大孔树脂吸附法（共9篇）
大孔树脂吸附法 篇1
摘要：本文对10种大孔吸附树脂进行了筛选, 发现S-8、HPD-400这两种树脂适合于栀子黄色素的分离精制。研究了HPD-400树脂对栀子黄色素的吸附性能, 得到提纯栀子黄色素的最适工艺条件为:吸附流速1.5mL/min、解吸剂为70%的乙醇水溶液、解吸流速1mL/min、解吸剂用量为120mL。经过HPD-400大孔吸附树脂分离精制后, 产品中栀子黄色素OD值达0.32, 色价为470。
关键词：栀子黄色素,分离纯化,大孔吸附树脂
栀子是栀子属(Gardenia)的一种常绿灌木，具有降低胆固醇，凉血解毒的功效，临床上用于治疗黄疸型肝炎、血淋涩痛、火毒疮疡、扭伤等。栀子中黄色素含量高，其主要成分是藏花素(Crocin)和藏花酸(Crocetin)。藏花素是自然界中少见的一种水溶性类胡萝卜素，由于其水溶性好，着色力强，已广泛用于工业染料和食品添加剂中。粗制的黄色素在实际应用中，容易褪色和发生绿变，主要是因为黄色素中的栀子苷和绿原酸与食品中糖化酶和蛋白质的作用，产生蓝色或绿色化合物。当黄色素溶液的OD值(栀子苷在最大吸收波长238nm处的吸光值与藏花素在最大吸收波长440nm处的吸光值之比)小于0.4时，可以避免发生绿变现象。
目前精制栀子黄色素的方法有：超临界CO2流体法、凝胶层析法、聚酰胺层析法、酸碱沉淀法、无机膜提取法等，他们都难以大规模的应用于工业化生产。大孔树脂是一种高聚物吸附剂，吸附速度快、吸附容量大，可反复使用，近年来已成为天然活性成分提取、分离的一种有效手段。本文以精制栀子黄色素为目标，系统研究大孔树脂对栀子黄红色素的吸附和洗脱条件，讨论大孔吸附树脂对栀子黄色素的吸附与解吸特性，以期为工业化生产提供理论参考。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
栀子黄色素粗提液：孝感栀子果磨成粉后，用70%乙醇浸提3次，分离去渣得到的黄色素溶液，吸光值A440nm=0.597;大孔吸附树脂X-5、NCA-9、HPD-100、HPD-400、HPD-500、HPD-600、D-3520、S-8、AB-8、09A7、S-8，各种树脂按说明书要求预处理后备用;栀子黄色素标准品;自动部分收集器及恒流泵;恒温摇床;UV-200-02紫外可见分光光度计;吸附柱：φ(30×3.0)。
1.2 方法
1.2.1 静态吸附率的测定
将10种处理好的树脂分别称1g置于250mL的锥形瓶中，再量取100m L经过适当稀释的栀子黄色素粗提液，加入装有树脂的锥形瓶中，恒温振荡24h达吸附平衡，测吸附前后色素溶液在440nm(栀子黄色素的最大吸收波长)处的吸光度值，并计算静态吸附率。
吸附率=(初始吸光值-吸附后吸光值)/初始吸光值
1.2.2 流速对动态吸附的影响
取一定量处理好的HPD-400树脂，湿法装柱，并以不同的流速，让栀子黄色素粗提液上柱吸附，每6mL测一次流出液在440nm处的吸光度值，达到泄漏点时(流出液的吸光值为上样液吸光值的10%)停止进样，计算吸附量(以总A440nm计)。
吸附量=上样液A440nm×流出液体积。
1.2.3 pH值对动态吸附的影响
取6份5mL栀子黄色素粗提液，每份稀释至200mL，分别装入250mL烧瓶，用柠檬酸溶液(10g柠檬酸加入90mL蒸馏水)和碳酸氢钠溶液(10g碳酸氢钠加入90mL蒸馏水)调节各烧瓶内栀子黄色素粗提液的pH值，分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0作为上样液备用。将上样液以1.5mL/min速度上柱吸附，计算吸附量。
1.2.4 乙醇浓度对动态解吸的影响
取6份5mL栀子黄色素粗提液，每份稀释至200mL，分别上柱吸附，1h后吸附饱和;先用蒸馏水冲洗，然后用不同浓度的乙醇以1mL/min的速度进行洗脱，收集流出液，测定其吸光值。
1.2.5 测定栀子黄色素的色价
调整样品浓度为1%，用1cm的比色皿，测定其在440nm波长处的吸光度，测定结果即为栀子黄色素的色价值，用E1%1cm表示。
1.2.6 栀子黄色素的定量分析方法
由于栀子的乙醇溶液中藏红花素、栀子苷、绿原酸的最大吸收波长分别为440、238、325nm，根据朗伯比尔定律：吸光度值在一定范围内与溶液浓度呈正比，以此进行定量分析。测定标品藏红花素(70%的乙醇为溶剂)溶液在440nm处的吸光度值A，以其为横坐标，相应的浓度C为纵坐标作图，得到标准曲线为C=0.0266A+0.0001 (r=0.9999)线性范围：0.0084～0.0196mg/mL。
2 结果与讨论
2.1 树脂静态吸附率的测定
由表1可知：S-8、HPD-400、09A7、AB-8、HPS-500、X-5对黄色素的吸附率较高，对黄色素的吸附能力很强，其中以S-8、HPD-400的吸附率分别达到97.82%、96.98%为最佳效果，而实际操作中S-8难洗脱，故选择HPD-400为吸附剂，并系统研究其对栀子黄色素的吸附和解吸情况。
2.2 流速对动态吸附的影响
取一定量处理好的树脂装柱，以不同的流速，将栀子黄色素粗提液上柱吸附，吸附饱和后，测定达到泄漏点(吸附饱和)时树脂的吸附量，考察不同流速对吸附量的影响，结果见表2。
由表2可知：当上样速度为0.5mL/min时，吸附量最高，吸附效果最好;当速度大于0.5mL/min时，吸附量依次下降，流速大于1.5mL/min后，吸附量急剧下降，同时，实际生产中流速还影响到生产效率的高低，流速越小，效率越低，并且流速过小时，吸附时间延长，且树脂再生困难，树脂寿命降低，因此，我们选择流速为1.5mL/min。
2.3 p H值对动态吸附的影响
将不同p H值的黄色素粗提液上柱吸附，用小试管接流出液，每管6mL，测定其吸光度，考察不同p H值条件对动态吸附的影响。由表3可知：不同p H值条件下各吸附量的变化很小，说明p H值对动态吸附的影响很小。
2.4 乙醇浓度对解吸的影响
分别用不同浓度的乙醇，对吸附饱和之后的树脂进行解吸。考虑到HPD-400树脂吸附栀子黄色素的同时，也吸附栀子苷和绿原酸，先用蒸馏水冲洗，然后采用不同浓度的乙醇溶液进行的梯度洗脱。由表4可知：当乙醇浓度大于40%以后，解析液的吸光度处于上升趋势。乙醇浓度达到80%时，解析液的吸光度最高，解析效果最好。乙醇浓度大于80%后，解析液的吸光度开始下降，说明解吸效果变差，因此本研究采用80%乙醇作为洗脱溶液。
2.5 流速对解吸效果的影响
本试验用80%的乙醇，以0.5、1.0、1.5和2.0mL/min流速，分别考察其对解吸效果的影响。由图1可知：流速越低，洗脱剂与树脂和色素之间作用的时间越长，解吸越充分;流速越高，图像变宽，吸光度降低，说明洗脱效果变差，同时所需的洗脱剂增多;当流速为0.5mL/min时，洗脱高峰比较集中，所需的洗脱剂少，曲线上升、下降的斜率非常大，不存在拖尾，能很好地解吸被树脂HPD-400吸附的栀子黄色素。兼顾生产效率，解吸时采用1mL/min的流速较好。洗脱液用量为120mL时即可解吸完全。
2.6 HPD-400树脂对栀子黄色素的分离纯化效果
栀子果中含有丰富的黄色素，采用70%的乙醇提取，浓缩后可直接制得色素粉，作为色素使用。由于其中含有的栀子苷、绿原酸易和制品中的蛋白质等成分作用，实际应用时易发生绿变现象，影响使用效果。
采用上述分离条件对栀子黄色素粗提液进行纯化，测定纯化前的粗提液与解吸所得洗脱液干物质中栀子黄色素的含量(以藏花酸计)，结果发现，栀子黄色素粗提液中为37.8%，洗脱液中为92.5%，总回收率为60.3%，所得黄色素OD由2.37降到0.32、色价达到470。初步测定，纯化后的色素，能有效避免绿变现象。
3 结论
在所研究的10种大孔吸附树脂中，S-8、HPD-400这两种树脂具有较大的吸附容量，由于S-8难洗脱，故本试验选择HPD-400对栀子黄色素进行分离纯化。通过动态吸附与解析试验得到最佳工艺参数为：上样速度1.5mL/min、洗脱剂为80%的乙醇水溶液、洗脱速度1mL/min、洗脱剂用量为120mL。栀子黄色素粗提液经过HPD-400大孔吸附树脂分离精制后，OD值达0.32，色价为470，适合应用于工业生产中。
参考文献
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大孔树脂吸附法 篇2
大孔吸附树脂纯化草珊瑚总黄酮的工艺条件
利用静态吸附和动态吸附的方法对大孔吸附树脂纯化草珊瑚Sarcandra glabra总黄酮的`工艺条件进行研究,以得到高纯度的草珊瑚总黄酮.结果表明,AB-8树脂对草珊瑚总黄酮有较好的吸附和解吸效果,最优工艺条件为:草珊瑚总黄酮上样液的质量浓度为4mg/mL,速率为2mL/min,草珊瑚总黄酮的最大吸附量为8mg/mL,洗脱剂为70%乙醇,洗脱速率为2mL/min,洗脱剂用量为3BV,草珊瑚总黄酮的回收率为88.92%,按此工艺条件纯化后的草珊瑚总黄酮纯度达64.71%.
作 者：邵佳 蔡立 郁建平SHAO Jia CAI Li YU Jian-ping 作者单位：贵州大学,生化营养研究所,贵州,贵阳,550025刊 名：山地农业生物学报 ISTIC英文刊名：JOURNAL OF MOUNTAIN AGRICULTURE AND BIOLOGY年，卷(期)：27(1)分类号：Q946.83 Q949.732.406关键词：草珊瑚 总黄酮 纯化 大孔吸附树脂 吸附量
大孔树脂吸附法 篇3
【关键词】雪人参；大孔吸附树脂；α-葡萄糖苷酶抑制物质
【中图分类号】R2842【文献标志码】 A【文章编号】1007-8517（2016）18-0017-04
近年来，糖尿病发病率逐年增大，已成为继肿瘤和心脑血管疾病后的第三大慢性疾病，因此侧重长期治疗且措施个体化，以达到控制病情、防止或减少并发症的目的[1]。而传统降糖药物对血糖的控制并不理想[2]。临床研究表明，α-葡萄糖苷酶抑制剂是一类新型口服降糖药物[3]，可以缓解高胰岛素血症和防治餐后高血糖症，还可以减少血糖波动对机体器官的损伤，提高糖耐量，具有非常广阔的应用前景。近年开发的伏格列波糖和米格列醇等作为治疗Ⅱ型糖尿病的首选药和Ⅰ型糖尿病的辅助药物已广泛应用于临床。
[JP+1]雪人参（Radix Indigofera）为豆科木蓝属植物茸毛木蓝的根，又名铁刷子、血人参、红苦刺和山红花，主要分布于云南、贵州、广西等地，具有抗氧化[4]、补虚活血、降血糖及调经舒筋等功效，在贵州苗族地区，药用历史悠久。其化学成分研究表明，其富含黄酮类、萜类、酚类等化合物[5-7]。李园园等[8]报道雪人参乙醇提取物具有α-葡萄糖苷酶抑制作用，但尚未见对雪人参乙醇提取物经大孔树脂纯化后对α-葡萄糖苷酶的抑制作用研究。本实验探讨了大孔树脂分离纯化雪人参中α-葡萄糖苷酶抑制物质的工艺条件，为α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备及应用提供新思路。[JP]
1仪器与材料
11仪器Multiskan MK3酶标仪（美国Thermo Electron公司）；SP-75PC型紫外可见分光光度计（上海光谱仪器有限公司）；FW-177型中草药粉碎机（天津泰斯特仪器有限公司）；BSA224S-CW型电子天平（赛多利斯科学仪器（北京）有限公司）；TGL-16G高速台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；HH系列数显恒温水浴锅（金坛市科析仪器有限公司）；PH-618型酸度计（上海仪电科学仪器有限公司）；96微孔酶标板，各型号微量进样器。
12材料雪人参采集于贵州省都匀市周边，用中草药粉碎机粉碎，过20～60目标准筛。4-硝基苯基α-D-吡喃葡萄糖苷（4-N-trophenyl-α-D-glucopyranoside，PNPG，美国Sigma公司）；α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase，美国Sigma公司）；阿卡波糖（Acarbose，德国Serva公司）；二甲基亚砜（DMSO，美国Sigma公司），无水乙醇等均为分析纯试剂。
2方法
[JP3]21大孔树脂的预处理将D101、AB-8、HPD600、HPD100、X-5五种大孔树脂用95%乙醇浸泡24h后，用95%乙醇淋洗至流出液不浑浊为止，然后用蒸馏水洗至无醇，备用。[JP]
22雪人参中α-葡萄糖苷酶抑制物质的提取称取雪人参粉末100g，加入一定量60%乙醇溶液，回流提取3次，每次2h，合并提取液，离心，上清液减压蒸干，用20%二甲基亚砜溶液溶解后定容到1000mL容量瓶中，备用。
23大孔树脂的筛选分别称取5g上述5种大孔树脂于100mL锥形瓶中，加入80mL雪人参乙醇提取液（质量浓度为2252mg/mL，下同），常温下在振荡器上提取2h，静止24h后，离心分离，以α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率（简称酶活性抑制率）为指标，测定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量。酶活性抑制率越小，表明上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量越低，则该树脂的吸附性能就越好[9]。
24α-葡萄糖苷酶抑制物质活性测定[10]在96微孔酶标板上，加入112μL磷酸钾缓冲液（pH=68），8μL上述上清液和20μL 01U/mL α-葡萄糖苷酶，混合均匀后，于37℃恒温箱中孵育30min，再加入20μL 40mmol/L PNPG开启反应，置于37℃恒温箱中反应30min，最后加入80μL 02mol/L Na2CO3溶液终止反应，于405nm处测其OD值，根据下式计算出上清液中酶活性抑制率（用Y表示），A0表示空白对照组OD值（不加样液），Aj表示样品组OD值，由于雪人参乙醇提取液本身就有颜色，因此需要测定其背景吸收，并对测定结果进行校正。
Y=「（Ao-Ai）/A0」×100%
25静态吸附
251吸附时间准确称取5g HPD600大孔树脂置于100mL锥形瓶中，加入80mL雪人参乙醇提取液，常温下振荡2h，静态吸附不同时间，离心，测定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量，根据上述公式计算酶活性抑制率。
252吸附温度和树脂质量分别称取不同质量的HPD600大孔树脂置于100mL锥形瓶中，加入提取液80mL，在15、20、25、30、35、40、50℃下振荡2h，静态吸附24h，离心，测定上清液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量，根据上述公式计算酶活性抑制率。
26动态吸附分别称取5g上述5种树脂，装入30mm×300mm层析柱中，80mL提取液冲洗该柱，流速控制在2-3 BV/h，收集流出液，先用2BV去离子水冲洗层析柱，再用3BV 70%乙醇溶液洗脱，并收集流出液，减压蒸干后，用20%二甲基亚砜溶解，定容至50mL，测定α-葡萄糖苷酶抑制物质的含量，根据上述公式计算酶活性抑制率。
261提取液的pH值称取5g HPD600大孔树脂7份，湿法装柱，用5%NaOH和1mol/L HCl溶液调节提取液的pH值分别为10、35、50、60、70、80、100，使80mL不同pH值的提取液经过层析柱，以下按26步骤操作。
262洗脱液的筛选取5g HPD600大孔树脂，湿法装柱，使80mL提取液经过层析柱，吸附完全后，先用2BV去离子水冲洗，再分别用3BV 70%甲醇溶液、70%乙醇溶液和70%乙酸乙酯溶液洗脱，以下按26步骤操作。
263洗脱液的体积分数称取5g HPD600大孔树脂8份，湿法装柱，各使80mL提取液经过层析柱，吸附完全后，先用2BV去离子水冲洗，再分别用3BV 20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、95%乙醇溶液洗脱，以下按26步骤操作。
264洗脱液的用量取5g HPD600大孔树脂，湿法装柱，使80mL提取液经过层析柱，吸附完全后，先用2BV去离子水冲洗，再分别用1、2、3、4、5BV 70%乙醇溶液洗脱，以下按26步骤操作。
3结果
31静态和动态吸附5种大孔树脂对雪人参提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的吸附情况如表1所示。被5种大孔树脂吸附后的提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率均有所下降，表明5种树脂对α-葡萄糖苷酶抑制物质均有吸附。但由于树脂的孔径、极性和比表面积等性质的不同，吸附能力亦不相同，其中， HPD-600的酶活性抑制率最低，说明该树脂对α-葡萄糖苷酶抑制物质吸附最多，效果最好，因此选为进一步实验的最佳树脂。
32吸附速率吸附速率是衡量吸附效果的重要指标。不同的吸附时间，大孔树脂对雪人参乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的吸附效果也不相同，通过对大孔树脂HPD600吸附时间的考察后发现，前5h吸附速率较大，之后渐缓，表明该树脂在5h内已基本吸附完全。如图1。
33温度和树脂质量对吸附效果的影响25℃时，α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率最低，且随着HPD600树脂质量的增大，酶活性抑制率逐渐降低，在提取液体积（80mL）和树脂质量（5g）之比为16∶[KG-*3/5]1时基本不再变化，表明该树脂对α-葡萄糖苷酶抑制物质的吸附达到饱和。如图2。
34提取液pH值当雪人参乙醇提取液的pH值为80时，酶活性抑制率最低，表明HPD600树脂对提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的吸附率最高，因此选择提取液pH值为80作为进一步实验的最佳酸度。详见图3。
35洗脱条件的考察结果
351洗脱液的确定实验通过对70%甲醇溶液、70%乙醇溶液和70%乙酸乙酯溶液的洗脱效果进行考察后发现，70%乙醇溶液作为洗脱液时，α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率最高，如表2所示，表明洗脱效果最好，故选用为进一步实验的洗脱液。
352洗脱液体积分数随着乙醇溶液体积分数的增大，洗脱液中α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率逐渐增大，当乙醇浓度为70%时，曲线呈平缓趋势，考虑到经济成本，采用70%乙醇溶液即可达到较好的解吸效果。见图4。
353洗脱液用量通过对1、2、3、4、5BV（1BV=25mL）洗脱液洗脱效果的考察后发现，从第3份洗脱液开始，其中的α-葡萄糖苷酶抑制物质已非常微量，表明3倍柱体积的70%乙醇溶液已能基本洗脱树脂所吸附的α-葡萄糖苷酶抑制物质，因此确定洗脱液的体积为3BV。
36工艺验证按照优化后的工艺参数，将100g雪人参粉末经回流提取所得的浸膏制成提取液，使80mL该提取液通过装有5g HPD600大孔吸附树脂的层析柱（30mm×300mm）中进行纯化，通过测定提取液纯化前后α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率验证纯化工艺效果，通过计算，纯化前雪人参乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物质酶活性抑制率为37%，纯化后为7123%，提高约3倍。
4结论
通过对5种大孔吸附树脂吸附性能的考察，筛选出纯化苗药雪人参乙醇提取液中α-葡萄糖苷酶抑制物质的大孔树脂为HPD600，并通过静态和动态吸附对影响分离纯化的主要因素进行优化，从而确定出HPD600树脂在室温下吸附，吸附时用5%NaOH和1mol/L HCl溶液调节提取液的pH值为80，提取液体积与大孔树脂质量之比为16∶[KG-*3/5]1，采用70%乙醇溶液作为洗脱剂，洗脱体积为3倍柱体积。经过大孔树脂纯化后的提取液，对α-葡萄糖苷酶抑制物质抑制率提高了约3倍，优化工艺稳定可行，希望为α-葡萄糖苷酶抑制剂的制备和应用提供一定的参考。
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大孔树脂吸附法 篇4
黄酮类化合物的结构母核是以C6-C3-C6为骨架的2-苯基色原酮。它的存在形式一种是游离的苷元, 另一种是与糖等相结合的苷。柑橘皮含有丰富黄酮类化合物, 至今已经从柑橘中鉴定分离出60多种黄酮类化合物, 常见有柚皮苷、橙皮苷等二氢黄酮类, 它们具有抗氧化、防治心血管疾病、消炎抗菌以及防癌抗癌等多种生理和药理功效。
大孔吸附树脂是一类有机高分子聚合物吸附剂, 具有吸附容量大、吸附速度快及再生简便等优点, 因而被广泛用于天然产物的分离纯化。本试验采用的是AB-8大孔吸附树脂, 它是一种球状、弱极性聚合物吸附剂, 试验考察其对芦柑皮总黄酮静态吸附和解吸的特性, 并确定适宜的吸附和解吸条件。
1 试验材料与方法
1.1 材料与仪器
AB-8大孔吸附树脂, 天津南开大学;成熟芦柑, 福建省泉州市永春县;芦丁标准品为生化试剂;石油醚、无水乙醇、硝酸铝、亚硝酸钠和氢氧化钠均为分析纯。
HH-6数显电子恒温水浴锅, 金坛市晶玻试验仪器厂;循环水式多用真空泵, 郑州长城科工贸有限公司;旋转蒸发仪, 德国海道尔夫有限公司;奥利龙酸度计, 美国赛默飞世尔THERMO有限公司;752N紫外分光光度计, 上海精密科学仪器有限公司;BS124S分析天平, 北京赛多利斯仪器系统有限公司;DZF-6050型真空干燥箱, 上海精宏仪器设备有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 芦柑皮总黄酮的提取
取成熟芦柑果实的外皮, 70℃烘干, 粉碎过30目筛, 先用石油醚提取除去色素和油脂, 之后用95%乙醇回流提取3次, 合并滤液, 减压浓缩, 备用。
1.2.2 AB-8大孔吸附树脂吸附条件的优化
称取5 g预处理后并抽干的AB-8湿树脂, 置于100m L的原料液中搅拌吸附后过滤, 滤液用乙醇定容至100m L, 测定滤液中芦柑皮总黄酮浓度, 分别考察原料液浓度 (1.05、2.08、3.09、3.95和5.03mg/m L) 、p H值 (1.0、2.0、3.0、4.0和5.0) 对AB-8大孔吸附树脂吸附芦柑皮总黄酮的影响。
1.2.3 AB-8大孔吸附树脂解吸条件的优化
称取5 g预处理后并抽干的湿树脂, 分别置于p H值为3、浓度为3.95mg/m L的100 m L原料液中搅拌吸附4.0h后过滤, 滤液用乙醇定容至100m L, 测定滤液中芦柑皮总黄酮的浓度;吸附芦柑皮总黄酮后的AB-8大孔吸附树脂, 分别考察解吸液乙醇体积和树脂质量比 (5∶1、7.51、10∶1、12.5∶1和15∶1m L/g) 和解吸液乙醇浓度 (30%、50%、70%、80%和90%) 对解吸芦柑皮总黄酮的影响。
1.3 分析方法
1.3.1 芦柑皮总黄酮的测定
将芦丁烘干至恒重, 之后称取20mg于100m L容量瓶中, 用60%乙醇水溶液定容至刻度, 得标准溶液。精确量取标准溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0和6.0m L分别置于25m L容量瓶中, 各加60%乙醇水溶液至6.0m L;先分别加5%Na NO2溶液1m L, 摇匀, 静置6min之后各加10%Al (NO3) 3溶液1m L, 摇匀, 静置6min;之后各加4%Na OH溶液10m L, 分别用60%的乙醇水溶液定容至刻度, 摇匀, 静置15min, 用紫外分光光度计在510nm处测定吸光值, 以吸光值为纵坐标, 芦丁浓度为横坐标绘制标准曲线。回归得标准曲线方程为:y=11.13x+0.004 (x为芦丁浓度mg/m L, y为吸光度) , 相关系数r=0.9995。
取一定体积待测溶液于25m L容量瓶中, 用60%的乙醇水溶液补加至6 m L, 根据上述方法测吸光度值。吸附量、吸附率、解吸率和回收率分别按以下公式计算。
式中:C1、C2、C3分别为原料液、滤液和洗脱液的黄酮浓度, mg/m L;V1、V2、V3分别为原料液、滤液和洗脱液的体积, m L;m为树脂质量, g。
1.3.2 芦柑皮总黄酮高效液相色谱法测定
取一定量的原料液以及在最佳工艺条件下试验得到的洗脱液, 将原料液和洗脱液分别浓缩冻干后, 取一定量冻干品用甲醇溶解后, 经0.45μm过滤膜过滤后用高效液相色谱仪分析, 以橙皮苷为标品。色谱条件:Shimadzu C18 (150mmx4.6mm, 5μm) ;流动相为甲醇-水, 梯度洗脱:甲醇5% (10min) →35% (30min) →75% (60min) →100%;流速:1.0m L/min;柱温35℃;PDA检测器;检测波长283nm。
2 结果与讨论
2.1 原料液浓度对AB-8树脂吸附芦柑皮总黄酮的影响
由图1可知:随着原料液芦柑皮总黄酮浓度的增加, AB-8大孔吸附树脂对芦柑皮总黄酮的吸附量不断上升, 吸附率却逐渐下降, 当原料液芦柑皮总黄酮浓度为3.95mg/m L, 树脂吸附量为27.1mg/g, 吸附率为68.6%;继续增加原料液芦柑皮总黄酮浓度到5.03mg/m L, 树脂吸附量为27.8mg/g, 吸附率仅为55.3%, 可能原因是浓度高的原料液中含多糖、鞣质和蛋白质等杂质较多, 这些杂质与芦柑皮总黄酮类化合物竞争吸附于AB-8大孔吸附树脂的表面, 导致吸附量提高不明显;从节约成本的角度出发, 原料液芦柑皮总黄酮浓度4.0 mg/m L左右较为合适。
2.2 原料液p H值对AB-8树脂吸附芦柑皮总黄酮的影响
由图2可知:p H值在1~2的范围内, 吸附率由86.3%上升到91.7%;p H值在3~5的范围内, 吸附率由90.7%下降到79.8%;这是因为芦柑皮总黄酮类化合物含有较多的酚羟基, 呈弱酸性, 酸性条件下可使其保持分子状态有利于树脂对其吸附;试验过程中发现p H值在1~2时的原料液颜色变化明显, 可能生成了其他物质, 故此p H值为3左右是较为合适的原料液p H值。
2.3 解吸液体积与树脂质量比对AB-8树脂解吸芦柑皮总黄酮的影响
由图3可知:随着解吸液体积与树脂质量之比增大, 解吸率不断上升, 当解吸液体积与树脂质量之比在5∶1~12.5∶1m L/g的范围内, 解吸率随着解吸液体积与树脂质量之比的上升而增大;进一步增大解吸液体积与树脂质量之比到15∶1m L/g, 此时解吸率为98.3%, 解吸率上升不明显;故试验选择解吸液体积与树脂质量之比为12.5∶1 m L/g较为适宜。
2.4 解吸液浓度对AB-8树脂解吸芦柑皮总黄酮的影响
由图4可知:解吸率随着解吸液浓度的增大而增大, 当解吸液乙醇浓度在50%~70%浓度范围内, 解吸液浓度与解吸率呈显著的正相关 (相关系数r=0.995) , y=1.829x-29.8 (y为解吸率, x为解吸液浓度) , 解吸液浓度为70%时解吸率为97.2%, 解吸液浓度继续增大时, 解吸率增加缓慢。从经济角度出发, 试验选择解吸液浓度为70%左右较为适宜。
2.5 芦柑皮总黄酮纯化前后高效液相色谱比较
1.未知物2.橙皮苷3.未知物4.未知物5.未知物6.未知物
在相同条件下, 橙皮苷标准品的保留时间为20.5min, 其他5种物质均有黄酮特征吸收峰, 结合分离得到的单体结果可判断这5种未知物有可能是多甲氧基黄酮类化合物;由纯化前后的液相色谱图 (图5) 可知:AB-8大孔吸附树脂对芦柑皮提取液中黄酮类物质有一定的富集作用。以橙皮苷为标准品, 采用高效液相色谱法测得经AB-8大孔吸附树脂处理后可使芦柑皮中总黄酮的纯度提高到51.6%。结果表明AB-8大孔吸附树脂对芦柑皮黄酮有一定的纯化作用。
3 结论
由单因素试验确定AB-8大孔吸附树脂吸附芦柑皮总黄酮的最佳工艺条件为:样品溶液浓度为4.0 mg/m L, p H值为3.0, 解吸液体积与树脂质量之比为12.5∶1, 解吸液浓度为70%;在此条件下, 可使纯度提高到51.6%;结果表明AB-8大孔吸附树脂能够较好的纯化芦柑皮总黄酮, 为进一步分离纯化芦柑皮总黄酮化合物奠定基础。
摘要：通过静态吸附和解吸单因素试验确定最佳工艺条件。静态吸附的最佳条件:样品溶液总黄酮浓度为4.0mg/mL, pH值为3.0;静态解吸的最佳条件:解吸液体积与树脂质量之比为12.5∶1, 解吸液乙醇浓度为70%;高效液相色谱法 (HPLC) 测定在最优条件下可使芦柑总黄酮的纯度提高到51.6%。AB-8大孔树脂能较好地分离纯化芦柑皮总黄酮类化合物。
关键词：芦柑皮,总黄酮,AB-8树脂,静态吸附和解吸,高效液相色谱法
参考文献
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[7]景怡, 等.AB-8大孔吸附树脂分离纯化玉米须中总黄酮的研究[J].中医药学报, 2010, 38 (1) :75-78.
大孔树脂吸附法 篇5
盐酸克伦特罗是一种用于治疗支气管哮喘、喘息性支气管炎和由于过敏症、感染和运动造成的支气管痉挛的药物,在畜牧养殖中能够对动物体内的营养物质起重新分配作用,可促进动物生长,提高瘦肉率、降低脂肪沉积、降低饲料报酬等,是获得瘦肉的理想方法[1]。但盐酸克伦特罗对热稳定,使用后会在动物组织体内形成累积性残留,特别在内脏中会有高浓度的残留,对人与动物的肝、肾及神经系统有一定的毒副作用[2]。我国农业部已禁止将盐酸克伦特罗作为饲料添加剂使用。因此,建立简便、可靠的盐酸克伦特罗测定方法,对于保障食品安全具有重要意义。
盐酸克伦特罗的测定一般包括分离和检测两个方面,其中又以分离为最重要步骤。有关文献资料主要研究了盐酸克伦特罗检测方法的改进,而较少涉及到其分离方法[3,4]。文章以大孔吸附树脂为吸附剂,采用固相萃取方法吸附分离盐酸克伦特罗。与实验室常用的以活性炭、C18等为吸附剂的萃取小柱相比,文章采用可重复使用的固相萃取大柱,具有操作费用较低,操作简单等特点,适合实验室使用。
1 实验部分
1.1 仪器与试剂
TU-1901双光束紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限公司;pHS-3 C酸度计,上海雷磁仪器厂;固相萃取大柱,Φ12×150;盐酸克伦特罗,广州侨光制药厂;无水乙醇,分析纯,广州化学试剂厂;Amberlite XAD-2大孔吸附树脂,Sigma-Aldrich Co.。
1.2 实验方法
准确称取5 g Amberlite XAD-2大孔吸附树脂,用无水乙醇浸泡12 h后装柱,用50 mL蒸馏水洗涤柱体。将2 mL的100 μg/mL盐酸克伦特罗溶液样品加入分离柱中,用25 mL蒸馏水洗涤柱体,再用25 mL洗脱剂洗涤柱体,洗脱速率为1 mL/min。收集洗脱液并定容至25 mL比色管中,以蒸馏水为参比,在波长242 nm处测定样品的吸光度,计算回收率。
2 结果与讨论
2.1 盐酸克伦特罗的测定
盐酸克伦特罗的紫外吸收谱图如图1所示。根据图1可以发现,在扫描波长范围内,盐酸克伦特罗存在两个吸收峰,分别为242 nm和294 nm。由于242 nm处的吸收强度明显高于294 nm处的吸收强度,选择242 nm为测定波长。盐酸克伦特罗在242 nm的工作曲线如图2所示,拟合方程为Y=0.00607+0.03348 X,相关系数R=0.99939,表明该波长下盐酸克伦特罗的吸光度与浓度之间存在良好的线性关系。
2.2 洗脱剂的选择
洗脱剂的洗脱作用实质上是流动相分子与被分离物质分子竞争占据大孔树脂表面活性吸附中心的过程,强极性分子占据吸附中心的能力强,因而具有较强的洗脱能力。以水为洗涤剂,分别采用不同的洗脱剂,发现不同浓度的甲醇为洗脱剂时的回收率均超过100 %,表明有影响盐酸克伦特罗浓度测定的杂质同时被洗脱,而乙酸、乙酸乙酯以及乙酸乙酯及正己烷的混合物为洗脱剂时的回收率过低,最高仅能达到72.3 %,但无水乙醇为洗脱剂时的回收率最高可达到76.98,因此,选择无水乙醇为洗脱剂。不同洗脱剂对盐酸克伦特罗回收率的影响如表1所示。
2.3 样品pH值的影响
分别采用0.1 mol/L的盐酸以及10 wt?%的NaOH溶液调节待测样品的pH值,计算待测样品的回收率,结果如图3所示。
由图3可知,碱性样品的回收率较高,酸性样品较低。将待测样品的pH值调节至碱性可以有效提高其回收率。
2.4 洗脱剂体积的影响
按照实验方法分别加入不同体积的无水乙醇进行洗脱,回收率如图4所示。
一般说来,洗脱剂用量越大,盐酸克伦特罗的回收率越高,但成本也相应增大。由图4可知,无水乙醇用量达到20 mL之后,随洗脱剂用量增大,盐酸克伦特罗的回收率并没有明显提高,因而在实际操作中可选择20 mL作为洗脱剂的用量。
2.5 洗脱剂流速的影响
洗脱剂流对盐酸克伦特罗回收率的影响如图5所示。
由图5可知,最佳洗脱剂流速为1 mL/min。洗脱剂流速过快将导致盐酸克伦特罗的回收率降低,其原因在于洗脱剂没有足够的时间在吸附剂的吸附活性中心上与盐酸克伦特罗分子展开竞争吸附,产生“短路”现象。
2.6 最大饱和吸附量
更改盐酸克伦克罗的进样量,测定大孔吸附树脂的最大饱和吸附量,结果如图6所示。
由图6可知,Amberlite XAD-2大孔吸附树脂对盐酸克伦特罗的最大饱和吸附量约为319 μg/g。
2.7 重现性及误差分析
按照本文实验方法,根据上述所得最佳条件平行测定3次,计算回收率及标准偏差,并比较重现性,结果如表2所示。
根据表2可以发现:采用Amberlite XAD-2大孔吸附树脂对盐酸克伦特罗进行固相萃取分离,重现性好,回收率较高,适于作为高效液相色谱法测定盐酸克伦特罗的前处理方法。
3 结 论
采用Amberlite XAD-2大孔吸附树脂对盐酸克伦特罗进行固相萃取分离,最大饱和吸附量可达319 ug/g。以水为洗涤剂,无水乙醇为洗脱剂,洗脱剂流速为1 mL/min,样品pH值为10.8,回收率最高可达76.98 %。具有较好的重现性,适于作为高效液相色谱法测定盐酸克伦特罗的前处理方法。
摘要：采用大孔吸附树脂分离盐酸克伦特罗,对吸附分离条件进行了研究。结果表明,采用大孔吸附树脂作吸附剂对盐酸克伦特罗进行固相萃取,再用无水乙醇洗脱,可有效分离盐酸克伦特罗。洗脱流速为1mL/min,平均回收率可达76.07%,最大柱容量为319μg/g。
关键词：盐酸克伦特罗,固相萃取,大孔吸附树脂
参考文献
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大孔树脂吸附法 篇6
关键词：槐耳,多糖,大孔吸附树脂
槐耳是我国民间重要药用真菌, 其学名为trarnetes robiniphila murr.中药名为槐栓菌, 它仅生长于老龄中国槐树干上。味苦辛无毒, 能“治风”、“破血”、“益力”。在其产地民间多用以治疗癌症和炎症[1]。槐耳含有多种药效成分, 药理研究表明多糖是其主要活性成分[2], 槐耳多糖不仅能抑制肿瘤细胞生长, 诱导肿瘤细胞凋亡, 还能增强机体免疫力, 是一种较理想的免疫增强剂。它对巨噬细胞有非常显著的促进作用, 还能增强溶酶体活性, 提高体液免疫及细胞免疫, 同时, 能激活淋巴单核细胞的细胞毒活性的产生, 增强干扰素、白介素及其它的活性淋巴细胞之间的协同作用, 达到联合增效的目的[3]。
传统水提法得到的提取液中多糖含量较低, 不能很好的发挥多糖的药用价值。大孔吸附树脂具有吸附性强, 解吸附容易, 机械强度好, 可反复使用和流体阻力小等优点。近年来大孔吸附树脂在天然药物化学成份的提取、分离纯化、制剂工艺改革、制剂质量分析等方面有了较广泛的应用研究。本实验在以前研究的基础上采用DM301大孔吸附树脂研究槐耳多糖动态吸附性能, 对影响树脂吸附的一系列工艺参数进行了优化研究。
1仪器与试药
紫外可见分光光度计;旋转蒸发仪;槐耳 (购于毫州药材市场) ;95%乙醇、葡萄糖、浓硫酸、氯仿、正丁醇、苯酚、无水乙醇等均为分析纯。DM301大孔吸附树脂;PHS-4CT型精密酸度计等。
2方法与结果
2.1多糖含量的检测:以葡萄糖为标准品, 采用硫酸—苯酚法[4]。
2.2标准曲线绘制:量取配置好的葡萄糖标准溶液0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5ml分别置于50m L容量瓶中定容, 吸取上述供试液1.0ml于试管中, 分别加入5%苯酚溶液0.6ml, 摇匀, 然后加浓硫酸3.0ml, 充分摇匀, 置60℃水浴中20分钟, 在490nm波长处测其吸光度, 绘制吸光度—浓度标准曲线, 得回归方程A=0.0098C-0.0234, r=0.9999。其中A为吸光度, C为葡萄糖浓度 (ug/m L) 。
2.3除蛋白质:采用Sevag法 (氯仿:正丁醇=4:1) , 加入多糖溶液中反复震荡多次, 静置除去蛋白质沉淀。
2.4萃取方法:称取一定量除脂后的槐耳粉, 加入试验规定用量的水, 静置24h以充分润湿物料, 放入超声波清洗器的浴槽中, 室温下进行超声波辅助萃取, 直至时间达到实验规定值, 固液分离, 收集萃取液。按同样条件重复萃取1次。合并萃取液, 用旋转蒸发仪真空浓缩到原体积的1/5左右, 除去蛋白质, 配成不同浓度的多糖液待用。
2.5正交试验。为了进一步优化吸附条件, 根据单因素实验结果选取了4个因素:上柱液浓度 (A) 、上柱液温度 (B) 、上柱液PH值 (C) 、上柱液流速 (D) , 采用L9 (34) 正交表进行了正交试验。
由结果可知, 在所选取的条件中, 多糖吸附量的影响因素的主次分别为C>D>A>B, 上柱液PH值对吸附量影响最为明显, 其次为上柱液流速、上柱液浓度和上柱液温度。最佳工艺条件为C2D1A1B3即上柱液浓度为0.5mg/ml, 上柱液温度40℃, 上柱液PH值5.0, 上柱液流速1BV/h。
以正交实验得到的最佳条件进行三次吸附试验, 结果多糖的吸附量分别为:11.5mg/g, 10.5mg/g, 10.8mg/g, 平均为10.9 mg/g。结果表明正交实验得到的最佳提取条件具有很好的重现性。 (表1, 表2)
3结论
通过正交试验得到了树脂吸附多糖的最佳工艺条件, 即:在上柱液浓度为0.5mg/ml, 上柱液温度40℃, 上柱液PH值5.0, 上柱液流速1BV/h的条件下进行吸附, 多糖的吸附量提高到10.9 mg/g, 大大提高了树脂的处理量, 利于后续纯化工作。
参考文献
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大孔树脂吸附法 篇7
1.1 仪器
Agilent高效液相色谱仪:包括化学工作站, VWD检测器, ZORBAX SB-C18 (5μm, 4.6×250mm) 色谱柱;梅特勒电子天平。
1.2 试剂
甲醇为色谱纯 (美国天地公司) , 其余为分析醇。
1.3 对照品
阿魏酸对照品由中国药品制品检定所提供。
1.4 药材
当归购于甘肃岷县, 为道地药材, 经鉴定为当归Angelica sinensis (Dliv.) Diels的干燥根。
1.5 大孔吸附树脂
购于天津南开大学化工厂。
2 色谱条件
Z O R B A X S B-C 1 8 (5μm, 4.6×250mm) 色谱柱;柱温:30℃;流动相:甲醇∶0.05%冰醋酸 (40∶60) ;检测波长:320nm;流速:0.6ml/min。
3 实验方法
3.1 树脂的前处理
取市售大孔吸附树脂, 用乙醇加热回流提取洗脱, 洗至洗脱液蒸干后无残留。经乙醇洗净的树脂保存备用。以乙醇湿法装柱。继续用乙醇在柱上流动清洗, 不时检查流出的乙醇, 至与水混合不呈白色混浊为止 (取1ml乙醇液加2ml蒸馏水) 。然后以大量的蒸馏水洗去乙醇, 洗至流出液Molish反应呈阴性, 备用。少量乙醇的残留将会大大降低树脂的吸附能力。
3.2 不同树脂比吸附量 (absorbtion ratio) 的测定
精密量取当归提取液75ml (每ml含生药1g) , 加到已经前处理的树脂, 调节流速为0.5ml/min, 过柱流出液重吸附2次, 静置15分钟, 用水洗至流出液Molish反应呈阴性, 再用95%的乙醇洗脱, 洗脱至流出液无色为止。结果见表1, AB-8型大孔吸附树脂具有较大比吸附量, 性能优于其他几种树脂。故选择弱极性树脂AB-8作为当归总酚酸吸附纯化的树脂。
3.3 A B-8型大孔吸附树脂对当归总酚酸吸附, 分离相关参数的研究
3.3.1 比上柱量 (saturation ratio) 的测定
精密量取当归提取液50ml (1g生药/ml) , 加到已经前处理的树脂, 调节流速为0.5ml/min, 过柱流出液重吸附2次, 静置15分钟, 测定其比上柱量。比上柱量是所用树脂达吸附终点时, 单位质量干树脂吸附夹带成分的总和, 即S= (M上-M残) /M。经测定, AB-8型大孔
吸附树脂对当归总酚酸 (以阿魏酸计) 的比上柱量为5.60, RSD=3.40%。
3.3.2 比吸附量 (absorbtion ratio) 的测定
上述树脂用水洗至流出液Molish反应呈阴性, 测定其比吸附量。比吸附量是单位质量干树脂吸附成分的总和。即A= (M上-M残-M水) /M。经测定, AB-8型大孔吸附树脂对当归总酚酸 (以阿魏酸计) 的比吸附量为3.88, RSD=3.99%。
3.3.3 洗脱溶媒的选择
取AB-8型大孔吸附树脂7克, 湿法上柱, 平行制备7份, 分别经过前处理, 根据吸附容量, 精密吸取当归提取液 (1g生药/ml, 含阿魏酸0.8439mg/ml) 上柱, 过柱流出液重吸附2次, 静置15分钟, 用蒸馏水洗脱至流出液Molish反应呈阴性, 分别用30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%的乙醇洗脱, 测定其中阿魏酸的含量。
另当归提取物每ml含固形物0.5373g, 经过计算, 其纯度为0.158%。结果显示30%乙醇洗脱液所得样品中, 阿魏酸纯度为9.60%, 相对含量最高, 故确定洗脱溶媒为30%的乙醇溶液。当归提取物经过AB-8大孔吸附树脂的吸附、洗脱后, 在固形物含量降低的同时, 纯度呈显著性提高。
3.3.4 洗脱累积率的测定
取AB-8型大孔吸附树脂7克, 湿法上柱, 经过前处理, 根据该树脂的吸附容量, 精密吸取当归提取液 (每ml含1克生药) 上柱, 用蒸馏水洗脱至流出液无色, 用30%乙醇液洗脱, 刚开始连续收集50ml洗脱液, 以后分段收集, 每50ml收集一次, 累计收集350ml。计算各部分洗脱液中阿魏酸的含量, 测定结果可知, 用30%乙醇液洗脱, 收集150ml洗脱液, 99.23%的指标成分已从树脂上解吸下来, 即洗脱体积为9BV。
3.3.5 比洗脱量 (Eluation ratio) 的测定
取AB-8型大孔吸附树脂, 湿法上柱, 经过前处理, 根据该树脂的吸附容量, 精密吸取当归提取液 (每ml含1克生药) 上柱, 用蒸馏水洗脱至流出液无色, 用30%乙醇液洗脱, 收集洗脱液200ml (终点) , 计算其比洗脱量。比洗脱量是吸附达饱和后, 用一定浓度的乙醇洗脱至终点, 单位质量干树脂洗脱成分的质量, 即E=M醇/M。经测定, 比洗脱量为3.16, RSD=2.69%。
3.3.6 不同浓度的当归提取物对AB-8树脂吸附性能的影响
原液浓度会直接影响到AB-8树脂吸附性能。故用不同浓度的当归提取物上柱, 考察其比吸附量及解吸率, 为选择适宜的上样浓度提供依据。定量加入已知含量的当归提取物, 以2BV/1小时的流速上样吸附洗脱, 用蒸馏水洗脱至流出液无色, 再用30%乙醇液洗脱至终点。经试验, 虽然上样浓度高, 比吸附量也随之增加, 但解吸率显著降低, 有效成分不能被完全洗脱下来。因此选择当归药液浓度为1.0g/ml为宜。
3.4 讨论
3.4.1 不同类型树脂对同一成分有不同程度的吸附, 同一型号树脂对多种成分也有不同程度的吸附。为了使树脂法成功地应用于生产, 除选用分离介质, 还要配合最佳的工艺条件, 如药液的预处理, 浓度, PH, 吸附和解吸附的速度, 洗脱剂的选用。同一成分, 所用的大孔树脂的型号不同, 其吸附性能有很大的差异, 故富集纯化不同的成分对大孔树脂的选择很有必要。
3.4.2 当归提取物在没有上柱分离之前, 阿魏酸的含量仅为0.9%, 结果大孔吸附树脂富集纯化, 纯度提高到9.6%。
3.4.3 一般情况下, 纯化同一种药物的大孔树脂, 当其吸附量下降30%以上时, 应视为不宜再用。故应该积累树脂再生的研究数据, 建立合理的树脂再生方法及再生合格标准, 使不同批次产品的纯化效果稳定并能节约成本。
摘要：目的:选择适宜的大孔吸附树脂来纯化当归中酚酸类成分, 并优选其相关参数。方法:采用HPLC法, 测定阿魏酸的含量。结果:选择AB-8型大孔树脂作为当归酚酸类成分吸附纯化的树脂。结论:AB-8型大孔树脂对当归酚酸类成分吸附及洗脱参数为:比上柱量=5.6, 比吸附量=3.88, 比洗脱量=3.66, 洗脱溶媒为30%的乙醇, 洗脱体积为9VB。
大孔树脂吸附法 篇8
TU-1900双光束紫外-可见分光光度计 (北京普析通用仪器有限责任公司) , 酸枣仁皂苷A对照品 (批号:110734-201201, 中国药品生物制品检定所) 。
2 方法与结果
2.1 酸枣仁总皂苷含量测定[1]
2.1.1 对照品溶液的制备
精密称取酸枣仁皂苷A标准品3.0 mg, 置于10 ml容量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度, 配制成0.3 mg/ml的对照品溶液备用。
2.1.2 标准曲线的绘制
在472 nm波长处采用比色法, 以吸收度 (Y) 为纵坐标, 以质量 (X) 为横坐标, 计算得回归方程Y=16.205X-0.0015 (r=0.9991) 。
2.1.3 样品测定
精密吸取供试溶液适量, 置于10 ml具塞试管中, 挥尽溶剂, 按照“2.1.2”项下总皂苷测定方法进行样品测定。
2.2 酸枣仁总皂苷纯化工艺参数考察与优化
2.2.1 酸枣仁总皂苷的静态吸附及解吸附考察
精密称取预处理后的六种大孔吸附树脂5 g (干树脂) , 分别将其置于500 ml锥形瓶中, 加入250 ml酸枣仁供试液, 预吸附24 h后吸取上清液测量吸光度, 从而计算吸附量。将上述6种吸附树脂滤出, 水洗, 滤纸吸干, 每种树脂等分成4份, 分别精密加入30%、50%、70%、90%乙醇200 m L, 振摇解吸附24 h, 精密量取1.0 ml, 测定吸收度, 结合吸附量计算解吸率。通过吸附—解吸试验, 可知HPD-100型大孔吸附树脂吸附量为122.5 mg/g, 70%乙醇解吸率为96.93%。综合分析各类型大孔树脂对酸枣仁总皂苷的吸附量、解吸率, 选择HPD-100型大孔吸附树脂对酸枣仁总皂苷进行富集。
2.2.2 HPD-100型大孔吸附树脂动态吸附考察
2.2.2. 1 原液浓度对吸附的影响
取5 g (干树脂) 装柱, 准确称量样品溶液5份, 每份10 ml, 分别加入蒸馏水0、5、10、15、20 ml, 体积流量为0.5 ml/min, 分别收集5份过柱液, 完成含量测定和吸附容量的计算。结果表明, 酸枣仁总皂苷吸附溶液质量浓度在1.05~1.58 mg/ml为最佳, 因此可考虑用1.58 mg/ml酸枣仁提取物直接上大孔吸附树脂进行富集。
2.2.3 HPD-100型大孔吸附树脂动态解吸附考察
2.2.3. 1 洗脱剂浓度的影响
取酸枣仁提取物溶液上样, 将4根HPD-100树脂柱 (干树脂5 g) 分别用等量蒸馏水洗脱, 流速控制为1ml/min, 蒸馏水洗脱馏分中Molish反应呈阳性, 说明蒸馏水可除去糖类杂质, 进而以1 ml/min流速分别用30%、50%、70%、90%乙醇洗脱, 5%香草醛浓硫酸反应作为指标, 洗脱至反应为阴性。洗脱后的各馏分经水浴浓缩至干后减压干燥, 冷却后称重并测定其中总皂苷的含量, 计算总皂苷回收率。结果表明, 选用70%的乙醇作洗脱剂, 总皂苷百分含量和总皂苷回收率均最高。
2.2.3. 2 洗脱剂用量的考察
按照以上试验确定的吸附洗脱条件, 70%乙醇的用量是影响酸枣仁皂苷纯化的主要因素, 称取HPD-100干树脂5 g, 按饱和时上样量取酸枣仁提取物溶液168 ml, 待吸附完全后用蒸馏水洗脱至Molish反应呈阴性, 后用70%乙醇洗脱, 分段收集馏分, 共收集5份, 每份40 ml, 馏分经水浴浓缩至干后减压干燥, 冷却后称重并测定其中总皂苷的含量。结果表明, 总皂苷的含量从第1份到第5份在逐渐减少, 说明酸枣仁总皂苷至第5份时已基本被解析附完全, 故确定洗脱剂的用量为200 ml, 相当于40 ml/g (干树脂) 。
3 讨论
本研究通过静态吸附解吸附实验考察了AB-8、NKA-9、HPD-100、D-101、D-301、X-5等六种大孔吸附树脂对酸枣仁皂苷的吸附与解吸附能, 结果表明HPD-100型大孔吸附树脂吸附容量大、解析率高、吸附速度快, 对纯化酸枣仁皂苷工艺具有较高应用价值。洗脱实验结果表明:酸枣仁总皂苷富集于70%乙醇洗脱液部位, 回收率为91.77%, 工艺稳定可行, 重现性好。
摘要：目的 研究最佳大孔吸附树脂纯化酸枣仁皂苷工艺。方法 分别从静态吸附及解吸附考察酸枣仁总皂苷的解析率, 从动态吸附及解吸附考察洗脱剂用量、浓度。结果 选用HPD-100大孔吸附树脂, 酸枣仁总皂苷富集于70%乙醇洗脱液部位, 回收率为91.77%。结论 通过大孔吸附树脂富集方法可较好地纯化酸枣仁皂苷, 工艺稳定可行。
关键词：酸枣仁,纯化,总皂苷,大孔吸附树脂
参考文献
大孔树脂吸附法 篇9
中药提取纯化研究是改变中药制剂粗大黑外观和服用剂量过大的问题, 也是中药制剂现代研究的热点和难点［1］。大孔树脂主要应用于中药成分的富集分离, 能达到纯化精制的目的, 作为一种有机高聚吸附剂, 它具有选择性吸附有机化合物的能力, 应用于中药皂苷类、酚酸类成分的富集纯化有较好的效果［2］。但不同的大孔树脂对不同的成分吸附性能及其洗脱参数不尽相同。文献报道, 当归中阿魏酸常用大孔吸附树脂来分离, 但未见有大孔吸附树脂型号的选择及相关参数的报道, 本文旨在探讨选择一合适的大孔树脂, 并就该大孔树脂纯化当归酚酸类成分的工艺条件与参数开展研究。
1 材料
1. 1 仪器Agilent高效液相色谱仪: 包括化学工作站, VWD检测器; ZORBAX SB - C18 ( 5μm, 4. 6mm × 250mm) 色谱柱; 梅特勒电子天平。
1. 2 试剂甲醇 ( 色谱纯) : 美国天地公司; 其余为分析醇。
1. 3药材阿魏酸对照品: 由中国药品制品检定所提供, 购于天津南开大学化工厂; 当归: 购于甘肃岷县, 为道地药材, 经鉴定为当归Angelica sinensis ( Dliv. ) Diels的干燥根。
2 色谱条件ZORBAX SB - C18 ( 5μm, 4. 6mm × 250mm) 色谱柱; 柱温: 30 ℃; 流动相: 甲醇∶ 0. 05%冰醋酸 ( 40∶ 60) ; 检测波长: 320 nm; 流速: 0. 6 mL/min。
3 实验方法与结果
3. 1 树脂的前处理取市售大孔吸附树脂, 用乙醇加热回流提取洗脱, 洗至洗脱液蒸干后无残留, 经乙醇洗净的树脂保存备用。以乙醇湿法装柱, 继续用乙醇在柱上流动清洗, 不时检查流出的乙醇, 至与水混合不呈白色混浊为止 ( 取1mL乙醇液加2mL蒸馏水) , 然后以大量的蒸馏水洗去乙醇, 洗至流出液Molish反应呈阴性, 备用。少量乙醇的残留将会大大降低树脂的吸附能力。
3. 2 不同树脂比吸附量的测定精密量取当归提取液75mL ( 每mL含生药1g) , 加到已经前处理的树脂, 调节流速为0. 5mL/min, 过柱流出液重吸附2 次, 静置15 分钟, 用水洗至流出液Molish反应呈阴性, 再用95% 的乙醇洗脱, 洗脱至流出液无色为止。结果见表1, AB -8 型大孔吸附树脂具有较大比吸附量, 性能优于其他几种树脂。故选择弱极性树脂AB -8 作为当归总酚酸吸附纯化的树脂。
3. 3 AB - 8 型大孔吸附树脂对当归总酚酸吸附、分离相关参数的研究
3. 3. 1 比上柱量的测定精密量取当归提取液50mL ( 1g生药/mL) , 加到已经前处理的树脂, 调节流速为0. 5mL/min, 过柱流出液重吸附2 次, 静置15 分钟, 测定其比上柱量。比上柱量是所用树脂达吸附终点时, 单位质量干树脂吸附夹带成分的总和, 即S = ( M上- M残) /M。由表2 结果可知, AB -8 型大孔吸附树脂对当归总酚酸 ( 以阿魏酸计) 的比上柱量为5. 60, RSD =3. 40%。
M: 干树脂的重量; M上: 为上柱液中成分的质量; M残: 为过柱流; M水: 为水洗脱下来成分的质量; M醇: 为不同浓; A ( 比吸附量) : 单位质量干树脂吸 A = ( M上- M残- M水) /M
3. 3. 2 比吸附量的测定上述树脂用水洗至流出液Molish反应呈阴性, 测定其比吸附量。比吸附量是单位质量干树脂吸附成分的总和。即A = ( M上- M残- M水) /M。由表3 结果可知, AB - 8 型大孔吸附树脂对当归总酚酸 ( 以阿魏酸计) 的比吸附量为3. 88, RSD =3. 99%。
3. 3. 3 洗脱溶媒的选择
取AB - 8 型大孔吸附树脂7g, 湿法上柱, 平行制备7份, 分别经过前处理, 根据吸附容量, 精密吸取当归提取液 ( 1g生药/mL, 含阿魏酸0. 8439mg /mL) 上柱, 过柱流出液重吸附2 次, 静置15 分钟, 用蒸馏水洗脱至流出液Molish反应呈阴性, 分别用30%、40%、50%、60%、70%、80%、90% 的乙醇洗脱, 测定其中阿魏酸的含量, 结果见表4。
解吸率 ( %) : M 醇/ ( M上- M残- M水) ; 纯度: 阿魏酸占固形物
另当归提取物每mL含固形物0. 5373g, 经过计算, 其纯度为0. 158%。结果显示30%乙醇洗脱液所得样品中, 阿魏酸纯度为9. 60%, 相对含量最高, 故确定洗脱溶媒为30% 的乙醇溶液。当归提取物经过AB - 8 大孔吸附树脂的吸附、洗脱后, 在固形物含量降低的同时, 纯度呈显著性提高。
3. 3. 4 洗脱曲线的绘制
取AB -8 型大孔吸附树脂7g, 湿法上柱, 经过前处理, 根据该树脂的吸附容量, 精密吸取当归提取液 ( 1g生药/mL) 上柱, 用蒸馏水洗脱至流出液Molish反应呈阴性, 依次用30%、50%、70%、90% 的乙醇作梯度洗脱, 洗脱液流速为1. 5mL/min, 蒸馏水洗脱液先收集250mL; 30%、50%、70% 、90% 乙醇洗脱液分别收集50mL 5 份, 测定阿魏酸的含量, 以容量瓶编号 ( X) 为横坐标, 阿魏酸含量 ( Y) 为纵坐标, 绘制洗脱曲线。洗脱曲线显示, 阿魏酸主要集中在30% 乙醇洗脱液中, 占全部洗脱液中阿魏酸含量的99% 以上。故确定洗脱条件为: 先用蒸馏水洗去水溶性杂质, 再用30% 乙醇洗脱阿魏酸, 收集30%乙醇洗脱部分。
3. 3. 5 洗脱累积率的测定取AB - 8 型大孔吸附树脂7g, 湿法上柱, 经过前处理, 根据该树脂的吸附容量, 精密吸取当归提取液 ( 每mL含1g生药) 上柱, 用蒸馏水洗脱至流出液无色, 用30%乙醇液洗脱, 刚开始连续收集50mL洗脱液, 以后分段收集, 每50mL收集1 次, 累计收集350 mL, 计算各部分洗脱液中阿魏酸的含量, 结果见表5。
该吸附柱参数为: 直径D =1. 5cm, 高度H = 10cm, 计算得BV ( 树脂床体积) 为18cm3。由表5 洗脱累积率的测定结果可知, 用30%乙醇液洗脱, 收集150mL洗脱液, 99. 23% 的指标成分已从树脂上解吸下来, 即洗脱体积为9BV。
3. 3. 6 比洗脱量的测定取AB - 8 型大孔吸附树脂, 湿法上柱, 经过前处理, 根据该树脂的吸附容量, 精密吸取当归提取液 ( 每mL含1g生药) 上柱, 用蒸馏水洗脱至流出液无色, 用30%乙醇液洗脱, 收集洗脱液200mL ( 终点) , 计算其比洗脱量。比洗脱量是吸附达饱和后, 用一定浓度的乙醇洗脱至终点, 单位质量干树脂洗脱成分的质量, 即E = M醇/ M 。由表6 结果可知, 比洗脱量为3. 16, RSD =2. 69%。
3. 3. 7 不同浓度的当归提取物对AB - 8 树脂吸附性能的影响用不同浓度的当归提取物上柱, 考察其比吸附量及解吸率, 为选择适宜的上样浓度提供依据。定量加入已知含量的当归提取物, 以2BV/h的流速上样吸附洗脱, 用蒸馏水洗脱至流出液无色, 再用30% 乙醇液洗脱至终点。结果见表7。可见, 虽然上样浓度高, 比吸附量也随之增加, 但解吸率显著降低, 有效成分不能被完全洗脱下来。因此选择当归药液浓度为1. 0g/mL为宜。
4 讨论
不同类型树脂对同一成分有不同程度的吸附, 同一型号树脂对多种成分也有不同程度的吸附。为了使树脂法成功地应用于生产, 除选用分离介质, 还要配合最佳的工艺条件, 如药液的预处理、浓度、PH值, 吸附和解吸附的速度、洗脱剂的选用。
同一成分, 所用的大孔树脂的型号不同, 其吸附性能有很大的差异, 故富集纯化不同的成分对大孔树脂的选择很有必要。
当归提取物在没有上柱分离之前, 阿魏酸的含量仅为0. 9% , 结果大孔吸附树脂富集纯化, 纯度提高到9. 6% 。
一般情况下, 纯化同一种药物的大孔树脂, 当其吸附量下降30%以上时, 应视为不宜再用。故应该积累树脂再生的研究数据, 建立合理的树脂再生方法及再生合格标准, 使不同批次产品的纯化效果稳定并能节约成本; 目前市售的大孔树脂中大都含有未聚合的单体、交联剂、致孔剂、分散剂及防腐剂等, 这些有机物可能在生产过程中带入药品而影响人体的健康, 所以要在成品中建立树脂残留物及裂解产物的检测方法, 制定合理的限量, 并列入质量标准正文。树脂只有通过合理的前处理, 才能使有机残留物限量低于国家标准或国际通用标准。大孔吸附树脂前处理的研究及再生的研究有待于进一步的工作。
摘要：目的:选择适宜的大孔吸附树脂纯化当归中酚酸类成分, 并优选其相关参数。方法:采用HPLC法, 测定阿魏酸的含量。结果:AB-8型大孔树脂对当归酚酸类成分有良好的吸附分离性能, 洗脱参数为:比上柱量为5.6, 比吸附量为3.88, 比洗脱量为3.66, 洗脱溶媒为30%的乙醇, 洗脱体积为9VB。结论:AB-8型大孔树脂可用于当归酚酸类成分的提取纯化。
关键词：当归酚酸,大孔吸附树脂,中药提取纯化
参考文献
[1]朱浩, 候世祥.大孔吸附树脂纯化不同中药有效部位特性研究.中国中药杂志, 1998, 23 (10) ∶607.