大孔树脂分离法（精选11篇）
大孔树脂分离法 篇1
桑叶为桑科植物桑Morusalba L.的干燥叶, 具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目的功效。主治风热感冒、头昏头痛、目赤昏花等症, 现代药理研究证实桑叶可抑制血糖的升高, 可预防和治疗糖尿病, 黄酮为其主要有效成分之一[1,2]。为了进一步开发利用桑叶黄酮, 本实验参照以往的实验方法[3,4], 对大孔树脂分离纯化桑叶黄酮进行了系统研究。
1 材料
Perkin elmer UV/Vis spectrometer Lambada 12紫外分光光度计。桑叶:药材购于浙江省中医院药房。大孔树脂购于华东医药器械公司;乙醇等为分析纯。
2 方法与结果
2.1 上柱药液的制备
取桑叶药材70g, 先用50%的乙醇浸泡3小时, 超声提取3次, 每次30分钟。过滤, 合并滤液, 回收至无醇味, 加水调整至140m L, 相当于每m L含0.5g生药的浓缩液。高速离心15分钟, 过滤, 备用。测得黄酮含量为160mg/m L。
2.2 含量测定
2.2.1 芦丁对照品的制备
精密称取120℃干燥恒重的芦丁对照品50.85mg, 用甲醇定容于50m L容量瓶中, 摇匀, 精密量取10m L, 用甲醇定容于25m L容量瓶中, 摇匀备用。
2.2.2 标准曲线的绘制
精密称取芦丁对照品溶液0.1、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0m L, 分别置于25m L具塞试管中, 各加水至6.0m L, 加入5%亚硝酸钠1.0m L摇匀, 放置6分钟, 加入10%硝酸铝1.0m L, 加水至刻度, 摇匀, 放置15分钟, 在510nm处测吸光度, 绘制浓度-吸光度标准曲线, 得回归方程:y=0.0115x+0.0004, r=0.9999。
2.2.3 桑叶总黄酮的含量测定
按照桑叶的提取工艺提取桑叶制成浸膏, 取上述桑叶浸膏适量置于100m L容量瓶中, 加水稀释至刻度, 摇匀作为供试品溶液, 分别吸取供试品及芦丁对照溶液20m L, 测定桑叶总黄酮含量。
2.3 静态吸附-解吸实验
2.3.1 静态吸附
取5种处理好的大孔树脂 (DA-101、D-101、AB-8、HP-20、H-103-1) 1g, 分别加入桑叶提取液10m L于25m L三角瓶中。每间隔20分钟振荡1分钟, 持续4小时后, 静置24小时, 使达到饱和吸附。然后进行抽滤, 测定滤液中黄酮含量, 按下式计算吸附率, 见表1。
饱和吸附率= (C0-C1) /C0×100%
2.3.2 静态解吸
将静态吸附好的树脂进行过滤抽干, 各加入50%乙醇20m L, 每间隔20分钟振摇1分钟, 持续4小时后, 测定洗脱液中桑叶黄酮的含量, 按下式计算解吸率, 见表1。
洗脱率=[洗脱浓度×洗脱体积]/饱和吸附量×100%
比较各种树脂的吸附和解吸率, 表明DA-101对桑叶黄酮的吸附分离效果最佳。
2.4 工艺条件考察
2.4.1 上样量考察
取桑叶提取液, 加于8m L (1BV) 的DA-101树脂上以2BV/h的流速进行吸附, 按树脂体积数收集流出液, 于510nm处测定吸光度, 计算总黄酮含量, 绘制动态吸附曲线, 见图1。由图可知上样量为8BV时达到饱和吸附, 故确定上样量为8BV。
2.4.2 醇洗脱浓度的考察
取桑叶提取液, 加于DA-101树脂上, 以2BV/h的流速进行吸附, 再以6种不同浓度的醇 (10%、30%、50%、70%、90%、100%) 进行洗脱, 收集各浓度的洗脱液100m L, 于510nm处测定吸光度, 计算总黄酮含量结果见表2。从表2可以看出, 当醇浓度为50%时洗脱效果最好。
2.4.3 洗脱终点的确定
按上述确定的条件, 取桑叶提取液进行上柱, 吸附和洗脱, 分段收集洗脱液, 测定洗脱液中黄酮含量, 绘制洗脱曲线, 见图2。从图2可以看出, 当洗脱剂用量为15BV时基本上将黄酮洗净。
2.5 分离的桑叶总黄酮纯度的考察
按优化的工艺条件, 取桑叶提取液加于DA-101树脂上, 收集洗脱液, 浓缩, 蒸干, 加甲醇定容至100m L容量瓶, 测定总黄酮的含量, 并测定干膏收率, 计算总黄酮的纯度, 见表3。从表3可看出, 经DA-101大孔树脂处理后的总黄酮含量可达72.6%以上, 具有良好的应用价值。
3 结论
通过实验得出:DA-101分离富集效果最好, 其最佳工艺为以每m L含0.5g生药, 上样量为8BV, 洗脱浓度为50%乙醇, 洗脱剂用量为15BV。经过分离富集后黄酮含量可达到72.6%以上。该法简单可行, 分离效果好, 能满足于大生产的要求。
摘要：目的:筛选分离桑叶总黄酮的最佳树脂, 并对影响分离的各种因素进行系统的研究, 使分离工艺达到最优化。方法:采用静态与动态吸附-解吸两种方法, 用紫外分光光度法测定桑叶总黄酮的含量, 优化最佳工艺。结果:DA-101分离效果最好, 其最佳工艺为以每m L含0.5g生药, 上样量为8BV, 洗脱浓度为50%乙醇, 洗脱剂用量为15BV。经过分离富集后黄酮含量可达到72.6%以上。结论:该法简单可行, 分离效果好, 能满足于大生产的要求。
关键词：桑叶黄酮,大孔树脂,工艺优化
参考文献
[1]徐爱良, 熊湘平, 文宁.桑叶的现代研究进展.湖南中医学院学报, 2005, 25 (2) :60.
[2]孟磊, 孙莲, 张丽静, 等.新疆桑叶中总黄酮含量的测定.中国民族民间医药杂志, 2002, (3) :176.
[3]孙敏耀, 唐文照, 卢霞, 等.分光光度法测定不同采收时间桑叶中总黄酮.中草药, 2004, 35 (10) :1190.
[4]何伟, 李伟.大孔树脂在中药成分分离中的应用.南京中医药大学学报, 2005, 21 (2) :134.
大孔树脂分离法 篇2
【文件来源】国家食品药品监督管理局
应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品申报与审评规定（试行）
(国食药监注[2005]202号)
根据《保健食品注册管理办法（试行）》，为规范、统一营养素补充剂等申报与审评行为，我局制定了《营养素补充剂申报与审评规定（试行）》、《真菌类保健食品申报与审评规定（试行）》、《益生菌类保健食品申报与审评规定（试行）》、《核酸类保健食品申报与审评规定（试行）》、《野生动植物类保健食品申报与审评规定（试行）》、《氨基酸螯合物等保健食品申报与审评规定（试行）》、《应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品申报与审评规定（试行）》、《保健食品申报与审评补充规定（试行）》8个与保健食品申报与审批相关的规定。上述规定于2005年7月1日起正式实施，现予以通告。
国家食品药品监督管理局
二○○五年五月二十日
应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品申报与审评规定（试行）
第一条第一条 为规范应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品审评工作，确保保健食品的食用安全，根据《 中华人民共和国食品卫生法》和《 保健食品注册管理办法（试行）》，制定本规定。
第二条第二条 应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品是指产品生产过程中及原料生产过程中应用了大孔吸附树脂分离纯化工艺的保健食品。
第三条第三条 申请应用大孔吸附树脂分离纯化工艺生产的保健食品除按照保健食品注册管理的有关规定提交资料外，还应提供以下资料：
（一）大孔吸附树脂的相关资料
1、大孔吸附树脂规格标准。标准内容应包括大孔吸附树脂名称、牌（型）号、结构、合成原料（主要原料、交联剂、致孔剂、分散剂等名称和规格）、外观、极性和粒径范围、含水量、湿密度、干密度、比表面积、孔径、孔隙率、孔容等，并提供大孔吸附树脂标准级别等。
2、大孔吸附树脂使用说明书。使用说明书的内容应包括：
（1）大孔吸附树脂性能简介、适用范围、主要原料和添加剂种类与名称；
（2）残留物（包括未聚单体、交联剂、主要添加剂）及其残留量检测方法和限量标准及依据；
（3）使用方法和注意事项，包括新大孔吸附树脂的预处理方法、再生处理方法和操作注意事项、贮存条件等，以及可能出现异常情况的处理方法。
3、生产批号、生产时间、产品检验报告书。
4、相关证明文件。大孔吸附树脂生产企业的企业名称、地址、电话、营业执照及相关生产许可证件的复印件等。
（二）应用大孔吸附树脂进行分离纯化的制备工艺研究资料
1、制备工艺中应用大孔吸附树脂进行分离纯化的目的与依据。详细说明应用大孔吸附树脂进行分离、纯化的目的和必要性，并提供相关研究或文献资料。
2、大孔吸附树脂的预处理方法和合格标准。预处理方法包括考察预处理溶剂的种类、用量、浸泡时间、流速、温度、pH值等工艺参数和操作规程。
3、生产工艺的研究资料。大孔吸附树脂型号的选择、比上柱量、比吸附量、比洗脱量、树脂柱的径-高比、提取液的适宜上柱温度、pH及流速、解吸附溶剂及其条件的选择、解吸附终点判定方法等研究资料，并将上述资料作为该产品的生产工艺的一部分。
4、大孔吸附树脂再生方法的确定。大孔吸附树脂经使用后，吸附能力下降，应进行再生处理。根据功效成分和大孔吸附树脂的理化性质，制订大孔吸附树脂再生处理方法及其合格标准，申请人应制定相应的标准、操作规程并列入企业标准的附录。
（三）使用以大孔吸附树脂分离纯化工艺制造的原料生产的保健食品，申请时还应提供原料生产企业的详细资料，原料的制备工艺和详细的质量标准，包括原料中大孔吸附树脂残留物的标准和检测报告。申请人应提供由国家食品药品监督管理局确定的检验机构出具的该原料大孔吸附树脂残留物的检验报告。
（四）大孔吸附树脂及其纯化工艺等安全性评价资料
第四条应用苯乙烯骨架型树脂分离纯化工艺的保健食品应符合以下要求：
（一）大孔吸附树脂应用前应进行预处理，预处理以后的大孔吸附树脂中的有机残留物应控制在安全范围内，对苯乙烯骨架型树脂要求苯的残留量小于2mg/kg、二乙烯苯小于20 mg/kg。对其它类型的大孔吸附树脂，根据具体情况确定限量标准。
（二）一般情况下,不得使用再生后的比吸附量仍下降达30%以上时的大孔吸附树脂。
（三）应用以大孔吸附树脂分离纯化工艺生产保健食品原料的生产企业，应当对原料的大孔吸附树脂残留物进行检验或复核。对用苯乙烯骨架型树脂制备的原料中二乙烯苯含量要求为小于50μg/kg，并将此列入企业标准。如果原料质量达到上述标准的，可以免测该保健食品终产品的大孔吸附树脂残留物的含量。
（四）建立树脂残留物的检测方法和标准，并列入企业标准。
（五）对保健食品生产过程中应用苯乙烯骨架型树脂分离纯化工艺的保健食品，其产品中二乙烯苯含量要求为小于50 μg/kg。
第五条第五条 其它类型的大孔吸附树脂参照苯乙烯骨架型并结合具体品种制定相应的残留物及残留标准等内容。
第六条第六条 原则上不得以多个动植物原料混合后再应用大孔吸附树脂纯化工艺生产保健食品。
第七条第七条 必要时，国家食品药品监督管理局可对大孔吸附树脂生产企业和应用大孔吸附树脂生产保健食品所用原料的企业进行现场核查。
第八条第八条 本规定由国家食品药品监督管理局负责解释。
第九条第九条 本规定自二○○五年七月一日起实施。以往发布有关规定与本规定不一致的，以本规定为准。
大孔树脂分离法 篇3
关键词：大孔吸附树脂；静态吸附；解吸；纯化；洗脱；石榴花；多酚
中图分类号： R284.2 文献标志码： B 文章编号：1002-1302（2015）10-0359-03
石榴5—7月开花，花期长，开花量大，不能结实的钟状花和部分筒状花会自然脱落，因此石榴花资源丰富，极具开发价值。石榴花中含有黄酮、多酚及三萜类等物质[1-2]，其中含量最丰富的是多酚，Kaur等报道石榴花乙醇提取物中的多酚含量达321.8 mg/g（以没食子酸为标准品）[3]。近年来，有大量研究表明，石榴花多酚不仅具有显著的抗氧化活性[4]，还具有抑制低密度脂蛋白和胆固醇的氧化[5]，防止动脉粥样硬化，降血压，降血脂[1]，抑制乳腺癌、前列腺癌和口腔癌等癌细胞增生[6-7]，减轻对肝组织的氧化损伤[3]等功能。因此，石榴花多酚在食品、化妆品和医药等领域有一定的应用前景。石榴花提取物中多酚总量与其多种生物活性呈明显的正相关性[4]，采用溶剂法提取的石榴花多酚还含有多种其他成分，因此需要对其进行纯化，才能提高其利用效率。目前，可用于植物多酚纯化的方法主要有溶剂萃取法[8]、重金属沉淀法[9]和树脂吸附法。萃取法须消耗大量三氯甲烷等有机溶剂，沉淀法须要消耗重金属，这2种方法容易导致产品中有机溶剂或重金属残留，而且产品收率较低。大孔树脂具有选择性强、吸附速度快、容量大、解吸容易、成本低等优点，近年来被用于分离纯化植物中的多酚[10]、黄酮[11]、花青素[12]等天然产物。然而，目前在还未见有关大孔吸附树脂法纯化石榴花多酚的研究报道。本研究从5种国产大孔树脂中筛选出 1种对石榴花多酚具有良好吸附和解吸性能的树脂，考察了该树脂对石榴花多酚的吸附与解吸性能及主要的影响因素，以期建立适宜的石榴花多酚纯化条件，为石榴花的深加工提供技术支持。
1 材料与方法
1.1 材料
石榴花采自山东省枣庄市石榴园，于鼓风干燥箱内 115 ℃ 杀青处理5 min，然后在80 ℃烘干至恒质量，粉碎后过孔径约380～400 μm筛，备用。经预处理过的D101、AB-8、DA201、DM130和X-5大孔吸附树脂由安徽三星树脂科技有限公司提供。
1.2 仪器与试剂
UV-2550 紫外可见分光光度计（日本岛津公司），旋转蒸发器RE-52AA（上海亚荣生化仪器厂），玻璃层析柱（1.5 cm×20 cm），KQ-5200超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司）。没食子酸标准品为Sigma公司产品，其他试剂均为国产分析纯。
1.3 分析方法
多酚含量的测定采用Folin-Ciocalteu试剂比色法，以没食子酸为标准品。
1.4 试验方法
1.4.1 石榴花多酚提取液的制備方法 石榴花干燥粉碎，超声波辅助提取（70%乙醇溶液，料液比1 g ∶ 20 mL，超声波功率80 W，温度30 ℃，处理时间40 min），过滤，弃去滤渣，回收滤液即为石榴花多酚提取液的母液，并用Folin-Ciocalteu法测定滤液中的多酚含量，不同含量的提取液由母液稀释配制。
1.4.2 树脂静态吸附与解吸试验 分别称取5种预处理过的大孔吸附树脂D101、AB-8、DA201、DM130和X-5各 2 g，置于100 mL的锥形瓶中，并加入50 mL多酚含量为 2.5 g/L 的石榴花粗提物样品液，在25 ℃恒温环境中吸附 12 h，取其中一定量的样品液用于测定其中的多酚含量；静态吸附后过滤除去石榴花粗提物溶液，树脂用蒸馏水洗净，放入100 mL的锥形瓶中，加入50 mL无水乙醇，于相同温度下解吸，取一定量解吸液测其中的多酚含量，以比较不同树脂对石榴花多酚的吸附和解吸特性。吸附量、吸附率、解吸率、回收率的计算公式：吸附量（mg/g）=（ρ0-ρe）×V0/m；吸附率=（ρ0-ρe）/ρ0×100%；解吸率=ρd/（ρ0-ρe）×100%；回收率=ρd/ρ0×100%。其中：ρ0表示提取物溶液中多酚含量，g/L；ρe表示上清液中多酚的含量，g/L；ρd表示解吸液的多酚含量，g/L；V0表示提取物溶液体积，mL；Vd表示解吸液体积，mL；m表示树脂质量，g。
1.4.3 树脂吸附条件的优化
1.4.3.1 上柱液 pH 值对吸附效果的影响 将预处理好的X-5树脂，装入1.5 cm×20.0 cm的层析柱中，层析柱高度（L）/层析柱内径（D）=13。用水洗涤平衡后上柱，上柱条件：流速3 mL/min，上样液中多酚含量2.5 g/L，上柱液体积V=160 mL，上柱液 pH 值分别为 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0。检测漏出液多酚含量，考察上柱液 pH 值对树脂吸附石榴花多酚含量的影响。
1.4.3.2 上柱液浓度对吸附效果的影响 吸附条件：最佳 pH 值由“1.4.3.1”节确定，石榴花提取液中多酚含量经稀释分别调整为0.11、0.42、0.85、1.55、2.49、3.11、4.66、6.22 g/L，各50 mL，置于100 mL锥形瓶中，加入5 g预处理过的X-5大孔吸附树脂，25 ℃水浴吸附12 h，检测上清液多酚含量，计算X-5树脂对多酚的吸附量，考察上样液浓度对吸附量的影响，绘制静态吸附曲线。
1.4.3.3 X-5树脂的吸附动力学 按照“1.4.3.2”节确定的最佳浓度配制石榴花粗提物溶液50 mL，置于100 mL锥形瓶中，加入5 g预处理过的X-5大孔吸附树脂，25 ℃水浴吸附，分别在吸附后1、2、3、4、5、6 h取上清液样品2 mL，测定其多酚含量，绘制吸附动力学曲线。
nlc202309010032
1.4.3.4 上样液流速对吸附效果的影响 将多酚含量为31 mg/mL的石榴花提取液50 mL（pH值由“1.4.3.1”节确定）分别以6、4、2、1 mL/min的流速上柱，然后用去离子水冲洗至澄清，以70%乙醇作洗脱液，流速2 mL/min，测定洗脱液中多酚含量，计算树脂对多酚的吸附量，然后以流速为横坐标、吸附量为纵坐标绘制曲线。
1.4.4 树脂洗脱条件的优化
1.4.4.1 乙醇浓度对洗脱效果的影响 取100 mL多酚含量为3 mg/mL的石榴花提取液，加入25 g X-5树脂，25 ℃下吸附12 h，湿法上柱，用去离子水冲洗，再分别用100 mL 20%、40%、60%、70%、80%的乙醇溶液洗脱，流速 6 mL/min，测定洗脱液中多酚含量，考察乙醇浓度对洗脱效果的影响。
1.4.4.2 洗脱液体积对洗脱效果的影响 依照“1.4.3”节优化的吸附条件上柱吸附之后，用40 mL水迅速冲洗树脂柱，洗脱条件：洗脱液由“1.4.4.1”节确定，流速为80 mL/h。洗脫液分步收集并测定其多酚含量，绘制动态解吸曲线，从而考察洗脱液体积影响洗脱液效果的情况。
1.4.4.3 洗脱流速对洗脱效果的影响 按“1.4.3”节优化的吸附条件上柱吸附之后，用40 mL水快速淋洗树脂柱，洗脱条件：洗脱液由“1.4.4.1”节确定，洗脱液体积由“1.4.4.2”节确定，洗脱流速分别为6、4、2、1 mL/min。收集洗脱液并测定其含量，考察洗脱流速对洗脱效果的影响。
2 结果与分析
2.1 树脂的的筛选
通过静态吸附与解吸试验测定5种大孔树脂的吸附与解吸特性，结果见表1。其中，X-5型大孔吸附树脂对石榴花多酚的吸附容量、吸附率、解吸率及回收率都是最高的。吸附量和解吸率是评价一种树脂性能优劣的主要参数，前者反映树脂的吸附能力，后者反映吸附之后能否容易洗脱下来。 因此，X-5树脂纯化石榴花中的多酚较为理想。
2.2 X-5大孔吸附树脂吸附条件的优化
2.2.1 上样液pH值对吸附效果的影响 由图1 可知，其他操作条件不变，随着pH 值的升高，树脂对石榴花多酚的吸附量逐渐降低，说明低pH值有利于吸附。石榴花多酚含有鞣花酸、没食子酸等酚酸类物质[2]，因此具有弱酸性，在pH值较大时会解离成离子形态存在，此时不易被大孔树脂吸附，而以分子态存在时易被所用的大孔树脂吸附。当pH值下降时，石榴花多酚多以分子态存在就易被大孔树脂吸附。因此，pH值为 2.0的条件最适合X-5树脂吸附石榴花多酚。
2.2.2 上样液浓度对吸附效果的影响 从图2可以看出，上样液浓度较低时，X-5树脂对对石榴花多酚的吸附量随上样液浓度的增大而增大；在石榴花多酚含量为3.1 mg/mL时，吸附量达到最大；之后，吸附量反而随上样液浓度的增大而逐渐下降，这种变化趋势与其他文献中的结果[13-15]一致。上样液的浓度决定了同一时间与树脂相互作用的目标物质分子数量，从理论上讲，在达到饱和之前，该数量越大越有利于目标物质的富集；超过一定值后，随浓度增大，吸附量下降，可能是由于上样液中的糖类等物质在较大浓度时黏度变大，堵塞树脂孔隙，目标物质与树脂相互作用的机会减少，从而影响对多酚的吸附量。因此，选择3.1 mg/mL作为上样液浓度。
2.2.3 吸附动力学曲线 吸附速度也是大孔树脂吸附性能的重要参考指标。25 ℃时，X-5树脂对石榴花多酚的静态吸附动力学曲线见图3。由图3可以看出，在0～5 h内，X-5树脂对石榴花多酚的吸附量随时间的延长而增大，之后趋于稳定，说明吸附 5 h即可达到饱和，而XDA-1树脂对杜仲黄酮的吸附需要10 h以上才能达到平衡[11]，可见X-5树脂对石榴花多酚的吸附属快速吸附平衡型。
2.2.4 上样液流速对吸附效果的影响 由图4可见，随上柱流速的增大，对石榴花多酚的吸附量逐渐减小。流速对树脂吸附的影响主要是影响溶质向树脂表面扩散，从而对吸附效果产生影响。上柱时流速过大，石榴花多酚溶液与树脂之间接触时间变短，石榴花多酚分子来不及进入到树脂的内表面而流过，从而降低吸附率。降低流速，会使石榴花多酚分子同树脂的内表面有足够的接触时间，有利于树脂吸附石榴花多酚，减少多酚的漏出量，从而提高其吸附率；当流速过小时，会使作业周期延长，提高成本。从本试验结果来看，上柱流速为1 mL/min的吸附量与上柱流速为2 mL/min的吸附量相差不大，因此上柱流速以 2 mL/min 为宜。
2.3 X-5树脂对多酚吸附后洗脱条件的优化
2.3.1 洗脱液浓度的选择 为尽可能提高多酚的回收率，通常选用解吸率较高的溶剂作为解吸剂，丙酮、甲醇及乙醇是常用的解吸剂，但考虑到石榴花多酚要应用在食品及化妆品中，因此本试验选用无毒性的乙醇作为解吸剂，并考察乙醇浓度对解吸效果的影响，结果如图5所示。当乙醇浓度为20%～60%时，解吸效果很低，变化也不大；超过60%之后，随乙醇浓度增大，解吸效果迅速提高，当乙醇浓度为70%时，解吸效果最好，之后又迅速下降。因此，宜选用70%乙醇溶液对石榴花多酚进行洗脱。
2.3.2 洗脱液体积对解吸效果的影响 经吸附达到饱和的X-5树脂先用40 mL的水洗去树脂吸附的可溶性糖类，再用200 mL的70%乙醇溶液洗脱，洗脱速度为2 mL/min，在室温下测定乙醇溶液对多酚物质的动态洗脱效果，结果如图6所示。图6显示，在动态条件下极易洗脱X-5树脂上吸附的多酚物质，很少量的洗脱液即可达到洗脱效果。多酚物质的洗脱高峰也相对比较集中，当洗脱液体积为10～40 mL时，洗脱液中的石榴花多酚含量较高；在洗脱液体积达到80 mL时，能够将吸附在X-5树脂上的多酚充分洗脱，因此，洗脱液体积宜选择80 mL。
2.3.3 洗脱液流速对解吸效果的影响 图7显示，流速越大，洗脱效果越差，其中流速为1 mL/min 的解吸效果是流速为4 mL/min的3倍。因流速加快，洗脱液未能与被吸附的多酚进行充分作用而将其从大孔树脂的吸附位点上置换出来；而流速太小会使作业周期延长。因此，在本研究条件下，70%乙醇洗脱流速宜控制在2 mL/min。
nlc202309010032
3 结论
X-5树脂用于石榴花多酚纯化具有吸附量大、吸附率高、易解吸等特点，是纯化石榴花多酚的理想材料。选用X-5大孔吸附树脂纯化石榴花多酚的最佳上样条件为：上样液浓度3.1 g/L，pH 值2.0， 上样液流速 2 mL/min； 最佳洗脱条件：洗
脱液为70%乙醇溶液，流速2 mL/min，洗脱液体积为 80 mL。
参考文献：
[1]Huang T H W，Peng G，Kota B P，et al. Pomegranate flower improves cardiac lipid metabolism in a diabetic rat model：role of lowering circulating lipids[J]. Brit J Pharmacol，2005，145：767-774.
[2]Wang R，Wang L，Liu R，et al. Constituents of the flowers of Punica granatum[J]. Fitoterapia，2006，77（7/8）：534-537.
[3]Kaur G，Jabbar Z，Athar M，et al. Punica granatum （Pomegranate） flower extract possesses potent antioxidant activity and abrogates Fe-NTA induced hepatotoxicity in mice[J]. Food and Chemical Toxicology，2006，44（7）：984-993.
[4]Bektas N，Ozturk N. Antioxidant activity of Punica granatum （Pomegranate） flowers[J]. Toxicology Letters，2007，172（Supp.）：62.
[5]Singh R P，Chidambara M K N，Jayaprkasha G K. Studies on the antioxidant activity of pomegranate peel and seed extracts using in vitro models[J]. J Agric Food Chem，2002，50：81-86.
[6]Albrecht M，Jiang W，Kumi-Diaka J，et al. Pomegranate extracts potently suppress proliferation，xenograft growth，and invasion of human prostate cancer cells[J]. Journal of Medicinal Food，2004，7（3）：274-283.
[7]Seeram N P，Adams L S，Henning S M，et al. In vitro antiproliferative，apoptotic and antioxidant activities of punicalagin，ellagic acid and a total pomegranate tannin extract are enhanced in combination with other polyphenols as found in pomegranate juice[J]. The Journal of Nutritional Biochemistry，2005，16（6）：360-367.
[8]John K M，Vijayan D，Kumar R R，et al. Factors influencing the efficiency of extraction of polyphenols from young tea leaves[J]. Asian J Plant Sci，2006，5（1）：123-126.
[9]Tang K W，Zhpi C，Jiang X Y. Preparation of ester catechins with high proportion by deposition adsorpition[J]. J Cent South Univ Technol，2002，33（3）：247-249.
[10]Li P，Wang Y H，Ma R Y. Separation of tea polyphenol from green tea leaves by a combined CATUFM 2 adsorption resin process[J]. J Food Eng，2005，67：253-260.
[11]董娟娥，梁宗鎖，张康健，等. 大孔吸附树脂一次性分离杜仲叶中杜仲总苷和杜仲黄酮的研究[J]. 农业工程学报，2006，22（7）：154-158.
[12]Jaiswal V，Dermarderosian A，Porter J R. Anthocyanins and polyphenol oxidase from dried arils of pomegranate（Punica granatum L.）[J]. Food Chemistry，2010，118（1）：11-16.
[13]马希汉，王冬梅，苏印泉.大孔吸附树脂对杜仲叶中绿原酸、总黄酮的分离研究[J]. 林产化学与工业，2004，24（3）：47-51.
[14]艾志录，王育红，王 海，等. 大孔树脂对苹果渣中多酚物质的吸附研究[J]. 农业工程学报，2007，23（8）：245-248.
[15]黄阿根，董瑞建，谢凯舟.茶树花多酚大孔树脂纯化工艺研究[J]. 农业工程学报，2007，23（9）：239-245.滑金杰，袁海波，江用文，等. 响应面设计优化工夫红茶萎凋工艺参数[J]. 江苏农业科学，2015，43（10）：362-366.
大孔树脂分离法 篇4
盐酸克伦特罗是一种用于治疗支气管哮喘、喘息性支气管炎和由于过敏症、感染和运动造成的支气管痉挛的药物,在畜牧养殖中能够对动物体内的营养物质起重新分配作用,可促进动物生长,提高瘦肉率、降低脂肪沉积、降低饲料报酬等,是获得瘦肉的理想方法[1]。但盐酸克伦特罗对热稳定,使用后会在动物组织体内形成累积性残留,特别在内脏中会有高浓度的残留,对人与动物的肝、肾及神经系统有一定的毒副作用[2]。我国农业部已禁止将盐酸克伦特罗作为饲料添加剂使用。因此,建立简便、可靠的盐酸克伦特罗测定方法,对于保障食品安全具有重要意义。
盐酸克伦特罗的测定一般包括分离和检测两个方面,其中又以分离为最重要步骤。有关文献资料主要研究了盐酸克伦特罗检测方法的改进,而较少涉及到其分离方法[3,4]。文章以大孔吸附树脂为吸附剂,采用固相萃取方法吸附分离盐酸克伦特罗。与实验室常用的以活性炭、C18等为吸附剂的萃取小柱相比,文章采用可重复使用的固相萃取大柱,具有操作费用较低,操作简单等特点,适合实验室使用。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
TU-1901双光束紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;pHS-3 C酸度计,上海雷磁仪器厂;固相萃取大柱,Φ12×150;盐酸克伦特罗,广州侨光制药厂;无水乙醇,分析纯,广州化学试剂厂;Amberlite XAD-2大孔吸附树脂,Sigma-Aldrich Co.。
1.2 实验方法
准确称取5 g Amberlite XAD-2大孔吸附树脂,用无水乙醇浸泡12 h后装柱,用50 mL蒸馏水洗涤柱体。将2 mL的100 μg/mL盐酸克伦特罗溶液样品加入分离柱中,用25 mL蒸馏水洗涤柱体,再用25 mL洗脱剂洗涤柱体,洗脱速率为1 mL/min。收集洗脱液并定容至25 mL比色管中,以蒸馏水为参比,在波长242 nm处测定样品的吸光度,计算回收率。
2 结果与讨论
2.1 盐酸克伦特罗的测定
盐酸克伦特罗的紫外吸收谱图如图1所示。根据图1可以发现,在扫描波长范围内,盐酸克伦特罗存在两个吸收峰,分别为242 nm和294 nm。由于242 nm处的吸收强度明显高于294 nm处的吸收强度,选择242 nm为测定波长。盐酸克伦特罗在242 nm的工作曲线如图2所示,拟合方程为Y=0.00607+0.03348 X,相关系数R=0.99939,表明该波长下盐酸克伦特罗的吸光度与浓度之间存在良好的线性关系。
2.2 洗脱剂的选择
洗脱剂的洗脱作用实质上是流动相分子与被分离物质分子竞争占据大孔树脂表面活性吸附中心的过程,强极性分子占据吸附中心的能力强,因而具有较强的洗脱能力。以水为洗涤剂,分别采用不同的洗脱剂,发现不同浓度的甲醇为洗脱剂时的回收率均超过100 %,表明有影响盐酸克伦特罗浓度测定的杂质同时被洗脱,而乙酸、乙酸乙酯以及乙酸乙酯及正己烷的混合物为洗脱剂时的回收率过低,最高仅能达到72.3 %,但无水乙醇为洗脱剂时的回收率最高可达到76.98,因此,选择无水乙醇为洗脱剂。不同洗脱剂对盐酸克伦特罗回收率的影响如表1所示。
2.3 样品pH值的影响
分别采用0.1 mol/L的盐酸以及10 wt?%的NaOH溶液调节待测样品的pH值,计算待测样品的回收率,结果如图3所示。
由图3可知,碱性样品的回收率较高,酸性样品较低。将待测样品的pH值调节至碱性可以有效提高其回收率。
2.4 洗脱剂体积的影响
按照实验方法分别加入不同体积的无水乙醇进行洗脱,回收率如图4所示。
一般说来,洗脱剂用量越大,盐酸克伦特罗的回收率越高,但成本也相应增大。由图4可知,无水乙醇用量达到20 mL之后,随洗脱剂用量增大,盐酸克伦特罗的回收率并没有明显提高,因而在实际操作中可选择20 mL作为洗脱剂的用量。
2.5 洗脱剂流速的影响
洗脱剂流对盐酸克伦特罗回收率的影响如图5所示。
由图5可知,最佳洗脱剂流速为1 mL/min。洗脱剂流速过快将导致盐酸克伦特罗的回收率降低,其原因在于洗脱剂没有足够的时间在吸附剂的吸附活性中心上与盐酸克伦特罗分子展开竞争吸附,产生“短路”现象。
2.6 最大饱和吸附量
更改盐酸克伦克罗的进样量,测定大孔吸附树脂的最大饱和吸附量,结果如图6所示。
由图6可知,Amberlite XAD-2大孔吸附树脂对盐酸克伦特罗的最大饱和吸附量约为319 μg/g。
2.7 重现性及误差分析
按照本文实验方法,根据上述所得最佳条件平行测定3次,计算回收率及标准偏差,并比较重现性,结果如表2所示。
根据表2可以发现:采用Amberlite XAD-2大孔吸附树脂对盐酸克伦特罗进行固相萃取分离,重现性好,回收率较高,适于作为高效液相色谱法测定盐酸克伦特罗的前处理方法。
3 结 论
采用Amberlite XAD-2大孔吸附树脂对盐酸克伦特罗进行固相萃取分离,最大饱和吸附量可达319 ug/g。以水为洗涤剂,无水乙醇为洗脱剂,洗脱剂流速为1 mL/min,样品pH值为10.8,回收率最高可达76.98 %。具有较好的重现性,适于作为高效液相色谱法测定盐酸克伦特罗的前处理方法。
摘要：采用大孔吸附树脂分离盐酸克伦特罗,对吸附分离条件进行了研究。结果表明,采用大孔吸附树脂作吸附剂对盐酸克伦特罗进行固相萃取,再用无水乙醇洗脱,可有效分离盐酸克伦特罗。洗脱流速为1mL/min,平均回收率可达76.07%,最大柱容量为319μg/g。
关键词：盐酸克伦特罗,固相萃取,大孔吸附树脂
参考文献
[1]魏德成,郭俊峰,杨翼洲.供港活猪“瘦肉精”残留检测方法及其重要意义[J].河南畜牧兽医,2000,21(2):35-36.
[2]卢业玉,尚红霞,余倩,等.饲料中克伦特罗和沙丁胺醇分离方法的研究[J].离子交换与吸附,2003,19(4):331-336.
[3]戴华,袁智能,黄志强,陈新焕.饲料中盐酸克伦特罗、沙丁胺醇高效液相色谱测定[J].分析测试学报,2003,22(3):57-59.
大孔树脂分离法 篇5
介绍了采用蒸发浓缩方式对DSD酸生产废水大孔树脂洗脱液进行减量处理的方法.
作 者：赵丽平周汾涛 钱锦霞 ZHAO Li-ping ZHOU Fen-tao QIAN Jin-xia 作者单位：赵丽平,ZHAO Li-ping(山西省气象科学研究所,山西太原,030002)
周汾涛,ZHOU Fen-tao(山西省环境技术评估中心,山西太原,030027)
钱锦霞,QIAN Jin-xia(山西省气候中心,山西太原,030002)
大孔树脂分离法 篇6
摘 要：采用聚酰胺-大孔树脂联用法对菠菜叶中总黄酮的纯化条件进行研究。以总黄酮的纯度和得率为考察指标，确定纯化菠菜叶总黄酮的最佳树脂为AB-8，其最佳纯化条件为：上样量与聚酰胺量之比为1∶2；上样量与树脂量之比为1∶8；乙醇洗脱的浓度为60%；洗脱流速为2 mL·min-1；洗脱剂的用量为2BV。总黄酮得率最高可达71.42%，纯度可达26.63%。
关键词：菠菜叶；总黄酮；纯化；聚酰胺-大孔树脂联用
中图分类号：S636.1 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2015.09.017
Study on Enriching Total Flavonoids from Spinach Leaves with Polyamide and Macroporous Resin
GUO Cai-zhen，CHU Pan-pan， QIAO Yuan-biao
（Department of Biology， Lyuliang University， Lyuliang， Shanxi 033000， China）
Abstract： Purigying total flavonoids from spinach leaveswith polyamide and macroporous resin was studying in this paper.Purity and yield of total flavonoids as investigates index.The best purified resin of total flavonoids in spinach leaves was AB-8，The optimum experimental conditions were：the best ratio of absorbing solution and polyamide was 1：2；the best ratio of absorbing solution and resin was 1：8；ethanol concentration was 60%；the eluting velocity was 2 mL·min-1；the dosage of the eluting solution was 2BV.The yield of total flavonoids reached to 71.42% and the purity was 26.23%.
Key words： spinach leaves；total flavonoids；purification；combination polyamide and macroporous resin
黄酮类化合物是植物次生代谢产生的一种天然产物，近年来研究报道了黄酮类化合物具有抗菌、降血糖血脂、抗肿瘤、抗氧化性、防治心脑血管疾病等丰富的药理活性[1-3]。蔬菜中黄酮类化合物的含量在0.21～6.44 mg·g-1，而且主要存在于叶中。叶菜中的黄酮类化合物含量远大于茎菜、果菜和根菜[4-7]。菠菜的叶片厚实而且叶肉多，所以含有较多的黄酮类化合物，具有较高的研究价值。目前对菠菜叶片的研究主要集中在色素及提取方面，很少涉及菠菜叶中黄酮类化合物的纯化。本试验首次用聚酰胺-大孔树脂联用对菠菜叶中总黄酮的纯化进行了初步研究，以期为其进一步的开发应用提供参考。
1 材料和方法
1.1 材 料
菠菜叶片：将新鲜的菠菜叶片洗净，置于60 ℃的恒温干燥箱中干燥，粉碎机粉碎备用。
1.2 试剂与仪器
试剂：石油醚、纤维素酶、无水乙醇、芦丁标准品、硝酸铝、亚硝酸钠、硝酸钠、氢氧化钠盐酸（HCl） 以上试剂均为分析纯；D4020、AB-8、S-8、X-5 大孔吸附树脂；聚酰胺。
仪器：电子天平：上海电子仪器；层析柱：上海玻璃仪器厂；高速万能粉碎机：天津市泰斯仪器有限公司；HH-8 数显恒温水浴锅：江苏金坛市荣华仪器制造有限公司；DGH-9053A 型电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司。
1.3 方 法
1.3.1 总黄酮提取物的制备及含量测定 称菠菜叶片粉末适量，用石油醚脱脂后加10倍原料质量的蒸馏水混匀，按酶用量为6.5 mg·g-1，在46 ℃和pH值4.7的条件下进行纤维素酶预处理1.5 h，然后再加入20倍原料的70%乙醇溶液在70 ℃下恒温浸提2次，每次1 h，过滤，合并滤液，浓缩干燥，备用。总黄酮的含量采用NaNO2-Al（NO3）3比色法测定 [8]，以芦丁作标准品，在510 nm的波长下测其吸光值，再绘制标准曲线，并计算回归方程：Y=0.123 6X+0.004 4，式中X为总黄酮的浓度（mg·mL-1），Y为吸光度值。
1.3.2 大孔树脂及聚酰胺粉末预处理 称取一定量的大孔树脂，用95%乙醇浸泡24 h，再用酒精洗直至与3倍的蒸馏水混合不会变浑浊，然后用蒸馏水洗到无酒精味，取出备用[9]。
称取适量的聚酰胺粉末用无水乙醇煮沸2次，每次0.5 h，然后用湿法装柱，静置0.5 h再用蒸馏水洗，直到洗出液变为澄清，备用。
1.3.3 不同型号大孔树脂的筛选 取预处理好的等量不同型号的大孔树脂用湿法装柱（1 cm×20 cm），再用甲醇溶解5份0.5 g的总黄酮提取物，分别拌入1 g处理好的聚酰胺粉末，溶剂挥干后放置于漏斗中，用蒸馏水洗脱到流出液近无色，再将洗脱后的聚酰胺分别置于不同型号的大孔树脂柱上面，用60%乙醇溶液洗脱至无色。分别测定洗脱液中的固体量及其总黄酮的含量，计算总黄酮的得率和纯度。总黄酮得率（%）=（洗脱液中所含总黄酮量/上柱前提取物所含总黄酮量）×100%，总黄酮纯度（%）=（洗脱液中所含总黄酮量/洗脱液含固体量）×100%；表1列出了不同型号各树脂的结构性能。
1.3.4 上样量与聚酰胺用量比的确定 称取试验最佳的树脂5 g，湿法装柱。再分别称0.5 g的总黄酮提取物，用甲醇溶解后拌合以一定量的聚酰胺粉末，使提取物与聚酰胺用量比分别为1∶4、1∶2、1∶1、2∶1、4∶1，水洗至无色后置树脂柱上部，以60%乙醇进行洗脱，收集各比例的洗脱液并测其相应指标。
1.3.5 上样量与树脂用量比的确定 称取0.5 g的总黄酮提取物，以提取物与树脂用量为1∶6、1∶8、1∶10、1∶12、1∶14的比例进行湿法装柱。按已确定的上样量与聚酰胺最佳比例进行处理后用60%乙醇进行洗脱，收集各比例的洗脱液并测定其相应指标。
1.3.6 洗脱剂浓度的确定 称取0.5 g的总黄酮提取物，按上述已确定的上样量与聚酰胺最佳比例和上样量与树脂最佳比例上样后，分别用20%，40%，60%，80%的乙醇浓度洗脱，收集各浓度的洗脱液并测定其相应指标，确定最佳洗脱剂的浓度。
1.3.7 洗脱流速的确定 称取0.5 g的总黄酮提取物按已确定最佳的上样量与聚酰胺比例、上样量与树脂比例和洗脱剂浓度上样后，用60%的乙醇分别以1，2，3，4 mL·min-1的流速洗脱，收集各流速的洗脱液并测定其相应指标，确定最佳的洗脱速度。
1.3.8 洗脱剂用量的确定 称取预处理好的AB-8树脂4 g用湿法装柱，将其处理好的总黄酮提取物按上述最佳条件上样和洗脱，进行分段收集，每5 mL收集一份，共收集20份，然后测其总黄酮含量及相应指标并绘制其洗脱曲线，从而确定洗脱剂的最佳用量。
2 结果与分析
2.1 不同型号大孔树脂的筛选
由于聚酰胺分子筛和大孔树脂吸附的双重作用，聚酰胺初步纯化的供试液进入大孔树脂后将会进行更进一步的纯化。不同树脂的吸附性能和物理性质不同，对所需有效成分吸附的影响较大。由表2可以看出，在四种树脂中AB-8树脂纯化和富集总黄酮的纯度及得率方面的效果最佳，因此，本试验选用AB-8树脂与聚酰胺联用进行纯化。
2.2 上样量与聚酰胺用量比分析
由表3可知，随着上样量-聚酰胺用量比不断增大，在洗脱液中总黄酮的纯度和得率逐渐降低。这可能是因为聚酰胺的用量降低以后，在聚酰胺上吸附的杂质和总黄酮的量相应减少，同时在水洗脱除杂的过程当中，流失了大量的总黄酮所致。所以综合考虑总黄酮的纯度和得率，本试验选择1∶2的上样量与聚酰胺用量比。
2.3 上样量与树脂用量比分析
由表4可知，上样量一定时，上样量与树脂用量比为1∶8时总黄酮的纯度和得率都达到最大值。若树脂用量过少，就会超过树脂的饱和吸附量而使部分总黄酮损失而引起总黄酮的纯度和得率降低；随着树脂量不断增多，纯度和得率的变化不是很大，但是会使纯化的周期变长，生产成本也就相应的增高。所以最佳的上样量与树脂用量比例为1∶8。
2.4 乙醇洗脱浓度的确定
乙醇浓度对洗脱液中总黄酮的纯度和得率都有一定的影响。表5结果表明，随着乙醇浓度的增大，总黄酮的纯度和得率也逐渐升高，当乙醇浓度为60%时达到最高值；当乙醇的浓度大于60%后，总黄酮的纯度和得率变化趋于平缓，说明翅果油树叶片中的总黄酮已经基本被洗脱下来。考虑到洗脱剂的浪费，本实验选择用60%的乙醇为洗脱剂。
2.5 洗脱流速的确定
表6表明，洗脱流速为2 mL·min-1时，总黄酮的纯度和得率达到最大，能将总黄酮较完全的洗脱下来。当流速过快时，洗脱剂和树脂接触的时间比较短，树脂对洗脱剂中总黄酮的吸附率降低而导致其纯度和得率都下降；但当流速较慢时，则会使洗脱循环的周期变长，浪费洗脱剂。所以本试验选择2 mL·min-1的洗脱流速。
2.6 洗脱剂用量的确定
在洗脱的过程中，若洗脱剂用量较少，所需的成分就不会被完全洗脱下来，若洗脱剂较多则会造成试验成本的升高，也会给后续的浓缩干燥等处理带来困难。由表7可知，当洗脱剂的用量大于2 BV以后，总黄酮的得率变化不是很大反而纯度有所降低，绝大部分的总黄酮已经在2 BV时基本被洗脱下来。本着缩短时间和减少试验周期的原则，本试验选择2 BV的洗脱剂用量。
3 结 论
聚酰胺和大孔树脂是纯化黄酮类化合物的常用材料，由于二者吸附原理不同使其在分离纯化黄酮类化合物方面各有优缺点，但是把聚酰胺和大孔树脂联用就能充分发挥其优点。本试验采用聚酰胺-大孔树脂联用纯化菠菜叶总黄酮的最佳树脂为AB-8，其最佳纯化条件为：上样量与聚酰胺量之比为1∶2；上样量与树脂量之比为1∶8；乙醇洗脱的浓度为60%；洗脱流速为2 mL·min-1；洗脱剂的用量为2 BV，总黄酮收率最高可达71.42%，纯度可达26.63%。该方法优于目前常用的总黄酮的纯化方法且工艺简单，具有良好的应用前景。
参考文献：
[1] 鲁晓翔.黄酮类化合物抗氧化作用机制研究进展[J].食品研究与进展，2012，33（3）：220-224.
[2] 周宝利，姚婷，张健，等.苦参黄酮对黄瓜枯萎病及抗性生理的影响[J].华北农学报，2009（6）：78-82.
[3] Middleton J R.Biological properities of plant flavonoid：anoverview[J].Int J P Harmacognos， 1996（34）：344-348.
[4] 赵娟娟.响应面法优化提取菠菜中黄酮类物质的工艺研究[J].北方园艺，2013（14）：137-139.
[5] 杨建兴，宋曙辉，王文琪，等.几种特色蔬菜抗氧化作用的研究[J].安徽农学通报，2009，15（3）：43-45.
[6]刘江，胡筱波，郝强，等.洋葱皮总黄酮提取工艺的优化[J].河南农业科学，2011（6）：153-156，160.
[7] 李众飞.黄瓜藤中黄酮的提取工艺研究[J].内蒙古农业科技，2005（1）：20-21.
[8] 卫强，戴一，吴燕，等.聚酰胺-大孔树脂联用纯化菊叶总黄酮的初步研究[J].中药材，2011，34（8）：1 285-1 288.
大孔树脂分离法 篇7
1 材料与仪器
1.1 材料
十子代平方组方,购自唐山市同仁堂药店;芦丁标准品,购自中国食品药品检定研究院;95%乙醇、无水乙醇、石油醚等均为分析纯,盐酸、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等均购自天津市永大化学试剂有限公司;AB-8、HPD700、DM130、HPD100、D900、D101大孔吸附树脂购自沧州宝恩吸附材料科技有限公司。
1.2 仪器
电子天平(上海第二天平仪器厂);微型高速粉碎机(深圳化试科技有限公司);电热恒温水浴锅(上海器械五厂);旋转蒸发器RE-SZAA(上海亚荣生化仪器厂);循环水式真空泵(北京中兴伟业仪器有限公司);TU-1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)。
2 方法与结果
2.1 十子代平方总黄酮提取
精密称定中药复方十子代平方组方粉末24g,置于索氏提取器中,以石油醚240mL于90℃下回流脱脂2次,每次2h,挥干石油醚,置于60℃烘箱中干燥2h,放至室温。再以80%乙醇350mL在热水浴(95℃)中回流浸提3次,每次3h,合并流液,回流结束后抽滤,收集滤液,浓缩得十子代平方总黄酮。
2.2 总黄酮含量测定
2.2.1 标准曲线制备[5]
精密称取芦丁标准品10.06mg,置于烧杯中用适量的无水乙醇溶解,转移到50mL容量瓶中,加入无水乙醇定容、摇匀。分别精密量取上述溶液0.0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、6.0mL于25mL容量瓶中,加超纯水至8.0mL,然后加1.0mL 5%NaNO2摇匀,放置6min,加1.0mL 10%Al(NO3)3摇匀,放置6min,再加10.0mL 4%NaOH摇匀,用超纯水定容后放置15min,以第一份溶液作为空白对照在510nm处测定吸光度,以吸光度A对浓度C绘制标准曲线。标准曲线方程为A=17.687C-0.0166,R2=0.999 4,R=0.999 6,结果表明线性关系良好。
2.2.2 样品含量测定
精密量取上述总黄酮提取液10.0mL,置于100mL容量瓶中稀释至刻度,定容,摇匀。精确量取10.0mL样品溶液3份置于25mL容量瓶中,按测定标准曲线的方法操作测定吸光度,根据标准曲线计算得样品溶液中总黄酮浓度。样品含量=样品浓度C(mg/mL)×稀释倍数。见表1。
注:样品含量=0.8150mg/mL×10=8.150mg/mL
2.3 大孔吸附树脂筛选
2.3.1 大孔树脂预处理[6]
大孔吸附树脂一般有未聚合的单体及残留溶剂,使用前须先行去除。树脂用无水乙醇浸泡24h,蒸馏水洗至无醇味,抽去水分备用。
2.3.2 静态吸附与解吸附实验
分别称取预处理过的AB-8、HPD700、DM130、HPD100、D900、D101大孔树脂1.008g(湿重),置于100mL具塞锥形瓶中,加入总黄酮浓度0.815 0mg/mL的样品液25mL,在25℃下,180r/min振荡24h,充分吸附后,分别精密量取上层液1.0mL测定总黄酮浓度,之后用蒸馏水洗涤、抽滤得到吸附后的树脂,加入50mL体积分数80%乙醇,在相同条件下震荡5h,分别精密量取上层液1.0mL测定总黄酮浓度。
按照如下公式计算吸附量、吸附率和解吸率:
式中C1和C2分别为吸附前后样品溶液总黄酮浓度(mg/mL);C3为洗脱液中总黄酮的浓度(mg/mL);V为样品液体积(mL);G为树脂湿重(g)。静态吸附、解吸附实验结果见表2、表3。
由表2和表3可知AB-8大孔吸附树脂均优于其他树脂,因此选择AB-8树脂分离纯化十子代平方中总黄酮。
2.3.3 AB-8树脂静态吸附动力学曲线绘制称取已预处理的AB-8大孔吸附树脂1.003g(湿重),置于100mL具塞锥形瓶中,加入总黄酮浓度0.716 0mg/mL的十子代平方复方总黄酮提取液50mL,在25℃下,160r/min振荡,分别于0、30、60、90、120、150、180、210、240、480、600min吸取上清液1.0mL测定总黄酮浓度,绘制树脂静态吸附动力学曲线。结果见图1。
2.4 AB-8树脂分离纯化总黄酮动态吸附解吸附实验
2.4.1 最佳上样浓度确定
分别取4.008g AB-8大孔树脂7份,湿法装入玻璃层析柱中。分别取C1(0.867 1mg/mL)、C2(1.293mg/mL)、C3(2.412mg/mL)、C4(3.493mg/mL)、C5(4.353mg/mL)、C6(4.604mg/mL)、C7(4.938mg/mL)十子代平方总黄酮提取液30mL进行动态吸附,收集流出液,定容到50mL,摇匀。分别精确量取1.0mL上述样品溶液测定总黄酮的浓度,根据“2.3”项中的(2)式计算吸附率。结果见表4。由表4可知最佳上样浓度为2.412mg/mL。
2.4.2 洗脱剂浓度确定
分别取4.005g AB-8大孔树脂5份,湿法装入玻璃层析柱中。精密量取浓度2.412mg/mL十子代平方复方总黄酮提取液30mL上柱吸附,收集过柱液,吸附树脂经过水洗后,再分别用10%、30%、50%、75%、95%的乙醇溶液50mL进行洗脱,收集洗脱液。分别精确量取1.0mL样品液测定总黄酮的浓度。结果见图2。当乙醇体积分数达50%时,总黄酮浓度变化较小,综合考虑最佳洗脱剂浓度为50%。
2.4.3 吸附穿透曲线绘制
取4.0g AB-8大孔树脂,湿法装入玻璃层析柱中。取浓度2.412mg/mL的提取液上样,以10mL为1管分段收集流出液,分别精确量取0.50mL流出液测定各管的总黄酮浓度,绘制穿透曲线。结果见图3。由图3可知饱和吸附量为160mL。
2.4.4 洗脱剂用量确定
将“2.4.3”中吸附饱和的树脂,用水洗脱树脂柱至脱液近无色,用50%的乙醇洗脱,每10mL收集一管,测定各管总黄酮浓度,绘制洗脱曲线。结果见图4。由图4可知洗脱剂用量为150mL,即5BV。
3 讨论
大孔树脂的吸附性能受多种因素的影响,如树脂的极性、比表面积、孔径等。根据“相似相溶”的原则[7],AB-8树脂吸附效果最好,可能是因为AB-8树脂为弱极性,更容易吸附弱极性十子代平方复方总黄酮。AB-8树脂不仅吸附好,还能较快地达到平衡,节约时间。本实验确定了上样浓度、上样量、洗脱剂浓度、洗脱剂体积等因素对分离纯化效果的影响,为十子代平方中总黄酮类成分的分离纯化提供了新方法。
参考文献
[1]吴立军.天然药物化学[M].北京:人民卫生出版社,2011:183.
[2]张伟,陈素红,吕圭源.菟丝子功效性归经与现代药理学的相关研究[J].时珍国医国药,2010,21(4):808-811.
[3]郑秀棉,杨莉,王峥涛.车前子的化学成分与药理活性研究进展[J].中药材,2013,36(7):1190-1195.
[4]GAO M,WANG XL,GU M,et al.Separation of polyphenols using porous polyamide resin and assessment of mechanism of retention G-2422-2011[J].Journal of Separation Science,2011,34(15):1853.
[5]YANG SH,DOU K F,SONG W J.Prevalence of diabetes among men and women in China[J].N Engl J Med,2010,326(25):2425-2426.
[6]李洋,曹珊珊,张媛,等.大孔树脂分离纯化楮果总黄酮优化工艺研究[J].离子交换与吸附,2013,29(4):323-333.
大孔树脂分离法 篇8
1材料
1.1 仪器
旋转蒸发仪, 上海爱朗仪器公司;低温冷却液循环泵, 郑州长城科工贸有限公司;玻璃层析柱购于广州东征公司。
1.2 药品与试剂
补骨脂药材, 购于广州清平中药材市场, 经鉴定符合国家药典标准。芦丁对照品购于中国药品生物制品鉴定所;NaNO3、Al (NO3) 3、NaOH、乙醇为分析纯。
2实验方法
2.1 样品溶液的制备及总黄酮含量测定
取补骨脂药材粉末100 g, 加入75%乙醇浸泡12 h, 超声30 min, 过滤, 收集滤液, 减压浓缩至200 ml, 备用。采用分光光度法测定总黄酮含量, 以芦丁为对照品, 510 nm处测定吸光光度值, 计算含量。
2.2 大孔吸附树脂ZTC-1对补骨脂总黄酮的吸附
2.2.1 上样药液流速对ZTC-1树脂吸附影响
取补骨脂提取液体100 ml, 分别以1 ml/min, 2 ml/min, 3 ml/min, 4 ml/min, 5 ml/min通过预处理好的ZTC-1树脂柱, 考察不同流速下的吸附效果。
2.2.2 上样药液浓度的考察
分别取入5 mg/ml、10 mg/ml、15 mg/ml、20 mg/ml的补骨脂提取液, 以2 ml/min流速上样, 计算黄酮的吸附量。
2.2.3 洗脱液乙醇浓度对ZTC-1树脂的影响
将100 ml浓度为10 mg/ml的补骨脂提取液, 通过预处理好的树脂, 用300 ml水洗脱后, 依次用10%、30%、50%、70%、90%乙醇洗脱, 各浓度分别收集100 ml洗脱液, 并将水洗液浓缩至50 ml, 各溶液取样, 用分光光度法进行含量测定。总黄酮洗脱率=醇洗脱黄酮量/上柱黄酮量×100%。
3结果
3.1 上样药液流速对ZTC-1树脂吸附效果的影响, 见表1。
吸附量随着接触时间的延长而增加, 当吸附流速加快时, 其接触时间也相应的减少, 吸附量减少。由表1可以看出, 吸附量是随着上样药液流速的增加而减少的, 从时间成本角度考虑, 可选择2 ml/min的流速上样。
3.2 上样药液浓度的考察, 见表2。
由上表2可知, 上样药液浓度不同对黄酮的吸附结果不一, 补骨脂总黄酮的浓度在10 mg/ml时树脂的吸附量最大。
3.3 洗脱液乙醇浓度对ZTC-1树脂的影响, 见表3。
由上述实验结果可以看出, 50%乙醇溶液洗脱的黄酮含量最大。
4讨论
大孔树脂作为一种有机高聚吸附剂, 具有选择性吸附有机化合物的能力, 可应用于皂苷、黄酮、蒽醌、生物碱、水溶性酚性成分及中药提取、分离及纯化[2,3]。本实验拟采用大孔吸附树脂来精制补骨脂总黄酮, 以ZTC-1为吸附树脂, 并对其工艺相关参数条件进行考察, 筛选出最佳的洗脱条件。研究结果表明将10 mg/ml的浓度补骨脂总黄酮超声提取液以2 ml/min的流速, 经过预处理好的ZTC-1大孔吸附树脂动态吸附, 用50%乙醇溶液进行洗脱所得黄酮含量较高, 该洗脱工艺简便易行。
参考文献
[1]谭胜兵.大孔讨脂在天然产物提取分离中的应用.菏泽学院学报, 2007, 29 (2) :81.
[2]刘志祥, 曾超珍.大孔树脂法纯化苦丁茶总黄酮的研究.时珍国医国药, 2009, 20 (9) :2183-2184.
大孔树脂分离法 篇9
大孔吸附树脂是一种多孔性的高分子材料, 具有多孔性和较大的比表面积, 因此具有良好的吸附性能, 尤其在纯化中药化学成分或天然产物活性成分方面具有极大优势[8], 不同型号的树脂由于本身性质的差异而影响纯化的效果。该研究首先通过考察7种不同型号大孔吸附树脂对千斤拔总黄酮的静态吸附与解析性能, 筛选出适合分离千斤拔总黄酮的大孔树脂, 然后探索了该大孔吸附树脂分离纯化千斤拔总黄酮的最佳工艺条件, 拟为千斤拔总黄酮在医药工业中的应用提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 材料
千斤拔购于安徽省亳州市华申药业有限公司, 经吉林大学药学院王广树教授鉴定为豆科植物蔓性千斤拔的根, 大孔脂D101、AB-8、LSA-21、XDA-6、XDA-8、LSA-7、LSA-19购于西安蓝晓科技有限公司, 芦丁对照品 (批号:MUST-12122003) 纯度≥98%, 购于成都曼斯特生物科技有限公司, 甲醇为色谱纯, 购于天津大茂化学试剂厂, 其它试剂均为分析纯。
TU-1810PC型紫外分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任有限公司) 、R-52AA型旋转蒸发仪 (上海亚荣生化仪器厂) 、SHA-B型水浴恒温振荡器 (常州国华电器有限公司) 、SHZ-D型循环水真空泵 (河南巩义市英峪仪器厂) 、DHZ-9075型电热鼓风干燥箱 (上海一恒科学仪器有限公司) 、AUY220型电子天平 (日本岛津) 、BS50-1A型恒流泵 (保定思诺流体科技有限公司) 、PHS-2C型酸度计 (上海精密科学仪器厂) 和CBS-B型自动部分收集器 (上海沪西分析仪器厂) 。
1.2 方法
1.2.1 供试品溶液的制备
称取适量千斤拔药材, 粉碎, 过40目筛, 依次加入15倍量70%乙醇回流提取, 提取3次, 每次2h, 合并提取液, 过滤, 滤液减压回收乙醇至无醇味, 浓缩液加水稀释, 静置, 滤去不溶性物质, 将滤液以蒸馏水定容, 即得千斤拔供试品溶液。
1.2.2 标准曲线的建立
精密称取芦丁对照品 (105℃干燥至恒重) 5.0 mg于50 mL容量瓶中, 以65%乙醇超声溶解, 稀释至刻度, 摇匀得对照品溶液 (0.1mg·mL-1) 。精密吸取对照品溶液2.0、4.0、6.0、8.0、10.0和12.0 mL, 分别置于25mL容量瓶中, 分别加5%亚硝酸钠0.3mL, 摇匀, 放置6min, 加入10%硝酸铝溶液0.3mL, 摇匀, 放置10 min, 加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液1.0mL, 用65%乙醇定容, 摇匀, 静置20min后, 以相应溶剂为空白对照液, 采用分光光度法在510nm处测吸光度A[9], 以吸光度A为纵坐标, 质量浓度C为横坐标, 绘制标准曲线, 得回归方程:A=11.87C-0.015 6, R=0.999 6, 表明吸光度与浓度在0.008~0.048 mg·mL-1范围内线性关系良好。
1.2.3 总黄酮纯度的测定
定量取上样液或洗脱液, 按1.2.2方法测定吸光度, 计算总黄酮质量浓度, 将该样品液真空干燥后得固体干膏[10]。按公式 (1) 计算总黄酮纯度P。
其中:P为固体干膏中总黄酮的纯度;CS为样品溶液中总黄酮的浓度 (mg·mL-1) ;VS为样品溶液体积 (mL) ;MS为固体干膏的质量 (mg) 。
1.2.4 树脂的预处理
分别取试验用7种型号的树脂, 用95%乙醇浸泡过夜, 倾去漂浮物后湿法装柱, 用95%乙醇以1BV流速通过树脂层, 洗至流出液按1∶2体积比加蒸馏水不变浑浊为止, 用蒸馏水以同样流速洗至树脂无醇味为止, 树脂以蒸馏水浸泡备用。
1.2.5 树脂的筛选
分别以比吸附量和解析率为考察指标, 进行树脂型号的筛选。称取预处理好的树脂D101、AB-8、LSA-21、XDA-6、XDA-8、LSA-7、LSA-19各2.0g, 加入到100mL具塞三角瓶中, 加入总黄酮质量浓度为1.57mg·mL-1的千斤拔总黄酮提取液40mL, 25℃恒温水浴振荡24 h, 过滤, 分别吸取各树脂吸附后的溶液1.0mL置于50mL容量瓶中, 65%乙醇定容, 按1.2.2方法测定吸光度, 按公式 (2) 计算各树脂的吸附量[11];将过滤后各型号树脂表面用滤纸吸干, 以100mL 95%乙醇进行解析, 25℃恒温水浴振荡24h, 过滤, 分别吸取各树脂解析后的溶液2.0mL置于50mL容量瓶中, 以65%乙醇定容, 按1.2.2方法测定吸光度, 按公式 (3) 计算各树脂的解析率。7种树脂在相同条件下, 经过24h的静态吸附及解析, 求得静态比吸附量和解析率。
其中:A为比吸附量 (mg·g-1) ;C0为千斤拔总黄酮样品液中总黄酮的质量浓度 (mg·mL-1) ;C1为吸附24h后千斤拔总黄酮样品液中总黄酮的质量浓度 (mg·mL-1) ;V0为千斤拔总黄酮样品液体积 (mL) ;V1=V0;W为称取树脂质量 (g) 。
1.2.6 吸附条件的选择
一般认为影响吸附效率的主要因素有上柱液浓度、pH、流速及吸附温度等, 该试验主要考察上样液浓度、pH、流速对吸附的影响, 并绘制动态吸附曲线 (泄漏曲线) , 最终确定最佳吸附条件。
1) 上样液质量浓度对吸附的影响。取不同质量浓度的千斤拔总黄酮上样液 (3.207 2、1.603 6、0.801 8、0.534 5、0.320 7mg·mL-1) 以1.5 mL·min-1的流速分别连续通过装柱体积为30mL的AB-8树脂柱 (20mm×300mm) 进行动态吸附, 利用自动部分收集器收集流出液, 用紫外分光光度法检测。
2) 上样液pH对吸附的影响。取质量浓度为1.603 6mg·mL-1的千斤拔总黄酮上样液6份, 每份100mL, 分别调节pH至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0, 以1.5 mL·min-1的流速分别通过装柱体积为30 mL的AB-8树脂柱 (20 mm×300mm) , 进行动态吸附, 利用自动部分收集器收集流出液, 用紫外分光光度法检测。
3) 上样液流速对吸附的影响。取pH 5.0, 质量浓度为1.603 6mg·mL-1的千斤拔总黄酮上样液100 mL, 分别以1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mL·min-1的流速分别通过装柱体积为30mL的AB-8树脂柱 (20mm×300mm) , 进行动态吸附, 利用自动部分收集器收集流出液, 采用紫外分光光度法检测。
4) 动态吸附曲线的确定。按所确定的吸附条件, pH5.0, 质量浓度为1.603 6mg·mL-1的千斤拔总黄酮上样液, 以2.0mL·min-1的流速通过装柱体积为30 mL的AB-8树脂柱 (20 mm×300mm) , 利用自动部分收集器收集流出液, 采用紫外分光光度法对流出液进行检测[12]。
1.2.7 解析条件的选择
分别对影响解析的洗脱剂浓度和洗脱剂流速进行考察, 绘制洗脱曲线, 最终确定最佳解析条件。
1) 洗脱剂浓度的选择。取千斤拔总黄酮质量浓度为1.603 6mg·mL-1的上样液100 mL, 以2.0mL·min-1流速通过装柱体积为30 mL的AB-8大孔吸附树脂柱 (20 mm×300 mm) , 进行动态吸附, 吸附完全后, 依次用蒸馏水、10%、30%、50%、70%、95%乙醇各210mL以1.5mL·min-1流速进行梯度洗脱, 利用自动部分收集器收集各部分洗脱液, 紫外分光光度法测定吸光度, 计算洗脱率[13]。
2) 洗脱流速的确定。取已处理好的AB-8型大孔树脂5份, 湿法装柱 (20mm×300mm) , 控制柱体积为30mL, 各加入pH为5.0, 质量浓度为1.603 6 mg·mL-1的千斤拔总黄酮上样液100mL, 以2.0mL·min-1的流速通过树脂柱, 进行动态吸附, 吸附饱和后, 先用蒸馏水洗至流出液无色, 再用210 mL 30%乙醇洗至无色, 最后用210mL 70%乙醇溶液分别以1.0、1.5、2.0、2.5和3.0mL·min-1的流速进行洗脱, 利用自动部分收集器收集洗脱液, 用紫外分光光度法进行检测, 计算各洗脱流速下的洗脱率。
3) 洗脱曲线的确定。按所确定的吸附和解析条件, 取千斤拔总黄酮上样液 (总黄酮质量浓度为1.603 6mg·mL-1) 240mL, 调节溶液pH至5.0, 以2.0mL·min-1流速通过装有柱体积约为30mL的AB-8大孔吸附树脂柱 (20mm×300mm) , 进行动态吸附, 吸附饱和后, 先用蒸馏水洗至无色, 再用30%乙醇洗至无色, 后用70%乙醇以1.5mL·min-1流速进行充分洗脱, 利用自动部分收集器收集洗脱液, 测定其中总黄酮含量, 绘制洗脱曲线图。
1.2.8 验证试验
取上样液质量浓度相当于原生药质量浓度为0.12g·mL-1的上样液240mL, 调节pH5.0, 以2.0mL·min-1流速连续通过装柱体积为30 mL的AB-8大孔吸附树脂柱 (20mm×300mm) , 吸附平衡后, 先用蒸馏水洗至无色, 再用30%乙醇洗至无色, 后用210mL的70%乙醇以1.5mL·min-1流速进行充分洗脱, 收集洗脱液, 减压浓缩回收溶剂, 水浴蒸干, 真空干燥得干浸膏, 称重, 按1.2.2方法测定吸光度, 计算浸膏中总黄酮纯度。结果表明上样液制成的膏状物中千斤拔总黄酮含量为31.26%, 而经大孔树脂分离纯化后的洗脱液制成的膏状物中千斤拔总黄酮含量为65.78%。
2 结果与分析
2.1 树脂的筛选
从表1可知, 7种不同型号树脂对千斤拔总黄酮的吸附能力差异很大, 其中对千斤拔总黄酮比吸附量最高的树脂是LSA-21, 其次为AB-8型树脂, XDA-6型树脂的比吸附量最低;而由解析率测定结果可以看出, LSA-21型大孔树脂的解析率只有62.39%, 小于AB-8型大孔树脂的93.65%, 综合考虑选择AB-8型大孔树脂进行千斤拔总黄酮的分离纯化。
2.2 吸附条件的选择
2.2.1 上样液质量浓度对吸附量的影响
从图1可以看出, 树脂的吸附量随上样浓度增大呈现先增大后减小的趋势, 当上样液浓度为1.603 6mg·mL-1时, 树脂的吸附量达到最大, 上样液浓度继续增大, 树脂的吸附量反而降低, 可能是由于上样液浓度过大导致树脂泄漏加快, 因此最佳上样液浓度选择1.603 6 mg·mL-1, 相当于原生药质量浓度为0.12g·mL-1。
2.2.2 上样液pH对吸附量的影响
由图2可知, 当上样液pH为5.0时, 树脂的吸附量最大;pH>5时, 吸附量随pH增大而逐渐减小, 可能是由于黄酮类化合物分子上的酚羟基逐渐与溶液中的OH-反应形成离子, 从而不容易被树脂吸附;pH<5时, 吸附量随pH减小而降低, 可能是由于溶液酸性太强, 黄酮类化合物容易转化成佯盐而不易被树脂吸附, 因此适当的酸性环境有利于千斤拔总黄酮化合物的吸附, 故选定上样液pH为5.0。
2.2.3 上样液流速对吸附率的影响
由图3可知, 随着上样液流速的增大, 总黄酮的吸附率降低, 主要原因是树脂的泄漏随上样液流速增大而加快;但如果流速过慢, 工作效率大大降低。因此, 在保证目标成分被充分吸附的同时兼顾工作效率, 确定2.0mL·min-1为最佳上样液流速。
2.2.4 动态吸附曲线的确定
从图4可以看出, 30mL AB-8树脂可处理3BV柱体积, 即90mL的千斤拔总黄酮上样液而不发生泄漏。此时树脂床共吸附千斤拔总黄酮144.3mg, 湿态AB-8大孔吸附树脂对千斤拔总黄酮的吸附量为4.81mg·mL-1。树脂床达到吸附饱和时可处理8BV, 即240mL的千斤拔总黄酮上样液, 湿态饱和吸附量为12.83mg·mL-1。
2.3 洗脱条件的选择
2.3.1 洗脱剂浓度的选择
从图5可知, 水洗的洗脱率为3.7%, 各浓度乙醇洗的洗脱率分别为0.5%、2.38%、25.7%、64.69%和0.83%。因此, 蒸馏水和低浓度的乙醇只能将少量千斤拔总黄酮洗脱下来, 而浓度为50%和70%的乙醇洗脱完后, 总洗脱率可以达到90%以上, 故选用70%乙醇作为最佳洗脱剂。
2.3.2 洗脱流速的确定
由图6可知, 洗脱率随洗脱流速增大呈现逐渐减小的趋势, 可能是因为洗脱流速太大, 洗脱剂分子来不及与被吸附物质分子相互作用就已流出色谱柱;但流速太慢, 工作效率低, 综合考虑, 最佳洗脱流速选择1.5mL·min-1。
2.3.3 洗脱曲线的确定
从图7可以看出, 当洗脱液体积达到7BV柱体积, 即210mL时, 基本能把树脂吸附的千斤拔总黄酮洗脱完全。
2.4 工艺验证试验结果
为了验证上述工艺的稳定性, 进行3次验证性。试验结果表明, 采用AB-8大孔树脂分离纯化千斤拔总黄酮的最佳工艺条件为:上样液质量浓度相当于原生药质量浓度为0.12g·mL-1, 最大上样量为12.83mg·mL-1, 上样液pH5.0, 上样流速为2.0mL·min-1, 洗脱液乙醇体积分数为70%, 洗脱剂用量为7BV, 洗脱流速为1.5mL·min-1。
3 结论
大孔树脂分离法 篇10
大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂,具有选择性好、吸附量大、吸附速率快、机械强度高、易再生等优点,已被广泛运用于天然产物黄酮类化合物的分离纯化[10,11,12]。目前关于两种及多种树脂混用在天然产物分离纯化上的运用研究已有相关报道[13,14,15],而关于大孔树脂在竹叶黄酮类化合物的分离纯化的研究多为单一树脂的研究,未见多种树脂的混用技术的研究报道。
本研究采用大孔树脂混用技术,在8 种大孔吸附树脂中选取两种进行混合,对竹叶黄酮进行分离特性的研究,分离纯化效果好,样品中黄酮纯度得以大大提高,为竹叶黄酮的纯化提供了新方法,具有较好的应用价值,对竹叶资源的利用具有重要意义。
1 实验
1. 1 材料、试剂与仪器
竹叶采于2013 年贵州赤水,并通过自然风干,备用。
芦丁标准品( 中国食品药品检定研究院; 批号: 100080 -201409) ; 氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚、乙醇、甲醇、盐酸均为国产分析纯; 大孔吸附树脂( D101 - 1、D101、AB - 8、DM130、DM301、ADS - 17、S - 8) 来自安徽三星树脂有限公司、NKA - 9 来自沧州宝恩树脂有限公司。
恒温水浴锅、旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂; SHB -IV循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司; HH - 4数显恒温水浴锅,常州澳华仪器有限公司; 恒温循环器,北京博医康实验仪器有限公司; JC - 100 恒温培养振荡器,上海精旭实业有限公司; 酒精计,河北省武强县同辉仪表厂; JF1204电子分析天平,余姚市金诺天平仪器有限公司; 101 - 1AB电热鼓风干燥箱,天津市泰斯特仪器有限公司; UV - 6100S紫外/ 可见分光光度计,上海美谱达仪器有限公司; 雷磁PHS -25p H计,上海仪电科学仪器股份有限公司; 玻璃层析柱。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 竹叶黄酮提取方法
取干燥未粉碎的竹叶,先按料液比1∶20( g/m L) 加入50%乙醇提取一次分离固液后,再以料液比1∶15( g/m L) 进行二次提取. 合并两次提取液,醇沉过夜以除去糖类、蛋白质等,浓缩至一定浓度,备用。
1. 2. 2 树脂处理方法
先用体积分数95% 乙醇溶液充分浸泡过夜,然后用无水乙醇洗至洗出液加适量水后无白色浑浊,再用去离子水洗至洗出液无醇味,转入酸碱处理,用4 BV的5% HCL溶液以5 BV/h流经层析柱后浸泡3 h,然后用去离子水洗至p H值为中性,用4 BV的5% Na OH溶液以5 BV / h流经层析柱后浸泡3 h,然后用去离子水洗至p H值为中性,浸泡于95% 乙醇中备用,使用前用水洗至无醇味。
1. 2. 3 竹叶黄酮的测定方法
1. 2. 3. 1 标准曲线的绘制
由于芦丁和黄酮类化合物都是以2 - 苯基色原酮为母核,具有相同的吸光度测试性质,故用芦丁为标准品,采用Na NO2- Al ( NO3)3- Na OH比色法测定总黄酮含量[16]。精确称量0. 0150 g芦丁标准品,置于100 m L容量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀得浓度为0. 15 mg/m L的标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0 m L、1. 0 m L、2. 0 m L、3. 0 m L、4. 0 m L、5. 0 m L、6. 0 m L、7. 0 m L于25 m L具塞比色管中,用30% 乙醇补齐至10 m L,加0. 7 m L 5% Na NO2溶液摇匀放置5 min后,加入0. 7 m L 10% Al( NO3)3溶液摇匀6 min后,再加入5 m L 1 mol/L Na OH溶液,摇匀,用30% 乙醇定容至刻度。静止15 min后置于分光光度计于510 nm处测吸光度A,记录数值。以吸光度为纵坐标,芦丁质量浓度为横坐标,绘制标准曲线,所得线性标准回归方程为y = 11. 66071x + 0. 00186,相关系数R2=0. 99972。
1. 2. 3. 2 样品含量及纯度的测定
取一定量待测试样溶液,按绘制标准曲线的步骤,于510 nm处测定吸光度,根据标准曲线方程计算样品黄酮浓度。
竹叶黄酮精制后于50 ℃ 条件放置烘箱干燥至恒重,取精制产品100 mg,用30% 乙醇溶解并定容至100 m L,摇匀待测其黄酮浓度。
1. 2. 4 单一大孔吸附树脂的筛选
1. 2. 4. 1 静态吸附与解吸实验
准确称取1 g已处理好的8 种吸附树脂( 用滤纸吸干后称重)装入100 m L锥形瓶中,精密加入30 m L质量浓度0. 8 mg/m L竹叶黄酮样品溶液,于25 ℃ 下置恒温培养振荡器中振荡吸附24 h,过滤,测定剩余黄酮的质量浓度,按式( 1) 、( 2) 计算吸附量和吸附率; 吸附后的树脂用滤纸吸干后加入30 m L的95%乙醇,在25 ℃ 下置恒温培养振荡器中振荡解吸24 h,过滤测定洗脱液中黄酮质量浓度,按式( 3) 、( 4) 计算其解吸率。
1. 2. 4. 2 静态吸附与解吸动力学实验
根据1. 2. 4. 1 结果所示,选择其中2 种较理想的树脂进行静态吸附与解吸动力学实验。按1. 2. 4. 1 的方法,每隔1 h取样检测,测定其中吸附液剩余黄酮浓度,以树脂对黄酮的吸附量与时间作图,绘制大孔树脂静态吸附动力学吸附曲线及静态动力学解吸曲线。
1. 2. 5 混合大孔吸附树脂比例的筛选
将上述两种效果较好的树脂以一定质量比混合,按1. 2. 4. 1 的方法,于25 ℃ 下置恒温培养振荡器中振荡吸附5 h,解吸4 h,按公式( 1) ~ ( 4) 计算吸附量、吸附率和解吸率。筛选出最优树脂混合比例。
1. 2. 6 混合大孔吸附树脂静态吸附、解吸实验
1. 2. 6. 1 上样液质量浓度对吸附效果的影响
各取30 m L上样液质量浓度分别为0. 4 mg/m L、0. 8 mg/m L、1. 2 mg / m L、1. 6 mg / m L、2. 0 mg / m L的竹叶总黄酮提取液。加入1 g树脂( AB - 8∶D101 - 1 = 1∶2) ,于25 ℃ 下恒温振荡吸附5 h,取一定量上层清液按绘制标准曲线的方法测定其总黄酮浓度,计算其吸附率和吸附量。
1. 2. 6. 2 洗脱液体积分数对解吸率的影响
将吸附饱和的1 g树脂( AB - 8∶D101 - 1 = 1∶2) 用滤纸吸干后,分别加入体积分数为40% 、50% 、60% 、70% 、80% 、90% 乙醇各30 m L。下同1. 2. 6. 1,计算其解吸率。
2 结果与讨论
2. 1 单一大孔吸附树脂的筛选
2. 1. 1 静态吸附与解吸实验
竹叶黄酮具有一定的酚羟基且有一定的极性,而大孔吸附树脂是种表面吸附剂,吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质,即树脂的极性( 功能基) 和空间结构( 孔径、比表面积、孔容等) ,由于不同树脂结构性质的不同,从而对竹叶黄酮树脂的吸附解吸难易程度不同。由表1 可知,如D101 - 1 型树脂吸附效果较好,吸附率达到71. 04% ; S - 8 型树脂虽然吸附效果最好,但是其解吸效果较低; 而解吸率最高的是AB - 8 型树脂达95. 07% 。综合考虑黄酮的吸附率、解吸率,本实验拟采用D101 - 1 和AB - 8 两种树脂按一定比例混合,筛选出对竹叶黄酮分离纯化效果更好的树脂混合比例。
2. 1. 2 静态吸附与解吸动力学实验
分别考察其静态吸附解吸动力学特性,结果如图1、图2所示,D101 - 1 与AB - 8 两种大孔树脂能够达到快速吸附与解吸平衡,在5 h时,D101 - 1 与AB - 8 的吸附量分别是15. 37mg / g和15. 09 mg / g,基本达到吸附平衡; 在4 h时,D101 - 1 与AB - 8 的洗脱液浓度分别是0. 490 mg / m L和0. 487 mg / m L,基本达到解吸平衡。
2. 2 混合大孔吸附树脂比例的筛选
大孔树脂对竹叶黄酮的吸附作用与其空间结构和功能团息息相关,考虑到不同树脂的协同作用和空间结构参数的不同,通过不同比例树脂的混合,混合树脂的空间结构和功能团有所差异。由表2 可知,当两种树脂以一定比例混合时,其不同的吸附率和解吸率作为判断对竹叶黄酮分离纯化效果的标准,当AB - 8∶D101 - 1 = 1 ∶2 时,吸附率与解吸率均较高所以选择以此比例混合后对竹叶黄酮进行分离纯化。
2. 3 不同条件下混合大孔吸附树脂对竹叶黄酮纯化工艺的实验
2. 3. 1 上样液质量浓度对吸附效果的影响
大孔树脂对竹叶黄酮溶液吸附过程是一种液固吸附过程,而液固之间的吸附不仅存在吸附剂与溶质之间的作用,还存在溶质- 溶质、溶质- 溶剂、溶剂- 吸附之间的作用[17]。由图3可知,随着上样液浓度的增加,吸附率逐渐降低,吸附量逐渐增大。综合考虑黄酮的吸附率与树脂的吸附量,选择最适上样液浓度为1. 2 mg/m L。
2. 3. 2 洗脱剂体积分数对解吸率的影响
常用的洗脱剂多为甲醇、乙醇、丙酮等,由于乙醇安全、无毒、易回收等优点,本实验选择乙醇作为洗脱剂,通过静态吸附解吸实验,吸附5 h后,考察不同乙醇体积分数对竹叶黄酮分离纯化的影响,如图4 所示。从图4 中可以看出,随着乙醇体积分数的增加,解吸率先增加后减少,在70% 时解吸率达到最大值90. 81% 。当体积分数大于70% 时解吸率降低,这是由于当乙醇浓度过高时,醇溶性杂质增加,降低洗脱液中黄酮纯度。
2. 3. 3 最佳上样体积的确定
取1. 2 mg/m L竹叶黄酮提取液,以2 BV/h流经层析柱。每0. 5BV为一收集段收集流出液,测定其黄酮质量浓度,绘制其泄漏曲线如图5 所示。流出液黄酮浓度随着上样量的增加而增加,则吸附率逐渐降低; 而上样量过少时,树脂的吸附量减小,树脂利用率降低。综合考虑树脂的吸附率与树脂的吸附量,选择3. 5 BV为最佳上样量体积。
2. 3. 4 最佳上样流速的确定
上样液通过树脂床的流速对树脂的吸附效率及生产效率均有着一定的影响。本实验通过控制不同流速考察对吸附效果的影响,将树脂( AB - 8∶D101 - 1 = 1∶2) 装柱,竹叶黄酮上样量浓度1. 2 mg/m L,上样量3. 5 BV,分别以1 BV/h、2 BV/h、3 BV / h、4 BV / h、5 BV / h的流速流经层析柱,测定吸附过程中流出液的黄酮质量浓度,计算黄酮吸附总量。结果如图6所示。随着上样流速的增加,吸附量降低,反之,流速降低,有利于总黄酮的吸附,但会影响生产效率,增加吸附时间,生产周期和成本增加。综合考虑树脂的处理量和黄酮的利用率,选择2 BV/h为最佳上样流速。
2. 3. 5 最佳洗脱体积的确定
按确定的最佳吸附条件上柱,用1 BV水洗去水溶性杂质,再用70% 乙醇作为洗脱剂以2 BV/h的流速洗脱,每0. 5 BV作为一收集段收集洗脱液,检测其中总黄酮质量浓度,绘制洗脱曲线如图7 所示。当洗脱体积达到4 BV时,洗脱液中黄酮浓度接近于0,考虑到洗脱效率与洗脱剂用量,选择4 BV为最佳洗脱体积。
2. 3. 6 最佳洗脱流速的确定
按确定的吸附条件上柱,先用1 BV水洗去水溶性杂质,用4 BV的70% 乙醇分别以1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h、5 BV / h的速度进行洗脱。测定洗脱液总黄酮质量浓度计算解吸率,如图8 所示。不同的流速对其解吸效果影响不大,考虑洗脱时间不至于过长,选用2 BV/h为最佳洗脱流速。
2. 4 混合树脂纯化工艺验证实验
上样条件: 上样质量浓度1. 2 mg/m L,上样量体积3. 5 BV,上样流速2 BV/h; 洗脱条件: 洗脱剂体积分数70% ,4 BV洗脱剂体积,洗脱流速2 BV/h。以此条件对竹叶黄酮进行精制,收集洗脱液经旋转蒸发器浓缩后烘干。测得其黄酮纯度为28. 16% ,与纯化前黄酮纯度8. 46% 相比,纯度为原来的3. 3倍。纯化效果显著。
3 结论
在8 种大孔吸附树脂中选取两种( D101 -1 与AB -8) ,采用混用技术进行分离纯化竹叶黄酮工艺条件考察,结论如下: D101- 1 与AB - 8 以2∶1 比例混合,上样液质量浓度1. 2 mg / m L、上样量为3. 5 BV、上样流速2 BV/h条件下上柱吸附、洗脱剂体积分数70% 、洗脱体积4 BV、洗脱流速2 BV/h的条件下进行洗脱。比较纯化前后黄酮纯度,较纯化前8. 46% ,纯化后黄酮纯度为28. 16%,纯度为原来的3. 3 倍。大孔树脂混用技术为竹叶黄酮的纯化提供了新方法,具有较好的应用价值。
摘要：采用大孔树脂混合使用技术,用于分离纯化竹叶黄酮的工艺研究。通过研究8种大孔树脂对竹叶黄酮的静态吸附与解吸实验,筛选出两种较好的树脂D101-1和AB-8,采用混用技术进行实验,结果表明:D101-1与AB-8的最优混合比例为2:1;上样液质量浓度1.2 mg/m L、上样量为3.5 BV、上样流速2 BV/h为最佳上样条件,洗脱剂体积分数70%、洗脱体积4BV、洗脱流速2 BV/h的条件下进行洗脱。在此条件下进行纯化实验,分离纯化效果最好,样品中黄酮纯度由原来的8.46%上升至28.16%。
大孔树脂分离法 篇11
近年来,随着大孔树脂在天然产物活性成分分离纯化方面的应用日益广泛,由于其具有优良的纯化效果及可反复再生使用和低成本的应用特点,因此非常适合于大生产要求。本文采用大孔吸附树脂法,对芥子中的黑芥子苷分离纯化工艺进行研究。
1 仪器与材料
1.1 仪器
Agilent 1 200 L高效液相色谱仪,安捷伦科技有限公司生产;Mettler Toledo al 204电子天平,瑞士梅特勒公司生产;R-205B旋转蒸发仪,上海申生生物技术公司生产;pHtestr30笔试pH机,上海必发生科技有限公司生产。
1.2 试剂
大孔树脂D101,西安蓝晓公司生产;AB-8,南开大学化工厂生产;XAd-4,美国罗门哈斯公司生产;HP-20,日本三菱化学公司生产,黑芥子苷标准品(99%),SIGMA公司生产;甲醇为色谱纯,其体试剂为分析纯,广州西陇化工有限公司生产。
1.3 实验原料
芥子籽,由桂林毕生药业有限公司提供。
2 高效液相色谱分析方法
2.1 色谱条件
色谱柱碳十八柱(ODS/C18)(250 mm×4.6 mm),检测波长为228 nm,流动相为水(含0.1%H3P04):乙腈(97:3,V/V),流速为0.7 mL/min,柱温为25℃。
2.2 高效液相HPLC检测法
取黑芥子苷标准品12.5 mg,用30%甲醇25 mL完全溶解。采用逐级稀释法,取此溶液5 mL加30%甲醇至10 mL,取10mL中的5 mL加30%甲醇至10 mL,取前次的2 mL加30%甲醇至10 mL,取第4次2 mL加30%甲醇至10mL,混合均匀后,用高效液相检测。以峰面积Y与标准溶液的质量百分比浓度X,做回归方程Y=6.3307X-31.509R2=0.999 7,表明黑芥子苷浓度在5～100 mg/L范围内有良好的线性关系。
2.3 样品检测
取样品溶液,稀释到一定体积后,用高效液相色谱测定,通过回归方程计算黑芥子苷的浓度。
3 实验方法
3.1 吸附原液制备
取芥子籽5 kg,依次加入40 L、35 L 70%的乙醇,回流提取2次,过滤,合并提取液,减压浓缩,喷雾干燥,混匀,得提取物1 kg。经测定,含黑芥子苷15%(干计)。临用前,取上述芥子提取物适量,加纯水,根据需要含量制成固体含量为5%～10%(质量体积百分数)的水溶液,作为吸附原液。
3.2 树脂的预处理
树脂先用乙醇浸泡溶胀24 h,湿法装柱,用95%乙醇洗脱,至流出液加5倍量纯水不变成白色混浊为止。再用大量的纯水洗尽柱内乙醇,然后依次用3倍量树脂体积的5%盐酸、纯水、4%氢氧化钠浸泡,流过树脂,最后用大量的纯水洗至流出的水呈中性,备用。
3.3 吸附树脂的筛选
准确量取预处理的4种树脂各350 mL,分别装入直径为45 mm的玻璃柱,各取上柱量为2 000 mL 8%的吸附原液,速度为6.0～6.5 mL/min,用800 mL纯水以相同的速度洗脱,上柱和流出液合并,测定其黑芥子苷的浓度,计算吸附量。然后用70%乙醇800 mL洗脱,得到70%乙醇洗脱液,测定黑芥子苷的浓度,合计流出液的浓度,计算树脂的解析率。将流出液浓缩、干燥,得固体粉末,测定黑芥子苷的含量。筛选最好的树脂。不同树脂对黑芥子苷的吸附和解吸效果见表1。
由表1可知,HP-20树脂的吸附量和解析率都是最好的。含量明显高于其他树脂的含量。故选用HP-20树脂对黑芥子苷的分离纯化工艺进行研究。
3.4 树脂对黑芥子苷的分离效果——吸附
3.4.1 上柱液浓度对吸附效果的影响
取处理好的大孔树脂湿法装柱,将黑芥子苷用水稀释到黑芥子苷浓度分别为498 mg/L、848 mg/L、1 700 mg/L,每柱进样1.5 L溶液,过滤后按2.0 BV/h的速度上柱吸附,用2.5 BV纯水洗脱,分别收集流出液,测定黑芥子苷的含量。上柱液浓度对吸附效果的影响见表2。
由表2可以看出,黑芥子苷的浓度对树脂的吸附影响较大,随着上柱液浓度的升高,黑芥子苷处理量减少,达到1 700 mg/L时,含量和回收率明显下降,说明树脂的吸附能力下降,达到过饱和状态。因此,要达到好的吸附效果,需要降低上柱浓度,如果是498 mg/L,则树脂的处理量减少了。考虑到实际生产中会影响生产效率,本实验采用848 mg/L为最佳的上柱浓度。
3.4.2 上柱液流速对吸附效果的影响
取处理好的大孔树脂湿法装柱,将黑芥子苷用水稀释到黑芥子苷浓度为848 mg/L,过滤后分别按1.0 BV/h、2.0 BV/h、3.0BV/h、4.0 BV/h的速度上柱吸附,用2.5 BV纯水洗脱,分别收集流出液,测定黑芥子苷的含量。上柱液流速对吸附效果的影响见表3。
从表3可以看出,随着流速的增加,流出液的含量明显降低,回收率增高。流速过大,会使树脂的工作交换量下降,从而降低树脂的性能。因此,在实际生产中,操作的流速不宜过大,本实验综合最终产品的含量和生产速度进行考察,选择2.0 BV/h为最佳流速。既保证能实现较高的工作效率,又能保证树脂的黑芥子苷的吸附。
3.4.3 洗脱量对树脂吸附效果的影响
取处理好的大孔树脂湿法装柱,黑芥子苷用水稀释到黑芥子苷浓度为848 mg/L,过滤后分别按2.0 BV/h的速度上柱吸附,分别用1.5 BV、2.5 BV、3.5 BV、4.5 BV的纯水洗脱,分别收集流出液,测定黑芥子苷的含量。洗脱量对树脂吸附效果的影响见表4。洗脱量对树脂的吸附效果的影响图如图1所示。
从图1可以看出,黑芥子苷的含量随着洗脱量的增加而增加,达到2.5 BV后稳定,没有再增高。多洗脱的水,会增加浓缩的生产时间,因此最佳选择为2.5 BV洗脱,可使黑芥子苷含量高、回收率也高,适合大量生产。
4 结论
黑芥子苷的生物活性功能受到越来越多的关注,具有很大的应用前景。通过考察4种大孔树脂(D101,AB-8,XAD-4,HP-20)的吸附情况,比较其性能,确定HP-20大孔树脂作为黑芥子苷分离纯化的介质。通过对HP-20大孔树脂的动态吸附性能进行考察,得到HP-20大孔树脂分离纯化的最佳条件如下:上柱浓度为848 mg/L,上柱速度为2.0 BV/h,水洗脱量为2.5 BV。
实验结果表明,HP-20大孔树脂能有效地纯化芥子中的黑芥子苷,适合工业大规模生产,纯化后产品采用HPLC检查,黑芥子苷含量达到31.50%,呈淡黄色、水溶性好,可满足市场对黑芥子苷的含量要求。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版.一部[M].北京:中国医药科技出版社,2010.
[2]刘月萍,王向阳.黑芥子酶研究进展[J].生物技术通讯,2006(5).