的制作方法分析。

（4）最低检出限实验：见表14

分别将0.011ng/mL、0.0044 ng/mL、0.0011ng/mL、0.00044ng/mL、0.00011ng/mL五种不同浓度的莱克多巴胺溶液为标准系列。分别将五种溶液先与3.34μg/mL的抗体溶液等体积混合，并放入37℃恒温箱中孵育30min，再以100μL/孔加入到板中，做ELISA实验。选出该方法能检出的最小浓度。

结果表明，该方法不能对0.00044 ng/mL及更小的浓度做出响应，对0.0011ng/mL的标准品有响应，但是所得吸光值不符合标准曲线，所以该方法最低检出限为0.0044ng/mL。

（5）交叉实验：见表15

分别将11ng/mL莱克多巴胺、11ng/mL盐酸克伦特罗、11ng/mL沙丁胺醇三种溶液先与3.34ug/mL的抗体溶液等体积混合，并放入37度反应30min，再以100μL/孔加入到板中，做ELISA实验。

结果表明：盐酸克伦特罗、沙丁胺醇和未加任何标准品的吸光值变异系数小于10%，符合ELISA实验要求，盐酸克伦特罗和沙丁胺醇对莱克多巴胺的检测无干扰。

（6）回收率实验

阴性猪尿样品加标，使待检样品中浓度为0.44ng/mL、1.1ng/mL、2.2ng/mL。猪尿样无需任何前处理可以直接测定。结果见表16。

猪尿中加标回收率在72%～89%之间。

阴性猪肉样品中加标：称取2.0g阴性样品至50mL离心管中，加入不同浓度的莱克多巴胺标准品，震荡混匀。加入4mL甲醇，混匀，超声5min，5000转/min离心2分钟，取上清液1mL，用氮吹仪吹干，用PBS复原至1mL按标准曲线的制作方法分析。结果见表17。

结果表明该方法回收率可达65%～84%。

2 结语

该方法与经典的间接竞争ELISA方法有所区别，没有将抗体和标准品同时加入到孔中与抗原竞争，而是先让抗体和标准品反应一段时间，让方法检出限更低，达到0.0044ng/mL，并以LogC为横坐标，LnA/（A。-A）为纵坐标，得到线性方程y=-0.5356x-0.4146，相关系数R2=0.9799，IC50<1ng。通过交叉试验和回收率实验验证，结果表明该方法具有较好地稳定性和可靠性，能满足实验室的检验要求。

参考文献

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检测方法的建立论文 篇4

1 材料与方法

1.1 病毒和细胞

猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒(PCV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),均由西北农林科技大学动物医学院预防兽医学平台鉴定、保存;猪血管内皮细胞(EC),由西北农林科技大学动物医学院预防兽医学平台传代、保存。

1.2 主要试剂和仪器

猪瘟阳性血清和猪瘟阴性血清,中国农业科学院哈尔滨兽医研究所唐青海副研究员馈赠;荧光素(FITC)标记的羊抗猪IgG,由Southern Biotech公司产品;高糖DMEM干粉, Gibco 公司产品;胎牛血清(FBS),购自杭州四季青公司;荧光倒置显微镜,日本Nikon公司产品。

1.3 细胞及病毒的培养

从液氮中取出冻存的EC管迅速放入37 ℃水浴中快速融化;将冻存管中的细胞液迅速倒入新的培养皿或培养瓶中,加入适量含有10% FBS的DMEM培养基,混合均匀,放入37 ℃、5%CO2培养箱中培养;18～24 h后常规换液1次,减少DMSO对细胞的伤害,以后按生长状态和密度适时传代或换液;将病毒液经过适当稀释,加入到培养板的相应孔中,100 μL/孔,37 ℃吸附1 h;补加维持液,在37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养。

1.4 IFA试验的建立

1.4.1 抗CSFV抗体最适工作浓度的确定

用十字交叉法,选择荧光清晰、明亮且稀释度最大的抗体稀释度,即为抗CSFV的阳性血清(一抗)及FITC标记的羊抗猪IgG(二抗)的最适工作浓度。同时设阴性对照、空白对照及样本自发荧光对照。一抗设立的稀释梯度为1∶50,1∶100,1∶200,1∶500;二抗设立的稀释梯度为1∶20,1∶50,1∶100,1∶500。

1.4.2 特异性试验

制备长成单层的EC培养板,分别接种CSFV、PCV、TGEV,37 ℃ 吸附1 h;补加细胞维持液至100 μL/孔,继续在37 ℃、5%CO2 恒温箱中培养24～72 h;并设正常细胞对照,然后进行间接免疫荧光试验。一抗和FITC标记的羊抗猪IgG 均按照最适工作浓度稀释,检测是否有交叉反应发生,以确定本方法的特异性。

1.4.3 空白对照试验

以PBS 代替一抗,进行间接免疫荧光试验,观察二抗本身有无非特异性反应。同时设阳性对照。

1.4.4 样本自发荧光对照试验

向新的96孔板和接毒的96孔板分别滴加100 μL PBS后直接置于荧光显微镜下,观察是否存在自发荧光。同时设阳性对照。

1.4.5 抑制试验

在固定其他条件的基础上,先将FITC标记的羊抗猪IgG 荧光抗体与过量的CSFV 一抗作等量混合,37 ℃避光作用1 h;再加在样本上进行荧光抗体染色,然后置于荧光显微镜检查样本是否有荧光出现。同时设阴、 阳性对照及空白对照。

1.4.6 敏感性试验

用PBS将猪瘟阳性血清按1∶50,1∶100,1∶200,1∶500,1∶1 000,1∶2 000进行稀释,滴加到细胞培养板孔中进行间接免疫荧光试验,以出现明显荧光的最大抗体稀释度为其检测的灵敏度。

1.4.7 重复性试验

取相同批次的细胞培养板,相同批次的CSFV阳性血清及荧光二抗,在相同条件下,不同时间进行IFA试验,观察荧光强弱是否改变,检测本方法是否具有良好的重复性。

2 结果

2.1 抗CSFV抗体最适工作浓度

通过荧光显微镜观察,当二抗稀释度为1∶500时,无论一抗稀释度多大,均无荧光或为很弱的荧光;二抗在其他3个稀释度下,一抗稀释度为1∶50和1∶500时,荧光较一抗稀释度为1∶100和1∶200弱,而在一抗稀释度为1∶200、二抗稀释度为1∶50时,荧光最强(见193页彩图1);因此,可以确定一抗稀释度为1∶200、二抗稀释度1∶50为最适工作浓度。

2.2 特异性试验结果

2.2.1 交叉试验结果

接种PCV、TGEV的细胞无特异性荧光,正常不接毒的细胞也无特异性荧光,而接种CSFV的细胞有明显特异性荧光。说明建立的IFA法与其他病毒感染无交叉反应,具有特异性。

2.2.2 空白对照试验结果

用PBS代替一抗,进行IFA,结果没有发现特异性荧光或为弱荧光,而阳性对照有明显特异性荧光,说明抗原与二抗之间无非特异性反应。

2.2.3 样本自发荧光对照试验结果

将所做的样本自发荧光对照试验置于荧光显微镜下观察,均无特异性荧光,而阳性对照试验有明显特异性荧光,说明样本本身并不发荧光。

2.2.4 抑制试验结果

抑制试验组、阴性对照组、空白对照组均无荧光,而阳性对照有特异性荧光。

2.3 敏感性试验结果

结果表明,在抗体稀释度为1∶1 000时有清晰可见的荧光,而在1∶2 000时有很微弱的荧光。

2.4 重复性试验结果

对相同批次、相同方案、相同条件、不同时间、相同判定结果进行的IFA检测,结果基本一致或只有微小变化。

3 讨论

3.1 IFA法的优越性

与检测CSFV的其他常规方法相比,IFA法不仅可以特异、直观地检测抗原,而且可以用已知抗原检测抗体,具有简单、快速、特异、直观、经济等优点,因而得到了广泛的应用[4]。采用试验建立的IFA法对CSFV进行检测,结果表明,CSFV感染EC细胞后,病毒主要分布于细胞质中,这和许保疆等[5]于2010年用建立的单克隆抗体IFA法检测CSFV的结果是一致的。本试验建立的方法以猪瘟阳性血清作为一抗,试验材料来源更方便,而且成本低、易得到,因此作为一种实验室检测方法更具有实用性,为CSFV感染的实验室诊断及CSFV在感染细胞中的定位和动态分布提供了有效的试验检测手段。

3.2 IFA法的最优条件建立

研究应用抗CSFV的阳性血清为一抗,FITC标记羊抗猪IgG为二抗,通过优化最佳工作条件,建立了一种检测细胞中CSFV的IFA法, 得出了IFA法最佳工作条件:接种病毒后细胞的培养时间为72 h,一抗稀释度为1∶200、二抗稀释度为1∶50。特异性试验结果表明,所建立的方法特异性良好。通过敏感性试验测定了IFA法中抗体稀释度在1∶1 000时具有明显荧光,而在1∶2 000时荧光很弱。在此方法初步建立的基础上,在不同时间段进行了多次试验,结果表明,本方法具有很好的重复性。用本方法检测CSFV具有敏感、特异、简便、快速、经济等优点,可用于CSFV在EC上的感染和定位研究。

4 问题与展望

试验结果表明,所建立的IFA法可以直观、方便、经济、特异地检测出CSFV,并具有良好的特异性和重复性。该方法的建立也为其他不致细胞病变病毒的研究提供了很好的借鉴。但是依然存在一些不足,如对于不同来源、不同批次的猪瘟阳性血清,即一抗,可能会得出不同的结论,因此在应用不同批次的猪瘟阳性血清进行IFA检测之前应进行预试验。

参考文献

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检测方法的建立论文 篇5

利用高效液相色谱法(HPLC-UV),建立了银鲫肌肉中甲苯咪唑(MBZ)及其两种代谢产物氨基甲苯咪唑(MBZ-NH2)和羟基甲苯眯唑(MBZ-OH)残留的检测方法.采用氨化乙酸乙酯作为提取溶剂,减压浓缩后去脂,二氯甲烷萃取,氢氧化钠净化,乙酸乙酯二次萃取,N2吹干,定容后使用高效液相色谱分析.方法在0.1～4.0μg/mL之间呈线性相关,相对标准偏差为1.09%～5.12%,MBZ、MBZ-NH2、MBZ-OH平均加标回收率分别为72.17%～77.44%、63.51%～68.07、82.37%～86.83%,检出限分别为10 μg/kg、15 μg/kg和10 μg/kg.

作 者：姜朝军 于慧娟 冯兵 蔡友琼 惠芸华 作者单位：姜朝军,于慧娟,蔡友琼,惠芸华(中国水产科学研究院东海水产研究所,上海,90)

冯兵(大连水产学院食品工程学院,辽宁大连,116023)

检测方法的建立论文 篇6

【关键词】建筑工程；质量检测；问题 责任制度

随着全民质量意识的提高，工程质量不断受到人们的重视。工程质量检测是人们对工程质量判定的一个重要依据。工程质量的优劣主要是靠具体的检测方法和检测数据来评定的，这些质量检测方法和检测数据是否科学、真实、有效，越来越成为工程建设者关注的焦点。

1 当前建筑工程质量试验检测中应注意的问题

1.1 各种材料产品进场复检的内容(技术指标)不规范

检测单位应按规范、标准规定的进场或出厂检验内容填写委托单,使检测既及时又满足质量控制的需要。有的材料产品规范规定了进场复检内容,规范没有规定的,按材料产品标准中规定的出厂检验内容复检。

1.2 检测标准执行问题。

1.2.1 企业标准检测:新材料、新产品尚无国标、行标、地方标准的情况下,可依据企业标准检测及质量验收,委托单位办理委托或抽检手续必须提供企业标准,而且是经技术监督行政主管部门审核备案的有效标准,否則不能检测,也不能验收和使用。

1.2.2 委托单位选择标准检测:在无国家、行业强制性标准情况下,委托单位可以选择有效的检测标准检测。

1.3 检测与实际施工现场脱节。

目前检测机构只对来样负责，对样品的真实性、抽样是否具有代表性、送检过程是否合理都无法保证。特别是目前大部分施工单位质量意识停留在施工内业资料过关的阶段，只求可作为内业资料的合格报告，而不求真实了解所使用的工程材料质量的真实情况，这导致了施工单位在材料取样送检过程弄虚作假是常有的事，尽管法律、法规明文规定：建筑材料取样必须真实、符合要求，监理单位必须见证、陪同送检，并对材料的真实、有效承担责任，但目前监理行业自身存在不足，未能真正发挥应有的责任和义务。因此，对检测单位来说，就算样品检测出来的参数合格，也无法保证施工的材料合格。

1.4 报告更改问题。

委托的内容经常更改是个普遍现象,改的内容各种各样,见证没有尽责是主要原因,报告的更改应由委托单位提出书面申请,经原见证人和单位确认后签字盖章报检测站,经审核批准后方于更改。

1.5 委托方或被抽检方合法权益的维护

1.5.1 检测报告及检测结果的解释:可以要求检测机构对执行标准或结果作出解释或分析。检测机构也有义务和具备能力提供服务。

1.5.2 检测报告及检测结果提出异议的处理:对检测结果有异议应按合理的途径处理,即向出具报告的检测单位正常提出,检测单位必须受理并做出答复。可进行复核、复检或仲裁等方式处理。

2 完善我国建筑工程质量责任制度的建议

2.1 加强立法，规定检测机构为建设责任主体。

在市场经济中，权力和义务是平衡的，在享受一定权力的同时，还要履行应有的义务，承担开放市场所面临的风险和压力。检测机构应当继建设单位、监理单位、勘察单位、设计单位、施工单位五方建设质量行为责任主体之后，作为第六方责任主体在法律上得以确认。检测机构作为工程建设过程的一个重要的责任主体，应会同施工、监理等单位共同承担施工材料的质量风险责任，而不再互相推诿。作为责任主体，检测机构为了保证工程材料的可靠性，就会确立合理的材料取样、送检和检测过程的有效方式；就能独立承担检测数据和检测报告的合法性、公正性、真实性和准确性的法律责任，保证工程质量检测的科学性和公正性等要求。为了提高市场竞争力和保证工程材料的可靠性，检测单位将逐步提高检测技术和检测能力，这将有利于检测行业的健康发展。

2.2 构建信息监管平台。

当前由于行政监管的人力、物力有限，缺少科学的检测方法，就难于实现有效的行政监管。信息化是提高行政监管效力的最佳途径，通过构建信息化监管平台，在一定程度上规范了检测机构的行为。如《福建省建设工程质量检测管理实施暂行办法》规定：“检测机构应采用检测数据自动采集系统，并与检测监督管理网络联网，且按统计有关规定及时上报单位经营状况报表。” 这是检测机构通过资质认证的必备条件；规定中的“即时向监督机构报送检测数据，尤其是即时报送不合格报告”，可避免不必要的人为因素干预检测结果。

2.3 坚持质量经营原则,适应设计市场需求。

由于我国经济体制的改革不断深入,市场已成为企业赖以生存和发展的唯一环境。因此,在生产经营中必须以质量为核心,以市场为导向。

2.4 建立建设单位委托机制。

检测业务施工单位委托机制，对于检测单位来讲，施工单位是它的客户，在市场竞争相当激烈的现状下，提供不利于客户的数据等于赶走客户，在共同利益驱动下，很难保证检测机构选择公正性。这就从根本上动摇了检测数据准确性的基础，同时为日后的工程质量安全留下了诸多隐患。建设单位从工程建设的整体利益出发选择检测机构，从根本上理顺了业务委托方与检测机构间的利益关系，这会更加合理、更加科学、更有利于合法经营的检测机构的发展，同时为规范检测市场提供了前提条件。

2.5 建立、健全检测人员培养机制。

行业之间的竞争最终是人才的竞争。目前我国的建设工程检测行业最缺乏的恰恰是专业人才。建设工程检测行业的从业人员普遍素质偏低，并且我国大专院校也没有开设工程检测专业，检测人才的培养成为整个检测行业发展中的重点。因此必须一方面提高检测行业从业人员的门槛，一方面建立检测人员培训机制和人才培养机制。培养检测人员首先应提高他们的质量意识。按照全面质量管理的观点，检测人员应当树立质量第一的观念、为客户服务的观念、用数据说话的观念以及综合效益（社会效益和企业效益）观念；再者应提高他们的技术素质。检测人员应有精湛的技术技能、严谨的科学态度、一丝不苟的工作作风，严格执行质量标准和操作规程的法制观念，以出色的工作质量，间接地保证工程质量。

总之,随着科学的发展,社会的进步, 检测机构必须建立覆盖检测市场的信用体系，提高检测机构的信用意识和服务水平，我国建筑工程质量责任制度必定可以更完善,因工死亡人数有望逐年减少,建筑活动各主体规范落实将更为明确。

检测方法的建立论文 篇7

槐花中的主要成分为芦丁 (Rutin) , 又名芸香苷, 其化学名称为:5, 7, 3′, 4′-四羟基,

3-芸香糖黄酮, 槐花中芦丁的含量大约在4.30%~23.50 %之间[1]。现代药理研究表明槐花之所以具有如此非凡的药效, 主要与其含有黄酮类物质芦丁有很大的关系 [2]。本试验旨在建立和优选槐花中芦丁的正交提取工艺模式, 并对提取物进行检测, 为槐花药物的开发和利用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 药材:

槐花粉末 (初夏采集于天水师范学院生物园, 自然风干, 粉碎) 。

1.1.2 仪器设备:

KQ-500D型数控超声波清洗器、AB104-S精密电子分析天平、Lambda 35型紫外-可见光光度计、Spectrum one B型傅立叶变换红外光谱仪。

1.1.3 药品及试剂:

芦丁对照品、95%乙醇、5%硼砂、石灰水、NaNO2、AlCl3、乙酸乙酯、甲醇、浓氨水, 其余试剂均为国产或进口分析纯。

1.2 槐花中芦丁的正交提取工艺

① 提取:

粗称槐花粉末10 g, 放入锥形瓶中, 加入15mL蒸馏水, 在60℃下超声波萃取30 min (超声功率40%) , 静置过夜, 加入100 mL 3%硼砂溶液, 再加入饱和石灰水调节pH在8~9之间, 静置1 h。将静置液加热煮沸, 搅拌, 待晶体溶解后趁热减压抽滤, 滤液用9%盐酸调节pH使晶体析出, 静置过夜, 抽滤静置, 得芦丁粗品[3,4,5]。将粗品置于烧杯中, 加入150 mL蒸馏水、5 mL 3%硼砂溶液, 加热、搅拌使晶体溶解, 在此过程中加入饱和石灰水调节pH, 趁热减压抽滤, 滤液用9%盐酸调节pH, 静置过夜, 抽滤、凉干得芦丁精品[3,4,5]。

② 纯度测定:

准确称取芦丁对照品

0.0 625 g, 加75% 50 mL乙醇溶解, 定容至250 mL刻度线, 摇匀作为芦丁对照品溶液。

精密量取芦丁对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL 于50 mL容量瓶中, 分别加蒸馏水至10 mL, 另取三重蒸馏水作为空白对照, 分别加入5% NaNO2溶液2 mL, 摇匀, 静置6 min, 加1% AlCl3溶液6 mL, 摇匀静置6 min, 加4% NaOH溶液20 mL, 摇匀静置15 min, 加蒸馏水至刻度, 在紫外-可见光分光光度计510 nm波长时测定其吸光度, 以芦丁对照品的浓度为横坐标, 吸光度为纵坐标, 得回归方程:Y=0.009X-0.0018, R2=0.9998。

称取样品约30 mg, 置50 mL容量瓶中, 加入10 mL 75%乙醇使其溶解, 加水定容至刻度。取正交实验所需的9组样品, 精密量取2 mL, 依次加入显色试剂, 在510 nm波长时测定其吸光度, 代入回归方程计算芦丁的含量。

1.3 槐花中提取物的TLC检测

用100 μL的移液器吸取槐花提取物甲醇溶解液3~4 μL, 点于距硅胶薄层板下边缘8 mm的位置, 点样斑点的直径为1~2 mm。以乙酸乙酯∶甲醇∶水∶浓氨水 (8∶1∶1∶0.5) 为展开剂展开。待展开8 cm时, 置于紫外灯下观察, 记录显色荧光点的颜色, 并计算比移值 (Rf) 。

1.4 槐花提取物红外光谱检测

将提取物做红外光谱分析。在玛瑙研钵中放入2 mg样品和300 mg锭剂KBr, 将两者研磨使其混合均匀, 取混合物200 mg置于锭剂成型器中加压制成薄片。将压片放入样品槽中, 采用Spectrum One傅立叶红外光谱仪, 于频率450~4 000 cm-1范围内进行测定。

1.5 槐花提取物紫外光谱检测

将提取物进行紫外光谱分析。在1 cm×1 cm石英比色管中加入事先配制好的溶液4 mL (将2 mg样品溶于40 mL甲醇溶液中) , 另取不含该样品的甲醇做为空白对照, 采用Lambda 35型紫外可见光光度计, 于波长为200~400 nm范围内进行测定。

2 结果与分析

2.1 正交提取工艺结果与分析

结合文献和预备试验, 选用碱提pH、酸沉pH和煮沸时间作为影响芦丁提取的主要考察因素, 按照L9 (33) 正交表进行正交试验, 其结果见表1~表3。

正交试验结果表明, I3A

2.2 TLC检测的结果与分析

本试验以乙酸乙酯∶甲醇∶水∶浓氨水 (8∶1∶1∶0.5) 为展开剂, 对槐花提取物进行TLC检测, 在紫外灯照射下观察其色斑情况, 并测定其Rf值在0.39~0.45之间, 与纯品芦丁的文献报道一致[6]。

2.3 红外光谱检测的结果与分析

将槐花提取物进行红外光谱检测, 其测定结果如图1所示。

由红外光谱图可知, 该提取物在3336.91 cm-1处的吸收峰较宽, 是成氢键的-OH、或为配位水、醇和酚羟基的伸缩振动吸收峰;2938.59 cm-1是以螯合形式存在的形成了分子内氢键的-OH;1967.54 cm-1是积累双键 (如:丙二烯等) ;1655.52 cm-1是处于氢键烯醇形式的β - 酮酯、或羰基伸缩振动吸收峰;1600.37、1506.68 cm-1是α、β -不饱和羰基化合物、或为苯环π键共扼体系的C=C键伸缩振动吸收峰;1456.88 cm-1是-CH3的弯曲振动, 也可能是-CH2的剪切式振动, 且与-CH3相重叠;烯烃的C-H面内弯曲振动在1 420~1300 cm-1处, 面外弯曲振动位于1 000~670 cm-1之间, 或此处两个谱峰是酚羟基的C-O键伸缩振动与O-H键面内变形振动偶合所致;1169.25 cm-1是醚的C-O-C伸缩振动吸收峰。以上数据与纯品芦丁的文献报道一致或接近[6]。

2.4 紫外光谱检测的结果与分析

将槐花提取物进行紫外光谱检测, 其测定结果如图2所示。

在紫外光谱图中可以看到, 该提取物在362.65 nm 是包峰, 不表示任何生色基团;在258.62 nm有明显吸收峰, 表明该提取物有苯基或-O-Ph结构;在211.36 nm有尖锐吸收峰, 表明该提取物有-OH、-OMe、或两个以上双键的共轭体系。其数据与纯品芦丁的文献报道基本一致[6]。

3 讨论

本试验通过碱提酸沉法对槐花中芦丁的正交提取工艺研究, 得知影响芦丁产率和纯度的主要因素是:碱提pH、酸沉pH和煮沸时间, 从而优选出的最佳提取工艺为碱提pH=9、酸沉pH=3、煮沸时间10 min, 提取率最高可达4.4%。从而初步建立了槐花中提取芦丁的正交提取工艺模式。提取物经TLC法、红外光谱和紫外光谱的检测, 其数据与文献报道基本一致, 故可认定从槐花中提取得到的晶体为芦丁。

槐花广泛分布于我国各地, 作为一种重要的药用植物, 具有清肝泻火、清热凉血等作用, 已广泛应用于临床实践。通过本试验研究以期探求槐花中芦丁的最佳提取工艺, 为槐花药物的进一步开发和利用提供依据。

摘要：采用碱提酸沉法对槐花中芦丁进行正交提取试验, 并对提取物进行TLC法、红外和紫外光谱检测。结果表明, 碱提酸沉法最佳正交提取工艺为碱提pH=9, 酸沉pH=3, 煮沸时间10 min, 提取率最高可达4.4%。其提取物经光谱检测可确定为芦丁纯品。

关键词：槐花,芦丁,提取,检测

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检测方法的建立论文 篇8

1 材料

1.1 病料

采自确诊为PCV-2感染病猪的淋巴结、肺脏和脾脏等组织, 置于-80 ℃冰柜中保存, 备用。

1.2 主要试剂

Tris平衡酚, 购自Solarbio公司;10×Tap Reaction Buffer、Taq DNA聚合酶 (含10×Buffer, 25 mmol/L MgCl2) 、dNTPs、100 bp DNA Marker, 购自天根生化科技 (北京) 有限公司;蛋白酶K, 购自宝生物工程 (大连) 有限公司。蛋白酶K储存液 (10 mg/mL) 、细胞裂解缓冲液、饱和酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1) 、3 mol/L醋酸钠 (pH 值为5.2 ) 、TE缓冲液 (pH 值为8.0) 、RNase A (10 mg/mL) 和EB贮存液 (10 mg/mL) 、50×TAE (Tris-乙酸) 、10×上样缓冲液、1.2%琼脂糖凝胶, 均参照参考文献[1]自制。

2 方法

2.1 引物的设计与合成

根据GenBank中PCV-2核苷酸全序列 (DQ910865) , 应用Oligo 4.0软件设计了1对PCV-2特异性引物 (由上海生工生物工程技术服务有限公司合成) , 序列为P1 5′-AGTGAGCGGGAAAATGCAGA -3′, P2 5′-TCCTCCGTGGATTGTTCTGT-3′。

2.2 组织病料DNA的提取

组织病料DNA的提取参照参考文献[1]进行。

2.3 PCR扩增

将提取的DNA作为PCR模板, 建立25 μL的PCR的反应体系:DNA模板 2 μL, 10×PCR Buffer 2.5 μL, dNTP (2.5 mmol) 2 μL, 上游引物 (P1, 25 pmol/μL) 0.5 μL, 下游引物 (P2, 25 pmol/μL) 0.5 μL, Taq DNA聚合酶 0.5 μL, 加双蒸水至25 μL。反应程序:94 ℃ 3 min;94 ℃ 45 s, 55 ℃ 45 s, 72 ℃ 45 s, 共32个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃ 保存。取PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检查。

2.4 敏感性检测

将所提取的已定量的病毒DNA (19 μg/mL) 按照1×10-1～1×10-7进行10倍倍比稀释, 分别作为PCR模板。按上述扩增反应体系和反应程序分别对这些模板进行PCR扩增。各取5 μL PCR产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳, 以出现阳性反应条带的模板用量为最高稀释倍数, 推算可检出的最低病毒含量。

2.5 特异性检测

采用设计的PCV-2特异性引物及所建立的PCR方法对PCV-2、猪繁殖与呼吸综合征病毒 (PRRSV) 、猪细小病毒 (PPV) 及PK-15 细胞的阳性样品进行PCR扩增, 观察是否扩增出PCV-2、PRRSV、PPV等病毒及PK-15 细胞的核酸片段。

2.6 临床送检样品的检测

对保定、满城、山东、正定送检的病料 (脾脏、淋巴结、心脏等) 进行PCR检测。

3 结果

3.1 PCR扩增结果

扩增出的片段大小为417 bp, 与预期大小相符, 见图1。

1.100 bp DNA Marker;2～4.阳性病料。

3.2 敏感性检测结果

将提取的DNA按照1×10-1～1×10-7作10倍倍比稀释后进行PCR扩增, 结果可检出目的基因的最低DNA模板的稀释浓度为1×10-4, 见图2。根据该模板的OD260值计算, 在DNA模板稀释浓度为1×10-4时, DNA模板含量为3.8 pg, 可见该方法具有较好的敏感性。

1.100 bp DNA Marker; 2～8.稀释度分别为1×10-1, 1×10-2, 1×10-3, 1×10-4, 1×10-5, 1× 10-6, 1×10-7时扩增结果。

3.3 特异性检测结果

用PCV-2特异性引物对PCV-2、PRRSV、PPV等病毒及PK-15 细胞的阳性样品进行PCR扩增, 经1.2%琼脂糖凝胶电泳后, 只有PCV-2扩增出1条417 bp大小的条带, 而PRRSV、PPV及PK-15 细胞都没有条带出现 (见图3) , 表明该方法所扩增的片段为PCV-2特异性片段, 方法具有良好的特异性。

1.100 bp DNA Marker; 2.阳性标准PCV-2株; 3.阳性标准PRRSV株; 4.阳性标准PPV株; 5.PK-15细胞。

3.4 临床样品的检测结果

对保定、满城、山东、正定等地送检的4份病料应用所建立的PCR方法进行检测, 结果均为阳性, 见图4。

1.100 bp DNA Marker; 2～5.病料分别来自正定、满城、山东、保定;6.PCV-2阳性对照。

4 讨论

(1) PCV-2感染是近些年新发现的一种猪的传染病, 动物感染后可以使机体的免疫系统遭到损害, 导致抵抗力下降, 从而易并发或继发其他病原的感染, 使病情加重, 严重地影响着世界养猪业的发展。从2001年我国报道猪群中存在PCV-2感染以来, 由PCV-2感染所致疾病的发生和流行呈上升趋势[2]。但由于目前国内外尚没有有效的疫苗和药物用于该病的防治, 一旦发病将会给养殖户带来较大的损失。因此, 建立一种快速、特异、敏感的检测方法对该病的预防将发挥极其重要的作用。

(2) 目前, 国内外已对PCV-2的诊断方法进行了大量的研究, 并取得了一定的进展, 主要包括血清学诊断方法和病原学诊断方法。由于PCV-1和PCV-2两个血清型之间的同源性较高, 并存在着共同的抗原表位, 用血清学检测难以区分;并且国内不同厂家生产的PCV-2酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒检测结果差别较大, 因此用ELISA法检测PCV-2抗体很难对临床病例进行确诊。国外生产的ELISA、免疫荧光试验 (IFA) 等诊断试剂盒非特异性较高, 重复性、稳定性还需进一步改进, 而且价格昂贵。要确定病毒病的病原常常需要进行病毒的分离与鉴定, 但由于PCV在细胞上不产生细胞病变, 在细胞培养中病毒的含量也很低, 需要盲传多代后才能获得高效价的病毒, 因此病毒分离费力、耗时, 不适合于临床上对本病的快速诊断[2]。由此可见, 从以往的试验研究的方法、结果和临床实用性上来看, PCR方法具有特异性强、敏感性高和简便易操作的特点, 可以快速准确地检测感染病例组织样品中的核酸DNA, 对临床上PCV-2的快速诊断非常适合。

(3) 本试验根据PCV-2的ORF1基因的保守序列设计了1对引物, 建立了PCV-2的PCR检测方法, 并进行了敏感性、特异性检测, 结果表明敏感性和特异性较好。然后又用该方法对临床样品进行检测, 均能获得预期长度的DNA条带。

(4) 试验中, 提取病毒基因组DNA时, 各操作步骤要谨慎小心, 尽量减少DNA的人为降解;取上清液时不应贪多, 以防非核酸类成分干扰;异丙醇、乙醇、醋酸钠等要预冷, 以减少DNA的降解, 促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。

参考文献

[1]宋勤叶.表达圆环病毒2型衣壳蛋白重组质粒的构建及免疫效应[D].北京:中国农业大学, 2005.

检测方法的建立论文 篇9

关键词：水貂,绿脓杆菌,PCR,特异性,敏感性

绿脓杆菌也称铜绿假单胞菌, 属于假单胞菌属, 是一种常见的条件致病菌 [1]。水貂出血性肺炎是由绿脓杆菌引起的毛皮动物的急性、败血性传染病, 属人畜共患病, 在我国水貂养殖区域广泛流行, 给水貂养殖业造成了较大的经济损失[2,3,4]。

绿脓杆菌能产生多种与毒力有关的物质, 其中外毒素A (PEA) 是一种致死性毒素, 是绿脓杆菌最主要的致病因子[5]。吴凌娟等[6]、胡晓梅等[7]、G.L.Gray等[8]已经克隆和测定了PEA结构基因。本试验选择PEA基因作为PCR检测的目标基因, 建立了水貂绿脓杆菌PCR快速检测方法, 为进一步研究其结构与功能的关系奠定了基础。

1 材料

1.1 菌株

水貂绿脓杆菌标准菌株, 由中国农业科学院特产研究所馈赠;其他菌株, 均为从某貂场采集分离所得。上述菌株用LB培养基或营养琼脂培养基培养 (实验室配制) , 37 ℃培养24 h, 4 ℃保存[9]。

1.2 主要试剂

Taq DNA聚合酶、dNTPs、DL-2 000 Marker、琼脂糖等, 购自武汉天源生物有限公司;细菌基因组提取试剂, 由辽宁医学院经济动物教研室保存。

1.3 PCR扩增引物

根据GenBank已上传的绿脓杆菌PEA基因序列设计、扩增该基因大约400 bp区域片段的引物 (由上海生工生物工程技术服务有限公司合成) , 序列为5′-GACACGCCCCTCAGCATCATC-3′ (退火温度为65 ℃) , 5′-CGCTGGCCCATACGCTCGAGC-3′ (退火温度为67 ℃) 。

2 方法

2.1 检测样品的制备

挑取数个菌落悬浮于含100 μL超纯水的试管中, 振荡混匀, 用PCR仪95 ℃加热10 min, 置于冰上冷却10 min, 12 000 r/min离心2 min, 取上清液作为PCR反应的DNA模板。细菌DNA的提取参照参考文献[10]。

2.2 PCR反应体系

反应体系 (50 μL) :10×Buffer (含Mg2+) 5 μL, dNTPs 1 μL, Taq酶1 μL, 上、下游引物各2.5 μL, 模板1～5 μL, 加ddH2O至50 μL。PCR反应条件:95 ℃预变性3 min;94 ℃变性30 s, 57 ℃退火40 s, 72 ℃延伸2 min, 共32个循环;72 ℃终延伸7 min。-20 ℃保存, 备用。

2.3 PCR 产物的检测

取5 μL PCR产物用2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测 (电压为160 V, 电泳时间为1 h左右) [11], 紫外灯下观察扩增结果, 并一次成像拍照。

2.4 PCR扩增敏感性的检测

通过确定能够产生目的条带所需模板DNA的最小量来检验该PCR反应的敏感性。将模板DNA经过系列10倍梯度稀释以后[12]分别进行PCR反应, 反应条件与2.2相同, PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测。

2.5 PCR扩增特异性的检测

分别取过夜培养的水貂绿脓杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、乳酸菌菌液各1 mL, 按照2.1方法提取基因组DNA, 各取1 μL作为模板, 按照2.2方法进行PCR扩增。

3 结果

3.1 PCR产物的电泳结果 (见图1)

1～4.PCR产物;M.DL-2 000 Marker。

PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳检测, 结果扩增出400 bp基因片段, 与预期的结果相符。

3.2 PCR扩增敏感性的检测结果 (见图2)

1～5.DNA模板量分别为1 pg和10 pg、100 pg、1 ng、10 ng;6.阴性对照;M.DL-2 000 Marker。

从图2可以看出, 在25 μL的反应体系中, 当模板DNA量为10 pg时, 目的条带仍然可以较清晰地看到。

3.3 PCR扩增特异性检测结果 (见图3)

1.阴性对照;2.水貂绿脓杆菌;3.金黄色葡萄球菌;M.DL-2 000 Marker;4.大肠杆菌;5.乳酸菌。

从图3可以看出, 只有水貂绿脓杆菌在400 bp处得到1条带型清晰的条带, 由此说明该PCR反应对水貂绿脓杆菌具有特异性。

4 讨论

水貂绿脓杆菌病常呈地方性爆发流行, 死亡率为10%～50%[13], 2001年后该病在我国各省频繁爆发[14]。目前, 绿脓杆菌病的诊断主要靠传统的免疫学技术, 试验步骤繁琐, 通常需要几天甚至更长的时间才能最终确诊, 从而延误了对该病的诊治。本试验应用PCR技术扩增了水貂绿脓杆菌外毒素基因的一段400 bp的片段, 在4 h之内即可完成对该菌的鉴定, 具有简单、快捷、特异性强和敏感度高的优点, 便于在实际工作中推广、应用。

检测方法的建立论文 篇10

目前, 国内外对PCV2的检测方法已经进行了大量的研究, 除了传统的病毒分离、免疫荧光法、ELISA方法、免疫组化法等方法以外, 还建立了检测PCV2的普通PCR、竞争PCR、套式PCR和实时荧光定量PCR等分子生物学诊断方法。在这些方法中, 普通PCR方法具有较高的敏感性和特异性, 而且操作简便, 特别适合于临床的快速诊断。本研究根据PCR技术原理, 建立了PCV2的PCR快速检测方法, 对日常的临床诊断具有较强的指导意义, 现将结果报告如下。

1 材料

1.1 病毒

PCV2毒株为本课题组从临床上发病猪的肺脏和淋巴结中分离得到。对照毒株猪瘟病毒 (HCV) 、猪繁殖与障碍综合征病毒 (PRRSV) 、猪伪狂犬病毒 (PRV) 均为疫苗毒。

1.2 病料

病料采集于2005年6月至2006年3月, 分布于温州市的11家养猪场的发病猪。所有发病猪均是断奶后仔猪, 并具有明显的呼吸道症状。主要表现体温升高, 食欲下降, 消瘦, 被毛粗乱, 皮肤苍白, 呼吸困难或明显咳喘。有的在耳部、腹部可见出血性紫红色斑块, 眼角分泌物增多, 部分病猪共济失调。病猪生长缓慢, 大部分成为僵猪。剖检的病猪大部分表现为全身淋巴结出血、肿胀, 特别是腹股沟淋巴结、肠系膜淋巴结、肺门淋巴结及颌下淋巴结肿大, 切面呈均匀的苍白色;肺萎陷, 肺尖叶有实质性病变, 胸腺萎缩;脾脏中度肿大, 肉变;肝脏变暗, 萎缩, 肝小叶间结缔组织增生;心包积液, 包膜内有大量炎性渗出物;肾脏水肿, 苍白, 被膜下常伴有白色坏死灶;盲肠和结肠粘膜充血或淤血。采集病猪的腹股沟淋巴结、颌下淋巴结、肠系膜淋巴结、脾脏、肺脏等组织, 冷冻保存, 作为PCV2检测材料。

1.3 主要试剂

r Taq DNA聚合酶 (上海Promega公司) 、蛋白酶K (MERKE公司) 、10×Buffer、d NTP (25 mmol/L) 、DL-2 000 Marker均购自Ta Ka Ra公司。其余试剂均为分析纯产品。

1.4 主要仪器

PCR扩增仪 (Eppendorf公司) 、冷冻离心机、-70℃超低温冰箱、凝胶成像分析仪。

2 方法

2.1 引物设计

根据Gen Bank中发表的PCV2全基因序列, 设计了一对扩增PCV2 ORF2片段的引物, 引物序列如下:

P1:5’-TCT CAG TAT GAC AGT CTC AAG-3’

P2:5’-GCC ATC GTT CGT CAT GTT TAT-3’

预扩增目的片段大小为750 bp, 引物由上海生物工程公司合成, 用高压灭菌dd H2O溶解配成20 pmol/L, -20℃保存备用。

2.2 病毒DNA的制备

取少量组织病料, 剪碎后加入4倍体积的0.01 mol/L PBS研磨匀浆, 反复冻融3次;10 000 r/min离心5 min, 取上清液 (500~700μL) ;加入等体积的氯仿, 振荡混匀, 10 000 r/min离心10min;取水相, 放入新的EP管中, 再加入等体积的氯仿, 重复操作3次;取上清液于新的EP管中, 加入终浓度为分别为1%和50μg/μL的SDS和蛋白酶K, 55℃作用30 min;加入等体积的酚抽提, 振荡混匀, 10 000 r/min离心10min;取上清液, 加入等体积的酚/氯仿抽提, 振荡混匀, 10 000 r/min离心10min;取上清液, 加入等体积的氯仿抽提, 10 000 r/min离心10 min;取上清液, 加入1/10~1/8体积的p H 5.2, 3M乙酸钠和2~2.5倍体积的无水乙醇, -20℃过夜, 沉淀DNA;然后12 000 r/min离心20 min, 弃掉上清液, 室温干燥;最后加入20μL dd H2O/DEPC溶解, -20℃保存备用。

2.3 PCR扩增

25μL反应体系:引物P1 1.5μL, 引物P2 1.5μL, 2.5 m M d NTPs 2.0μL, 25 m M Mg2+1.5μL, 10×Mg2+free buffer2.5μL, Taq酶0.2μL, dd H2O 10.8μL, DNA 5μL。

反应循环参数:95℃预变性5min, 94℃变性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 共30循环;最后72℃延伸10 min。PCR产物于1%琼脂糖凝胶电泳。

2.4 特异性试验

采用设计的PCV2特异性引物对PCV2、HCV、PRRSV、PRVR的阳性样品进行PCR扩增, 观察是否扩增出PCV2、HCV、PRRSV、PRV的核酸片段。

2.5 敏感性试验

提取PCV2 DNA, 用核酸测定仪确定其浓度, 然后按10倍倍比稀释至7~10 ng/m L, 进行PCR扩增, 确定能检测到核酸条带的最低扩增模板浓度。

2.6 重复性试验

对10份临床样本重复检测2次, 确定该方法的稳定性。

3 结果

3.1 PCR反应条件的优化

通过对PCR反应体系中d NTPs、Mg2+、Taq酶、引物浓度的优化, 得出了各成分的最佳反应浓度分别为:d NTPs的浓度为2.5 m M, Mg2+的浓度为25 m M, Taq酶的浓度为0.05 U/μL, 引物的浓度为20 pmol/L。反应的循环参数为95℃预变性5 min, 94℃变性30 s, 58℃退火30 s, 72℃延伸40 s, 共30循环;最后72℃延伸10 min。用优化的条件对标准PCV2进行PCR扩增, 1%琼脂糖凝胶电泳, 扩增出大小为750 bp的片段, 与预期大小相符。

3.2 特异性试验

用PCV2特异性引物对PCV2、HCV、PRRSV、PRVR的阳性样品进行了PCR扩增。1%琼脂糖凝胶电泳后, 只有PCV2扩增出一条750 bp大小的条带, 而HCV、PRRSV、PRV都没有条带出现, 这表明该方法所扩增的片段为PCV2特异性片段, 方法具有良好的特异性。结果如图1所示。

3.3 敏感性试验

将提取的PCV2 DNA从100 ng按10倍倍比稀释至10-7ng/m L, 进行PCR扩增, 结果, 引物对P1/P2可以检测出目的基因的最低DNA模板量为10-5ng, 具有较好的敏感性。结果如图2。

3.4 PCR重复性

对10份临床样本重复检测2次, 结果均与第1次结果相符, 方法稳定性良好。

4 讨论

猪圆环病毒2型感染是近些年新发现的一种猪的传染病, 病毒感染后可以使机体免疫系统遭到损害, 导致抵抗力下降, 从而易并发或继发其他病原的感染, 使病情加重, 严重地影响着世界养猪业的发展。我国从2001年报道猪群中存在PCV2感染以来, 由PCV2感染所致疾病的发生和流行呈上升趋势。但由于目前国内外尚没有有效的疫苗和药物用于该病的防治, 一旦发病, 将会对养殖户带来较大的损失。因此, 建立一种快速、特异、敏感的检测方法, 对本病的预防将发挥极其重要的作用。

目前, 国内外已对PCV2的诊断方法进行了大量的研究, 并取得了一定的进展, 主要包括血清学诊断方法和病原学诊断方法。由于PCV1和PCV2两个血清型之间同源性较高, 并存在着共同的抗原表位, 所以用血清学检测难以区分两者, 并且国内不同厂家生产的PCV2酶联免疫吸附试验抗体检测试剂盒检测结果差别较大, 用ELISA检测PCV2抗体方法很难对临床病例进行确诊;国外市售的ELISA、间接免疫荧光试验 (1FA) 等诊断试剂盒, 非特异性较高, 重复性、稳定性也还需进一步改进, 而且价格昂贵。而对病毒病的病原学的确诊常常需要进行病毒的分离与鉴定, 但由于PCV在细胞上不产生细胞病变, 在细胞培养中病毒的含量也很低, 需要盲传多代后才能获得高滴度的病毒, 因此病毒分离费力、耗时, 不适合于临床上对本病的快速诊断。由于PCV2是DNA病毒, 并且基因组较小, 因此便于从核酸水平对病毒进行检测和研究。PCR方法具有特异性强、敏感性高和简便易操作的特点, 可以快速准确地检测感染病例组织样品中的核酸DNA, 对临床上PCV2的快速诊断非常适合。

本研究根据PCV2 ORF2基因的保守序列, 应用Primer Premier5.0软件设计了一对引物, 建立了PCV2的PCR快速检测技术, 用该技术对临床样品进行检测, 均能获得预期长度的DNA条带。通过对HCV、PRRSV、PRV的PCR扩增, 证明该方法具有良好的特异性。敏感性试验结果表明该方法敏感性较高, 可以直接用于临床样品的快速检测。重复性试验也说明该方法具有良好的稳定性, 可用于大规模PCV2病料的检测, 能够为温州市PCV2疫情监测提供较好地技术支持。

相关链接

猪圆环病毒PCR常用检测方法

1聚合酶链式反应检测:聚合酶链式反应 (PCR) 做为一种快速、简便、特异的诊断方法, 目前为病毒学诊断、分子生物学实验最常用的技术包括 (1) 多重PCR检测; (2) 定量竞争性PCR检测; (3) 复合PCR检测; (4) PCR-RFLP检测; (5) 其他PCR检测。

2间接荧光免疫试验:将组织病料接种PK-15细胞玻片培养, 丙酮固定, 用兔抗PCV高免血清与细胞培养物中的PCV反应, 可对PCV进行检测和定型。

3免疫组织化学技术检测:免疫组织化学技术 (IHC) 是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下, 借助于酶细胞化学的手段, 检测某种物质在组织细胞内存在部位的一门新技术。

4酶联免疫吸附试验:针对猪圆环病毒病血清学诊断方法, 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 是最主要的试验方法。

参考文献

[1]芦银华, 谈国蕾, 陈德胜, 等.猪圆环病毒复合PCR检测方法的建立及初步应用.农业生物技术学报, 2002 (4) :415-416

[2]Allan, G.M., Ellis, J.A., Porcine circoviruses:a review.Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 2000 (12) :3～14

[3]Harms P A, Sorden S D, Halbur P G, et al.Experimental reproduction o fsevere disease in CD CD pigs concurrently infected with type2porcine circovirus and porcine reproductive and respiratory syndrome virus.Vet Pathol, 2001 (5) :528～539

[4]Hamel AL, Lin LL, Nayar G.P.Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning mutisystemic wasting syndrome in pigs.J virol, 1998, 72:5262-5267

[5]Nawagitul P, Morozov I, Bolin SR, et al.Open reading frame2of porcine circovirus type2encodes a major capsid protein.J Gen Virol, 2000, 81 (Pt9) :2281-2287

培训制度建立的方法与策略分析 篇11

关键词：问题;培训制度;方法策略

中图分类号：F274    文献标识码：A      文章编号：1006-8937（2016）26-0026-02

随着全球经济一体化的加剧，市场竞争越来越激烈，企业要在竞争中立足，必须增强自身的竞争力。从表面看，竞争力来自企业的资金、资源、环境等客观条件;但从本质上看，企业的竞争力主要取决于人。充分发挥人力资源的作用，是企业在竞争中立于不败之地的重要保障，而教育培训则是开发和发展人力资源最基本的途径和手段。

越来越多的企业意识到培训的重要性，加强了企业的培训工作，但不少企业特别是中小企业的培训工作仍停留在最基础的操作层面，培训未制度化，存在诸多问题。

1  企业培训未制度化导致的问题

1.1  培训缺乏系统性

企业出于短期成本收益的考虑，往往出现问题的时候才被动去进行培训，使培训工作往往是间歇性的，而非长远系统的，培训无法解决企业的根本问题。如笔者所在的A企业，在未建立培训制度前没有专职负责培训的人员，往往是老板在企业经营中发现了问题后要求人力资源部安排相应的课程对所有员工进行培训，培训课程没有连续性、系统性，员工得不到全面的提高，制约了企业的发展。

1.2  培训缺乏针对性

企业往往是管理者选择什么，员工就培训什么，未考虑员工的需要，不进行培训需求调查，也不在培训前对员工进行相关知识的测评，讲师根据自己的经验设置课程和教学方案，造成学员重复学习或去学严重超出自己接受能力的知识技能。以笔者所举的A企业之前的做法为例，经营中出现问题后老板责令人力资源部安排课程对所有员工进行培训，而不同层次的员工知识层面不同，所需要的培训也不同，人力资源部安排的培训对公司员工没有吸引力，员工参加培训成了应付，培训课程上甚至有人玩手机、打瞌睡。企业花了不菲的金钱和时间，却达不到想要的效果。

1.3  缺乏培训效果评估和激励

企业没有严格的培训效果评价体系，员工培训是否成功，能否为企业带来预期的收益不得而知。员工参加培训通过努力学习提高了知识和业务能力但无相应的激励机制，不利于调动员工参加培训的积极性。

要解决这一系列的问题，企业必须建立完善的培训制度，才能发挥培训的功效。

如何建立完善培训制度，笔者所在的A企业在近年内作了以下尝试。

2  建立培训制度方法与策略的思考

2.1  建立健全企业培训机构

培训机构是企业培训工作的基石，培训机构功能的有效发挥可以更好地促进培训工作的开展，推动企业的发展。A企业在着手建立培训制度之初，从人力资源部门架构上分设培训管理部，负责培训工作的计划、组织、执行与评估。培训管理部设培训经理1名、培训专员2名，后增设部门兼职培训管理员、内部培训讲师。

2.1.1  培训经理的职责

①制定企业年度培训计划、月度培训计划与年度培训预算，并监督培训计划的实施;②负责培训管理的考核工作，对员工培训效果撰写评估报告，根据培训效果调整培训方案;③拓展培训渠道和培训资源，积累培训经验和资料，开发培训方案;④建立健全培训管理制度。

2.1.2 培训专员的职责

培训专员是培训管理部专职常设人员，其职责包括：

①进行培训需求调查和培训效果评估; ②组织执行培训工作;③进行档案管理，包括员工信息、培训档案及台帐、外部培训机构及讲师信息管理等; ④对公司培训教案库，定期进行修改和整理; ⑤维护培训场地和设施。

2.1.3  部门兼职培训管理员的职责

部门兼职培训管理员是由部门负责人指定一名部门员担任，其职责包括：①拟订部门月度培训计划; ②组织执行部门培训工作; ③进行部门培训需求调查与培训效果评估。

2.1.4 内部培训讲师的职责

内部培训讲师是通过选拔，从公司内部产生，按照讲师级别享有讲师津贴和授课津贴。其职责包括：①开发设计专业课程，如培训教材PPT、案例、试卷，并定期改进;②落实培训计划，讲授培训课程，负责培训监考、阅卷;③协助培训管理部完善公司培训体系。

2.2  有效制定和实施培训规划

培训规划是在培训需求分析的基础上，从企业总体发展战略的全局出发，根据企业各种培训资源的配置情况，对计划期内的培训目标、对象和内容、培训的规模和时间、培训评估的标准、负责培训的机构和人员、培训师的指派、培训费用的预算等一系列工作所做出的统一安排。A企业主要通过以下步骤制定和实施培训规划。

2.2.1  密切结合公司的发展战略和现状

企业培训的目的是通过提升员工的素质和能力，让员工更好的完成工作，达成企业的战略目标。实现企业的经营战略需要员工具备什么样的素质与技能，而企业经营现状中员工实际具有什么样的素质技能，理想状态与现实状态之间存在怎样的差距，要求培训管理部用全局的眼光去组织企业培训。

2.2.2  对培训需求进行调查分析

需求分析包括组织分析、人员分析和任务分析。①组织分析，考虑的是培训是在怎样的一种背景下发生的。通过组织分析来决定在公司的经营战略、可用的培训资源以及员工的上级、同事对培训活动的支持与否的情况下，培训是否符合需要。②人员分析，确定哪些人需要参加培训包括：其一，查找原因，判断业绩不佳到底是什么原因引起的，是知识、技能或能力不足，还是由于工作动力不够，或者是工作岗位设计本身有问题;其二，确定谁需要培训，确定员工是否作好培训准备。③工作任务分析，需要明确各个岗位及各级别的能力要求，这样才能根据不同的培训对象开发出不同的课程。例如，针对基层、中层、高层这些不同层级的管理者进行管理技能培训时，就要考虑到对他们不同的能力要求。基层管理者也要带团队，但事务性工作所占比例要多一些;中层管理者不但要做事、管事，而且管人的比例也提高了，所以在管理能力上要求更高，对企业而言是非常重要的;高层是企业的掌舵人，决定着企业的发展方向。

A企业进行的培训需求分析是将“自上而下”与“与自下而上”相结合，即：将按照员工岗位级别收集到的培训需求信息与根据公司战略方向、经营策略等管理层期望的培训需求相结合。

2.2.3  编订审核培训规划

各部门依照培训管理部划定的培训内容与责任部门，按年度、月度拟订“培训计划”送培训管理部审核，并作为培训实施依据。

培训管理部就各部门所提出的年度、月度培训计划汇编培训规划，呈报上级领导核鉴。各项培训课程由培训管理部根据培训规划审核编制，并填写《培训实施计划表》呈报审核后，通知有关部门及人员。

2.2.4  实施培训规划

①培训管理部根据《培训实施计划表》，按期实施并负责全部培训事宜，如培训课程安排、培训讲师的指派、场地安排，有关教材分发、教具借调，通知受训者等。②各项培训结束时，进行考核测验，由培训讲师负责监考，考试题目由培训讲师在开课前递交培训管理部审核。③培训管理部根据受训人员的签到表，检查受训人员出席情况。④培训管理部定期召开检查会，评估各项课程实施效果，并记录评估内容，递交各有关部门参考，予以改进。⑤各项培训考核测验因故缺席者，事后可以参加补考，补考测验不到者，一律以零分计算成绩。⑥培训测验成绩列入绩效考核积分，报人力资源经理履行“人事建议权”。

2.3  建立完善的培训课程体系

①A企业根据培训课程的普及型、基础型和提高型将培训课程分为员工入职培训课程、专业业务类课程和管理类课程三类。员工入职培训课程属普及型培训，课程主要包括企业文化、企业政策、企业相关制度、企业发展历史等。专业业务类课程属基础型培训，是从事各类各级岗位所需掌握的知识和技能的集合，岗位调动、职位晋升、绩效考核反应知识技能有欠缺者需加强专业业务类课程培训。管理类课程属提高型培训，是和个人及组织能力提升的软性技能的相关课程集合，主要针对中高层管理者。员工入职培训课程和专业业务类课程主要由内部培训讲师授课，对于管理类课程，A企业主要聘请外部培训师进行授课，针对高层管理者还设有特别管理课程，由培训管理部与高管签订培训协议后安排高管参加外训。

②培训管理部在培训课程的选择与设计前通过量化培训目标，将培训目的具体化、数量化、指标化和标准化，指导培训讲师和受训者掌握衡量培训效果的尺度和标准。

③确定各类型培训课程名称、培训对象、培训范围、培训规模、培训时间、培训地点、培训费用、培训方法、培训形式、培训教师。

④根据培训的效果评估，调整完善培训课程。其一，反应评估，主要评估受训者对培训课程内容、讲师、培训材料、设施等的满意程度，这是一种浅层评估，通常采用调查问卷进行;其二，学习评估，主要评估受训者在知识、技能、态度、行为方式等方面的学习收获，可以通过书面考试或撰写学习心得的形式进行;其三，行为评估，主要评估受训者在工作工程中态度、行为方式的变化和改进，可以通过绩效考核方式进行;其四，结果评估，主要评估受训者在一定时期内取得的生产经营或技术管理方面的业绩。结果评估内容是企业组织培训的最终目的，也是培训评估的难点，因为对企业经营结果产生影响的不仅仅是培训活动，还有其它因素的影响。

A企业培训管理部根据不同类型课程进行效果评估，将评估结果与受训者及其领导沟通，并反馈给培训讲师，作为培训课程改进的指导。

随着A企业的不断发展，A企业的培训制度也随之不断发展，笔者相信只要企业以人本思想为中心，结合本企业实际情况加强培训工作，企业的培训制度将更加完善、有效。

参考文献：

[1] 安鸿章.企业人力资源管理师（二级）第2版[M].北京：中国劳动社会保   障出版社，2007.

[2] 李钢英.企业培训制度的建立与实施研究[J].广西师范学院学报，

2007，28：4.

[3] 谭仲花.对企业培训规划的思考[EB/OL].http：//blog.sina.com.

检测方法的建立论文 篇12

目前, 人们通常根据临床症状以及病原菌的分离对巴氏杆菌感染进行诊断, 但这些方法工作量大, 花费的时间长, 不利于该病爆发流行时的及时诊断和疾病控制。随着分子生物学技术的发展, 对于细菌鉴定和特性研究已经深入到了基因水平之上, 例如DNA杂交、核酸扩增等分子生物学手段能够直接从临床样品中检测细菌, 大大减少了鉴定所需的时间[1,2]。试验建立了一种快速、特异性强的巴氏杆菌PCR诊断方法, 并对已被鉴定的32株巴氏杆菌进行检测, 以期为该病的临床诊断提供试验依据。

1 材料与方法

1.1 菌株

多杀性巴氏杆菌标准株 (C48-1) , 购自中国兽药监察所;1～32号巴氏杆菌菌株, 华中农业大学畜牧兽医学院附属兽医院分离、鉴定并提供;大肠杆菌和葡萄球菌, 长江大学生命科学学院微生物实验室保存;肺炎双球菌、胸膜肺炎放线杆菌和链球菌, 长江大学动物科学院兽医微生物实验室惠赠。

1.2 培养基

禽多杀性巴氏杆菌疫苗制造培养基, 购自青岛巴斯德生物工程有限责任公司。

1.3 引物的设计与合成

参照NCBI上发布的序列设计引物 (上海生工生物工程技术服务有限公司合成) , 预期扩增目的片段长度为1 226 bp, 序列为上游引物 (P1) 5′-TATAAAATTCAAAGTATATC-3′, 下游引物 (P2) 5′-CGCAGTCCACCCTTTTTTTA-3′。

1.4 模板的制备

分别将32个巴氏杆菌菌株和多杀性巴氏杆菌标准株 (C48-1) 培养16～20 h;各吸取菌液200 μL置于离心管中, 8 000 r/min离心5 min;弃上清液, 沉淀用50 μL ddH2O溶解, 100 ℃水浴中煮5～8 min;8 000 r/min离心5 min, 取上清液作为模板。

1.5 PCR反应

反应体系:10×Taq Buffer (含MgCl2) 2.5 μL, 10 mmol/L dNTPs 0.2 μL, 40 μmol/L上、下游引物各0.2 μL, 5 U/μL Taq DNA聚合酶0.1 μL, 模板5 μL, 加无菌水至每管总体积25 μL。

反应程序:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s, 58 ℃ 1 min, 72 ℃ 2 min, 共35个循环;72 ℃ 10 min;4 ℃ 2 min。

1.6 结果观察

取PCR扩增反应产物6 μL和DL-2 000 Marker 5 μL分别上样到1%琼脂糖凝胶中, 150 V电泳15 min, 然后在紫外线灯下观察。

1.7 PCR反应的特异性

同等条件下分别对大肠杆菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌和链球菌进行PCR扩增, 以多杀性巴氏杆菌标准株 (C48-1) 为阳性对照, 以双蒸水为阴性对照, 检测PCR反应的特异性。

2 结果与分析

2.1 引物序列的特异性分析

在NCBI上对引物序列进行比对, 结果表明, 与该引物序列同源性达到85%以上的基因序列有 8个, 其中与多杀性巴氏杆菌多杀亚种Pm70 (Pasteurella multocida subsp. multocida str. Pm70) 全序列的1 782 522～1 782 541 bp相似性达到100%, 与小家鼠6号染色体的BAC库RP23-100O18 (Mus musculus BAC clone RP23-100O18 from chromosome 6) 全序列的46 430～46 448 bp相似性达到86%, 与成年雄性小家鼠的胸腺cDNA (Mus musculus adult male thymus cDNA) [3]全序列的624～606 bp相似性达到86%, 但这些同源性在85%以上的基因序列中除了目的基因多杀性巴氏杆菌外没有其他细菌的基因。

2.2 32个巴氏杆菌菌株的鉴定

以32个巴氏杆菌菌株的DNA为模板, 用所设计的引物进行PCR扩增, 结果见图1～5。

1～8.1～8号巴氏杆菌;9.PM (C48-1) ;10.阴性对照;M.DL-15 000 Marker。

1～6.9～14号巴氏杆菌;7.PM (C48-1) ;8.阴性对照; M.DL-2 000 Marker。

1～6.15～20号巴氏杆菌;7.PM (C48-1) ;8.阴性对照;M.DL-2 000 Marker。

1～6.21～26号巴氏杆菌; 7.PM (C48-1) ;8.阴性对照;M.DL-15 000 Marker。

1～6.27～32号巴氏杆菌;7.PM (C48-1) ;8.阴性对照;M.DL-2 000 Marker。

由图1～5可知, 32株巴氏杆菌经所设计的引物进行PCR扩增后, 只有3, 15, 32号菌株扩增后为阴性, 其余29个菌株经PCR扩增后均出现1条长度约为1 226 bp的DNA扩增带, 与禽多杀性巴氏杆菌标准株C48-1的扩增带一致, 也与预期的扩增目片段长度相符。

2.3 PCR反应的特异性检测 (见图6)

1.大肠杆菌;2.肺炎双球菌;3.葡萄球菌;4.胸膜肺炎放线杆菌;5.链球菌;6.PM (C48-1) ;7.阴性对照; M.DL-2 000 Marker。

由图6可以看出, 以大肠杆菌、肺炎双球菌、葡萄球菌、胸膜肺炎放线杆菌和链球菌的DNA为模板所进行的PCR扩增结果都为阴性, 这一结果说明用该引物所进行的PCR扩增对多杀性巴氏杆菌具有较强的特异性。

3 讨论

1) 用研究设计的特异性引物对32个巴氏杆菌菌株进行PCR扩增, 结果有29个菌株经扩增后均出现1条长度约为1 226 bp的阳性DNA扩增带, 与禽多杀性巴氏杆菌标准株C48-1的扩增带一致, 检出率达到91%。本试验采用PCR方法鉴定禽多杀性巴氏杆菌所设计的引物扩增出的目的片段约为1 226 bp, 该结果与Kumar P等[4]、唐先春等[5]报道的460 bp有差异, 可能是由于引物序列不同所扩增出的目的DNA区段不同造成的。

2) 特异性试验结果表明, 试验建立的PCR检测方法具有很高的特异性, 灵敏性有待进一步检测。

参考文献

[1]曾静雯.禽多杀性巴氏杆菌质粒pC48-1和pX73序列测定与分析[D].贵阳:贵州大学, 2006.

[2]曾静雯, 刘慧芳, 沈琴芳, 等.多杀性巴氏杆菌鉴定与特性研究的分子生物学方法[J].中国兽药杂志, 2006, 40 (4) :41-44.

[3]CARNINCI P, HAYASHIZAKI Y.High-efficiency full-length cD-NA cloning[J].Methods in Enzymology, 1999, 303:19-44.

[4]KUMAR P, SINGH V P, AGRAWAL R K, et al.Identification ofPasteurella multocida isolates of ruminant origin using polymerasechain reaction and their antibiogram study[J].Trop Anim HealthProd, 2009, 41:573-578.