酶联免疫吸附试验法

酶联免疫吸附试验法（精选8篇）

酶联免疫吸附试验法 篇1

摘要：目的 探讨酶联免疫吸附法 (ELISA) 与金免疫层析试验 (GICA) 在检测梅毒特异性抗体中的应用价值。方法 分别采用ELISA与GICA检测方法对6250例门诊标本及术前标本进行检测, 检测结果以梅毒螺旋体明胶凝集试验 (TPPA) 作为“金标准”, 比较ELISA与GICA法对梅毒特异性抗体的临床诊断价值。结果 GICA法对一期梅毒、三期梅毒、不明期梅毒的检出率及总检出率低于ELISA法和TPPA法, 差异均有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。ELISA法与TPPA法各时期TP的检出率及总检出率差异无统计学意义 (P>0.05) 结论 与GICA法相比, ELISA法检测梅毒特异性抗体检出率更高, 漏检率更低, 可用于临床梅毒感染患者的诊断之中。

关键词：酶联免疫吸附法,金免疫层析试验,明胶凝集试验

梅毒主要是由苍白密螺旋体 (TP) 感染而引起的一种慢性全身性传播疾病, 严重地危害人们的生命健康。TP一旦进入人体, 血清中会产生非特异性抗体及梅毒特异性抗体[1]。因此, 应加强对梅毒的诊断, 而血清型检测是诊断机体是否为TP感染的唯一途径。临床上检测TP抗体的血清检验学方法有多种, 其检测敏感度与特异度也具有一定的差异性[2]。酶联免疫吸附法 (ELISA) 与金免疫层析试验 (GICA) 常用于TP抗体的临床检测之中。本研究以“金标准”TPPA作为参照, 对比ELISA与GICA法对TP抗体的检测情况, 现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择6250例产前和术前标本, 其中男2350例, 女3900例;年龄19~68 (45.09±5.92) 岁;共检测出梅毒阳性患者50例, 检出率为0.8% (50/6250) , 均符合梅毒临床诊断标准, 其中一期梅毒患者14例, 二期梅毒患者17例, 三期梅毒患者6例, 不明期梅毒患者13例。

1.2 仪器与试剂

ELISA试剂为上海科华公司生产, 生产批号为201003011;TPPA试剂为日本富士康必欧株式会社公司生产, 生产批号为VN00303;GICA试剂为英科新创公司生产, 生产批号为2010020907。主要仪器为:郑州anthos2010酶标仪, 郑州anthos fluido型全自动酶标洗板机。

1.3 检测方法

首先抽取5ml空腹条件下静脉血, 于4000rpm转速下离心5min之后将血清加以分离, 若血清标本不能及时地送检, 则需将其置于温度为4℃的冰箱中保存, 备用, 以避免反复地冻融, 分别采用ELISA法、GICA法及TPPA法进行检测, 检测方法严格按各自试剂盒上的说明进行规范操作。前两种检测方法的结果与TPPA法检测结果进行对比。

1.4统计学方法

采用SPSS 16.0进行数据处理。计数资料以率 (%) 表示, 组间比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

GICA法对一期梅毒、三期梅毒、不明期梅毒的检出率及总检出率低于ELISA法和TPPA法, 差异均有统计学意义 (P<0.05或P<0.01) 。ELISA法与TPPA法各时期TP的检出率及总检出率差异无统计学意义 (P>0.05) 。见表1。

3 讨论

当梅毒进入人体之后, 机体会产生2种类型的抗体, 即:抗心磷脂的非特异性抗体 (“反应素”) 与抗菌体的特异性抗体。非特异性抗体不是机体针对菌体自身所发生的反应, 而是针对菌体破坏患者组织之后释放的内脂所产生的反应[3]。因此, 检出时间一般比检出机体对菌体产生的特异性抗体晚2周, 且在一期梅毒早期、晚期梅毒、潜伏期梅毒及梅毒治疗之后起检出率显著降低甚至呈阴性[4]。因此, 若使用检测非特异性TP抗体的检测方法对特异性抗体进行诊断, 会出现更多的假阴性。笔者认为特异性抗体是诊断TP感染的重要依据。

注:与GICA法比较, *P<0.01, #P<0.05

目前, 临床上常使用非特异性抗体试验, 如TRUST与RPR2种检测方法, 2种方法所使用的抗原均为心磷脂类。此类试验虽具有操作简单、结果易读、试剂成本低、设备要求低及检测快速等方面的特点[5], 然而因该试验方法的局限性以及结果极易受到主观因素的影响, 且灵敏度及特异度较低, 常出现生物学假阴性。因此, 上述检测方法不适合TP特异性抗体的临床检测。目前, 使用较多的ELISA法与GICA法, 通过对这2种方法检测结果的对比分析, 结果显示:50例确诊梅毒病例中, ELISA法与TPPA法对各时期TP的检出率具有较高的一致性, 除二期梅毒外, GICA法对各期TP检出率显著低于ELISA法与TPPA法 (P<0.01) 。由此可见, 与GICA法相比, ELISA法检测梅毒特异性抗体检出率更高, 漏检率更低, 且与“金标准”TPPA检测法检测结果基本一致, 可用于临床梅毒感染患者的诊断之中。

参考文献

[1] 肖春梅, 朴桂花, 李富荣, 等.梅毒血清学实验室检查及临床应用[J].实用医学杂志, 2011, 27 (8) :1485-1486.

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[4] 徐正红.金标法与滴度法应用于临床检测梅毒的效果观察[J].西南军医, 2011, 13 (1) :51-52.

[5] 王红梅.梅毒抗体胶体金法在街头献血者初筛中的应用及评价[J].中国输血杂志, 2012, 25 (1) :68-69.

酶联免疫吸附试验法 篇2

关键词：酶联免疫吸附分析 综合性实验 教学

中图分类号：G421文献标识码：A文章编号：1674-098X（2013）05（a）-0149-02

食品分析是食品科学与工程专业重要的专业基础课程之一。食品分析实验课是食品分析教学的重要组成，是锻炼学生实验操作能力，分析解决问题能力的重要教学途径之一。酶联免疫吸附分析（ELISA）技术涉及有机化学、食品化学、生物化学和免疫学等综合知识内容，在食品分析学中开展ELISA综合性实验，不仅利于提高教学质量，而且能锻炼学生综合技能运用能力。

1 ELISA综合实验在教学中开展的意义

酶联免疫吸附分析技术是一种固相免疫分析方法，因其具有灵敏、快速、特异性强等特点，迅速发展，在食品安全检测领域应用越来越广泛，成为食品中小分子有害因子主要的快速筛查技术手段[1]。目前，对于食品中的农药、兽药残留，生物毒素，致病微生物等有害物质的分析，市面上已有商品化的ELISA试剂盒[2]。但本科教学极少开展ELISA教学，学生对其原理和操作了解较少，缺乏实验机会，相关知识的理解主要停留在理论教学水平。在食品专业开设ELISA实验课程，已成为一项非常必要的实验教学内容。有助于帮助学生学习对相关知识点的学习及掌握，提高学生对生物分析技术的认识，了解免疫分析技术在食品安全领域应用的优势及重要性，并锻炼学生动手能力，培养学生的综合素质。

2 ELISA实验的原理

ELISA技术是用酶标记的抗原或酶标记的抗体为主要试剂，通过复合物中的酶催化底物呈色反应来对被测物进行定性或定量的一种免疫分析方法[3]。其原理是把抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，在测定时，将受检样品（测定其中的抗体或抗原）和酶标抗原或抗体按不同的步骤与固相载体表面的抗原或抗体起反应，形成抗原抗体复合物，用洗涤的方法使固相载体上的抗原抗体复合物与其他物质分开，最后结合在固相载体上的酶量与样品中受检物质的量成一定的比例。加入酶反应的底物后，底物被酶催化变为有色产物，通过定性或定量分析有色产物即可确定样品中待测物质的含量[4-5]。目前ELISA 的分类方法众多，主要技术类型有双抗体夹心法、间接法、捕获法、竞争法。在食品安全检测领域，竞争法为主要类型[6]。检测原理示意图见图1。

3 实施过程及具体实验步骤

根据笔者的教学经验，该综合性实验约需教学时数，10～12学时，具体操作过程如下。

（1）带教老师讲述ELISA的原理，应用及注意事项。

（2）通过观看酶联免疫吸附实验操作视频，了解整个实验流程及操作要点。

（3）将学生分组，每组3人，开展ELISA综合实验。

（4）实验操作结束，带教老师与学生共同讨论分析实验结果。

具体的实验操作步骤如下：

以测定牛奶和鱼肉中的氯霉素为例，采用酶标抗原的直接竞争法，介绍本实验具体实验步骤。

（1）包板：将抗体用包被液稀释一定的倍数，加入96孔酶标板中，100 μL/孔。37 ℃孵育，过夜。

（2）封板：洗板两次，加入封闭液120 μL/孔，37 ℃孵育，3小時。

（3）样品前处理：封板时，分别对样品牛奶和鸡肉进行前处理。

（4）烘干：将封闭好的板倒掉封闭液，37℃烘干。

（5）加样：加标准品/样本50 ?L/孔，然后加入酶标记物50 ?L/孔，再振荡混匀，用封板膜盖板，37 ℃条件下反应30 min。

（6）显色：洗板4～5次，每次浸泡30s，拍干。每孔加入底物缓冲液50 ?L，再加底物液50 ?L，轻轻振荡混匀，37 ℃或室温环境避光显色10 min。

（7）测定：每孔加入终止液50 ?L，轻轻振荡匀，设定酶标仪于450 nm处测定吸光度值。

（8）结果判定：以标准品百分吸光率为纵坐标，以氯霉素标准品浓度（ng/mL）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以其对应的稀释倍数即为样本中氯霉素实际浓度。

4 结语

ELISA实验是一个综合性实验，涉及到有机化学，食品化学，生物化学以及免疫学等方面的相关知识。因此，学生通过本实验，可以取得以下效果：（1）巩固理论知识，加强对相关知识的理解，并对该技术在食品安全检测领域的重要性有一定的认识。（2）结合视频及具体实验操作，了解整个实验的操作流程。（3）学生之间分组进行实验，加强相互协作及团队意识。

在食品科学与工程、食品营养、食品质量与安全、生物工程等专业的食品分析实验课中，我们为部分同学开设了ELISA综合实验，检测过的对象包括氯霉素、盐酸克伦特罗、三聚氰胺、和孔雀石绿等。本实验内容丰富充实，实验现象生动有趣，深受学生的欢迎。

参考文献

[1]何紫薇，郭琦.酶联免疫吸附（ELISA）技术在食品检验的发展应用[J].生物科技与医药卫生，2011（11）：71-72.

[2]李明尧.酶联免疫吸附（ELISA）技术在食品检验的发展应用[J].中国医药指南，2012，10（35）：380-381.

[3]王守法，阚春月，许学书.酶联免疫吸附试验在食品检测中的应用[J].食品科学，2009，30（23）：489-492.

[4]孙太凡.酶联免疫吸附分析技术在农药残留分析中的应用[J].安徽农业科学，2010，38（22）：11981-11983.

[5]Yu-Dong Shen， Xing-Fei Deng， Zhen-Lin Xu，et al. Simultaneous determination of malachite green，brilliant green and crystal violet in grass carp tissues by a broad-specificity indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay[J].Analytica Chimica Acta， 2011，707（1/2）：148-154.

酶联免疫吸附试验法 篇3

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年11月至2013年5月就诊的梅毒患者243例, 男136例, 女107例, 平均年龄 (41.2±10.3) 岁;其中早期潜伏梅毒37例, 一期梅毒52例, 二期梅毒68例, 三期梅毒44例, 临床治愈后复查42例。以上各期诊断严格依照《梅毒诊断标准》[1]。

1.2 检测方法

对243例患者全部以TRUST、ELISA与胶体金法进行联合筛查检测, 以3种试验中两种及以上试验阳性判别为联合筛查试验阳性, 全部标本以明胶颗粒凝集试验 (TPPA) 进行检测作为对照。TRUST试剂盒由上海荣盛科技有限公司提供、ELISA和胶体金试剂盒由厦门英科新创生物公司提供、TPPA试剂由日本富士株式会社提供, 所有试剂均在有效期内使用, 操作依据试剂盒说明书。

1.3 数据处理

用Excel 2007软件处理全部数据。分别计算4种方法检测各期梅毒阳性率;对联合筛查试验和对照试验各期梅毒检测结果进行比较。

2 结果

2.1 血清标本检测结果

243例各期梅毒患者血清标本4种方法检测结果见表1。对比发现, TRUST法潜伏期、三期梅毒阳性率低于其他3种方法, 一期和二期梅毒阳性率与其他3种方法比较差异无统计学意义 (P均>0.05) , 治愈后复查者阴转率则明显高于另3种方法 (P均<0.01) ;ELISA潜伏期梅毒阳性率低于胶体金法和TPPA, 但差异均无统计学意义 (P均>0.05) , 其余各期阳性率与二者相同;胶体金法潜伏期和一期梅毒阳性率略低于TPPA法, 三期梅毒阳性率低于ELISA和TPPA, 但差异均无统计学意义 (P均>0.05) 。

2.2 联合筛查试验和对照试验结果比较

243例各期梅毒患者血清标本联合筛查试验均为阳性, 对照试验仅潜伏期漏检1例, 其余各期亦均为阳性, 二者各期梅毒检出结果比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 联合筛查试验和对照试验结果比较, 见表2。

3 讨论

梅毒感染途径多, 感染程度轻重不一, 多数患者感染后均有不同程度治疗史, 就诊时临床症状和体征往往不太典型, 使病原学试验难以检出, 因此血清学检查对梅毒的诊断以及判定病程的发展、痊愈和药物疗效具有十分重要的意义[2]。

TRUST为最常用的非梅毒螺旋体血清学试验, ELISA和TPPA为特异性梅毒螺旋体血清学试验, 胶体金法为检测抗体的快速诊断试验。经分析, 患者感染梅毒后, 血清中可出现两类抗体, 一是非特异性心磷脂抗体, 为Ig M和Ig A混合型反应素, 二是特异性梅毒螺旋体制动抗体, 其中特异性梅毒抗体在潜伏期即可产生[3], 非特异性抗体在一期梅毒阶段增加, 非特异性心磷脂抗体出现晚于特异性螺旋体抗体, 且在晚期梅毒及梅毒治疗后此类抗体可转阴。因此TRUST对早期一期梅毒、晚期梅毒、治疗后梅毒、潜伏期梅毒及神经性梅毒不敏感[4];一期梅毒抗体主要有Ig M型, 二期梅毒抗体有Ig M、Ig G型, 三期梅毒抗体主要有Ig G型[5]。ELISA主要检测梅毒混合型Ig G和Ig M抗体, 胶体金法运用纯化的梅毒螺旋体基因工程抗原, TPPA利用梅毒螺旋体天然抗原作为诊断抗原[6], 具有较高的灵敏度, 故三者对各期梅毒皆有较高的检出率, 对梅毒的早期诊断较好。

梅毒病程较长, 病情复杂, 单一检测方法存在一定的假阳性和假阴性, 必须结合病史和症状选择合适的检测策略[6]。为提高检出率, 尽早发现感染者, 降低病损及传播危害, 最大限度维护医患双方利益, 减少医患纠纷, 在梅毒的诊断中采用联合筛查是十分必要的。在组合方法的选择上, 应兼顾各期梅毒的检出效果、疗效观察和实验操作、管理等因素。TPPA虽为公认的梅毒确认实验, 但成本高, 主观判断因素强, 结果不易保存;而ELISA在敏感性、特异性、临床诊断结果上与TPPA无显著性差异[7,8], 其结果清晰易判, 不受主观因素影响, 能长期保存, 操作简单, 便于管理[4], 是作为常规试验的较好方法, 但其主要缺点是在梅毒治愈后长时间存在很高的阳性率, 甚至终身阳性, 不能判断梅毒正在活动与否, 不能检测疗效。TRUST虽然对早期梅毒的辅助诊断差, 但其抗体滴度的变化与梅毒的治疗呈正相关, 适于疗效的观察和复发的辅助诊断[3], 不能被ELISA所完全取代, 二者联合检测确有必要。此次研究, 以“TRUST+ELISA+胶体金”进行联合筛查, 各期梅毒检出率与TPPA对照组比较, 均无统计学意义, 表明以上3种方法联合筛查, 对各期梅毒均可取得良好的检出效果, 且因其中纳入了TRUST, 结合病史和临床症状, 还可监测病程和疗效。

参考文献

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[7]李少玉.不同方法检测梅毒的结果比较分析[J].中国现代药物应用, 2010, 4 (14) :86-87.

酶联免疫吸附试验法 篇4

目前酶联免疫吸附法 (ELISA) 因其具有的灵敏度高, 重现性好, 检测成本低, 操作简单, 样品处理量大等特点, 已成为国内应用最广泛的兽药及违禁添加快速检测方法之一。它是将抗原结合到某种固相载体表面 (酶标板) , 让受检药物和酶标抗原与固相载体上的抗原反应一段时间后, 洗去多余的酶标抗原和杂质, 加入底物显色, 根据颜色反应的深浅进行定性或定量分析。由于酶的催化频率很高, 可以极大的放大反应效果, 从而使测定方法达到很高的敏感度。

ELISA检测对反应条件要求严格, 在检测过程中每一个步骤都有可能对检测结果产生较大影响, 致使同一批次的样品重现性不好或者出现假阴性、假阳性, 这影响到检测结果的准确性, 对此要采取一些相应的预防措施, 以提高检测结果的准确性。

1 ELISA试剂盒的保存

光照的影响试剂盒储存和反应时, 均应避免直接暴露在阳光下, 底物液和部分标准品对光敏感。试剂盒储藏时要在2~8℃温度条件下保存, 忌冷冻, 未使用完的试剂盒应注意把板条放入铝箔袋封口, 并放入干燥剂小袋, 以避免板条受潮失效。

2 检测前准备工作

2.1 检测室温度

试剂盒最佳的检测温度应在20~40℃之间, 温度过高或过低都会降低酶的活性, 而酶活性的降低会影响测量的准确性。试剂盒打开后, 在室内温度下至少平衡半小时, 如果室温低于20℃须在25℃的培养箱中回温。回温后于室温25℃±2℃使用, 使用时应避免阳光直射, 空调或风扇直吹。

2.2 溶液配制

在整个实验中所使用的水均需是蒸馏水。在配制样品提取液和洗涤液时一定要用蒸馏水或去离子水, 不可使用矿泉水或自来水, 否则, 里面的金属离子会对检测结果产生干扰。

2.3 移液枪的使用

加样的枪头需使用一次性的, 微量枪头清洗不干净, 很容易有药物残留, 重复使用会造成交叉污染。检测员在使用八道移液器时, 在吸取时按至第二停点, 将吸头没入试剂液面下2~3 mm, 轻缓松开按钮回原点, 慢慢提出吸头并在容器壁上停靠一下, 以去除多余试剂, 轻按按钮至第一停点, 排出液体, 保持手势不动, 再次将吸头没入试剂液面稍停片刻按至液面下2~3 mm, 轻缓松开按钮回原点, 此即为“吸二打一”式加样, 避免加样时产生气泡, 导致加样不均。加试剂时, 移液器要保持垂直;吸头有试剂时, 移液器不能平放或者倒置, 避免污染移液器, 进而污染其他试剂和样品。

3 检测仪器对检测结果的影响

3.1 酶标仪的影响

仪器每年均需要检定, 以保证仪器的准确性。酶标仪在使用前需预热30 min, 在室温条件下测定, 室温低于15℃时, 需使用加热等方式使室温保持25℃左右, 以确保酶标仪的正常运行。

3.2 微量移液器的影响

微量移液器需每年进行检定, 检定合格方可使用。微量移液器要有机相、水相分开, 贴上标签。在量取不同溶剂需更换枪头, 避免交叉使用造成污染;试剂从试剂瓶中吸出后, 不能再放回瓶中, 防止试剂污染。

4 检测员的操作对检测结果的影响

对于ELISA试剂盒来说, 检测员的熟练度对结果影响很大。检测人员上岗前需进行相关培训, 需具备基本的检测质控知识。熟练掌握ELISA检测方法的原理, 试验检测的目的, 检测员需保持认真负责的工作态度, 在实验前熟读试剂盒说明书, 对试验中的注意事项、重点难点加以标注, 特别要注意:标准品或抗体是否需要稀释、孵育温度是25℃还是37℃、酶标二抗、抗体工作液、底物液、终止液的加样顺序和时机 (试剂顺序加反通常会造成酶标板不显色, 使实验失败) 、酶标仪检测波长是双波长还是单波长。

5 关键点控制

5.1 样品前处理

样品前处理需根据试剂盒说明, 不同的样品种类有不同的处理方式。有些检测项目需要氮气吹干的方式浓缩富集药物, 在实际操作中, 除非试剂盒说明要求吹至尽量干, 否则只要吹干即可。某些样品 (肝脏样品) 剩余一些油脂很难吹干, 这些油脂干扰可以通过下一步的正己烷溶解去除。氮吹时间过长会造成药物损失严重, 回收率降低, 所以在氮吹时应随时查看吹干情况, 吹干后应尽快加溶剂复溶。

5.2 加样

不管什么试剂, 加样前均需摇匀, 加样时需将处理好的样液加在孔板底部, 避免加在孔壁上部。

5.3 洗板

洗板是关系到实验成败的关键步骤。ELISA通过洗板去除未结合抗原抗体和酶标记物, 同时也可以去除非特异性吸附的蛋白质干扰及样本中的部分杂质干扰。

手动用排枪洗板时需注意, 要垂直悬空加入液体, 吸打液体速度不能过快, 以免液体溅出, 造成交叉污染, 按照规定的洗涤液体积进行洗板, 注意不要出现孔间相溢现象。洗液尽量不要满溢或加到板孔外面, 若洗液不小心加到外面, 需用洁净无毛屑的滤纸沾干, 避免板底不洁净, 造成酶标仪读数出现误差。

5.4 孵育

孵育、显色过程中要在恒温箱里避光进行, 以保持温度的稳定。显色时间、温度需按试剂盒的规定来操作, 加完试剂后将微孔板从室温放入恒温箱时, 孔内温度从室温升至恒温箱温度需要一定时间, 尤其在室温比较低的状态下, 这段升温时间可能比较长。通常是将微孔板一放入恒温箱就开始计时, 这样就容易造成实际测定时孵育时间不够, 导致弱阳性样品测不出来。若温度相差大时, 可以适当延长孵育时间2~5 min。孵育时应盖封口膜, 否则会使孔内反应液蒸发, 导致孔板难以彻底洗净影响检测结果。

5.5 显色

底物液过期或配制时间过长也是影响实验结果的重要因素。尽可能在使用前配制底物液, 底物液禁止接触金属物品。加完底物液后的孵育时间依各孔颜色而定, 若反应时间到了, 但酶标板各孔颜色普遍较浅, 可继续显色5~10 min。

5.6 酶标仪判读结果

ELISA试剂盒内显色剂多为TMB (3, 3, 5, 5, -四甲基联苯胺) , TMB颜色底物显色后, 随着时间的延长, 颜色会逐渐消退, 因此显色并终止反应后必须尽快读数, 以免影响检测结果。测定波长一般为450 nm, 有的厂家会设有参比波长630 nm, 使用双波长可以消除试样的背景吸收干扰和混浊干扰。

综上所述, 尽管ELISA法操作简单, 但可能影响检测结果的因素也较多。故在实验操作中, 需严格按照试剂盒操作步骤操作, 同时做好室内质控、室间比对, 以严谨的工作态度对待每一份样品, 避免或减少影响因素的干扰, 力求结果准确, 为进一步加强畜产品质量监管提供可靠的数据支持。

摘要：酶联免疫吸附法 (ELISA) 因其具有的灵敏度高, 重现性好, 检测成本低, 操作简单, 样品处理量大等特点, 已广泛应用于兽药残留及违禁添加药物的快速检测。ELISA虽然操作简单, 但试验操作中各环节对试验的检测结果影响较大, 如不注意, 很可能导致显色不全、重现性不好、假阳性或假阴性的结果。本文对影响ELISA试验的常见因素进行分析并总结出解决方法, 以提高检测的准确性。

酶联免疫吸附试验法 篇5

1 试剂因素

1.1 试剂的选择

试剂的选择是保证血液检测质量的关键因素, 要选购知名度高, 质量有保证, 具有“三证”的试剂, 最好选用配套试剂。也可以和同行交流, 其他实验室对某种试剂盒的实际使用效果, 往往具有很强的说服力, 因此应使用检测口碑好的试剂 (可通过室间质评组织获得[1]) 。不使用过期试剂, 不同批号试剂不能混用, 同批号试剂盒的组分也不可混用。

1.2 试剂的储存运输。

1.2.1 试剂的储存至关重要, 试剂一到科室, 即应立即放入冷藏冰箱, 必须注意不得靠近冰箱后壁, 以防试剂冻结, 影响检测结果。

1.2.2 试剂供应商必须保障试剂在进入科室前运输储存的质量, 试剂盒从出厂到用户手中, 均要历经运输 (如送检、检定、发货等) 及运输中的储存环节, 某一环节不当, 均影响试剂盒的临床使用质量。去年我科有一段时间所做的表面抗原项目, 今天阳性, 同一份标本明天复检有可能是弱阳性甚至阴性, 查找原因可能是这批试剂在进入科室前储存温度出现了问题, 与试剂商联系更换新的批号试剂后, 此现象消失。

1.3 试剂的准备

在临床实验室, 试剂的准备一般不太注意, 工作人员通常在试验时将试剂从冰箱中拿出来就用, 其直接后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此酶联免疫吸附试验中, 试剂准备最关键的是使试剂盒在使用前与室温平衡, 以满足检测要求, 一般检测前30 min即应将试剂盒从冰箱中取出, 检测时试剂盒可与室温平衡。

2 标本因素

标本因素包括标本溶血、被污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。

2.1 标本溶血

血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶活性, 因此以辣根过氧化物酶为标记的酶联免疫吸附试验测定中, 如血清中血红蛋白浓度较高, 很容易在温育过程中吸附于固相, 从而与后面加入的辣根过氧化物酶反应显色, 造成假阳性。因此在采血过程中应注意, 采集血液标本时应缓慢抽动, 注射器插入生化管应让血液自动靠负压注入生化管, 不能用手推注射器栓塞, 以防标本溶血。处理方法:若轻微溶血影响还不大, 若为中度或重度溶血, 则必须与临床联系, 重新抽取标本, 并讲清楚正确采集血标本的重要性。并由有关部门定期培训临床护士怎样正确采集血液标本。

2.2 标本被污染

菌体可能含有内源性过氧化物酶, 可出现非特异性显色, 因此宜用新鲜标本, 如有特殊情况, 应冰箱保存或冰冻保存, 并应加盖保存。阳性结果应重抽血双孔复检。

2.3 标本的保存

标本在冰箱中保存时间过长, 可能造成污染或效价降低, 可引起假阴性, 因此应尽量用新鲜标本。冰冻标本应避免反复冻融, 因冰冻标本的反复冻融产生的机械力对标本中的蛋白分子有破坏作用, 可引起假阴性[2]。

2.4 标本凝固不全

标本凝固不全的血清中有部分纤维蛋白原, 影响结果。有的工作人员着急赶时间, 刚采集的标本就离心 (虽然现在都采用促凝生化管) , 结果刚离心完血清还可以, 但是在洗涤时, 此孔血清呈果冻状, 显然反应不完全。处理方法:标本采集后在37℃水浴30 min后再离心, 以3500转/min离心5 min可获得满意标本[3]。

3 操作因素

3.1 加样

孵育前加样时间过长, 漏加样本, 酶试剂加入孔外, 用滴瓶滴加试剂时加量不准等都可使试验结果不可靠。处理方法: (1) 标本过多时, 可分批操作, 标本要轻拿轻放, 防止标本溅出交叉感染; (2) 加完样品封板前要仔细观察反应板, 看是否有样品漏加, 以便及时发现; (3) 加酶试剂后可用吸水纸吸干孔外试剂; (4) 使用滴瓶加试剂时, 应垂直滴加, 匀速滴加, 以免速度过快有的孔中多加1滴试剂, 建议采用微量加样器加试验中的所有组分; (5) 加样器应定期校准, 消毒, 吸头要一次性使用, 以免交叉污染。

3.2 温育

温育是最为关键、最容易出现问题的步骤;温育的时间、温度选择一般按照试剂盒说明进行, 加完样本和试剂后微孔板放入水浴箱或温箱中, 孔内温度从室温升至摄氏37℃需一定时间, 若一放入就计时, 就容易造成孵育时间不够, 易致弱阳性标本检测不出。处理方法: (1) 可采用适当延长几分钟时间 (大约2 min) ; (2) 可把反应板封板后直接放入37℃水浴箱水中; (3) 用37℃孵育箱将是不错的选择。

3.3 洗板

3.3.1 洗涤液的配制, 按照说明书要求1∶20稀释, 看似很简单, 但必须注意一些细节问题: (1) 注意洗涤液是否有结晶析出, 冬天洗涤液易结晶, 如不注意很容易堵塞洗板机管路。处理方法:事先将洗涤液置37℃水温箱中预温一会再行配制就可解决。 (2) 要注意去离子水的pH值。处理方法:用0.1nNaOH调节pH值至7左右。

3.3.2 洗板有两种, 即手工洗板和洗板机洗板。采取手工洗板, 孔与孔之间液体易交叉;采取洗板机洗板时, 洗液量不足导致洗板不彻底, 针孔堵塞导致抽吸不完全, 清洗效果差。处理方法: (1) 手工洗板时, 孔内洗液不能溢出, 拍板时要垂直, 但用力不能过猛, 防止抗原抗体复合物脱落; (2) 用洗板机洗板, 洗涤液要新鲜配制, 洗板机要经常检查冲洗头是否畅通, 洗涤液瓶应定期彻底清洗, 要定期检查整个管路, 疏通管路, 若针头被堵塞, 可用注射器排除; (3) 我科采用机洗5遍人工加洗1遍, 效果较好; (4) 洗板时, 吸水纸不可重复使用; (5) 洗完板时, 应充分扣干反应孔, 可用吸水纸包住反应板扣干。

3.4 显色

要严格按照说明书进行, 充分显色到预定时间后加入终止液。

3.5 测定

加入终止液后用酶标仪检测, 酶标仪需预热15 min~30 min, 因反应板加入A、B显色剂后在37℃放置30 min, 反应板底部会有水雾, 检测时可出现假阳性, 上机前一定要在吸水纸上吸干。

在以上的操作过程中, 要保持试验的连续性, 有的工作人员在洗完板时, 因故未能及时加A、B显色液, 会对测定结果造成影响, 因此要注意试验的连续性, 这一点至关重要。

综上所述, 尽管酶联免疫吸附试验测定操作简单, 但影响测定结果的因素较多, 所以工作人员要加强责任心, 在操作过程中不能有一点疏忽, 要严格按照试剂盒说明书操作, 尽量避免或减少影响因素, 保证检验质量。

参考文献

[1]马斌国.现代临床检验质量保证[M].太原:山西科学出版社, 2001:6.

[2]李会英.酶联免疫吸附试验影响因素的分析[J].检验医学与临床, 2007, 4 (10) :985-986.

酶联免疫吸附试验法 篇6

1 材料与方法

1.1 样本与试剂

北京康彻思坦生物技术有限公司HbsAg标准品 (标准值:2ng/ml) , 批号GBW (E) 090072;珠海丽珠试剂股份有限公司生产的ELISA试剂盒。

1.2 仪器

MR-96A酶标仪, 深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司;移液器 (50μl) , 大龙医疗设备 (上海) 有限公司。

1.3 方法

以试剂盒说明书为参照, 基本流程为, 移液器加入血清和酶标抗体, 37℃孵育30min后洗涤, 然后加入显色剂A、B液, 37℃孵育15min, 然后加终止液, 最后酶标仪比色。HbsAg的不确定度包含测量重复性、操作过程以及酶标仪比色的不确定度。

1.4 数学模型

通过标准系列的OD值测定, 建立标准线性曲线, 数学模型为:y=x, (x—被测样本的浓度, 单位为ng/ml;y—被测样本的浓度, 单位为ng/ml) 。

2 结果

2.1 不确定度的计算

2.1.1 输入量的标准不确定度的分析与计算

由于工作曲线非线性引起的输入量x的标准不确定度分项u1。分别对质控血清中的HBsAg标准系列进行5次重复测定, 其吸光度/值测量数据见表1。

根据测量数据用线性回归法得标准工作曲线:Y=0.012+0.244x, 相关系数为r=0.999 6。

对于拟合的标准工作曲线非线性引起的不确定度u1=Sy/[∑ (xi-x) ]1/2=4.73×10-3v1=4。

测定未知样本浓度时重复性引起输入量X的标准不确定度分项u2, 测定5次结果分别为0.672、0.668、0.675、0.670、0.675。

实验标准差s通常可采用贝塞尔法计算:u2=S/n1/2=1.38×10-3v2=4。

2.1.2

由酶标仪测定OD值引起的不确定度为u3。u3由市质量技术监督局检定酶标仪并提供不确定度0.005, 自由度v3=47。

2.1.3

移液器实验过程中造成的不确定度u4, 移液器检定证书提供的数据, 加样量为50ul的误差为0.004。u4=0.004/31/2=2.31×10-3v4→∞。

2.2 合成标准不确定度

由于u1、u2、u3、u4各自独立, 因此u= (u12+u22+u32+u42) 1/2=7.39×10-3

有效自由度veff=21.40≈21。

2.3 扩展不确定度

Up=kp×up=95%kp=t95 (21) =2.080U95=2.080×0.007 39=0.015。

3 结论

综上所述, 实验中的HBsAg不确定度由直线回归曲线的标准差、酶标仪的不确定度、测量值的标准偏差、移液器的不确定度组成, 其它的因素可忽略不计。

结果得出该未知血清的HBsAg浓度为0.672ng/ml, 扩展不确定度U95=0.015ng/ml (自由度为21) 。

参考文献

酶联免疫吸附试验法 篇7

1 明确ELISA检测“乙肝二对半”的重要性

ELISA是目前临床上最常用的免疫标记技术, 是免疫检验技术课程的重要内容之一, 而ELISA检测“乙肝二对半”是ELISA在临床上应用的代表, 其灵敏度高、特异性强、操作简单, 同时运用到ELISA的3种方法, 即双抗体夹心法、双抗原夹心法、竞争抑制法, 是在学习了抗原抗体反应等基础上进一步学习的内容, 起到承前启后的作用。掌握这项技术可为以后的临床工作打下牢固的基础。

2 确立ELISA检测“乙肝二对半”的重点、难点

由于授课对象是检验专业的学生, 对其而言, 掌握操作过程和判断实验结果最重要, 因此, 应把操作方法及结果判断列为重点内容;而掌握实验原理对于中职生来说有一定难度, 所以列为难点内容。在教学过程中, 一方面, 安排的任务要符合学生实际, 注意任务的层次性;另一方面, 要根据实际情况灵活调整教学进度和深度。

3 合理运用各种教学方法

3.1 PBL教学法

PBL是以问题为基础的教学法, 它最大的优势, 就是要求学生主动学习。在学习过程中, 学生可以自主地探索某些问题, 虽然有时可能是失败的探索, 但是他们从失败中获得了智慧, 从成功中得到了快乐, 从学习中获得了经验。研究表明[1,2], 采用PBL教学法可以激发学生的学习热情、培养学生创新思维及自学能力、提高人际交往及协作能力、形成终身学习意识, 在以后的工作中更具开拓精神。

本次实验设计了以下问题: (1) 什么是乙型肝炎?它的病原体是什么? (2) 什么是“乙肝二对半”?想知道是否感染了乙肝病毒可以做什么检查? (3) 什么是酶联免疫吸附试验?ELISA检测“乙肝二对半”的原理是什么?如何进行操作及判断结果?如何解释得出的实验结果?什么是“大三阳”?激发学生的求知欲和探究欲, 促使学生主动学习实验所涉及的相关知识, 为实验打好理论基础。

3.2 实验操作多媒体演示法

很多中职生接受能力较差, 对做好ELISA没有信心。实验课可通过播放高年级学生的实验操作录像, 把操作内容直观、形象地展示给学生, 便于学生理解和掌握, 达到增强学生信心的目的:学长能做到的, 我们也能做到。

3.3 情境角色扮演法

本次课给学生创设情境, 让学生扮演检验科的“医生”和“病人”角色, 在角色扮演中学习, 在解决问题中达到理论和实践的有机结合, 即“做中学, 学中做”, 强调工作过程的整体性, 注重职业情境中实践能力的培养, 锻炼了学生的动手能力、分析和解决问题的能力。

3.4 启发、归纳教学法

从临床检验实际出发, 启发学生对ELISA的认识, 培养和提高学生团队协作精神及学习的积极性、主动性;引导学生以探讨、研究的方式, 认识思考和解决问题。

通过本次实验课, 引导学生归纳出5个检测项目操作步骤的异同, 举一反三, 更好地进行ELISA的相关检测。

4 加强对学生学习方法的指导, 培养学生的自学能力

最有价值的知识是关于方法的知识, 掌握了正确的学习方法就像有了能打开知识大门的金钥匙, 因此, 教师应当加强对学生学习方法的指导, 把金钥匙交给学生。本次课主要让学生学会以下学习方法。

4.1 问题讨论学习法

通过问题的导入, 让学生讨论, 并在操作过程中发现问题、分析问题、解决问题。让学生学会分析、归纳, 提高解决问题的能力。

4.2“一读、二联、三写、四练、五创”的学习方法

“一读”, 指教师指导学生阅读教材, 对学习好的学生指导其阅读课外资料和相关参考书。要求学生遇到问题, 学会查阅相关资料, 如实验操作说明书、微生物检验技术中乙肝病毒相关知识等。

“二联”, 指教师指导、启发学生进行联想, 把与问题相关联的知识串联起来, 理成线, 织成网, 总结出规律, 同时学生间相互讨论。学生学会将知识前后联系, 融会贯通;本次实验要求学生归纳出乙肝病毒5项检测指标操作、结果判断的异同, 以锻炼学生概括能力。

“三写”, 指学生在学完一章后, 写出知识要点和小结, 以培养学生的文字概括、写作和书面表达能力。在本次实验后要求学生概括出“乙肝二对半”所需试剂种类、操作步骤、结果判断, 加深对实验的印象。

“四练”, 指让学生自己动手做实验, 培养和提高其实验操作能力。

“五创”, 指教师尽量开拓学生的视野, 培养学生举一反三的知识迁移能力和创新精神, 把所学操作知识运用于临床检验工作。

通过学习方法指导, 既要学生学会, 又要学生会学, 在教知识的同时教方法。

5 合理安排实验各环节

(1) 做好实验前准备工作。实验课前一周进行实验分组, 布置学习任务, 让学生通过各种途径, 如利用网络查阅相关资料, 获取ELISA检测“乙肝二对半”的相关知识, 为实验打下良好的理论基础。

(2) 在实验过程中严格小组操作, 发挥“小老师”的监督作用。每个小组选出一位能力较强的组长进行培训, 做“小老师”, 全程负责监督, 从而保证实验顺利进行, 事实证明, 这个方法行之有效。同时, 教师负责巡回, 给予必要的指导和纠正;注意实验原理的分析, 及时了解学生对实验的掌握情况。

(3) 实验结果的判断。让学生自己思考判断, 记住自己的实验结果, 教师检查, 给予必要的指导和纠正, 激发学生的求知欲, 锻炼他们独立分析、解决问题的能力。在实验时要注意学生个人隐私的保密, 注意乙肝防治知识的拓展。

(4) 实验小结。实验结束后, 要及时进行总结, 由一位学生总结本次实验心得, 其他学生补充, 最后教师加以点评, 以加深对本次实验的印象, 锻炼学生的概括、总结能力。

(5) 课后布置作业, 加深印象, 进一步巩固所学知识;同时开放实验室, 让学生到实验室进行操作练习, 巩固操作技能。

6 实验反馈和评价

本实验的目标是让学生学会正确操作、结果判断和分析, 同时训练及提高学生的操作能力, 培养团体合作精神。只要学生得出正确的实验结果, 书写检验报告, 并且课后能独立完成布置的作业, 就达到了本次实验的目的。当然, 要熟练掌握一项实验技能不是一次实验课就能够实现的, 需要不断地巩固和练习。

总之, 在ELISA检测“乙肝二对半”的实验教学中, 学生充分认识到本次实验的重要性, 采用恰当的教学方法, 加强对学生学习方法的指导, 充分发挥学生学习的主动性, 合理安排实验各环节, 使学生更好地掌握操作技能。

参考文献

[1]魏红蕾, 方芳, 刘慧珠, 等.PBL教学法在临床护理教学中的应用[J].解放军护理杂志, 2005, 22 (7) :81~82.

酶联免疫吸附试验法 篇8

1 资料与方法

1.1 对象

收集郑州大学第一附属医院2013年3月1日-2013年9月30日门诊和住院患者818例, 男182例, 女636例, 年龄在8~80岁, 平均 (42.4±17.3) 岁。按照临床诊断将病例分为SLE组与非SLE组, SLE组360例, 非SLE组458例, 包括类风湿关节炎 (RA) 128例、干燥综合征42例、皮肌炎55例, 显微镜下多血管病41例, 混合结缔组织病27例, 抗磷脂抗体综合征17例, 硬皮病10例, 风湿性多肌病9例, 其他疾病129例。SLE的诊断依据1997年美国风湿病学学会修订的SLE分类标准[2], 非SLE的各类疾病均符合相应的国际分类诊断标准。采集受试者肘静脉血, 离心分离血清, 当日完成检测。

1.2 试剂和仪器

1.2.1 试剂

抗核小体抗体Ig G试剂盒 (酶联免疫吸附法) 和抗核抗体谱 (Ig G) 试剂盒 (欧盟印迹法) 均为德国EUROIMMUN公司产品。

1.2.2 仪器

芬兰雷勃Multiskan MK3型号酶标仪, XD236自动蛋白印迹仪为上海迅达医疗仪器公司产品。

1.3 方法

1.3.1 ELISA法

采用德国EUROIMMUN公司生产的抗核小体抗体Ig G试剂盒 (酶联免疫吸附法) , 方法及步骤如下:已包被核小体的微孔板中加入1∶201稀释的血清100μL, 室温孵育30 min, 冲洗3次后加入100μL酶结合物, 室温孵育30 min, 冲洗3次后加入100μL底物显色剂, 室温避光孵育10 min后每孔加入100μL终止液, 在30 min内应用酶标仪450 nm比色, 检测A值。结果判定:以20RU/m L作为Cut-off值, 结果<20 RU/m L为阴性, 结果≥20 RU/m L为阳性。

1.3.2 Western blot法

采用德国EUROIMMUN公司生产的抗核抗体谱 (Ig G) 试剂盒 (欧盟印迹法) , 方法及步骤如下:患者样本用样本缓冲液1∶101稀释, 取所需膜条用1.5 m L样本缓冲液预处理5 min, 吸去孵育槽中的液体, 加入1.5 m L已稀释的血清样本, 在摇床上室温孵育30 min, 清洗3次, 每次5 min, 加入1.5 m L稀释的酶结合物室温孵育30 min, 再清洗3次, 每次5 min, 加入1.5 m L底物液室温孵育10min, 用蒸馏水清洗膜条3次, 每次1 min, 取出膜条风干后按照膜条上条带标记位置判读结果, 与非抗原包被区比较, 阳性反应将在相应的抗原处呈现深色条带, 抗原位置出现白色条带判读为阴性。

1.4 统计学分析

采用SPSS 17.0统计学软件对数据进行分析。ELISA与WB检测Anu A的阳性率比较采用χ2检验, 两种方法诊断SLE的准确度比较采用χ2检验, 敏感性和特异性比较采用ROC曲线分析, 曲线下面积比较采用Z检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISA和Western blot两种方法检测结果

ELISA与WB检测818例患者Anu A阳性率分别为35.1% (287/818) 和31.1% (254/818) , 两者差异有统计学意义 (χ2=14.4, P<0.05, 见表1) 。两种方法检测Anu A结果的总一致率为91.3%, 其不一致情况以WB阴性而ELISA阳性多见 (6.4%) 。以SLE的临床诊断为金标准, 360例SLE患者中, ELISA与WB检测Anu A阳性率分别为72.5% (261/360) 和66.1% (238/360) , 两者差异有统计学意义 (χ2=9.13, P<0.05) ;两种方法检测SLE的准确度分别为84.7%和83.1%, 差异无统计学意义 (χ2=0.766, P>0.05) ;ELISA检测Anu A诊断SLE的敏感度为72.5%, 特异度为93.2%, WB检测敏感度为66.1%, 特异度为96.5% (见表2) , 两者ROC曲线下面积分别为0.840和0.813, 差异无统计学意义 (Z=1.23, P>0.05, 见附图) 。

2.3 ELISA和Western blot检测Anu A结果分析

818例患者中, ELISA共检测出287例Anu A阳性, 其中261例为SLE患者, 19例为非SLE自身免疫病患者, 7例为其他疾病患者;WB共检测出254例Anu A阳性, 其中238例为SLE患者, 7例为非SLE自身免疫病患者, 9例为其他疾病患者。

SLE组中, ELISA检测结果<20 RU/m L的99例患者中, 84例 (84.8%) WB检测结果为阴性, 15例 (15.2%) WB检测为弱阳性;ELISA检测结果为 (20~99) RU/m L的83例患者中, 38例 (45.8%) WB检测结果为阴性, 29例 (34.9%) WB检测结果为弱阳性, 16例 (19.3%) WB检测结果为阳性;ELISA检测结果>100 RU/m L的患者中, WB检测结果均为弱阳性和阳性, 以阳性者居多 (148/178, 83.1%) (见表3) 。非SLE组中, ELISA检测结果<20 RU/m L的432例患者中, 仅4例 (0.9%) WB检测结果为弱阳性, 其余428例 (99.1%) 患者WB检测结果均为阴性;ELISA检测结果为20~99 RU/m L的19例患者中, 13例 (68.4%) WB检测结果为阴性, 其余6例 (31.6%) 检测结果为弱阳性;ELISA检测结果>100 RU/m L的7例患者中, 6例 (85.7%) WB检测结果为阳性, 仅有1例 (14.3%) 患者ELISA检测值>200 RU/m L而WB检测结果为阴性。见表4。

3 讨论

系统性红斑狼疮是一种累及多系统、多脏器的自身免疫性疾病, 其特征是患者体内可产生多种针对细胞核结构和组分的自身抗体。Anu A是以核小体为靶抗原而产生的自身抗体, 属于自身抗体的一种。近年来研究显示, Anu A比抗ds DNA抗体和抗组蛋白抗体更早出现于系统性红斑狼疮的早期[3], 特异度较高, 并且Anu A与SLE疾病活动性及狼疮性肾炎 (LN) 的发生明显相关[4,5]。

目前检测Anu A的方法较多, 有化学发光免疫分析 (CLIA) 、WB、ELISA、间接免疫荧光法 (IIF) 、胶体金免疫层析法 (CGCIA) 和酶联免疫斑点法 (ELISPOT) 等。本研究针对以上检测方法, 选择了在临床工作中应用较多的ELISA法和WB法进行比较, 并结合临床诊断对两种方法进行对比分析, 客观评价二者的试验性能。WB用于体外定性检测血清或血浆中的人抗核小体的Ig G类抗体, 操作简便, 适合基层实验室开展。张国庆等[6]人应用免疫印迹法检测Anu A, 显示在SLE中阳性率达72.4%, 敏感度72.4%, 特异度达97.7%。ELISA用于在体外定量或半定量检测人血清或血浆中抗核小体Ig G类抗体。DOSTAL等[7]应用ELISA检测Anu A在SLE中的阳性率为73%, Anu A在SLE患者、狼疮性肾炎患者及神经精神性狼疮患者体内的浓度分别为为76 IU/m L, 139 IU/m L和117 IU/m L, 远高于其他自身免疫病患者及健康对照。SULEIMAN等[8]对90位SLE患者应用ELISA法进行检测, Anu A阳性率 (52.2%) 高于抗ds-DNA抗体阳性率 (36.7%) 。秦莉[9]等对ELISA法检测Anu A进行系统评价, 结果显示Anu A对SLE的诊断平均敏感度为64.9%, 平均特异度为92.6%, 提示其漏诊率高 (34.1%) , 误诊率较低 (7.4%) ;并推荐ELISA法检测Anu A用于SLE诊断, 但也表明该方法不适合用于SLE筛查。胡学芳等[10]人应用ELISA法检测122例SLE患者, 结果显示Anu A阳性率为68.85%, 敏感性为68.85%, 特异性为90.91%, 并且Anu A在SLE合并LN的患者中阳性率为84.48%, 提示Anu A与SLE的肾损害有明显关系。

本研究结果显示, ELISA检测Anu A阳性率 (35.1%) 高于WB (阳性率31.1%) , 两者差异有统计学意义 (P<0.05) , ELISA检测值较高时WB的灰度也较深, ELISA检测值较低时WB的灰度也较浅, 多为弱阳性。ELISA检测结果阳性而WB检测结果阴性时, ELISA检测值多在20~99 RU/m L之间, ELISA检测结果阴性而WB检测结果阳性时, WB检测结果均为弱阳性, 说明两种方法检测Anu A结果的总一致率较高, 符合性较好。

在SLE的诊断方面, 两种方法对SLE诊断的敏感性和特异性比较采用ROC曲线分析。ROC曲线即受试者工作特征曲线, 是反应敏感度和特异度连续变量的综合指标, 其曲线下面积越大, 诊断准确性越高, 可用于两种诊断方法的统计学比较。ELISA与WB诊断SLE的ROC曲线下面积分别为0.840和0.813, 提示两者对SLE的诊断准确性均较高, ELISA略高于WB, 但是两者差异无统计学意义 (P>0.05) 。ELISA检测SLE的敏感度为72.5%, 特异度为93.2%, WB检测SLE的敏感度为66.1%, 特异度为96.5%, 与国内外文献基本相符[6,7,8,9,10]。

因此, ELISA与WB检测Anu A的总一致率高, 对SLE诊断的准确度较高, 敏感度和特异度均较好。目前, 在我国风湿病实验室普遍采用WB进行抗核提取物抗体谱 (ENA) 的检测, 虽然WB与ELISA检测Anu A在SLE诊断中的准确度及ROC曲线下面积差异无统计学意义, 但是ELISA可以定量检测Anu A的浓度, 可以观察血清抗体的变化与临床和实验室指标的相关性, 对疾病的监测和指导更优于WB检测方法, 不过ELISA检测试剂价格高于WB, 在基层实验室的开展也有很大的局限性。因此, 应用WB进行Anu A检测的初筛, 需要时应用ELISA进行复检, 可以提高6.4%的Anu A检测阳性率, 为临床提供更好的SLE诊断及疾病活动度的信息。

摘要：目的 比较酶联免疫吸附法 (ELISA) 和免疫印迹法 (WB) 检测抗核小体抗体 (Anu A) 的差异, 为临床工作寻找合适的检测方法。方法 收集818例临床血标本, 其中系统性红斑狼疮 (SLE) 360例, 其他自身免疫性疾病458例, 同时采用ELISA和WB两种方法检测样本血清中Anu A, 计算每种方法的敏感度、特异度、ROC曲线, 并运用SPSS 17.0进行统计学分析。结果 ELISA与WB检测Anu A的阳性率分别为35.1%和31.1%, 两者差异有统计学意义 (P<0.05) 。准确度、敏感度和特异度无差异。结论 ELISA与WB检测Anu A的总一致率高, 对SLE诊断的准确度较高, 敏感度和特异度均较好。提示临床监测时, 可应用WB进行Anu A检测的初筛, 需要时应用ELISA进行复检, 可以提高6.4%的Anu A检测阳性率, 为临床提供更好的SLE诊断及疾病活动度的信息。

关键词：酶联免疫吸附法,免疫印迹法,抗核小体抗体

参考文献

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