大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究

大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究（精选8篇）

大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇1

大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究

根据葛根总黄酮的理化性质,对葛根水提醇沉液采用大孔树脂进行分离纯化研究,以葛根总黄酮提取率为评价指标,筛选出大孔树脂分离纯化葛根总黄酮的最佳工艺为:选用D-100型大孔树脂,吸附速度为2 BV/h,除杂洗脱用水量为4 BV,洗脱剂乙醇浓度为70%,乙醇用量为3 BV.

作 者：何宇新 于杰 李玲 付超美 周亮 HE Yu-xin YU Jie LI Ling FU Chao-mei ZHOU Liang 作者单位：何宇新,李玲,HE Yu-xin,LI Ling(西华大学,生物工程学院,四川,成都,610039)

于杰,YU Jie(西南大学,园艺园林学院,重庆,400716)

付超美,FU Chao-mei(成都中医药大学药学院,四川,成都,610075)

周亮,ZHOU Liang(成都大学,生物产业学院,四川,成都,610070)

刊 名：西南大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF SOUTHWEST AGRICULTURAL UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)年，卷(期)：28(6)分类号：S567.9关键词：葛根 葛根总黄酮 大孔树脂

大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇2

1 实验仪器与材料

1.1 实验仪器

R-501旋转蒸发仪 (上海申顺生物科技有限公司) 、DZF-6050型恒温干燥箱 (上海精宏实验设备有限公司) 、TU-1810型紫外可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司) 、KQ-250DE数控超声波清洗器 (昆山市超声仪器有限公司) 、30 m L三角瓶若干、漏斗若干、量筒、10 m L容量瓶若干、层析玻璃柱等。

1.2 实验材料

菊米 (浙江省) 、芦丁对照品 (中国药品生物制品检定所) 、95%乙醇 (工业纯) 、无水乙醇 (分析纯, 检测) 、氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸银均为分析级。

大孔吸附树脂:D101大孔吸附树脂、HPD100大孔吸附树脂、AB-8大孔吸附树脂、HZ841大孔吸附树脂、HZ841B大孔吸附树脂。

2 实验方法

2.1 菊米提取物的制备

称取已粉碎的菊米粉末200 g, 按固液比1∶10加入70%的乙醇, 微沸状态下, 水浴回流3次, 1 h/次, 合并提取液, 减压回收溶剂至浸膏状, 恒温干燥得菊米提取物。

2.2 大孔吸附树脂的预处理

称取5种大孔吸附树脂各10 g, 用95%乙醇浸泡4 h, 放出洗脱液, 用95%乙醇充分淋洗至流出液加3倍水不显浑浊, 再用纯化水反复冲洗至无乙醇味。处理后的大孔吸附树脂用纯化水浸泡备用。

2.3 大孔吸附树脂筛选实验

吸干已处理好的大孔吸附树脂表面水分, 各称取2 g于三角瓶中。精密称取黄酮提取物, 配制成浓度10 mg/m L的供试液, 精密吸取10 m L供试液, 加入各三角瓶中, 置于超声波振荡吸附8 h, 以达到饱和吸附。取上清液测吸光度, 计算树脂的吸附率。

滤出饱和吸附总黄酮的树脂, 吸干表面水分, 精密加入60%乙醇20 m L, 在超声波中振荡2 h后滤出, 测定吸光度, 计算解吸率。

2.4 D101大孔吸附树脂对总黄酮的静态吸附实验

分别精密称取D101大孔吸附树脂1.0 g置于5个30 m L三角瓶中, 加入不同浓度的黄酮供试液各20 m L, 超声波中振荡吸附30 min。取吸附后的溶液测吸光度, 计算不同浓度黄酮供试液的树脂对黄酮的吸附率, 以确定黄酮供试液的最佳上柱浓度。

2.5 D101大孔吸附树脂对总黄酮的静态解吸实验

分别精密称取D101大孔吸附树脂1.0 g置于6个30 m L三角瓶中。精密称取黄酮提取物, 制成最佳上柱浓度的总黄酮供试液, 精密吸取20 m L加入大孔吸附树脂中, 超声波中振荡吸附30 min。过滤, 吸干表面的水分, 加入不同浓度的乙醇溶液15 m L解吸, 测定解吸液吸光度, 计算不同浓度乙醇对黄酮的解吸率, 以确定洗脱剂最佳浓度。

2.6 D101大孔吸附树脂对总黄酮的动态吸附与及解吸实验

称取D101树脂10 g装柱, 以最佳上柱浓度配置溶液上样, 流速1 m L/min, 每1个柱体积收集1瓶流出液, 测定吸光度, 计算出流出液中黄酮的浓度, 绘制树脂对菊米黄酮的吸附曲线。用纯化水洗脱杂质——多糖, 纯化水洗脱液每1个柱体积测定1次总黄酮的吸光度, 计算出总黄酮浓度, 确定水的洗脱倍量。再用60%乙醇对吸附后的树脂解吸, 每半个柱体积收集一瓶解吸液, 测定吸光度, 计算出解吸液中黄酮的浓度。

2.7 D101大孔吸附树脂的使用次数实验

取100 g D101大孔吸附树脂装柱, 用95%乙醇浸泡3～4 h (乙醇高于树脂层10～20 cm) 。结束后用95%乙醇洗至流出液加3倍量的水不显浑浊, 再加纯化水洗至流出液无明显乙醇味。以最佳上样浓度1.5 mg/m L配置溶液上样, 上样量为28 BV, 取吸附后的溶液测吸光度计算黄酮的总吸附量和吸附率, 再用6 BV的纯化水洗脱多糖, 用3 BV的60%乙醇洗脱黄酮。树脂再生:5个柱体积的5%HCL吸脱, 纯化水吸脱至中性, 5个柱体积5%NAOH洗脱至中性。将再生后的树脂重复上述实验, 通过计算吸附后的溶液的浓度确定树脂的吸附能力, 直至树脂的吸附能力降低, 确定大孔吸附树脂的重复使用次数。

2.8 提取液中黄酮含量测定

以芦丁作为标准物质, 采用紫外分光光度法测定总黄酮含量。

计算公式为:

黄酮含量 (以芦丁计) =nC0V1V3/ (WV2) 100%式中n——提取液稀释倍数 (未稀释为1) ;

C0——样液含黄酮浓度, mg/m L;

V1——定容体积, m L;

V2——显色反应测定取用样液体积, m L;

V3——提取液体积, m L;

W——称样量, mg。

3 结果与分析

3.1 大孔吸附树脂吸附量实验

大孔吸附树脂吸附量实验结果如表1所示。

从表1可知:D101大孔吸附树脂的吸附量最高, 吸附率及解析率都较高, 故选用D101大孔吸附树脂分离纯化菊米总黄酮。

3.2 大孔吸附树脂对菊米总黄酮的静态吸附实验

菊米总黄酮上柱液浓度。菊米总黄酮供试液浓度对树脂吸附效果的影响如图1所示。

由图1可见:随着黄酮浓度的增加, 其吸附率呈递减趋势。0.5 mg/m L时吸附率最大, 但供试液浓度偏小, 在生产操作中, 供试液体积偏大;1.0 mg/m L和1.5 mg/m L吸附率差别不明显。基于最大限度处理量的考虑, 选取1.5 mg/m L作为上柱浓度, 其吸附率达到73%, 即菊米总黄酮浓度在1.5 mg/m L左右时更有利于吸附。

3.3 D101大孔吸附树脂对总黄酮的静态解吸实验

洗脱剂的浓度。洗脱剂浓度对树脂解吸效果的影响如图2所示。

由图2可见:随着乙醇浓度的增加, D101大孔吸附树脂对菊米黄酮的解吸率呈递增趋势。当乙醇浓度达到60%以后, 解吸率趋于恒定。且乙醇浓度偏高, 会使其他杂货一起洗脱下来。基于实验的可行性及经济多种因素综合考虑, 选取60%乙醇作为洗脱剂。

3.4 D101大孔吸附树脂对总黄酮的动态吸附与及解吸实验

3.4.1 大孔吸附树脂对黄酮的动态吸附性能

大孔树脂对黄酮的吸附曲线如图3所示。

由图3可见:随着供试液上样量的增加, 流出液中黄酮含量增加, 即树脂对黄酮的吸附效果随上样量的增加而下降。上样量>28 BV (即405 m L) 时, 流出液中黄酮含量基本趋于平衡趋势, 即树脂吸附达到饱和。

3.4.2 纯化水洗脱的用量

纯化水对黄酮的解吸曲线如图4所示。

由图4可见:纯化水用量在6 BV时, 解吸液中黄酮总量基本不变, 所以纯化水的用量为6 BV。

3.4.3 60%乙醇洗脱的用量

60%乙醇对黄酮的解吸曲线如图5所示。

由图5可见:60%乙醇用量在6个1/2 BV时, 解吸液中黄酮总量基本不变, 所以60%乙醇用量为3 BV。

3.5 D101大孔吸附树脂对总黄酮分离纯化的次数实验

D101大孔吸附树脂使用次数与收率的关系如表2所示。

D101大孔吸附树脂吸附率变化曲线如图6所示。

由图6可见:D101大孔吸附树脂的吸附率随着使用次数的增加而不断下降, 第6次后吸附率降低至50%以下。从实际生产时的经济效益来看, D101大孔吸附树脂对总黄酮分离纯化次数为6次。

4 结语

(1) 5种大孔吸附树脂中, D101对菊米黄酮的吸附量较大, 吸附率与解吸率较高, 是较理想的载体, 适用于菊米黄酮的分离纯化。

(2) D101大孔吸附树脂分离纯化菊米黄酮流速为10 m L/min时, 最佳上柱供试液浓度约为1.5 mg/m L, 上样量为28 BV, 纯化水洗脱用量6 BV, 洗脱剂乙醇浓度60%, 乙醇洗脱用量3 BV, D101大孔吸附树脂柱的使用次数6次。

摘要：以总黄酮吸附量、吸附率及解析率为指标筛选分离纯化菊米总黄酮的工艺参数。结果:5种大孔吸附树脂中, D101大孔吸附树脂的静态饱和吸附量最高, 为46.2mg/mL, 最佳上柱供试液浓度约为1.5mg/mL, 纯化水洗脱用量6BV, 洗脱剂乙醇浓度60%, 乙醇洗脱用量3BV, D101大孔吸附树脂柱的使用次数5次。结论:D101大孔吸附树脂的静态饱和吸附量为46.2mg/mL, 上柱供试液浓度约为1.5mg/mL, 最佳上样量为28BV, 纯化水洗脱用量6BV, 洗脱剂乙醇浓度60%, 乙醇洗脱用量3BV, D101大孔吸附树脂柱的使用次数6次。

关键词：分离纯化,大孔吸附树脂,菊米,总黄酮,工艺

参考文献

[1]国家药典委员会.中国药典:一部[M].北京:中国医药科技出版社, 2010.1

[2]浙江大学.菊米中黄酮类物质的提取方法[P].中华人民共和国国家知识产权局, 200810162423.8

[3]张素华, 王正云.大孔树脂纯化芦笋黄酮工艺研究[J].食品科学, 2006, 27 (2) :182～186

[4]谢贞建, 唐鹏程, 焦士蓉.大孔树脂分离纯化枳实总黄酮工艺研究[J].食品与药品, 2009, 3:16～19

大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇3

摘 要：目的：研究大孔树脂纯化杠板归总黄酮的最佳工艺参数条件。方法：用紫外分光光度法测定，以杠板归总黄酮的吸附率和解吸附率为考察指标，考察杠板归总黄酮在3种不同类型大孔吸附树脂（D101，AB-8，NKA-9）上的吸附和解吸附行为，通过动态吸附试验考察不同上样浓度、不同体积分数的乙醇、pH值对洗脱效果的影响等因素选择其工艺参数。结果：在实验条件下，最佳纯化工艺为在pH=6条件下，以AB-8型大孔树脂为吸附剂，体积分数为70%的乙醇为洗脱剂，上样浓度为21.34 mg·mL-1。结论；该方法简便易操作，纯化工艺的效果比较好。

关键词：杠板归；总黄酮；大孔树脂；纯化工艺

中图分类号：TS201.1 文献标识码：A 文章编号：1006-8937（2016）14-0165-02

1 概 述

杠板归是蓼科蓼属植物杠板归Polygonum perfoliatum L.的干燥地上部分[1]，又名贯叶蓼、蛇不过、河白草、梨头刺、蛇倒退等[2]，具有清热解毒、利水消肿、散瘀止血、止咳祛痰、抗氧化、抗炎抗菌、抗肿瘤、护肝、降血压等功效[3]。有研究报道杠板归中的主要成分是槲皮素为主的黄酮类化合物[4]，黄酮类化合物能预防和治疗老年人的高血压和脑溢血，且有治疗冠心病和心绞痛的作用[5]，药用价值高。有效分离纯化杠板归中的黄酮类物质，对开发和利用杠板归的资源有比较重大的意义。

本论文应用大孔树脂进行纯化工艺的研究，对杠板归中的总黄酮进行纯化，应用静态吸附-解吸附试验在3种不同类型的大孔树脂中进行筛选，优选出最佳的大孔树脂的型号—AB-8型，并采用动态吸附试验选择AB-8型大孔吸附树脂的适宜工艺条件，为其相关大生产应用提供理论的参数和依据。

2 材料和仪器

2.1 材 料

杠板归（浙江中医药大学第二门诊部提供，经浙江医学高等专科学校陶锋副教授鉴定为蓼科植物杠板归的干燥地上部分），AB-8，D101，NKA-9型大孔树脂，其余试剂均为分析纯。

2.2 仪 器

Sartorius BP 110S电子天平（德国）紫外分光光度计。

3 方法与结果

3.1 标准曲线

精密准确地称取芦丁对照品20 mg，放置在100 mL的容量瓶中，加适量60%的乙醇溶解后，振荡，定容，即获得芦丁的标准对照液（200μg/mL）。依次精密移取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL芦丁对照液于25 ml的容量瓶中，补充60%的乙醇达6ml，再依次精密加入5%亚硝酸钠溶液0.75 ml，摇匀后放置6 min；再精密加入10%硝酸铝溶液0.75 ml，摇匀后放置6 min；精密加入10 mL4%氢氧化钠溶液10 ml，以60%的乙醇定容，摇匀；静置15 min后，以第1瓶为空白调零，测定各瓶溶液的吸光度的值。并以芦丁的浓度C为x，测得吸光度A为y，得到以下回归方程：

A=7.5958C+0.0280，r2=0.9997

表明芦丁在8.2 ～57.4 μg/mL的范围内其线性关系较良好。

3.2 大孔树脂筛选

3.2.1 大孔树脂的预处理

取3种类型的树脂适量，用95%的乙醇将其浸润24 h，使其充分溶解膨胀，倒出乙醇和杂物后湿法装柱，用95%的乙醇反复冲洗，不定时的检查其流出的液体，至其与水混合后不出现白色浑浊为止。接着用大量的蒸馏水反复冲洗，直到没有醇味，待用。

3.2.2 粗提液的制备

将杠板归粉碎至粗粉，并用60%的乙醇25倍量，于70 ℃萃取5 min，取滤液；相同的方法再重复操作一次，两次提取液放一起，回收乙醇，得到浓缩至42.67 mg·mL-1的杠板归粗提液。

3.2.3 样品的含量测定

用移液管精确移取样品1.0 mL，放置在10 mL的容量瓶中，用纯化水定容；精确移取对照品1.0 mL，放置在10 mL的容量瓶中，用纯化水定容，于500 nm波长下测定其吸光度，以对照品计算其黄酮的含量。

3.2.4 静态吸附与解吸附

精密称取1.00 g D101、AB-8、NKA-9三种型号的树脂在 50 mL的具塞锥形瓶中，加入10.67 mg·mL-1浓缩液10 ml置于摇床中，在30 ℃的条件下震摇24h，过滤，得滤液1，测定其黄酮浓度（C1）。

取出饱和的树脂，在树脂中加入50%乙醇10 mL，相同情况下震摇24 h，再过滤，得滤液2，测定其总黄酮的浓度（C2）。

吸附率=（C0-C1）×100%/C0（1）

吸附量=（C0-C1）×V/C0 （2）

解吸率=C2×100%/（C0-C1） （3）

式中：C0为原液的浓度（mg·mL-1）；

C1为吸附后剩余溶液的浓度（mg·mL-1）；

C2为洗脱液浓度（mg·mL-1）；

V为洗脱液体积（mL），结果见表1。

结果表明：采用AB-8型号的吸附率和解吸附率最好，纯化效果最强。

3.3 AB-8树脂的纯化工艺条件优选

3.3.1 上样浓度的选择

精确称量已经预处理的湿树脂10 g，湿法装入层析柱中。将3种不同浓度的样品液10.67，21.34，32.01 mg·mL-1分别依次上柱，进行动态吸附试验，接取流出液，水洗至无色后，用50%的乙醇洗脱，收集洗脱液，浓缩干燥后成固体，计算其中总黄酮的含量，结果，见表2。

结果表明：总体考量总黄酮的洗脱率和其纯净度，总结得21.34 mg·mL-1为上样液的浓度。

3.3.2 不同体积分数乙醇的选择

精密称取6份各3 g（湿重）AB-8型树脂，湿法装柱，精密移取10.67 mg·mL-1浓缩液各5 mL，分别装柱，以纯化水洗至流出液无色后，分别用30%，50%，60%，70%，80%，95%不同体积分数的乙醇进行动态洗脱到洗脱液无色，收集洗脱液。测定收集到的洗脱液的总黄酮的浓度，计算洗脱液的洗脱百分率，并将洗脱液干燥成固体，测定其总黄酮含量，结果，见表3。

结果表明：总体考量总洗脱率和产物纯度，确定70%体积分数的乙醇对树脂洗脱的效果最佳。

3.3.3 PH的选择

精确称量经预处理的AB-8湿树脂10克，湿量法装柱，用稀盐酸调节其pH值分别为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0。对各pH值下的树脂的洗脱率进行了比较，并分别测定其中的黄酮的固体产物纯度，结果，见表4。

结果表明：总体考量其洗脱率和产物的浓度，总结得出pH=6为最好的酸碱度。

3.4 漏曲线与洗脱曲线考察

按上述条件上样并用大量水冲洗，以每10mL为1份收集此过程的流出液，测定杠板归总黄酮的含量，以y为累积的渗出浓度，x为体积作图，绘制渗漏曲线，如图1所示。

4 讨 论

通过比较3种不同极性的大孔树脂（D101是非极性，AB-8是弱极性，NKA-9是极性），发现弱极性AB-8型的大孔吸附树脂对杠板归总黄酮的纯化效果最好，富集能力比较强。用50%的乙醇洗脱，洗脱率达到71.1%，综合性能好，适用于杠板归总黄酮的纯化。

经过对纯化工艺参数进行考察，验证了中草药杠板归中总黄酮的适宜工艺为：上样体积是10 mL，上样液的浓度为 21.34 mg·mL-1，洗脱率达到67.34%，其纯度达到74.03%；70%体积分数的乙醇为洗脱浓度，洗脱率随着乙醇体积分数的增加而提高，产物的纯度在70%的乙醇体积分数下达到峰值74.76%；确定pH=6为最佳pH值，洗脱率虽然在pH=5相对较高，但综合考虑产物的纯度，得出pH=6时的纯度较高，为62.14%，由此可见弱酸性或偏中性比较适合洗脱。该纯化工艺操作简易，可重复利用，可以作为杠板归总黄酮的有效纯化方法，能得到理想的纯度，为进一步利用开发中草药杠板归提供了研究基础。

参考文献：

[1] 高雅，李豪，钟明利，等.杠板归总黄酮抗肝纤维化大鼠的作用及其机制 研究[J].华西药学杂志，2015，（2）..

[2] 陶锋，张如松.杠板归的体内外抗肿瘤作用实验研究[J].中华中医药学 刊，2013，（9）.

[3] 中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典：1部[M]北京：人民卫生出版社，2010.

[4] 成焕波，刘新桥，陈科力.杠板归化学成分及药理作用研究概况[J].中国现代中药，2012，（3）.

大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇4

1 材料与仪器

1.1 材料

十子代平方组方,购自唐山市同仁堂药店;芦丁标准品,购自中国食品药品检定研究院;95%乙醇、无水乙醇、石油醚等均为分析纯,盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均购自天津市永大化学试剂有限公司;AB-8、HPD700、DM130、HPD100、D900、D101大孔吸附树脂购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司。

1.2 仪器

电子天平(上海第二天平仪器厂);微型高速粉碎机(深圳化试科技有限公司);电热恒温水浴锅(上海器械五厂);旋转蒸发器RE-SZAA(上海亚荣生化仪器厂);循环水式真空泵(北京中兴伟业仪器有限公司);TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。

2 方法与结果

2.1 十子代平方总黄酮提取

精密称定中药复方十子代平方组方粉末24g,置于索氏提取器中,以石油醚240mL于90℃下回流脱脂2次,每次2h,挥干石油醚,置于60℃烘箱中干燥2h,放至室温。再以80%乙醇350mL在热水浴(95℃)中回流浸提3次,每次3h,合并流液,回流结束后抽滤,收集滤液,浓缩得十子代平方总黄酮。

2.2 总黄酮含量测定

2.2.1 标准曲线制备[5]

精密称取芦丁标准品10.06mg,置于烧杯中用适量的无水乙醇溶解,转移到50mL容量瓶中,加入无水乙醇定容、摇匀。分别精密量取上述溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、6.0mL于25mL容量瓶中,加超纯水至8.0mL,然后加1.0mL 5%NaNO2摇匀,放置6min,加1.0mL 10%Al(NO3)3摇匀,放置6min,再加10.0mL 4%NaOH摇匀,用超纯水定容后放置15min,以第一份溶液作为空白对照在510nm处测定吸光度,以吸光度A对浓度C绘制标准曲线。标准曲线方程为A=17.687C-0.0166,R2=0.999 4,R=0.999 6,结果表明线性关系良好。

2.2.2 样品含量测定

精密量取上述总黄酮提取液10.0mL,置于100mL容量瓶中稀释至刻度,定容,摇匀。精确量取10.0mL样品溶液3份置于25mL容量瓶中,按测定标准曲线的方法操作测定吸光度,根据标准曲线计算得样品溶液中总黄酮浓度。样品含量=样品浓度C(mg/mL)×稀释倍数。见表1。

注:样品含量=0.8150mg/mL×10=8.150mg/mL

2.3 大孔吸附树脂筛选

2.3.1 大孔树脂预处理[6]

大孔吸附树脂一般有未聚合的单体及残留溶剂,使用前须先行去除。树脂用无水乙醇浸泡24h,蒸馏水洗至无醇味,抽去水分备用。

2.3.2 静态吸附与解吸附实验

分别称取预处理过的AB-8、HPD700、DM130、HPD100、D900、D101大孔树脂1.008g(湿重),置于100mL具塞锥形瓶中,加入总黄酮浓度0.815 0mg/mL的样品液25mL,在25℃下,180r/min振荡24h,充分吸附后,分别精密量取上层液1.0mL测定总黄酮浓度,之后用蒸馏水洗涤、抽滤得到吸附后的树脂,加入50mL体积分数80%乙醇,在相同条件下震荡5h,分别精密量取上层液1.0mL测定总黄酮浓度。

按照如下公式计算吸附量、吸附率和解吸率:

式中C1和C2分别为吸附前后样品溶液总黄酮浓度(mg/mL);C3为洗脱液中总黄酮的浓度(mg/mL);V为样品液体积(mL);G为树脂湿重(g)。静态吸附、解吸附实验结果见表2、表3。

由表2和表3可知AB-8大孔吸附树脂均优于其他树脂,因此选择AB-8树脂分离纯化十子代平方中总黄酮。

2.3.3 AB-8树脂静态吸附动力学曲线绘制称取已预处理的AB-8大孔吸附树脂1.003g(湿重),置于100mL具塞锥形瓶中,加入总黄酮浓度0.716 0mg/mL的十子代平方复方总黄酮提取液50mL,在25℃下,160r/min振荡,分别于0、30、60、90、120、150、180、210、240、480、600min吸取上清液1.0mL测定总黄酮浓度,绘制树脂静态吸附动力学曲线。结果见图1。

2.4 AB-8树脂分离纯化总黄酮动态吸附解吸附实验

2.4.1 最佳上样浓度确定

分别取4.008g AB-8大孔树脂7份,湿法装入玻璃层析柱中。分别取C1(0.867 1mg/mL)、C2(1.293mg/mL)、C3(2.412mg/mL)、C4(3.493mg/mL)、C5(4.353mg/mL)、C6(4.604mg/mL)、C7(4.938mg/mL)十子代平方总黄酮提取液30mL进行动态吸附,收集流出液,定容到50mL,摇匀。分别精确量取1.0mL上述样品溶液测定总黄酮的浓度,根据“2.3”项中的(2)式计算吸附率。结果见表4。由表4可知最佳上样浓度为2.412mg/mL。

2.4.2 洗脱剂浓度确定

分别取4.005g AB-8大孔树脂5份,湿法装入玻璃层析柱中。精密量取浓度2.412mg/mL十子代平方复方总黄酮提取液30mL上柱吸附,收集过柱液,吸附树脂经过水洗后,再分别用10%、30%、50%、75%、95%的乙醇溶液50mL进行洗脱,收集洗脱液。分别精确量取1.0mL样品液测定总黄酮的浓度。结果见图2。当乙醇体积分数达50%时,总黄酮浓度变化较小,综合考虑最佳洗脱剂浓度为50%。

2.4.3 吸附穿透曲线绘制

取4.0g AB-8大孔树脂,湿法装入玻璃层析柱中。取浓度2.412mg/mL的提取液上样,以10mL为1管分段收集流出液,分别精确量取0.50mL流出液测定各管的总黄酮浓度,绘制穿透曲线。结果见图3。由图3可知饱和吸附量为160mL。

2.4.4 洗脱剂用量确定

将“2.4.3”中吸附饱和的树脂,用水洗脱树脂柱至脱液近无色,用50%的乙醇洗脱,每10mL收集一管,测定各管总黄酮浓度,绘制洗脱曲线。结果见图4。由图4可知洗脱剂用量为150mL,即5BV。

3 讨论

大孔树脂的吸附性能受多种因素的影响,如树脂的极性、比表面积、孔径等。根据“相似相溶”的原则[7],AB-8树脂吸附效果最好,可能是因为AB-8树脂为弱极性,更容易吸附弱极性十子代平方复方总黄酮。AB-8树脂不仅吸附好,还能较快地达到平衡,节约时间。本实验确定了上样浓度、上样量、洗脱剂浓度、洗脱剂体积等因素对分离纯化效果的影响,为十子代平方中总黄酮类成分的分离纯化提供了新方法。

参考文献

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大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇5

关键词：大孔吸附树脂；静态吸附；解吸；纯化；洗脱；石榴花；多酚

中图分类号： R284.2 文献标志码： B 文章编号：1002-1302（2015）10-0359-03

石榴5—7月开花，花期长，开花量大，不能结实的钟状花和部分筒状花会自然脱落，因此石榴花资源丰富，极具开发价值。石榴花中含有黄酮、多酚及三萜类等物质[1-2]，其中含量最丰富的是多酚，Kaur等报道石榴花乙醇提取物中的多酚含量达321.8 mg/g（以没食子酸为标准品）[3]。近年来，有大量研究表明，石榴花多酚不仅具有显著的抗氧化活性[4]，还具有抑制低密度脂蛋白和胆固醇的氧化[5]，防止动脉粥样硬化，降血压，降血脂[1]，抑制乳腺癌、前列腺癌和口腔癌等癌细胞增生[6-7]，减轻对肝组织的氧化损伤[3]等功能。因此，石榴花多酚在食品、化妆品和医药等领域有一定的应用前景。石榴花提取物中多酚总量与其多种生物活性呈明显的正相关性[4]，采用溶剂法提取的石榴花多酚还含有多种其他成分，因此需要对其进行纯化，才能提高其利用效率。目前，可用于植物多酚纯化的方法主要有溶剂萃取法[8]、重金属沉淀法[9]和树脂吸附法。萃取法须消耗大量三氯甲烷等有机溶剂，沉淀法须要消耗重金属，这2种方法容易导致产品中有机溶剂或重金属残留，而且产品收率较低。大孔树脂具有选择性强、吸附速度快、容量大、解吸容易、成本低等优点，近年来被用于分离纯化植物中的多酚[10]、黄酮[11]、花青素[12]等天然产物。然而，目前在还未见有关大孔吸附树脂法纯化石榴花多酚的研究报道。本研究从5种国产大孔树脂中筛选出 1种对石榴花多酚具有良好吸附和解吸性能的树脂，考察了该树脂对石榴花多酚的吸附与解吸性能及主要的影响因素，以期建立适宜的石榴花多酚纯化条件，为石榴花的深加工提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 材料

石榴花采自山东省枣庄市石榴园，于鼓风干燥箱内 115 ℃ 杀青处理5 min，然后在80 ℃烘干至恒质量，粉碎后过孔径约380～400 μm筛，备用。经预处理过的D101、AB-8、DA201、DM130和X-5大孔吸附树脂由安徽三星树脂科技有限公司提供。

1.2 仪器与试剂

UV-2550 紫外可见分光光度计（日本岛津公司），旋转蒸发器RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂），玻璃层析柱（1.5 cm×20 cm），KQ-5200超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）。没食子酸标准品为Sigma公司产品，其他试剂均为国产分析纯。

1.3 分析方法

多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu试剂比色法，以没食子酸为标准品。

1.4 试验方法

1.4.1 石榴花多酚提取液的制備方法 石榴花干燥粉碎，超声波辅助提取（70%乙醇溶液，料液比1 g ∶ 20 mL，超声波功率80 W，温度30 ℃，处理时间40 min），过滤，弃去滤渣，回收滤液即为石榴花多酚提取液的母液，并用Folin-Ciocalteu法测定滤液中的多酚含量，不同含量的提取液由母液稀释配制。

1.4.2 树脂静态吸附与解吸试验 分别称取5种预处理过的大孔吸附树脂D101、AB-8、DA201、DM130和X-5各 2 g，置于100 mL的锥形瓶中，并加入50 mL多酚含量为 2.5 g/L 的石榴花粗提物样品液，在25 ℃恒温环境中吸附 12 h，取其中一定量的样品液用于测定其中的多酚含量；静态吸附后过滤除去石榴花粗提物溶液，树脂用蒸馏水洗净，放入100 mL的锥形瓶中，加入50 mL无水乙醇，于相同温度下解吸，取一定量解吸液测其中的多酚含量，以比较不同树脂对石榴花多酚的吸附和解吸特性。吸附量、吸附率、解吸率、回收率的计算公式：吸附量（mg/g）=（ρ0-ρe）×V0/m；吸附率=（ρ0-ρe）/ρ0×100%；解吸率=ρd/（ρ0-ρe）×100%；回收率=ρd/ρ0×100%。其中：ρ0表示提取物溶液中多酚含量，g/L；ρe表示上清液中多酚的含量，g/L；ρd表示解吸液的多酚含量，g/L；V0表示提取物溶液体积，mL；Vd表示解吸液体积，mL；m表示树脂质量，g。

1.4.3 树脂吸附条件的优化

1.4.3.1 上柱液 pH 值对吸附效果的影响 将预处理好的X-5树脂，装入1.5 cm×20.0 cm的层析柱中，层析柱高度（L）/层析柱内径（D）=13。用水洗涤平衡后上柱，上柱条件：流速3 mL/min，上样液中多酚含量2.5 g/L，上柱液体积V=160 mL，上柱液 pH 值分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0。检测漏出液多酚含量，考察上柱液 pH 值对树脂吸附石榴花多酚含量的影响。

1.4.3.2 上柱液浓度对吸附效果的影响 吸附条件：最佳 pH 值由“1.4.3.1”节确定，石榴花提取液中多酚含量经稀释分别调整为0.11、0.42、0.85、1.55、2.49、3.11、4.66、6.22 g/L，各50 mL，置于100 mL锥形瓶中，加入5 g预处理过的X-5大孔吸附树脂，25 ℃水浴吸附12 h，检测上清液多酚含量，计算X-5树脂对多酚的吸附量，考察上样液浓度对吸附量的影响，绘制静态吸附曲线。

1.4.3.3 X-5树脂的吸附动力学 按照“1.4.3.2”节确定的最佳浓度配制石榴花粗提物溶液50 mL，置于100 mL锥形瓶中，加入5 g预处理过的X-5大孔吸附树脂，25 ℃水浴吸附，分别在吸附后1、2、3、4、5、6 h取上清液样品2 mL，测定其多酚含量，绘制吸附动力学曲线。

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1.4.3.4 上样液流速对吸附效果的影响 将多酚含量为31 mg/mL的石榴花提取液50 mL（pH值由“1.4.3.1”节确定）分别以6、4、2、1 mL/min的流速上柱，然后用去离子水冲洗至澄清，以70%乙醇作洗脱液，流速2 mL/min，测定洗脱液中多酚含量，计算树脂对多酚的吸附量，然后以流速为横坐标、吸附量为纵坐标绘制曲线。

1.4.4 树脂洗脱条件的优化

1.4.4.1 乙醇浓度对洗脱效果的影响 取100 mL多酚含量为3 mg/mL的石榴花提取液，加入25 g X-5树脂，25 ℃下吸附12 h，湿法上柱，用去离子水冲洗，再分别用100 mL 20%、40%、60%、70%、80%的乙醇溶液洗脱，流速 6 mL/min，测定洗脱液中多酚含量，考察乙醇浓度对洗脱效果的影响。

1.4.4.2 洗脱液体积对洗脱效果的影响 依照“1.4.3”节优化的吸附条件上柱吸附之后，用40 mL水迅速冲洗树脂柱，洗脱条件：洗脱液由“1.4.4.1”节确定，流速为80 mL/h。洗脫液分步收集并测定其多酚含量，绘制动态解吸曲线，从而考察洗脱液体积影响洗脱液效果的情况。

1.4.4.3 洗脱流速对洗脱效果的影响 按“1.4.3”节优化的吸附条件上柱吸附之后，用40 mL水快速淋洗树脂柱，洗脱条件：洗脱液由“1.4.4.1”节确定，洗脱液体积由“1.4.4.2”节确定，洗脱流速分别为6、4、2、1 mL/min。收集洗脱液并测定其含量，考察洗脱流速对洗脱效果的影响。

2 结果与分析

2.1 树脂的的筛选

通过静态吸附与解吸试验测定5种大孔树脂的吸附与解吸特性，结果见表1。其中，X-5型大孔吸附树脂对石榴花多酚的吸附容量、吸附率、解吸率及回收率都是最高的。吸附量和解吸率是评价一种树脂性能优劣的主要参数，前者反映树脂的吸附能力，后者反映吸附之后能否容易洗脱下来。 因此，X-5树脂纯化石榴花中的多酚较为理想。

2.2 X-5大孔吸附树脂吸附条件的优化

2.2.1 上样液pH值对吸附效果的影响 由图1 可知，其他操作条件不变，随着pH 值的升高，树脂对石榴花多酚的吸附量逐渐降低，说明低pH值有利于吸附。石榴花多酚含有鞣花酸、没食子酸等酚酸类物质[2]，因此具有弱酸性，在pH值较大时会解离成离子形态存在，此时不易被大孔树脂吸附，而以分子态存在时易被所用的大孔树脂吸附。当pH值下降时，石榴花多酚多以分子态存在就易被大孔树脂吸附。因此，pH值为 2.0的条件最适合X-5树脂吸附石榴花多酚。

2.2.2 上样液浓度对吸附效果的影响 从图2可以看出，上样液浓度较低时，X-5树脂对对石榴花多酚的吸附量随上样液浓度的增大而增大；在石榴花多酚含量为3.1 mg/mL时，吸附量达到最大；之后，吸附量反而随上样液浓度的增大而逐渐下降，这种变化趋势与其他文献中的结果[13-15]一致。上样液的浓度决定了同一时间与树脂相互作用的目标物质分子数量，从理论上讲，在达到饱和之前，该数量越大越有利于目标物质的富集；超过一定值后，随浓度增大，吸附量下降，可能是由于上样液中的糖类等物质在较大浓度时黏度变大，堵塞树脂孔隙，目标物质与树脂相互作用的机会减少，从而影响对多酚的吸附量。因此，选择3.1 mg/mL作为上样液浓度。

2.2.3 吸附动力学曲线 吸附速度也是大孔树脂吸附性能的重要参考指标。25 ℃时，X-5树脂对石榴花多酚的静态吸附动力学曲线见图3。由图3可以看出，在0～5 h内，X-5树脂对石榴花多酚的吸附量随时间的延长而增大，之后趋于稳定，说明吸附 5 h即可达到饱和，而XDA-1树脂对杜仲黄酮的吸附需要10 h以上才能达到平衡[11]，可见X-5树脂对石榴花多酚的吸附属快速吸附平衡型。

2.2.4 上样液流速对吸附效果的影响 由图4可见，随上柱流速的增大，对石榴花多酚的吸附量逐渐减小。流速对树脂吸附的影响主要是影响溶质向树脂表面扩散，从而对吸附效果产生影响。上柱时流速过大，石榴花多酚溶液与树脂之间接触时间变短，石榴花多酚分子来不及进入到树脂的内表面而流过，从而降低吸附率。降低流速，会使石榴花多酚分子同树脂的内表面有足够的接触时间，有利于树脂吸附石榴花多酚，减少多酚的漏出量，从而提高其吸附率；当流速过小时，会使作业周期延长，提高成本。从本试验结果来看，上柱流速为1 mL/min的吸附量与上柱流速为2 mL/min的吸附量相差不大，因此上柱流速以 2 mL/min 为宜。

2.3 X-5树脂对多酚吸附后洗脱条件的优化

2.3.1 洗脱液浓度的选择 为尽可能提高多酚的回收率，通常选用解吸率较高的溶剂作为解吸剂，丙酮、甲醇及乙醇是常用的解吸剂，但考虑到石榴花多酚要应用在食品及化妆品中，因此本试验选用无毒性的乙醇作为解吸剂，并考察乙醇浓度对解吸效果的影响，结果如图5所示。当乙醇浓度为20%～60%时，解吸效果很低，变化也不大；超过60%之后，随乙醇浓度增大，解吸效果迅速提高，当乙醇浓度为70%时，解吸效果最好，之后又迅速下降。因此，宜选用70%乙醇溶液对石榴花多酚进行洗脱。

2.3.2 洗脱液体积对解吸效果的影响 经吸附达到饱和的X-5树脂先用40 mL的水洗去树脂吸附的可溶性糖类，再用200 mL的70%乙醇溶液洗脱，洗脱速度为2 mL/min，在室温下测定乙醇溶液对多酚物质的动态洗脱效果，结果如图6所示。图6显示，在动态条件下极易洗脱X-5树脂上吸附的多酚物质，很少量的洗脱液即可达到洗脱效果。多酚物质的洗脱高峰也相对比较集中，当洗脱液体积为10～40 mL时，洗脱液中的石榴花多酚含量较高；在洗脱液体积达到80 mL时，能够将吸附在X-5树脂上的多酚充分洗脱，因此，洗脱液体积宜选择80 mL。

2.3.3 洗脱液流速对解吸效果的影响 图7显示，流速越大，洗脱效果越差，其中流速为1 mL/min 的解吸效果是流速为4 mL/min的3倍。因流速加快，洗脱液未能与被吸附的多酚进行充分作用而将其从大孔树脂的吸附位点上置换出来；而流速太小会使作业周期延长。因此，在本研究条件下，70%乙醇洗脱流速宜控制在2 mL/min。

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3 结论

X-5树脂用于石榴花多酚纯化具有吸附量大、吸附率高、易解吸等特点，是纯化石榴花多酚的理想材料。选用X-5大孔吸附树脂纯化石榴花多酚的最佳上样条件为：上样液浓度3.1 g/L，pH 值2.0， 上样液流速 2 mL/min； 最佳洗脱条件：洗

脱液为70%乙醇溶液，流速2 mL/min，洗脱液体积为 80 mL。

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大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇6

关键词：三七/分析,山楂/分析,总皂苷/分离和提纯,总黄酮/分离和提纯,中药制药工艺

三七为五加科植物三七 [panax notoginseng (burk.) F.H.chen]的干燥根及根茎, 功能散瘀止血、消肿定痛[1], 三七总皂苷为其主要有效成分。山楂叶系蔷微科植物山里红[Crataegus pinnatifida/Bge.var.major N.E.Br]或山楂[Crataegus pinnatifida/Bge) 的干燥叶, 具活血化瘀、理气通脉的功能[1], 其主要化学成分为黄酮类, 如金丝桃苷、牡荆素、槲皮素、芦丁等[2]。现代药理研究发现, 三七总皂苷主要有改善心血管系统和血液系统功能, 调节免疫等作用[3];山楂叶中的黄酮成分有治疗心血管疾病作用, 特别是在降血压、降血脂、增加心脏血流量等方面疗效显著[4]。临床常将三七和山楂叶配伍用于治疗心血管疾病如冠心病、心绞痛等。大孔吸附树脂分离纯化单一成分报道较多, 但对混合物中不同有效成分同时分离纯化的报道鲜见。本实验以三七和山楂叶为材料, 通过D101大孔吸附树脂分离纯化三七和山楂叶中的总皂苷和总黄酮, 优化工艺条件, 为含有三七和山楂叶的复方制剂的生产工艺提供参考。

1仪器与试剂

UV-1601紫外可见分光光度计:日本岛津公司。D101大孔吸附树脂:天津农药股份有限公司树脂分公司。人参皂苷Rg1对照品:中国药品生物制品检定所, 批号:110703-200424。芦丁对照品:中国药品生物制品检定所, 批号100080-200306。三七药材:杭州华东医药股份公司药材参茸分公司。山楂叶:自行采集, 经浙江大学华家池校区孙红祥副教授鉴定, 自然干燥后, 粉碎成约1cm2的碎块备用。甲醇、乙醇、高氯酸、冰醋酸、香草醛等均为分析纯。

2方法与结果

2.1 总皂苷的含量测定[5]

2.1.1 标准曲线的制备

精密称取人参皂苷Rg1对照品2.4mg左右, 用甲醇定容至25ml, 摇匀。分别精密吸取上述溶液适量, 挥干溶剂, 加入新鲜配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2ml, 0.8ml高氯酸, 60℃水浴15分钟, 立即置冰水中冷却, 加入5ml冰醋酸摇匀, 放置15分钟, 相应试剂随行空白对照, 于550nm处测定吸光度。

2.1.2 测定方法

吸取供试品溶液, 挥干溶剂, 照标准曲线制备项下方法自“加入新鲜配制的5%香草醛-冰醋酸溶液0.2ml”起, 依法测定吸收度, 计算样品的含量。

2.2 总黄酮的含量测定[6]

2.2.1 标准曲线的制备

精密称取在120℃干燥至恒重的芦丁对照品20mg, 置100ml容量瓶中, 加入适量乙醇超声溶解, 并稀释至刻度, 摇匀, 作为储备液备用。精密量取芦丁对照品储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0ml置25ml量瓶中, 分别加蒸馏水至6ml;加入5%亚硝酸钠1.0ml, 摇匀, 放置6分钟;加入10%硝酸铝1.0ml, 摇匀, 放置6分钟:加入4%氢氧化钠10.0ml, 加水至刻度, 摇匀, 放置15分钟, 以相应试剂为空白, 在500nm处测吸收度。

2.2.2 测定方法

①固体样品的测定:精密称取浓缩干燥得到总黄酮的固体物0.05g, 置50ml量瓶中, 加适量乙醇超声溶解, 并定容至刻度;过滤, 精密量取续滤液1ml置25ml量瓶中, 按“2.2.1”项下操作, 测定总黄酮含量。②液体样品的测定:精密量取各部分收集得到的液体样品先定容至适当体积, 滤过后, 精密量取续滤液1ml至25ml量瓶中, 按“2.2.1”项下操作, 测定总黄酮含量。

2.3 工艺条件及参数的优化

2.3.1 大孔吸附树脂的预处理及装柱

取新购的大孔树脂适量, 以95%乙醇浸泡2天, 除去上浮树脂碎粒和杂物, 用湿法装柱, 用95%乙醇洗至滤液与水 (1:5) 混合不产生浑浊, 再用蒸馏水洗至无乙醇味, 备用。

2.3.2 上柱溶液的制备

称取三七粉末和山楂叶 (1:2) 适量, 混合, 用8倍量70%乙醇回流提取2次, 每次2小时;过滤, 合并滤液, 减压浓缩至一定体积, 即得上柱溶液 (0.36g生药/ml) , 备用。经测定总皂苷含量为9.57mg/ml;总黄酮含量为15.41mg/ml。

2.3.3 药材上样量的确定

准确称取3.6、7.2、10.8、14.4、18.0g已处理好的D101大孔树脂, 分别湿法装柱, 精密吸取10ml上柱溶液, 以流速1.5ml/min上柱, 过柱液重吸收1次, 经充分吸附后, 收集吸附后的样品液, 测定其中总皂苷和总黄酮的浓度, 计算吸附量和吸附率, 结果见表1。

由表1看出, 当药材量与湿树脂量比为1:3时, 混提物中三七总皂苷吸附达到饱和;当药材量与湿树脂量比为1:4时, 混提物中山楂叶总黄酮吸附达到饱和。因此, 确定药材量与湿树脂量比为1:4。

2.3.4 上样流速的确定

吸取样品液30ml上柱, 分别以1、2、3、4ml/min的流速进行动态吸附。树脂柱用水洗脱至无色, 洗脱液不显Molish反应。洗脱液依照含量测定方法分别测定总皂苷和总黄酮的含量, 计算吸附量, 结果见表2。实验确定上样流速以2ml/min为宜。

2.3.5 洗脱溶媒的选择

吸取样品液30ml上柱, 先用水洗至流出液无色、并不显Molish反应, 再依次用30%、50%、70%、90%乙醇溶液各120ml洗脱, 洗脱流速为2ml/min, 每种醇浓度溶液每30ml收集1份, 共4份。洗脱液照含量测定方法分别测定总皂苷和总黄酮的含量, 计算洗脱率, 结果见表3。

由表3可知, 用70%乙醇溶液洗脱总皂苷和总黄酮洗脱率均最高, 故选择70%乙醇溶液作为洗脱溶媒。

2.3.6 洗脱溶媒用量

根据上述结果确定的条件, 吸取样品液30ml上柱, 蒸馏水用量分别为100ml (条件1) 、150ml (条件2) 、200ml (条件3) , 然后用70%乙醇溶液200ml洗脱, 依次洗脱, 分段收集, 分别测定总皂苷和总黄酮的含量, 计算洗脱率, 结果见表4。

从表4可以看出, 在条件1、条件2与条件3下, 各对应结果无差异, 故确定洗去杂质蒸馏水用量为100ml。前100m170%乙醇溶液三七总皂苷洗脱率和山楂叶总黄酮洗脱率均在88%以上, 由此确定解吸洗脱溶媒70%乙醇溶液用量为100ml。

2.3.7 洗脱流速的考察

按上述所确定的吸附条件进行动态吸附后, 以70%乙醇为洗脱剂, 分别以1、2、3ml/min的速度进行洗脱, 分别测定乙醇洗脱物中总皂苷和总黄酮洗脱率, 结果见表5。

由表5可知, 总皂苷洗脱率在洗脱速度为1ml/min时最高, 但与2ml/min时的情况相差不多。总黄酮洗脱率在洗脱速度为2ml/min时最高。考虑到工作效率, 确定2ml/min为洗脱速度。

2.3.8 重复验证实验

根据试验结果, 按照所筛选的工艺条件进行3次试验, 测得洗脱液中总皂苷和总黄酮总含量为82.8% (其中, 总皂苷平均含量32.6%、总黄酮平均含量50.2%) ;总皂苷的得率为6.93% (总皂苷/三七药材) , 山楂叶总黄酮的得率为5.34% (总黄酮/山楂叶) , 与预测值接近, 证明此方法可行。

3讨论

3.1 三七和山楂叶的混提液中含有叶绿素、鞣质及其它杂质, 在上柱前应对粗提液进行有效的预处理, 以防降低柱效。

3.2 参考文献报道[5,6]以及对不同类型树脂进行筛选, 最后选择D101型大孔吸附树脂作为纯化用树脂。本实验采用同一大孔树脂分离纯化不同药材不同有效成分, 实验结果表明, 从吸附率、洗脱率、操作简便性等方面考虑, 适用于对三七和山楂叶总皂苷和总黄酮同步分离纯化, 有一定的推广价值。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典 (一部) .北京:化学工业出版社, 2005:10, 22.

[2]丁杏苞, 姜岩青, 仲英, 等.山楂叶化学成分的研究.中国中药杂志, 1990, 15 (5) :39.

[3]张继, 赵朝伟, 赵睿.三七的药理作用研究进展.中国药业, 2003, 12 (11) :76.

[4]李贵海, 孙敬勇, 张希林, 等.山楂降血脂有效成分的实验研究.中草药, 2002, 33 (1) :50.

[5]石召华, 熊富良, 李崇明, 等.大孔吸附树脂分离纯化三七总皂苷工艺研究.中成药, 2004, 26 (1) :10.

大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇7

近年来,随着大孔树脂在天然产物活性成分分离纯化方面的应用日益广泛,由于其具有优良的纯化效果及可反复再生使用和低成本的应用特点,因此非常适合于大生产要求。本文采用大孔吸附树脂法,对芥子中的黑芥子苷分离纯化工艺进行研究。

1 仪器与材料

1.1 仪器

Agilent 1 200 L高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司生产;Mettler Toledo al 204电子天平,瑞士梅特勒公司生产;R-205B旋转蒸发仪,上海申生生物技术公司生产;pHtestr30笔试pH机,上海必发生科技有限公司生产。

1.2 试剂

大孔树脂D101,西安蓝晓公司生产;AB-8,南开大学化工厂生产;XAd-4,美国罗门哈斯公司生产;HP-20,日本三菱化学公司生产,黑芥子苷标准品(99%),SIGMA公司生产;甲醇为色谱纯,其体试剂为分析纯,广州西陇化工有限公司生产。

1.3 实验原料

芥子籽,由桂林毕生药业有限公司提供。

2 高效液相色谱分析方法

2.1 色谱条件

色谱柱碳十八柱(ODS/C18)(250 mm×4.6 mm),检测波长为228 nm,流动相为水(含0.1%H3P04):乙腈(97:3,V/V),流速为0.7 mL/min,柱温为25℃。

2.2 高效液相HPLC检测法

取黑芥子苷标准品12.5 mg,用30%甲醇25 mL完全溶解。采用逐级稀释法,取此溶液5 mL加30%甲醇至10 mL,取10mL中的5 mL加30%甲醇至10 mL,取前次的2 mL加30%甲醇至10 mL,取第4次2 mL加30%甲醇至10mL,混合均匀后,用高效液相检测。以峰面积Y与标准溶液的质量百分比浓度X,做回归方程Y=6.3307X-31.509R2=0.999 7,表明黑芥子苷浓度在5～100 mg/L范围内有良好的线性关系。

2.3 样品检测

取样品溶液,稀释到一定体积后,用高效液相色谱测定,通过回归方程计算黑芥子苷的浓度。

3 实验方法

3.1 吸附原液制备

取芥子籽5 kg,依次加入40 L、35 L 70%的乙醇,回流提取2次,过滤,合并提取液,减压浓缩,喷雾干燥,混匀,得提取物1 kg。经测定,含黑芥子苷15%(干计)。临用前,取上述芥子提取物适量,加纯水,根据需要含量制成固体含量为5%～10%(质量体积百分数)的水溶液,作为吸附原液。

3.2 树脂的预处理

树脂先用乙醇浸泡溶胀24 h,湿法装柱,用95%乙醇洗脱,至流出液加5倍量纯水不变成白色混浊为止。再用大量的纯水洗尽柱内乙醇,然后依次用3倍量树脂体积的5%盐酸、纯水、4%氢氧化钠浸泡,流过树脂,最后用大量的纯水洗至流出的水呈中性,备用。

3.3 吸附树脂的筛选

准确量取预处理的4种树脂各350 mL,分别装入直径为45 mm的玻璃柱,各取上柱量为2 000 mL 8%的吸附原液,速度为6.0～6.5 mL/min,用800 mL纯水以相同的速度洗脱,上柱和流出液合并,测定其黑芥子苷的浓度,计算吸附量。然后用70%乙醇800 mL洗脱,得到70%乙醇洗脱液,测定黑芥子苷的浓度,合计流出液的浓度,计算树脂的解析率。将流出液浓缩、干燥,得固体粉末,测定黑芥子苷的含量。筛选最好的树脂。不同树脂对黑芥子苷的吸附和解吸效果见表1。

由表1可知,HP-20树脂的吸附量和解析率都是最好的。含量明显高于其他树脂的含量。故选用HP-20树脂对黑芥子苷的分离纯化工艺进行研究。

3.4 树脂对黑芥子苷的分离效果——吸附

3.4.1 上柱液浓度对吸附效果的影响

取处理好的大孔树脂湿法装柱,将黑芥子苷用水稀释到黑芥子苷浓度分别为498 mg/L、848 mg/L、1 700 mg/L,每柱进样1.5 L溶液,过滤后按2.0 BV/h的速度上柱吸附,用2.5 BV纯水洗脱,分别收集流出液,测定黑芥子苷的含量。上柱液浓度对吸附效果的影响见表2。

由表2可以看出,黑芥子苷的浓度对树脂的吸附影响较大,随着上柱液浓度的升高,黑芥子苷处理量减少,达到1 700 mg/L时,含量和回收率明显下降,说明树脂的吸附能力下降,达到过饱和状态。因此,要达到好的吸附效果,需要降低上柱浓度,如果是498 mg/L,则树脂的处理量减少了。考虑到实际生产中会影响生产效率,本实验采用848 mg/L为最佳的上柱浓度。

3.4.2 上柱液流速对吸附效果的影响

取处理好的大孔树脂湿法装柱,将黑芥子苷用水稀释到黑芥子苷浓度为848 mg/L,过滤后分别按1.0 BV/h、2.0 BV/h、3.0BV/h、4.0 BV/h的速度上柱吸附,用2.5 BV纯水洗脱,分别收集流出液,测定黑芥子苷的含量。上柱液流速对吸附效果的影响见表3。

从表3可以看出,随着流速的增加,流出液的含量明显降低,回收率增高。流速过大,会使树脂的工作交换量下降,从而降低树脂的性能。因此,在实际生产中,操作的流速不宜过大,本实验综合最终产品的含量和生产速度进行考察,选择2.0 BV/h为最佳流速。既保证能实现较高的工作效率,又能保证树脂的黑芥子苷的吸附。

3.4.3 洗脱量对树脂吸附效果的影响

取处理好的大孔树脂湿法装柱,黑芥子苷用水稀释到黑芥子苷浓度为848 mg/L,过滤后分别按2.0 BV/h的速度上柱吸附,分别用1.5 BV、2.5 BV、3.5 BV、4.5 BV的纯水洗脱,分别收集流出液,测定黑芥子苷的含量。洗脱量对树脂吸附效果的影响见表4。洗脱量对树脂的吸附效果的影响图如图1所示。

从图1可以看出,黑芥子苷的含量随着洗脱量的增加而增加,达到2.5 BV后稳定,没有再增高。多洗脱的水,会增加浓缩的生产时间,因此最佳选择为2.5 BV洗脱,可使黑芥子苷含量高、回收率也高,适合大量生产。

4 结论

黑芥子苷的生物活性功能受到越来越多的关注,具有很大的应用前景。通过考察4种大孔树脂(D101,AB-8,XAD-4,HP-20)的吸附情况,比较其性能,确定HP-20大孔树脂作为黑芥子苷分离纯化的介质。通过对HP-20大孔树脂的动态吸附性能进行考察,得到HP-20大孔树脂分离纯化的最佳条件如下:上柱浓度为848 mg/L,上柱速度为2.0 BV/h,水洗脱量为2.5 BV。

实验结果表明,HP-20大孔树脂能有效地纯化芥子中的黑芥子苷,适合工业大规模生产,纯化后产品采用HPLC检查,黑芥子苷含量达到31.50%,呈淡黄色、水溶性好,可满足市场对黑芥子苷的含量要求。

参考文献

[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版.一部[M].北京:中国医药科技出版社,2010.

[2]刘月萍,王向阳.黑芥子酶研究进展[J].生物技术通讯,2006(5).

大孔树脂分离纯化葛根总黄酮工艺研究 篇8

1 仪器与材料

UV-2550紫外分光光度计(日本岛津公司);Agilent 1100Series高效液相色谱仪(美国安捷伦公司);Sartorius BS 110电子天平(德国赛多利斯公司);延胡索药材(购于河北省安国以岭饮片有限公司,经鉴定,符合《中国药典》2010年版一部标准,批号:070902);延胡索乙素对照品(中国药品生物制品检定所,批号:0726-200208);大孔吸附树脂NKA-9(南开大学);HPD600、HPD500、HPD-450、HPD-400A、HPD-400、HPD100A(沧州宝恩吸附材料科技有限公司);AB-8、D101、DM-130、D-100、D141(中蓝晨光化工研究院物资公司)。95%乙醇(药用规格,天津市科密欧化学试剂有限公司);水为纯化水,其他试剂均为分析纯(北京化工厂)。

2 方法与结果

2.1 上柱药液的制备

取延胡索药材2 kg,用8倍量体积分数为60%乙醇提取3次,每次1.5 h。合并提取液,减压浓缩至无醇味。加水定容至9 000 m L,抽滤,备用。

2.2 含量测定

2.2.1 总生物碱的含量测定

2.2.1. 1 对照品溶液的制备

精密称取延胡索乙素对照品适量,加甲醇制成1 m L含204.8μg的溶液,即得。

2.2.1. 2 线性关系考察

精密吸取延胡索乙素对照品溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 m L置25 m L量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,在280 nm处测定。以标准品延胡索乙素的浓度(X1)为横坐标,吸光度(A)为纵坐标绘制标准曲线,进行线性回归,得回归方程:Y1=0.001 5X1-0.000 4,r=0.999 9。延胡索乙素在8.192 0~40.960 0μg/m L之间具有良好的线性关系。

2.2.1. 3 供试品溶液制备

精密吸取样品溶液10 m L,上中性氧化铝柱,30 m L乙醇洗脱,流出液及洗脱液收集至50 m L量瓶中,乙醇定容至刻度;精密吸取10 m L,加乙醇稀释至50 m L,摇匀,测定。

2.2.1. 4 精密度试验

选取某一浓度的对照品溶液,连续测7次,按上述条件测定吸光度。结果精密度良好,RSD=0.46%。

2.2.1. 5 稳定性试验

选取某一浓度的对照品溶液,按上述条件测定吸光度,间隔8 h测定1次,结果24 h内稳定,RSD=2.7%。

2.2.1. 6 重复性试验

精密吸取样品溶液10 m L,按“2.2.1.3”项下方法,制备供试品溶液5份,进行含量测定,测定结果RSD=1.3%。

2.2.1. 7 加样回收率试验

以重复性实验所得总生物碱平均含量为样品溶液含量,精密吸取样品溶液5份,加入等量对照品溶液,按“2.2.1.3”项下方法操作,计算总生物碱回收率为101.3%,RSD=1.07%。结果表明方法准确可靠。

2.2.2 延胡索乙素的含量测定

2.2.2. 1 色谱条件与系统适用性试验

Phenomenex C18柱(250 mm×4.6 mm,0.5μm);流动相为乙腈-0.1%磷酸溶液(三乙胺调p H 6.4)(52∶48);流速:1.0 m L/min;柱温:室温;检测波长:280 nm;进样量:10μL。理论板数按延胡索乙素峰计算应不低于3 000。

2.2.2. 2 对照品溶液的制备

精密称取延胡索乙素对照品适量,加甲醇制成1 m L含46.3μg的溶液,即得。

2.2.2. 3 线性关系考察

精密吸取延胡索乙素对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0μL,在上述色谱条件下进行试验,测定峰面积。以对照品延胡索乙素的量(X)为横坐标,吸收峰面积为纵坐标(Y)绘制标准曲线,进行线性回归处理,得回归方程:Y=36.425X+0.28,r=0.999 4。由此可知,延胡索乙素的进样量在0.432 8~2.164 0μg范围内,其峰面积与进样量呈良好的线性关系。

2.2.2. 4 精密度实验

选取某一浓度的对照品溶液,连续进样7次,按上述条件测定峰面积。结果精密度良好,RSD=0.37%。

2.2.2. 5 稳定性试验

选取某一浓度的对照品溶液,按上述色谱条件测定峰面积,间隔6 h测定1次,结果24 h内稳定,RSD=2.3%。

2.2.2. 6 重复性试验

精密吸取样品溶液10 m L,按“2.2.2.1”项下方法,制备样品溶液5份,进行含量测定,测定结果RSD=1.1%。

2.2.2. 7 加样回收率试验

以重复性实验所得延胡索乙素平均含量为供试品溶液含量,精密吸取供试品溶液5份,加入等量对照品溶液,按“2.2.2.1”项下方法操作,计算延胡索乙素回收率为101.7%,RSD=2.8%。结果表明方法准确可靠。

2.3 大孔吸附树脂的预处理

树脂预处理:分别取极性树脂NKA-9、HPD600、HPD500,中等极性树脂HPD-450、HPD-400A、HPD-400,弱极性树脂AB-8、DM-130、D-100,非极性树脂HPD100A、D101、D141适量于体积分数为95%的乙醇(以下乙醇浓度皆为体积分数)浸泡24 h后,湿法装柱,并用95%乙醇动态洗脱5 BV,水洗至无醇味,依次用质量分数5%盐酸(浸泡6 h后,水洗至中性)和质量分数5%氢氧化钠(浸泡6 h后,水洗至中性)处理,最后用95%乙醇动态洗脱至流出液加水(体积比1∶5)不变混浊为止,用水置换出乙醇后备用。

2.4 大孔吸附树脂的筛选

取20 m L不同型号已处理好的树脂分别装入色谱柱,测定死体积后,将一定浓度样品溶液通过树脂柱,以相同流速1.5 BV/h进行动态吸附,TLC检测(Dragendorff反应检识生物碱,Molish反应检识糖或糖苷类化合物)泄漏点,预试药液泄漏前的上样体积。HPD500、NKA-9、HPD600、HPD450、HPD400A、HPD400、AB-8、DM-130、D-100、D-141、HPD100A、D101的上样量分别为310、75、110、325、150、175、350、160、350、350、300、300 m L。结果表明,HPD500、HPD-450、AB-8、D-100、HPD100A、D101、D141 7种树脂用于延胡索总生物碱的吸附效果较好,因此选择这7种树脂继续进一步考察。

将选择的7种树脂上样后用水洗脱除杂,水洗体积为110 m L,流速为2 BV/h。观察发现:D101树脂水洗液中溶解有大量生物碱,水洗液颜色较其他树脂明显深很多,说明该树脂对延胡索生物碱的吸附量较小,不宜选用。用乙醇洗脱剩下的6种上样树脂,合并洗脱液于500 m L量瓶中,95%乙醇定容至刻度,摇匀,测定总生物碱含量和延胡索乙素的含量。结果见表1、2。

由表1和表2结果可知,AB-8、D-141、D-100吸附量和解析率较优,做进一步考察。

分别取AB-8、D-141、D-100树脂各25 m L,上样,用TLC薄层检测结合紫外分光光度法确定上样量,然后用水洗除杂,再用不同浓度乙醇冲洗,结果见表3。

由表3结果可知,D-141树脂效果较好,因此确定用D-141树脂纯化延胡索总生物碱。

2.5 吸附过程参数考察

2.5.1 上样浓度考察

将不同浓度的上样溶液0.25 g生药/m L(125 m L)、0.35 g生药/m L(90 m L)、0.5 g生药/m L(75 m L)、0.625 g生药/m L(50 m L),通过D141树脂柱(树脂水体积10 m L,径高比1∶6),进行动态吸附,吸附完全所用时间为3 h,每个上样浓度接馏分10份,进行TLC检测,结果上样体积分别为125、90、75、50 m L;上样浓度为0.25 g生药/m L在第6份泄漏生物碱,后3个浓度在第7份泄漏生物碱。考虑到上样过程同时也是除杂过程,应该是上样体积越大除去的杂质越多,从该角度考虑0.35 g生药/m L的上样浓度比较合适。

2.5.2 径高比考察

选择直径相同的色谱柱3根,湿法装入D141树脂,使树脂径高比分别达到1∶4、1∶6、1∶10,取浓度为0.35 g生药/m L的样品溶液通过树脂柱,进行动态吸附(4 BV/h),待吸附完全后,用8 BV纯净水洗脱除杂,后用4 BV 60%乙醇+4 BV90%乙醇洗脱,收集洗脱液,测定洗脱液中总碱的量及总浸膏的量,结果为树脂径高比分别为1∶4、1∶6、1∶10时,总浸膏量分别为541.8、549.1、459.4 mg;总生物碱量分别为312.4、329.9、321.7 mg。结果表明,选择树脂径高比1∶6较好。

2.5.3 吸附流速考察

选择直径相同的色谱柱3根,湿法装入D141树脂,树脂径高比1∶6,取浓度为0.35 g生药/m L的样品溶液分别以2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h通过树脂柱,进行动态吸附,待吸附完全后,用8 BV纯净水洗脱除杂,后用4 BV 60%乙醇+4 BV 90%乙醇洗脱,收集洗脱液,测定洗脱液中总碱的量及总浸膏的量。结果为吸附流速为2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h,总浸膏量为491.6、471.1、494.6 mg,总生物碱量为319.8、316.8、316.1 mg。表明吸附流速4 BV/h较好。

2.5.4 泄漏点考察

取色谱柱1根,湿法装入D141树脂,树脂径高比1∶6,取浓度为0.35 g生药/m L的样品溶液分以4 BV/h通过树脂柱,进行动态吸附,接馏份10份,每份10 m L,薄层检测,结果显示,上样80 m L生物碱开始泄漏,所以最大上样量确定为80 m L。

2.6 除杂过程各参数考察

2.6.1 除杂溶剂考察

取浓度为0.35 g生药/m L的上样溶液80 m L,4份,分别以2 BV/h的流速通过4根大孔树脂色谱柱(树脂体积为10 m L,径高比为1∶6),待吸附完全后,分别用常温纯净水,冷藏纯净水,质量分数1%Na Cl溶液(以下Na Cl浓度皆为质量分数),质量分数2.5%氨水(以下氨水浓度皆为质量分数))洗脱除杂,TLC检测结合目测优选洗脱溶剂。结果表明,常温纯净水、冷藏纯净水和2.5%氨水洗脱液都含有生物碱,颜色都较深,而1%Na Cl溶液洗脱液不含生物碱,颜色最浅。结果表明,1%Na Cl溶液做除杂溶剂较好。

2.6.2 Na Cl溶液洗脱浓度及洗脱体积考察

取浓度为0.35 g生药/m L的上样溶液80 m L,3份,分别以2 BV/h的流速通过3根大孔树脂色谱柱(树脂体积为10 m L,径高比为1∶6),待吸附完全后,分别用0.3%、0.6%、1%Na Cl溶液洗除杂(接除杂馏分,共接7份,前2份每份15 m L,后5份每份10 m L),TLC检测结合目测优洗脱溶剂浓度,确定洗脱溶剂浓度后,采用Molish反应(检识糖或糖苷类化合物)确定除杂体积。0.3%Na Cl溶液洗脱时,洗脱30 m L(3 BV)后Molish反应已呈阴性,说明糖已除掉,70 m L(7 BV)后已无其他杂质洗脱下来。考虑到尽量降低Na Cl的浓度和节约成本,结果为0.3%Na Cl溶液较合适,洗脱体积为7 BV,再用1 BV水洗脱除掉Na Cl(硝酸银反应检识Cl-),最终洗脱体积为8 BV。

2.7 洗脱过程各参数考察

2.7.1 洗脱溶剂浓度考察

取浓度为0.35 g生药/m L的上样溶液80 m L,8份,分别以2 BV/h的流速通过8根大孔树脂色谱柱(树脂体积为10 m L,径高比为1∶6),待吸附完全后,分别用0.3%Na Cl溶液7 BV+纯净水1 BV洗脱除杂,然后用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%的乙醇各8 BV分别洗脱,收集洗脱液于100 m L量瓶中,并用洗脱液定容,TLC检测以及HPLC指纹图谱分析检测生物碱,同时测定总生物碱含量及转移率。结果显示,随着乙醇浓度的升高,洗脱液中总生物碱的含量增加,90%乙醇洗脱时最大,总生物碱的转移率为86.95%。该结果不是很理想,继续考察。取浓度为0.35 g生药/m L的上样溶液80 m L,3份,分别以2 BV/h的流速通过3根大孔树脂色谱柱(树脂体积为10 m L,径高比为1∶6),待吸附完全后,分别用0.3%Na Cl溶液7 BV+纯净水1 BV洗脱除杂,然后分别用4 BV60%+4 BV 90%乙醇、4 BV 70%+4 BV 90%及4 BV 90%+4 BV60%乙醇分别洗脱,收集洗脱液于100 m L量瓶中,并用95%乙醇定容,测定总生物碱含量及转移率,结果出膏量分别为565.62、560.65、559.43 mg;总生物碱转移率分别为88.11%、87.33%、87.14%;出膏率分别为11.61%、11.38%、11.31%。结果表明,4 BV 60%+4 BV 90%乙醇洗脱浓度较好。

2.7.2 洗脱流速考察

取浓度为0.35 g生药/m L的上样溶液80 m L,共3份,分别以4 BV/h的流速通过3根大孔吸附树脂色谱柱(树脂体积为10 m L,径高比为1∶6),待吸附完全后,分别用0.3%Na Cl溶液7 BV+纯净水1 BV洗脱除杂,然后用4 BV 60%+4 BV90%的乙醇分别以4 BV/h、5.5 BV/h、8 BV/h洗脱,收集洗脱液于100 m L量瓶中,并用洗脱液定容,检测洗脱液出膏量分别为493.9 mg、497.8 mg和488.8 mg;总生物碱的量分别为346.8 mg、398.3 mg和359.5 mg。从结果可以看出洗脱流速为5.5 BV/h时较合适。

2.7.3 洗脱体积考察

2.7.3. 1 考察60%乙醇洗脱曲线

取浓度为0.35 g生药/m L的上样溶液80 m L,以4 BV/h的流速通过大孔树脂色谱柱(树脂体积为10 m L,径高比为1∶6),待吸附完全后,用0.3%Na C溶液7 BV+纯净水1 BV洗脱除杂,然后用8 BV 60%乙醇以5.5 BV/h洗脱,接收洗脱液,每10毫升为1份,检测每份洗脱液中总生物碱的量分别为55.9、124.75,33.7、32.0、21.3、16.8、13.0、10.8和10.1 mg。结果表明,3~4 BV洗脱较合适。

2.7.3.2考察90%乙醇洗脱曲线

取浓度为0.35 g生药/m L的上样溶液100 m L,以4 BV/h的流速通过大孔树脂色谱柱(树脂体积为10 m L,径高比为1∶6),待吸附完全后,用0.3%Na Cl溶液7 BV+纯净水1 BV洗脱除杂,接着用4 BV 60%乙醇洗脱收集洗脱液,然后再用8 BV 90%的乙醇以5.5 BV/h洗脱,接收洗脱液,每10毫升为1份,检测每份洗脱液中总生物碱的量分别为30.55、41.64、25.06、16.23、10.0、8.24、6.86 mg。结果显示,4 BV洗脱较合适。

综上所述,将洗脱体积定为60%乙醇4 BV+90%乙醇4 BV。

2.8 树脂再生方法及使用次数考察

树脂使用1次后,用纯净水及95%乙醇处理,进行了11次试验,测定每次总生物碱的吸附量,当总碱吸附量降低到最大吸附量的70%时,停止使用。考察结果表明:D141树脂每次使用后用95%乙醇冲洗除杂,使用7次后总生物碱的吸附量仍能达到最大吸附量的80%。该结果表明,虽然该树脂使用后颜色变深,但对下一步的使用影响不大。结论:D141树脂每次使用后用95%乙醇冲洗再生处理,至少能使用7次。

2.9 验证试验

按照上述确定的纯化延胡索总生物碱的工艺制备3批样品,测定总生物碱的和延胡索乙素的含量,总生物碱的转移率和出膏率。总生物碱的含量分别为82.3%、81.1%、82.7%,平均值为82.0%;延胡索乙素的含量分别为1.09%、1.21%、1.33%,平均值为1.21%;总生物碱的转移率分别为89.0%、88.0%、86.0%,平均值为87.7%;出膏率分别为1.81%、1.78%、1.73%,平均值为1.77%。由结果可以看出,该工艺比较稳定,重现性比较好。

3 讨论

在延胡索总生物碱的纯化研究工艺含量测定中,文献[4]报道采用延胡索乙素作为单一考察指标进行含量测定是不够全面的;文献[5,6,7,8]报道采用酸性染料比色法测定总生物碱,经过作者详细考察,此方法实验误差比较大,操作也比较烦琐,耗时较长,所得数据重复性不够理想。本文在研究紫外方法测量总碱时,发现由于色素等成分的干扰,使得直接测量有些偏差,采用中性氧化铝柱进行纯化则可有效地除去杂质,得到较纯净的生物总碱,再进行紫外法测定,结果较好。

在延胡索总生物碱纯化工艺研究中,对于除杂溶剂,作者进行了Na Cl溶液加入顺序的考察:(1)样品溶液+Na Cl溶液上样;(2)样品溶液上样后,Na Cl溶液洗脱后,用纯净水洗脱;(3)树脂先用Na Cl溶液饱和后,再上样;(4)样品溶液+Na Cl溶液上样后,再用Na Cl溶液洗脱+水洗脱。测定各洗脱液中总碱的量及延胡索乙素的量,结果为(1)(2)明显优于(3)(4),但(2)最佳。

经过实验,确定大孔吸附树脂纯化延胡索总生物碱的纯化工艺为:选择D141大孔吸附树脂,上样液浓度0.35 g生药/m L,径高比1∶6,吸附流速4 BV/h,除杂溶剂和体积为0.3%Na Cl溶液7 BV+纯净水1 BV,洗脱溶剂为4 BV60%乙醇+4BV90%乙醇,洗脱流速为5.5 BV/h。该工艺合理、可行,适合工业生产。

参考文献

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