酶联免疫技术（共11篇）
酶联免疫技术 篇1
随着食品工业的发展, 传统分析方法已远不能满足食品检测的要求。人们需要灵敏度高、特异性强、简便快捷的检测方法, 而生物技术的发展使这一要求成为可能。根据近年来国内外的研究进展, 本文将对酶联免疫测定技术在食品检测中的应用做一简单的介绍。
1 基本原理
酶免疫方法和其它免疫技术一样, 都是以抗体和抗原的特异性结合为基础的, 其差别在于酶免疫方法以酶或者辅酶标记抗原或者抗体, 用酶促反应的放大作用来显示初级免疫学反应, 使检测水平接近放射免疫测定法。酶免疫测定法可分为非均相免疫测定法和均相免疫测定法, 非均相法又有固相法和液相法之分。实践中, 常用的是非均相酶固相免疫测定法即ELISA法, 该法将抗原或抗体结合到固相载体表面, 将抗原或抗体相关物质与酶交联成酶结合物, 一方面保持了与相应抗原或抗体结合的免疫特性, 另一方面还具有酶活性。当酶结合物同相应的抗原或抗体结合后, 则形成酶标抗原抗体复合物, 复合物上的酶遇到相应底物时, 可以催化产物水解、氧化或还原, 从而产生有色物质。根据有色物质的有无及其浓度, 即可间接推断被检样品中有无相应抗原或抗体存在, 数量多少, 从而达到定性和定量测定的目的[1]。
在实际应用中ELISA技术主要有直接法、间接法、双抗体夹心法、直接竞争法、间接竞争法、捕获包被法、ABS-ELISA法、PCR-ELISA法、A蛋白酶联法、斑点免疫吸附法和组织印迹法等几种类型[2]。
2 在食品检测中的应用
2.1 食品中有毒有害物质的检测。
2.1.1 食品中微生物的检测。
目前传统的微生物学方法仍然是食品检测中常用的方法, 但存在操作繁琐、工作量大等缺点。对大部分微生物来说, 用传统方法检测至少需要4~5d的时间, 有些致病微生物甚至无法进行人工培养。而使用ELISA方法, 比常规培养法要提前3~4d出结果, 不需要特殊试验设备, 肉眼即可观察结果, 且样品易保存。沙门氏菌是引起细菌性食物中毒的主要致病菌之一, 田银芳[3]等应用直接ELISA方法对350份奶样进行沙门氏菌的检测, 与常规方法相比, 该法的敏感性和特异性分别为100%和99.7%, 所需检测时间仅为2~3d。
2.1.2 食品中毒素的检测。
目前发现能引起人中毒的霉菌代谢产物至少有150种以上, 常见的产毒性真菌有曲霉菌属、青霉菌属、镰刀菌属等, 其中最常见且研究最多的是黄曲霉毒素、赭曲霉毒素等。Biancardi[4]用ELISA检测牛奶中黄曲霉毒素AFTM1的残留量, 结果表明, 当黄曲霉毒素AFTM1浓度大于30ppt时, ELISA比高效液相色谱的精确度和准确度要高。
2.1.3 食品中残留药物的检测。
药物残留是指药物使用后残存于食品原料与半成品食品及成品中的微量药物原体、有毒代谢物、降解物以及杂质的总称。食品中残留的药物、抗生素等不仅直接危害到消费者的健康, 而且也影响我国的农副产品出口。这一问题已引起人们的高度重视。传统的分析方法不仅需要昂贵的仪器设备, 且操作烦琐对药物中毒事件不能快速做出诊断。
自1983年以来, ELISA成为许多国际权威分析机构 (如AOAC) 分析残留农药的首选方法。ELISA技术已广泛用于有机磷类、有机氯类、除虫菊酯、磺胺类等农药残留的检测。董玉华等[5]采用间接竞争酶联免疫吸附分析方法, 来测定海水样品和海洋贝类中的有机氯农药滴滴涕及其主要代谢产物的含量。张婧等[6]在前期建立溴氰菊酯间接竞争ELISA检测方法的基础上, 成功研制组装出溴氰菊酯残留检测ELISA试剂盒, 基本满足了溴氰菊酯残留检测的需要。
近几年, “瘦肉精 (盐酸克伦特罗) ”、三聚氰胺引起的食物中毒每每见诸报端。陈继明等[7]在黄永科等的研究基础上建立了克伦特罗ELISA测定方法, 用该法检测动物尿样、脏器或饲料等样品, 检测范围为15.6μg/ml~1.90ng/ml, 表明该法灵敏度高、特异性强。王黎丽[8]等建立三聚氰胺直接和间接竞争ELISA检测方法, 线性检测范围分别为0.05~10μg/L和0.1~1000μg/L。
2.1.4 食品中过敏原的检测。
对于鱼类的过敏反应是严重的食物过敏反应之一, 严重者能引起窒息死亡。为此世界上很多国家的食品机构要求在预包装食品的标签上强制实施鱼类成分标识。2007年, Faeste等[9]提出用夹心ELISA法检测鱼类过敏源, 该方法成功地检测出了多种鱼类。检测限为每千克食物中含鱼小清蛋白0.01mg, 相当于每千克食物中5 mg鱼肉。这种结果已经足以控制食品中的鱼蛋白含量, 降低对鱼类过敏消费者发生过敏反应的风险。
2.2 食品中生理活性物质的检测。
食品中常含有一些生理活性物质, 由于食品成分十分复杂, 研究人员一直在寻找快速、准确的检测出这些活性物质的方法。乳铁蛋白是一种铁结合糖蛋白, 具有多种生理活性。张英华[10]等应用ELISA检测牛初乳中乳铁蛋白的含量, 最小检出量为0.5ng/m L, 与通常采用的电泳法和免疫扩散法相比, 具有快速、准确, 可同时检查几十个甚至几百个样品的优点。朱慧莉[11]等用ELISA检测免疫球蛋白。免疫球蛋白是一类具有抗体活性且能与相应抗原发生特异性结合的球蛋白, 也是人类体液的一种免疫因子, 能杀死细菌和病毒, 增强机体的防御能力。近年来, 研究人员将1g用作食品添加剂生产保健食品, 如婴儿配方奶粉、乳珍等。常规的蛋白质分析方法无法检测1g的含量和活性, 应用ELISA可以成功的解决这个问题。
2.3 转基因食品的检测。
随着转基因食品的不断普及, 越来越多的国家要求对转基因产品实行标签制度, 这就对对转基因食品的检测提出了更高的要求。转基因食品或使用转基因原料的食品检测除了PCR技术直接检测转基因外, 还能用ELISA法检测某些特定的转基因表达蛋白, 以分析食品的原料是否来自转基因生物。
白卫滨等[12]以美国、阿根廷、巴西转基因大豆等为材料, 建立了ELISA法定量检测抗草甘膦转基因大豆CP4EP-SPS蛋白的方法, 成功检测出不同转基因大豆中CP4EP-SPS蛋白的含量, 从而为抗草甘膦转基因大豆中CP4EPSPS蛋白的定量检测提供了有效的手段。
3 发展趋势及展望
酶联免疫吸附技术具有检测快速、专一、灵敏的特点将在食品检测分析方面将得到广泛应用。食品中所研究的大小分子物质都可能直接或间接地成为抗原, 因此基本可以实现用ELISA方法对食品中的各种物质进行检测, 从而对各种病毒害物质进行控制, 保证食品安全。
参考文献
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酶联免疫技术 篇2
建立灵敏度高和特异性强的.己烯雌酚残留检测分析方法. 用人工合成的己烯雌酚免疫原多次免疫家兔,获取高效价抗体.纯化抗体经生物素标记,可同辣根过氧化物酶(HRP)标记的亲和素特异结合.采用纯化的抗体包被96孔板,形成固相抗体.加入不同浓度的己烯雌酚标准品后,再加入生物素标记抗体,以酶标记亲和素作为探针,经酶底物显色反应可获得良好的ELISA标准曲线. 该方法检测灵敏度为0.125 ng/mL,可定量检测范围为0.25～15.60 ng/mL. 该方法操作简便,具有较强灵敏度和特异性,可满足实践中一般样品的残留检测.
作 者：邴爱英 成连贵 褚新星 牛钟相 BING Ai-ying CHENG Lian-gui CHU Xin-xing NIU Zhong-xiang 作者单位：邴爱英,BING Ai-ying(山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271000;泰山医学院基础医学部,山东,泰安,271000)
成连贵,CHENG Lian-gui(滨州职业学院生物工程系,山东,滨州,256624)
褚新星,牛钟相,CHU Xin-xing,NIU Zhong-xiang(山东农业大学动物科技学院,山东,泰安,271000)
酶联免疫技术 篇3
【关键词】 酶联免疫试验；测定结果；分析前因素；解决办法
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2013.11.815 文章编号：1004-7484（2013）-11-6794-01
ELISA作为一种酶联免疫技术，它在固相板孔待测抗体以及抗原的检测过程中得到了十分广泛的应用[1]。ELISA自1971年被首次报道以来，由于其具有易于标准化、简便、敏感以及快速等优点，其在临床试验中的应用范围也变得越来越广[2]。随着基因功能以及计算机技术的不断发展，ELISA变得更加标准化，其实用性也随之提高，目前，此项技术已经成了临床试验过程中最常用的检测方法之一[3]。本研究将对影响酶联免疫试验测定结果的因素以及解决措施展开分析探讨，现报告如下。
1 影响测定结果的外源性因素与解决措施
1.1 标本溶血 在对临床标本进行检测时，一旦出现标本溶血的情况，就会使得标本中出现大量含有过氧化物酶活性的血红蛋白。在对此类标本进行ELISA测定时，如果将辣根过氧化物酶作为标记物，那么就会导致标本出现非特异性显色的情况，对最终的测定结果造成负面干扰。因此，在对此类标本进行采集以及处理时，一定要避免其出现溶血的情况，一旦出现此类情况就必须对标本进行重新采集，否则就会得出错误的试验结果。
1.2 细菌对标本造成污染 由于细菌的体内可能存在内源性辣根过氧化物酶，因此，在对标本进行ELISA测定时，受到含有在内源性辣根过氧化物酶细菌污染的标本会出现非特异性显色的情况，对最终的测定结果造成负面干扰。因此，在对标本进行采集时，一定要严格执行无菌操作的标准，同时在对标本进行保存时，也必须避免标本受到此类细菌的污染。
1.3 标本的凝集不全 导致标本出现凝集不全的主要原因就是，在对标本进行采集时，血液凝固不全或未开始凝固时就强行对其进行离心处理，将血清分离出来。此时所得的血清中仍含有部分纤维蛋白原，在对此类标本进行ELISA测定时，通常会形成肉眼可见的纤维蛋白块，使最终的检测结果出现假阳性的情况。为了避免标本ELISA测定过程中出现此类情况，在对标本进行采集时，一定要在血液充分凝固后方可对血清进行分离。同时，也可以在采集标本时，利用带有分离胶管的采血管来对标本进行采集，此外，还可以在采集血管中加入一定量的促凝剂，以此来加快血液标本的凝集。
1.4 标本中含有叠氮钠 部分标本在制定过程中，为了避免标本出现腐蚀的情况，通常会加入叠氮钠，叠氮钠作为一种酶抑制剂，在对标本行ELISA测定时，叠氮钠会对酶联免疫试验系统中的酶活性形成一定的抑制作用。为了避免试验过程中出现酶联免疫试验系统中的酶活性被抑制的情况出现，在对标本进行制定时，最好不要加入叠氮钠。
1.5 标本的保存不当 在ELISA测定过程中，部分标本在冰箱中的保存时间过长，导致血清中的lgG聚合成多聚体。在对此类标本行间接法ELISA测定时，就会出现标本自身显色过深，情况严重时还会出现假阳性的结果。在对长时间放置在室温下的标本进行检测时，由于抗体或抗原的免疫活性出现减弱的情况，那么就有可能导致最终的检测结果出现假阴性。为了避免标本在检测过程中出现此类情况，检测的标本最好是现采现检。如果采集到的标本需要在5天内才能完成检测，那么必须将标本放置在2-8℃的冰箱中保存，如果标本需要长期保存，那么就必须将其放置在零下20℃的冰箱中密封保存[4]。长期储存的标本最好为血浆或血清。在对冻存后溶解的标本进行检测时，由于标本局部出现了蛋白质浓缩的情况，导致蛋白质的分布不均，因此，在对此类标本进行测定时，一定要轻轻将其混合均匀后方可进行试验。
1.6 试剂处理问题 在ELISA测定时，试剂盒未完全恢复室温，导致试剂盒中的酶活性降低，最终使得测试的结果出现假阴性的情况。为了避免此类情况的发生，所有试剂盒在使用前必须将其温度控制在37℃左右。
2 影响测定结果的内源性因素与解决措施
2.1 内风湿因子 在ELISA测定过程中，人体血清中的lgG以及lgM型类风湿因子可以与ELISA中的酶标记物以及抗体相结合，导致最终的测试结果出现假阳性。对于这一情况，最好在制作标本时，利用相应的药物来对标本进行稀释处理，以此来使标本中的类风濕因子被降解。此外，还可以对标本进行适当的离心处理后再对其进行检测。
2.2 嗜异性抗体 所谓的嗜异性抗体主要是指可以和其他动物lgG中的Fc相结合的人类抗体。在对标本进行检测的过程中，由于ELISA系统中会用到大量的鼠单克隆抗体，因此在检测过程中，可能出现二抗与一抗相结合的情况，最终导致检测的结果出现假阳性。为了避免检测过程中出现此类情况，可以在标本稀释液中加入过量的动物lg，对标本中可能存在的嗜异性抗体进行封闭处理。在此过程中一定要注意，当加入的亚类不同或加入量不足，可能使检测的结果无效。
因此，做好分析前标本的保存及预处理对保证结果的准确性是至关重要的。
参考文献
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酶联免疫技术 篇4
ELISA基本原理与常见类型
该检测法的基本原理是将相关抗原或抗体提前结合到某种固相载体表面, 在检测过程中, 受检样品与酶标抗原或抗体会按照相应的程序与结合在固相载体上的相关抗原或抗体产生反应, 生成新的抗原或抗体复合物。当反应结束后固相载体上酶标抗原或抗体被结合量 (即免疫复合物) 和标本中待检抗体或抗原的量成一定比例。随后将反应液中的其它物质清除后, 加入相关酶反应底物, 固相载体上的酶会直接将底物催化为有色产物。最后, 通过对有色产物进行定性或定量分析即可确定待检样品中相关物质的含量。ELISA技术常见类型: (1) 双抗体夹心法:该检测法适合检测拥有多个抗原决定簇的抗原, 但由于农药分子通常为半抗原, 即只有一个抗原决定簇, 因此, 不适合农药检测。 (2) 简接ELISA法:对抗体无严格要求, 只需改变包被抗原便能检测相应的抗体。 (3) 竞争ELISA法:可检测抗原, 也可检测抗体。待测抗原 (抗体) 与酶标抗原 (抗体) 通过与固定化抗体 (抗原) 间的竞争, 获得与检测目的抗原 (抗体) 结合的机会。
ELISA法在食品农药残留检测中的应用
目前, 有机磷农药是我国农业生产中最常用的农药, 常见类型包括甲胺磷、敌敌畏、氧乐果、对硫磷、敌百虫等。大部分为高毒类农药, 通过降低生物体内胆碱酯酶活性, 引起迟发性神经毒性, 从而达到消灭害虫的目的。农药残留在人体内蓄积后可造成慢性中毒, 具体表现为神经功能紊乱、精神错乱等。王华等研制出竞争酶联免疫检测试剂盒, 可用于检测果蔬中含有的甲胺磷含量, 最低检测限为0.01g/ml, 线性检测范围在0.01~100g/ml[2]。该试剂盒具有非常高的特异性, 且回收率至少在93%以上, 在4℃条件下可保存半年以上。
这是一种仿生杀虫剂, 模拟天然除虫菊素结构达到杀虫的目的。这类农药的用量仅次于有机磷农药。若长期食用含有拟除虫菊酯类农药的食物容易引起慢性中毒。通过碳二亚胺法把相关半抗原与牛血清偶联制成免疫原, 形成联苯菊酯的竞争间接酶联免疫检测法。在合适的条件下, 此法的检出限值可降到 (0.016±0.002) mg/L, 并和其它菊酯类农药不会发生交叉反应。此类农药对人体的危害与有机磷农药比较相似。吴慧明等开发了一种直接ELISA试剂盒, 可用于检测土壤中残留的克百威含量, 其最低检测限位0.01mg/L, 线性检测分为在0.01~10mg/L之间[3]。另外, 现已研制出定量定性检测速灭威的间接竞争ELISA法, 对此种农药的检出限在0.08~0.10g/ml之间, 检测线性范围在1~10000g/L。
苏丹红是一种工业染色剂, 成本低, 被非法用作食品添加剂, 常见于辣椒粉与咸鸭蛋中。这给公众造成了极大的恐慌。目前, 已研制出基于单克隆抗体的间接竞争性酶联免疫吸附法, 对苏丹红有非常高的灵敏度, 操作简单, 适合大批量检测, 成本低。盐酸克伦特罗 (即“瘦肉精”) 曾被广泛用于畜牧养殖业, 以提高瘦肉率。目前, 通过竞争酶联免疫法能快速检测出猪尿、猪肝内的“瘦肉精”残余量, 可重复使用, 成本低廉。
酶联免疫技术 篇5
酶联免疫法快速检测牛乳中的三聚氰胺操作视频配音稿
准备好物品后即可进行检测操作，首先进行样品处理。取1mL纯牛奶样本，加入一根小试管，再加1mL去离子水，涡动1min混匀；取出40μL牛奶溶液，加入另一根小试管，再加入960μL样本稀释液稀释，涡动1min混匀。
接下来，吸取50μL牛奶样本到微孔中，做2孔平行，并记录所在位置。再取三聚氰胺标准品各50μL到微孔中，也做2孔平行，并记录所在位置。然后，每孔各加50μL酶标物，每孔再加入抗试剂50μL，轻轻振荡均匀，用盖板膜盖板，置25℃避光环境中反应30min。
取出微孔板，小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，每孔加入洗涤液250μL，充分洗涤4次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。接下来各孔加入底物液A液50μL，再每孔加入底物液B液50μL，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板，置25℃避光环境反应15～20min。取出微孔板，每孔加入终止液50μL，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值。
测定完成后我们得到了三聚氰胺标品和样本的吸光度平均值，如表格所示。首先进行三聚氰胺的定性分析，根据样本的吸光度值1.870，可以得出它的三聚氰胺浓度范围为1ppb-3ppb，再乘以稀释倍数50得出此纯牛奶中三聚氰胺的浓度为50ppb-150ppb。
接着我们进行三聚氰胺的定量分析，先计算百分吸光率和三聚氰胺浓度的对数，如表格中所示。
酶联免疫技术 篇6
【关键词】酶联免疫吸附试验；ELISA;梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验；TPPA;梅毒抗体
【中图分类号】R377+1【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2009)10-0077-01
梅毒是由梅毒螺旋体感染引起的性传播疾病.目前梅毒检测常用方法[1]主要有:快速血浆反应素试验(RPR)、甲苯胺红快速反应素试验(TRUST)、梅毒螺旋体EUSA试验(ElSA)、梅毒螺旋体血凝试验(TPHA)和梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TPPA)等，有时也用到免疫印迹法和PCR方法。高敏感性和特异性的检验方法对于该病的确诊和治疗具有重要意义。我们采用梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)和酶联免疫吸附试验(ELISA)对2000份血清标本进行了检测比较，现报道如下。
1材料与方法
1.1标本来源选取我市2006年10月～2008年10月献血者和梅毒临床患者共2000份血清标本，男1236例、女764例，其中包括1700份健康献血者血清、300份梅毒患者血清。
1.2试剂TP-ELISA试剂盒购自北京万泰生物药业有限公司，IPPA试剂盒购自日本富士瑞必欧株式会社，均批检合格，在有效期内使用。
1.3方法所有标本均采用ELISA和TPPA进行血清梅毒螺旋体抗体平行检测，具体操作和结果判定均按试剂盒说明书进行。
1.4统计学处理采用统计学软件SPSS13.0对所得数据进行统计学分析，率的检验采用卡方检验，P<0.05，差异有统计学意义。
2结果
2.1酶联免疫吸附试验(ELISA)和梅毒螺旋体特异性抗体明胶凝集试验(TPPA)两种方法检测对300份梅毒患者血清检测结果比较，见表1。
2.2两种方法对1700份献血者血清检测结果见表2。
3讨论
梅毒是一种由苍白密螺旋俸所致的密螺旋体病，主要通过性接触、血液、母要垂直传播。20世纪60年代初得到较彻底的控制。1973年梅毒死灰复燃，卷土重来，20世纪80年代后期，国内各地先后均有早期梅毒的病例报道，以后呈直线上升，成为仅次于艾滋病的对人体危害最大的性传播疾病．无偿献血者血液初筛检测中，梅毒抗体阳性率也高达2.0%．其中工人、农民、流动人口的检测阳性率为3．58％[2]。而且，早期梅毒患者作为供血者，可以通过输血传染梅毒[3]。因此，必须选用高质量的梅毒检测试剂，加强对献血者梅毒的检测，以控制其经输血传播。
人体感染梅毒螺旋体后，可以产生特异性梅毒螺旋体抗体和非特异性抗体即反应素，前者比后者出现得早，即使通过抗梅毒治疗后，梅毒螺旋体抗体仍可终生存在[4]。TPPA试验方法是将特异性TP抗原包被在明胶颗粒上，省略了吸收剂，不受生物因素影响，与血清中特异性TP 抗体结合后出现肉眼可见的凝集反应的检测方法。TP以是目前公认较好的梅毒抗体确认方法，敏感性高，特异性强。ELISA法是利用基因重组工程合成抗原，检测血清中梅毒特异性抗体，在梅毒各期均有较高敏感性，TP-ELISA是利用重组梅毒螺旋体的特异性抗原包被酶标板孔，并采用双抗原夹心法检测血清标本中的梅毒特异性IgM和IsG抗体，对早期和晚期梅毒都有较高的检出率[5]，但ELISA法也存在着假阳性问题[6]。
本文结果表明，TP-ELISA法的假阳性率为0.35％。通过本文实验，我们发现ELISA和TPPA都具有较高的敏感性和特异性，两法的检测结果无显著性差异(P>0.05)。因TPPA用肉眼判断结果，使结果可靠性下降，并且试剂昂贵，整个检验过程几乎全部依赖于手工，操作繁琐，存在操作出错的风险，检测时需将样本作系列稀释，不利于大批量样本筛查，也不便用于疗效判断。而ELISA现已利用全自动加样器和全自动酶免分析仪，实现了从标本加样、温育、洗板、加试剂到结果判断等整个检验过程的完全自动化，可同时检测大批量标本，操作简便，极大地减少了人为因素的影响;可实现室内质量控制的标准化;结果判断客观、准确;利用微机保存并管理原始检验结果，便于查询;适合血站大规模的血液筛检[7]。因此，综合考虑方法学和实际操作等因素，ELlSA目前最适合血站大规模的血液筛检。
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(收稿日期：2009.02.14)
酶联免疫技术 篇7
1 材料和方法
1.1 标本
来源为2009年至2010年来本院住院和门诊的患者,随机抽取50例血清标本。
1.2 仪器和方法
酶联免疫法使用雷勃酶标仪(MULTISKAN MK3)试剂使用上海科华。化学发光免疫法使用西门子全自动化学发光仪(ADVIA Centaur XP)和配套试剂,采用吖啶酯为发光底物,采用双抗体夹心法[3]。
1.3 统计学处理
采用统计学软件包SPSS11.0进行分析处理,所得数据以均数±标准差(x±s)表示,以p<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 线性实验
将标准液按不同浓度稀释后做线性实验,结果显示ELISA法和化学发光法呈良好的线性关系,见表1。
2.2 对比实验
用ELISA法和化学发光免疫法同时对血清标本进行定量分析,结果表明,两法差异无统计学意义(p>0.05),相关系数r=0.996,提示两法呈良好相关性,见表2。
2.3 精密度实验
用两种方法对低、中、高质控品分别进行精密度实验,表明化学发光免疫法重复性好于ELISA法,特别是病理高值化学发光免疫法明显优于ELISA法,见表3。
3 讨论
化学发光免疫技术既具有发光检测的高度敏感性,又具有高度特异性[4],是公认快速、精确、重复性好且安全无毒的方法。ELISA法也以快速、简便实效而被广泛应用[5~7]。我们检测AFP结果指示化学发光法和ELISA法之间差异无统计学意义(p>0.05)相关性好r=0.996.通过比较显示化学发光法线性范围宽,精密度等方面明显优于ELISA法,因此我们认为化学发光法可广泛应用于临床项目的检测[8]。
摘要：目的:探讨两种方法检测AFP的优缺点。方法:采用西门子全自动发光免疫分析仪和雷勃酶标仪。结果:化学发光法和ELISA法之间差异无统计学意义(P>0.05),相关性良好(r=0.996)。结论:化学发光法的精密度和准确性均优于酶联免疫法。
关键词：化学发光免疫法,酶联免疫法,甲胎蛋白
参考文献
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酶联免疫法检测猪尿中赛庚啶 篇8
1 材料与方法
1.1 主要仪器与试剂盒
Model 550酶标仪, 美国Bio-Rad公司制造;MS3 Basic圆周振荡器, 德国IKA公司制造。赛庚啶检测试剂盒 (赛庚啶标准品以及其他检测用试剂) , 购自深圳容金科技有限公司。
1.2 试验设计
实验室室温控制在 (23±1) ℃, 将检测试剂盒和样品置于室内, 自然回温至室温。
取出酶标板条, 将50μL猪尿样品 (标准品、空白样品、阳性对照) 加入不同的微孔内, 每个试样做双孔平行, 记录微孔位置。向各微孔内加入100μL一抗, 轻敲微孔板边缘混匀60 s;室温避光孵育30 min;用250μL工作洗液洗酶标板3次, 每次洗板后轻轻甩出微孔内液体, 倒扣在吸水纸上, 轻轻拍打出残留在孔内的液体, 向各微孔内加入150μL二抗, 轻敲微孔板边缘混匀60 s;室温避光孵育30 min;用250μL工作洗液洗酶标板3次, 拍出微孔内残留液体, 向各微孔内加入100μL TMB底物, 轻敲微孔板边缘混匀60 s;室温避光孵育15 min;加入100μL终止液终止反应。使用酶标仪在450 nm波长处测定吸光度。
1.3 相对吸光度的计算
相对吸光度是用猪尿样品 (标准品、空白样品、阳性对照) 的平均吸光度除以标准品阴性浓度为0质控的吸光度, 乘以100%而得。
2 结果与分析
2.1 标准曲线
采用Ridasoft Win软件以标准品的相对吸光度值为纵坐标、标准品浓度为横坐标绘制标准曲线。赛庚啶标准曲线结果见表1, 标准曲线见图1。
由表1可见, 标准品吸光度离散系数小于5%, 浓度变异系数不大于0.2%。由图1可见, 在15~1 500 ng/L范围内标准曲线线性良好, 绘制的标准曲线准确、可靠。
2.2 检出限
对20份阴性猪尿样品进行测定, 利用标准曲线计算样品浓度, 以20份样品检测浓度的平均值 () 和标准偏差 (s) 来表示方法检出限 (MDL) , 即MDL=+3 s, 结果获得该方法对猪尿样品的检出限为169 ng/L。目前江苏省畜禽产品质量安全标准中, 赛庚啶的限量规定为2μg/L, 因此, 检出限可以满足检测要求。
2.3 加标回收试验
使用阴性猪尿样品作为空白样品进行加标回收试验, 向空白样品中加入适量浓度为10μg/L的标准品溶液作为阳性对照, 用涡旋混合器4 000 r/min混合60 s后按步骤进行测定。回收试验结果见表2。
对6份空白样品不同加标浓度的回收率进行了试验, 部分空白样品检测结果在15~50 ng/L之间, 计算回收率时用加标样品的测定浓度扣除空白测定浓度之后进行计算。在加标量为200~1 250 ng/L的浓度范围内, 空白样品加标回收试验均有满意的结果, 完全满足测定要求。
2.4 实际样品的测定
对21份猪阳性样品进行了测定, 其中有1个样品测定浓度在500~1 500 ng/L范围内, 3个样品测定浓度在150~500 ng/L范围内, 2个样品测定浓度在15~150 ng/L范围内, 其他样品测定浓度均低于15 ng/L, 结果均符合要求。
3 讨论
3.1 样品的背景值
阴性猪尿样品的测定值一般很低, 无法使用有效的测定手段进行确认, 原因可能是背景干扰的结果。在实际测定中, 猪尿样品很可能呈现浑浊或混有其他组织液的情况, 这种情况下背景干扰更强, 应采取有效办法降低样品的背景值, 除离心外, 还应进行适当的稀释, 以降低干扰。
3.2 样品的选择
赛庚啶主要在动物肝脏内代谢, 肾脏和胰脏等其他组织中也有残留, 最后排泄出体外[6]。由于组织样品需要进行复杂的前处理, 作为快速检测方法而言, 用酶联免疫法检测组织样品并不占优势。尿液本身为液体, 取用方便, 不需要宰杀动物, 且试验操作步骤简便。考虑到测定成本和快捷性, 选用猪尿样品适合赛庚啶的快速测定, 尤其适用于屠宰场宰前检测和规模养殖基地现场抽样检测。
3.3 方法的特异性
酶联免疫法是建立在抗原抗体反应的特异性基础上的测定方法, 拥有良好的特异性, 但对结构类似的化合物有一定的交叉反应, 因此无法排除干扰物质对测定结果产生影响[7]。在实际样品测定中, 样品测定浓度在500~1 500 ng/L之间。此种样品经液相色谱-串联质谱进一步分析, 未检出赛庚啶。原因可能是背景值的影响或是其他药物的交叉反应所致。因此在使用酶联免疫法检出赛庚啶值较高的情况下, 应及时将样品送至有资质的检测单位, 使用液相色谱-串联质谱法进行进一步确证, 而不能直接判定赛庚啶超标。
4 结论
利用酶联免疫法对猪尿中赛庚啶进行了测定, 结果表明, 该方法特异性较好、灵敏度高、准确度高, 且仪器设备投资少、检测成本低, 是畜产品中药物残留测定发展的趋势, 在现场测定和大批量样品筛选测定中有着十分广阔的应用前景。
参考文献
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酶联免疫技术 篇9
1 试剂因素
1.1 试剂的选择
试剂的选择是保证血液检测质量的关键因素, 要选购知名度高, 质量有保证, 具有“三证”的试剂, 最好选用配套试剂。也可以和同行交流, 其他实验室对某种试剂盒的实际使用效果, 往往具有很强的说服力, 因此应使用检测口碑好的试剂 (可通过室间质评组织获得[1]) 。不使用过期试剂, 不同批号试剂不能混用, 同批号试剂盒的组分也不可混用。
1.2 试剂的储存运输。
1.2.1 试剂的储存至关重要, 试剂一到科室, 即应立即放入冷藏冰箱, 必须注意不得靠近冰箱后壁, 以防试剂冻结, 影响检测结果。
1.2.2 试剂供应商必须保障试剂在进入科室前运输储存的质量, 试剂盒从出厂到用户手中, 均要历经运输 (如送检、检定、发货等) 及运输中的储存环节, 某一环节不当, 均影响试剂盒的临床使用质量。去年我科有一段时间所做的表面抗原项目, 今天阳性, 同一份标本明天复检有可能是弱阳性甚至阴性, 查找原因可能是这批试剂在进入科室前储存温度出现了问题, 与试剂商联系更换新的批号试剂后, 此现象消失。
1.3 试剂的准备
在临床实验室, 试剂的准备一般不太注意, 工作人员通常在试验时将试剂从冰箱中拿出来就用, 其直接后果是对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此酶联免疫吸附试验中, 试剂准备最关键的是使试剂盒在使用前与室温平衡, 以满足检测要求, 一般检测前30 min即应将试剂盒从冰箱中取出, 检测时试剂盒可与室温平衡。
2 标本因素
标本因素包括标本溶血、被污染、标本保存时间过长和标本凝固不全等。
2.1 标本溶血
血红蛋白中含铁血红素有类过氧化物酶活性, 因此以辣根过氧化物酶为标记的酶联免疫吸附试验测定中, 如血清中血红蛋白浓度较高, 很容易在温育过程中吸附于固相, 从而与后面加入的辣根过氧化物酶反应显色, 造成假阳性。因此在采血过程中应注意, 采集血液标本时应缓慢抽动, 注射器插入生化管应让血液自动靠负压注入生化管, 不能用手推注射器栓塞, 以防标本溶血。处理方法:若轻微溶血影响还不大, 若为中度或重度溶血, 则必须与临床联系, 重新抽取标本, 并讲清楚正确采集血标本的重要性。并由有关部门定期培训临床护士怎样正确采集血液标本。
2.2 标本被污染
菌体可能含有内源性过氧化物酶, 可出现非特异性显色, 因此宜用新鲜标本, 如有特殊情况, 应冰箱保存或冰冻保存, 并应加盖保存。阳性结果应重抽血双孔复检。
2.3 标本的保存
标本在冰箱中保存时间过长, 可能造成污染或效价降低, 可引起假阴性, 因此应尽量用新鲜标本。冰冻标本应避免反复冻融, 因冰冻标本的反复冻融产生的机械力对标本中的蛋白分子有破坏作用, 可引起假阴性[2]。
2.4 标本凝固不全
标本凝固不全的血清中有部分纤维蛋白原, 影响结果。有的工作人员着急赶时间, 刚采集的标本就离心 (虽然现在都采用促凝生化管) , 结果刚离心完血清还可以, 但是在洗涤时, 此孔血清呈果冻状, 显然反应不完全。处理方法:标本采集后在37℃水浴30 min后再离心, 以3500转/min离心5 min可获得满意标本[3]。
3 操作因素
3.1 加样
孵育前加样时间过长, 漏加样本, 酶试剂加入孔外, 用滴瓶滴加试剂时加量不准等都可使试验结果不可靠。处理方法: (1) 标本过多时, 可分批操作, 标本要轻拿轻放, 防止标本溅出交叉感染; (2) 加完样品封板前要仔细观察反应板, 看是否有样品漏加, 以便及时发现; (3) 加酶试剂后可用吸水纸吸干孔外试剂; (4) 使用滴瓶加试剂时, 应垂直滴加, 匀速滴加, 以免速度过快有的孔中多加1滴试剂, 建议采用微量加样器加试验中的所有组分; (5) 加样器应定期校准, 消毒, 吸头要一次性使用, 以免交叉污染。
3.2 温育
温育是最为关键、最容易出现问题的步骤;温育的时间、温度选择一般按照试剂盒说明进行, 加完样本和试剂后微孔板放入水浴箱或温箱中, 孔内温度从室温升至摄氏37℃需一定时间, 若一放入就计时, 就容易造成孵育时间不够, 易致弱阳性标本检测不出。处理方法: (1) 可采用适当延长几分钟时间 (大约2 min) ; (2) 可把反应板封板后直接放入37℃水浴箱水中; (3) 用37℃孵育箱将是不错的选择。
3.3 洗板
3.3.1 洗涤液的配制, 按照说明书要求1∶20稀释, 看似很简单, 但必须注意一些细节问题: (1) 注意洗涤液是否有结晶析出, 冬天洗涤液易结晶, 如不注意很容易堵塞洗板机管路。处理方法:事先将洗涤液置37℃水温箱中预温一会再行配制就可解决。 (2) 要注意去离子水的pH值。处理方法:用0.1nNaOH调节pH值至7左右。
3.3.2 洗板有两种, 即手工洗板和洗板机洗板。采取手工洗板, 孔与孔之间液体易交叉;采取洗板机洗板时, 洗液量不足导致洗板不彻底, 针孔堵塞导致抽吸不完全, 清洗效果差。处理方法: (1) 手工洗板时, 孔内洗液不能溢出, 拍板时要垂直, 但用力不能过猛, 防止抗原抗体复合物脱落; (2) 用洗板机洗板, 洗涤液要新鲜配制, 洗板机要经常检查冲洗头是否畅通, 洗涤液瓶应定期彻底清洗, 要定期检查整个管路, 疏通管路, 若针头被堵塞, 可用注射器排除; (3) 我科采用机洗5遍人工加洗1遍, 效果较好; (4) 洗板时, 吸水纸不可重复使用; (5) 洗完板时, 应充分扣干反应孔, 可用吸水纸包住反应板扣干。
3.4 显色
要严格按照说明书进行, 充分显色到预定时间后加入终止液。
3.5 测定
加入终止液后用酶标仪检测, 酶标仪需预热15 min~30 min, 因反应板加入A、B显色剂后在37℃放置30 min, 反应板底部会有水雾, 检测时可出现假阳性, 上机前一定要在吸水纸上吸干。
在以上的操作过程中, 要保持试验的连续性, 有的工作人员在洗完板时, 因故未能及时加A、B显色液, 会对测定结果造成影响, 因此要注意试验的连续性, 这一点至关重要。
综上所述, 尽管酶联免疫吸附试验测定操作简单, 但影响测定结果的因素较多, 所以工作人员要加强责任心, 在操作过程中不能有一点疏忽, 要严格按照试剂盒说明书操作, 尽量避免或减少影响因素, 保证检验质量。
参考文献
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酶联免疫技术 篇10
腹泻性贝毒素(Diarrhetic Shellfish Poisons,DSP)是一种脂溶性毒素，被人食用后产生以腹泻为特征的中毒效应[2]。目前已发现的腹泻性贝类毒素大致可分为3类：软海绵酸(Okadaic acid,OA)及其衍生物鳍藻毒素(DTX)、大环内脂扇贝毒素(PTX)和磺化毒素(YTX)及其衍生物。毒素的检测分析方法主要有生物分析法、细胞毒性分析、免疫分析和化学分离法[3]。免疫分析包括放射免疫分析(RIA)和酶联免疫分析(ELISA)，具有选择性高、灵敏度好、专一性强的特点。
试验选择酶联免疫分析方法，通过比较2010—2012年海洲湾海域赤潮监控区、增养殖区、趋势性监测区牡蛎腹泻性毒素检测结果，探讨酶联免疫法在贝毒检测中的实际效果，以及贝毒与有毒赤潮的相关性应用。
1 材料与方法
1.1 材料
样品采集于2010、2011、2012年海洲湾海域赤潮监控区、增养殖区、趋势性监测区的新鲜牡蛎。经洗净、沥干、去壳后，取可食部分用高速匀浆机制成均质物，备用。
腹泻性贝毒标准品为伊普瑞斯科技有限公司E-OA-C100型。冈田软海绵酸检测试剂盒为荷兰EURO-PROXIMA公司产品，试剂盒为96微孔板，标准溶液浓度分别为0,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0ng/mL。实验用水为超纯水。甲醇为美国天地公司色谱纯(100%)。
检测酶标仪为美国伯乐公司Bio-rad680型。
1.2 方法
称取1.0 g检测样品均质物，加入1.0 mL超纯水，涡旋混合1 min，加甲醇2.0 mL，涡旋混合1min,2000 r/min离心10 min。收集上清液，0.45μm滤膜过滤。滤液用样品稀释缓冲液50倍稀释，充分混匀后吸取50μL为样品检测液[4]。
1.3 酶联免疫分析检测
微孔板从上到下依次设置为A～H,A为空白，B～H为标准溶液系列浓度。A孔加零标准溶液100μL,B～H孔依次加标准溶液50μL，浓度分别为0,0.2,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0 ng/mL，分别加入酶结合物溶液25μL和抗体溶液25μL。其余各孔分别为经过前处理的牡蛎检测样品。所有标准溶液和检测样品均同时设平行组2个。
薄膜封板，摇板1 min，室温20～25℃，暗处温育30 min。弃去孔中的液体，用洗涤缓冲液冲洗板孔，吸水纸上拍干，重复3次。各孔分别加底物溶液100μL，室温20～25℃，暗处温育15 min。再加入终止液100μL。以空气为空白，酶标仪450 nm处读取吸光值。
1.4 标准曲线及样品浓度的计算
将标准品和样品的吸光值减去空白值，结果除以零标准吸光值，再乘以100。以得到的系列比值为Y轴，X轴上的浓度对数构建标准曲线，在0.2～10.0 ng/mL范围成线性。
利用试剂盒公司提供的数据分析软件绘制出标准曲线，并乘以稀释倍数计算出各个样品的腹泻性毒素浓度。
1.5 加标回收
检测样品中分别添加浓度为1.0,3.0和5.0μg/kg腹泻性贝毒标样。按照样品的前处理方法同时进行前处理，测定腹泻性贝毒的含量，计算回收率。每隔10 d，进行3个批次样品的处理和测定，并计算回收率。
2 结果
2.1 标准曲线
标准曲线直线方程y=a+bln(x)，其中a=64.7,b=-20.28。相关系数R2=0.9914(图1)。
2.2 养殖牡蛎腹泻性毒素的检测结果
2010年赤潮监控区、增养殖区和趋势性监测区牡蛎腹泻性毒素含量分别为20.9～74.5μg/kg,21.3～34.8μg/kg和30.1～39.8μg/kg，以趋势性监测区为最高。3个不同监测区的检出率分别为83.3%，83.3%和80.0%，9月份检出率高于8月份(表1)。
2011年赤潮监控区、增养殖区和趋势性监测区的牡蛎腹泻性毒素含量分别为25.3～50.6μg/kg,20.6～52.5μg/kg和30.1～39.8μg/kg，以赤潮监控区为最高。3个不同检测区的检出率分别为100.0%，50.0%和50.0%，8月份的检出率高于5月份(表2)。
2012年赤潮监控区牡蛎腹泻性毒素含量为15.8～35.6μg/kg，检出率为66.7%。增养殖区牡蛎腹泻性毒素含量未检出(表3)。
2.3 加标回收率比较
腹泻性贝毒以1.0,3.0和5.0μg/kg在检测样品添加后，平均回收率分别达到88.0%，86.7%和88.6%。批内变异系数分别为1.60%～2.46%，1.81%～2.66%和1.44%～4.60%。批间变异系数分别为3.38%，3.08%和3.98%。
注:(1)2012年趋势性监测区未进行检测。(2)“未检出”为测定含量低于10μg/kg。
3 讨论
赤潮是一种海洋灾害，已引起沿海国家的高度重视，严格控制污水和污染物的入海量是比较有效的防治措施。赤潮对生物资源的影响已成为联合国有关组织所关注的全球性问题之一。在防范赤潮工作方面，建立了赤潮防治和监测系统，对有迹象出现赤潮的海区，进行连续的跟踪监测，及时掌握引发赤潮环境因素的动向，为预报赤潮的发生提供信息，对发生赤潮的海区采取必要的防范措施。
2010—2012年，在海洲湾海域赤潮监控区、增养殖区和趋势性监测区共检测42个养殖牡蛎样品的腹泻性毒素。腹泻性毒素含量由2010年的20.9～74.5μg/kg，逐渐降低到2011年至20.3～52.5μg/kg和2012年的15.8～35.6μg/kg。连续3年养殖牡蛎检测样品中腹泻性毒素平均检出率分别为82.4%、66.7%和57.1%。从养殖牡蛎检测样品中腹泻性毒素含量和检测率逐渐降低的情况分析，加强海洋环境保护，控制沿海废水废物的入海量，特别要控制氮、磷和其他有机物的排放量，对控制赤潮的发生起到了一定的效果。
应用酶联免疫法检测养殖牡蛎腹泻性贝毒，不仅方法简单，而且分析时间较短。同时进行加标回收率的比较，平均回收率达到88.0%，86.7%和88.6%。批内变异系数达到1.60%～2.46%，1.81%～2.66%和1.44%～4.60%。批间变异系数为3.38%，3.08%和3.98%。酶联免疫法可以应用于监测腹泻性贝毒。
参考文献
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酶联免疫技术 篇11
ELISA是酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)的简称,是以免疫学反应为基础,将抗体、抗原的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合的一种具有高特异性和高敏感性的实验技术。根据样本中待测物质的种类及性质不同,可以设计出各种不同类型的ELISA检测方法,包括抗体夹心法、抗原夹心法、竞争法、间接法及捕获包被法等。1971年瑞典斯德哥尔摩大学的Engvall和Perlmann[1]首次建立了酶联免疫吸附测定方法,短短几十年ELISA检测法的应用已渗入我们生活的许多方面,且在不断发展和完善,包括在临床诊断、医学研究、食品安全、植物资源、环境监测及生态学方面的应用。本文介绍了ELISA检测法的主要应用现状,并综合其优缺点对ELISA检测法的应用前景进行了展望。
1 ELISA的应用现状
1.1 临床诊断和医学研究中的应用
ELISA技术被广泛地用来检测与感染性疾病相关的病原因子以及相应的抗体、体液中的抗原成分、激素和药物等。用于临床医学类研究的标本通常以人的血液和尿液等为主,此外还包括粪便、组织等。在基础医学研究中ELISA检测标本则来源广泛,包括人、鼠、兔、猪、犬等多种实验用动物的血液、组织、细胞及细胞培养的上清液等[2]。
ELISA可以测定的项目包括:(1)抗原及其抗体的检测。ELISA在传染性疾病和病毒检测中具有突出的优势,如甲型H1N1流感病毒[3]、艾滋病毒、巨细胞病毒、柯萨奇病毒A组16型[4]、狂犬病毒、肝炎病毒、肠道病毒、风疹病毒、疱疹病毒和脊髓灰质炎病毒等,其敏感性都超过目前常用的检查方法。在细菌感染的检测方面包括:链球菌、金黄色葡萄球菌[5]、布氏杆菌等。ELISA在免疫性疾病方面可进行自身免疫病抗体的测定以及对过敏的诊断,如检测各种过敏原的抗体、甲状腺球蛋白抗体、红斑性痕疮抗体[6]、血清抗碳酸酐酶Ш抗体[7]等。(2)蛋白质的检测。各种免疫球蛋白;肿瘤标志物如:甲胎蛋白、胰岛素、癌胚抗原、磷酯酰肌醇蛋白聚糖3[8]、诱骗受体3(DcR3)[9]、前列腺碱性磷酸酶;其他蛋白等;(3)非肽类激素的检测。如:雌二醇、皮质醇等;(4)血液中药物浓度的检测。如:治疗心脏病类药物、抗哮喘药物、抗癫痫药物、抗生素、庆大霉素等[10]。这些利用ELISA建立起来的检测方法为保障人们的健康与安全提供了一种便捷有效的途径。
1.2 食品安全方面的应用
食品是人类赖以生存的物质基础,食品的安全问题关系到人类的健康和国计民生的重大问题。随着食品工业的发展,传统的分析方法已经不能满足食品检测的需求。ELISA在食品检测中得到了广泛的应用:(1)食品饲料中微生物的检测。用该法对沙门菌、李斯特菌、大肠杆菌、曲霉、毛霉等进行检测,反应特异性和敏感性高,检测时间短;(2)食品中毒素的检测。主要用于水产生物毒素的检测。李闽针等[11]建立了应用ELISA检测麻痹型贝类毒素的方法,检测过程仅需1h且灵敏度高;(3)食品中残留药品的检测。主要涉及动物和植物性食品的检测,包括动植物体内的抗生素,添加剂和药物残留(如水果蔬菜中的百草枯、蜂蜜中的磺胺类药物[12]);用于兽药残留尤其是动物性产品中兽药残留的检测[13](链霉素、氯霉素、青霉素、四环素、盐霉素、磺胺二甲基嘧啶等)。传统的仪器分析方法(高效液相色谱法,气相色谱法,薄层色谱法等)在兽药残留分析中虽然具有较大的优势,但其前处理过程复杂、仪器昂贵、效率低下,不能适应以筛选为目的的大量检测样本分析。ELISA由于具备灵敏度高、特异性强、方便和成本低等优点,越来越多的被应用到兽药残留检测。(4)外源性污染物残留,富集作用,寄生虫、细菌、病毒等的感染[14]以及食品中其他成分的检测。如对鲜乳中三聚氰胺的检测[15]和食品中"瘦肉精"的检测[16]。(5)转基因食品的检测。国外已开发出用于检测转基因食品的PCR-ELISA试剂盒,我国也建立了转基因食品(如大豆,水稻,鱼)的PCR-ELISA检测法。雷勃钧等[17]使用PCR-ELISA法对大豆品种进行转基因的定性检测,灵敏度高达0.1%,达到国际领先水平。
1.3 植物资源研究方面的应用
ELISA在植物资源方面的应用主要包括:(1)用于植物病毒的流行病学分析,研究不同的寄主和介主的关系。随着我国植物种质资源的引进和生态环境的改变,植物病毒株系分化和变异也不断出现。利用ELISA对植物病毒的分布情况进行追踪调查,研究变异株系的地域性,对植物流行病学的研究具有指导意义。李瑛等[18]利用ELISA对兰州百合病毒进行检测,发现兰州百合病情含量随着种植年限的增加而增加;施曼玲等[19]利用三抗体夹心ELISA对芜菁花叶病毒(TuMV)进行了检测,测定出7种农作物上有TuMV感染。(2)用于种子健康测试。秦碧霞等[20]从感染黄瓜绿斑驳花叶病毒的葫芦植株上收取种子,通过双抗体夹心酶联免疫吸附法检测种子的带毒情况,检出率为100%。(3)大规模经济作物中的植物病毒以及自然寄主中的植物病毒的检测等。目前ELISA检测已经应用到番茄、黄瓜、甜菜、甘蔗、花生等多种经济作物病毒的检测和预防。(4)中药材有效成分质量的检测。谭铭铭等[21]使用抗SSa单克隆抗体建立竞争性ELISA法测定广州市售柴胡药材中柴胡皂苷a(SSa)的含量,发现市售柴胡药材质量参差不齐,约30%不符合药典要求。
1.4 环境监测方面的应用
80年代后期,随着半自动化和自动化ELISA分析仪的问世和发展,ELISA技术在药物残留检测中的应用也越来越广泛。可以用于检测水、土壤中的异内甲草胺、苯并咪叶及多种农药等。有机磷和菊酯类农药广泛用于全球各国,为农业发展起了重要作用。但由此产生的毒物经生物圈物质循环后重新汇集到水中,对水环境产生负面影响;海藻水华产生的微囊藻毒素(MCs)是一类环状七肽毒素,具有很强的毒性,人类饮用被污染的水源后残留在体内的毒素逐渐积累富集会造成人体中毒。ELISA被用于水质检测已有多年,近年来刘延凤等[22]建立了氯菊酯农药残留的ELISA检测方法,抗血清检测线性范围为10~800μg·L-1,平均回收率大于97%,且与其他类似结构农药交叉反应率很低。此外,氯代芳烃化合物,二恶英化合物等有机物长期以来一直是环境科学研究的热点,ELISA法在如何快速检测其在水质,土壤,空气中的浓度发挥了重要作用。
1.5 生态学研究中的应用
食物关系分析可能使我们更好地理解和预测生态系统的一些基本过程,更好地了解相互作用的多物种系统的多样性格局和动态,为害虫管理提供新思路。目前,研究者们认为最有前途、应用最多的检测捕食作用的方法是以免疫学为基础的ELISA检测法[23]。最早将ELISA引入捕食作用研究的是Fichter和Stephen。此后,Ragsdale等[24]应用ELISA研究了大豆上一系列捕食者对稻绿蝽的捕食作用。刘雨芳,张古忍等[25]使用酶联免疫吸附试验双抗体夹心法对稻田节肢动物(捕食天敌、水稻害虫、和昆虫)之间的捕食关系进行了研究,为稻田捕食性节肢动物亚群落的重建和发展的研究提供了一定的参考依据。
2 ELISA在免疫检测中的优点
ELISA检测所需仪器化程度低、操作简便,对样本预处理要求简单,易于推广,具有准确、灵敏、特异、快速、经济等特点,除此之外,还有很重要的一点,即对环境没有污染。基于这一系列的优点,使得ELISA成为免疫检验中的主导技术,得到了快速的发展和广泛的应用。国际上许多权威机构将其列为优先发展的分析技术之一。
与其他检测方法相比,ELISA检测法具有明显的优越性。在口蹄疫诊断检测中新型ELISA(单克隆抗体ELISA、生物素-亲和素ELISA及Dot-ELISA)得到了广泛的应用[26];在梅毒血清学检测中,应用ELISA、TPPA(螺旋体明胶凝集试验)、TRUST(甲苯胺红不加热血清学试验)和RPR(快速血浆反应素试验)四种方法检测梅毒和非梅毒血清,检测结果的阳性率和假阳性率表明:ELISA法敏感性、特异性强都相对较好,是目前梅毒血清学检测的首选方法[27]。应用ELISA方法对鲜奶及肉制品中沙门氏菌进行检测的研究表明:与国际法相比,直接ELISA检验更可靠,同时也可以显著消除样品的非特异性干扰,可以进行大量样品的快速检测[28]。
随着制备单克隆抗体技术的发展,将其和ELISA方法互相结合,极大地提高了分析检测的灵敏性与可靠度。PCR-ELISA技术是将PCR技术、探针技术和ELISA技术三者结合起来的一项技术,即在PCR扩增以后,在微板上借用ELISA的原理,使用酶标抗体,进行固相杂交来实现定量。近年来PCR-ELISA技术被应用于致病菌、病毒的检测,由于该方法是PCR和ELISA技术的结合,是一种两级放大系统、灵敏度高,同时这种方法避免了PCR产物分析时的电泳及染色过程,与普通PCR和荧光PCR相比具有更为快捷、简便和灵敏等优点。除此之外,在端粒酶检测,寄生虫检测,血型基因分型,菌种鉴定等领域也取得了一定的进展[29]。
3 ELISA的局限性及展望
ELISA作为一项免疫检测技术,同时也具有一定的局限性,例如:在所检测的生物学样本中有可能存在各种干扰实验的因素,此外,在实验过程中影响结果的因素也比较多[30,31]。在ELISA定性测定实验中,阳性判定值(Cut-off)的建立是在一定的统计学基础上的,对于某一特定的受检者来说,有可能并不具备适用性。如在使用ELISA方法检测HIV时,检测所得的阳性结果或许并不是真正的阳性,需要利用其他方法如蛋白印迹、重组免疫印迹或中和试验来确认,才能报告阳性。
ELISA测定的基础是抗原与抗体的特异性反应。因此,如果检测抗原,则要求抗体特异性。此外,待测抗原还必须有能与抗体相结合的抗原决定簇,若因某些原因(突变导致某些位点不表达,结合位点因某些原因被封闭或阻断)影响了抗原和抗体的结合,就会造成假阴性结果。如检测抗体,除要求所用包被抗原尽可能包含所有的特异抗原决定簇,还要尽可能不含非特异成分,但是,这一点往往由于受到技术水平的限制难以完全做到。因此,假阳性和假阴性的结果是不能完全避免的。相信随着技术水平的提高,检测所需的抗体和包被抗原的特异性也会得到进一步的提高,从而最大限度的避免假阴性结果的出现,提高检测的准确性。