胶体金免疫层析技术（精选7篇）
胶体金免疫层析技术 篇1
胶体金是由氯金酸在还原剂如柠檬酸三钠、抗坏血酸、柠檬酸钠、鞣酸等作用下聚合成一定大小的金颗粒, 并在静电作用下形成稳定的胶体状态。因为胶体金具有肉眼可见的红色, 当抗原与抗体结合部位的金颗粒达到一定数量时, 便可观察到红色条带, 通过红色条带即可判断检测结果。本文将对胶体金免疫层析技术在食品检测中的运用展开研究, 以期能够为关注这一领域的人们提供相关有价值的参考。
胶体金免疫层析技术分析
所谓的胶体金, 其实就是氯金酸溶液在还原剂的作用下, 聚合成特定大小的金颗粒, 并且在静电作用下生成稳定胶体溶液。这些金颗粒具有较高的电子密度, 聚集成一定密度后就会以肉眼可见的粉红色斑点形式出现, 可以用作免疫层析试验的指示物。
在应用胶体金免疫层析技术时, 需要将特异性抗原或抗体固定在膜上, 利用毛细作用使样品在层析条上游动, 从而使其与受体发生免疫反应。而在这一过程中, 免疫复合物将被截留在检测带内, 所以能得到直观的试验结果。
在食品检测中, 利用该技术能够完成蛋白质、药物、毒素和病菌等多种物质的检测, 并且具有成本低、反应快和低交叉反应性的优势。
胶体金免疫层析技术在食品检测中的运用
食品安全事件出现, 往往会给社会带来巨大经济损失。所以, 近几年相关行业加快了食品检测技术的研究, 以期利用更先进的技术完成食品的有效检测。而胶体金免疫层析技术具有成本低、反应快和低交叉反应性的优点, 因此, 有必要对该技术在食品检测中的问题展开分析, 从而更好地促进食品检测技术发展。
在食品质量检测中的运用
从组成成分来看, 食品中含有蛋白质、水分、糖类、维生素和脂肪等物质。其中, 大部分都属于有机高分子物质, 可以使用胶体金免疫层析技术进行检测。在检测过程中, 一般会进行食品的半定量分析, 从而实现对食品成分的快速检测。例如, 奶牛分娩后最初几天分泌的乳汁为牛初乳, 含有大量非营养性功能组分, 保健价值提高。而在牛初乳中, Ig G含量与生物活性物质含量呈正相关关系, 所以可以使用胶体金进行标准牛Ig G的标记, 然后将其当成竞争抗原。通过将市面上牛乳样品中的Ig G和标记的标准牛Ig G相比, 就可以反映样品质量。
在食品安全检测中的运用
1在农兽药残留检测中的运用
使用胶体金免疫层析技术, 可以对食品中的农药、兽药和其他生物毒素残留进行检测。例如, 使用胶体金标记的抗氟喹诺酮类抗体进行胶体金制备, 就可以对牛奶中的11种氟喹诺酮类药物残留进行检测。而使用胶体金免疫层析技术将水样品和植物样品的实际检出限相比, 也能够完成一些农药物质的检测。相较于其他检测方法, 使用该技术不仅不需要使用大型仪器设备, 同时还具有简单、快速和方便的特点, 所以在食品农兽药检测方面得到了广泛使用。
2在非食品添加成分检测中的运用
在非食品添加成分检测方面, 胶体金免疫层析技术也得到运用。例如, 在三聚氰胺这种化工物质的检测上, 使用胶体免疫层析技术可以对乳制品中的三聚氰胺进行定性和定量检测, 而使用的试纸条具有较好的稳定性、重复性和灵敏度。在苏丹红I的检测上, 可以使用利用胶体金免疫层析技术制作成的苏丹红I测试纸条, 然后使用金标抗原方法将抗体固定在NC膜上, 就可以对食品中的苏丹红I进行定量检测。
3在霉菌毒素检测中的运用
食品中如果含有霉菌毒素等物质, 易导致人体和动物产生病理变化, 继而给人类健康带来严重危害。使用胶体金免疫层析技术, 能够有效鉴定黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和葡萄球菌肠毒素等多种霉菌毒素。例如, 在检测黄曲霉毒素B1时, 使用胶体金免疫层析试纸法进行检测, 可以与高效液相色谱法达到90.5%的相符率。同时, 使用该方法能够实现现场快速检测, 并且可以用于粮食中的黄曲霉毒素B1的初筛。此外, 使用该技术还能鉴定巧克力奶、婴儿奶粉和鲜牛奶等物质中的葡萄球菌肠毒素, 毒素最低检出限为10 mg/L。
4在致病菌检测中的运用
食品中的致病菌含量一旦超标, 就很可能导致食用者生病。目前, 食源性致病菌的检测仍是按照细菌分离、培养及生化鉴定的方法进行检测。这种方法耗时长、操作繁琐、环境和主观因素影响较大, 从而给食品检测带来较多不便。而使用胶体金免疫层析技术, 则能够解决该方面检测的操作复杂、灵敏度低和特异性低的问题。例如, 在大肠杆菌检测方面, 进行胶体金结合垫的制备只需要进行2次离心就可以消除标记过程中多余抗体。相较于其他方法, 胶体金免疫层析技术明显能够提高结合垫的性能和检验灵敏度。
结论
总而言之, 随着科学技术的发展, 胶体金免疫层析技术已在食品检测领域得到运用, 并且其凭借较好的检测效果、操作简便、快速的特点, 提高了在食品检测领域中的应用频率。为此, 本文在讨论胶体金免疫层析技术应用原理的基础上, 对该技术在食品检测中的运用问题展开了分析, 认为在食品检测方面, 应尽量提高食品检测的敏感度和特异性, 并且使食品检测更加简便, 为食品现场检测工作的开展提供便利。相信随着相关技术的发展, 该技术将能在食品检测领域得到更加广泛的应用。
胶体金免疫层析技术 篇2
1胶体金免疫层析技术的原理及构造
免疫层析技术是以抗原抗体反应与色谱层析技术相结合的一种快速免疫分析方法。胶体金免疫层析技术通过将标记了胶体金的抗原或抗体固定在条状纤维素膜(membrane)上,以形成固相载体,然后将待测样品以液体形式加入到一端的样本垫(sample pad)之后,通过液体在硝酸纤维素膜上形成的毛细作用(capillary flow)而向前移动,同时使待测样品中的受测物与硝酸纤维素膜上的抗体或抗原发生特异性结合而形成免疫复合物。免疫复合物被富集在特定区域(test line),通过胶体金的颜色反应而得到直观的结果,而游离的标记物则越过检测带(control line)进入到末端的吸水垫(wicking pad),不呈现显色反应。胶体金免疫层析试纸条的构造模式见图1。
2胶体金免疫层析技术的分类及结果判断
胶体金免疫层析按照反应模式可以分为三类,即:间接法、夹心法和竞争抑制法[5]。其中夹心法又可分为双抗体夹心法和双抗原夹心法。对未知抗原的检测常采用双抗体夹心法和竞争抑制法,而对未知抗体的检测常采用双抗原夹心法和间接法。
3免疫胶体金技术在动物疾病中的应用
3.1传染病的诊断
3.1.1病毒病的诊断廖圆圆等[6]建立了间接胶体金免疫层析方法用于检测犬血清中RV Ig G抗体,该方法不仅敏感性高(可检出最低中和抗体效价水平0.5 IU/m L),且与商品ELISA检测试剂盒的总符合率达到99.4%。陈一鸣等[7]用研制的PRRS抗体试纸条与ELISA检测方法分别对36份血清样品进行检测,结果显示PRRS抗体试纸条的敏感度为81.5%,特异度为100%,符合率为86.1%,重复性良好。王中力等[8]构建了检测犬细小病毒(CPV)的间接胶体金免疫层析法,(GICA)敏感性为100%;特异性为97.3%;与HA检测结果符合率为98.3%,对犬重要传染性疾病(犬细小病毒病)的诊断提供了快速的检测方法。因此,胶体金免疫层析诊断方法适合于临床的快速诊断。
3.1.2细菌病的诊断刘凯等[9]构建了牛出血性败血症胶体金免疫层析快速诊断方法,该方法采用双抗体夹心法检测牛源巴氏杆菌,经优化后该方法与细菌检查结果一致性为100%,无交叉反应,稳定性可以维持半年。布日额等[10]建立了检测牛乳中致病性金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析方法,试纸条与致病性金黄色葡萄球菌分离鉴定法符合率为90.0%、与PCR试剂盒符合率为83.3%。李伟等[11]建立的炭疽杆菌芽孢胶体金层析检测技术,胡孔新等[12]建立的快速检测鼠疫杆菌抗原用的胶体金标记免疫层析方法,谌志强等[13]建立的大肠杆菌0157:H7胶体金免疫渗滤法等都能够快速有效地对细菌性疾病进行检测和诊断。
3.1.3寄生虫病的诊断王艳华等[14]将构建的胶体金试纸条检测人工感染弓形虫GJS株速殖子的7只兔,对兔血清进行检测,同时用弓形虫分泌的抗原进行IHA参照。结果显示,试纸条在第3 d即可检测出抗体,而IHA法则在第5 d才可检测出抗体,且该方法对猪瘟及猪衣原体病阳性血清均为阴性,无交叉反应性。曾小军等[15]建立了检测血吸虫的免疫胶体金技术,与IHA抗体检测技术比较,检出率分别为95.24%和100.00%;慢性血吸虫病患者的检出率分别为92.86%和94.64%。两种方法对于血吸虫的检出效能一致,而胶体金技术对于血吸虫的检出效率略低于IHA方法,可能与包被所使用的蛋白及抗体出现的时机相关。
3.2检验检疫检验检疫对于国家进出口货物,尤其是生物源物品的安全流通具有重要的作用,是关系到国家生物安全的一个重要环节。然而对于进出口关卡的样品进行检测,需要快速准确的检测方法,方能提高效率而不耽误货物中转及旅客流通。动物活体检疫、动物源性食品及流通过程中的监测,对消费者的消费安全和身体健康具有直接或者间接的影响,同时制约了动物防疫工作切实有效地开展。胶体金免疫层析技术可快速、有效地对现场进行诊断,并可给出诊断结果,对于检验检疫具有较大的现实意义。
4不同方法试验对比
4.1试验材料禽流感H5抗体快速检测卡,深圳康百得生物科技有限公司生产;H5血凝抑制试验抗原与阳性血清由哈尔滨兽医研究所生产;禽血清30份,随机在散养户中采集。
4.2试验数据从试验数据(见表1)可知,禽流感抗体快速检测卡与禽流感HI和HA试验所得出的结果基本一致,区别在于,禽流感HI和HA试验可以得出准确的数值,而H5抗体快速检测卡只能定性作出阴性或阳性结果判断。
5总结
免疫胶体金层析技术因操作简便、无须使用仪器设备、快速出结果等优点而被广泛应用于各个领域。动物疾病诊断不但可帮助畜牧养殖业的健康发展,更重要的可为消费者提供安全放心的动物源性食品。就动物疾病的免疫胶体金层析技术研发而言,选择何种反应方式、包被抗体或抗原的选择、检测抗原或者不同抗原刺激的抗体出现顺序等都需要考虑在内。对于细菌引起的疾病,因菌种之间可能存在一定的抗原交叉性,故需要注意诊断方法的特异性。与此同时,还需要尽可能提高试纸条的敏感性,而且对于一项新的检测技术,往往需要经过长时间的实践检验才能进入临床应用和推广。如果能很好地解决免疫胶体金层析试纸条检测方法的特异性、敏感性和稳定性,而研发出一种比较成熟的检测技术,无疑具有广阔的实际应用前景,同时也应成为广大科技工作者努力的方向。
胶体金免疫层析技术 篇3
关键词：莴苣花叶病毒,胶体金免疫层析法,免疫试纸条
莴苣 (Lactuca sativa) , 为菊科莴苣属植物, 是一种常见的食用蔬菜, 可分为叶用和茎用两类, 中国南北各地以茎用莴苣 (莴笋) 栽培为主, 近年来叶用莴苣在北京及沿海一些城市发展迅速。莴苣花叶病毒 (Lettuce mosaic virus, LMV) 在世界莴苣产区广泛分布, 是危害莴苣的主要病毒, 曾给一些国家的莴苣生产造成严重损失。该病毒为马铃薯Y病毒属 (Potyvirus) 成员, 病毒粒体呈弯曲线状, 大小为750nm×13nm, 核酸为单分子正义RNA。其自然寄主有莴苣、苣荬菜 (Sonchus brachyotus) 、豌豆 (Pisum sativum L.) 、鹰嘴豆 (Cicer arietinum) 、野芥 (Sinapis arvensis L.) 、菠菜 (Spinacia oleracea L.) 、红花 (Carthamus tinctorius L.) 、蓝眼菊属 (Osteospermum spp.) 、勋章菊属 (Gazania spp.) 、柴胡 (Bupleurum falcatum) 和耳叶金鸡菊 (Coreopsis auriculata) 等[1,2,3]。LMV可通过汁液接种、蚜虫和种子等途径传播。国内外对其生物学特性[4,5,6]、血清学关系、抗病性和分子生物学等方面进行了研究[7,8,9,10]。
病毒的检测是病毒病防控的关键点, 虽然ELISA[11]及RT-PCR[12]等方法均可用于对LMV的检测, 但在大田生产上胶体金免疫层析试纸条因具有检测快速、准确和便捷等优点, 受到广泛关注, 美国Agdia公司、瑞士Bioreba公司已出售多种检测植物病毒的试纸条。该文通过病毒的提纯、抗血清的制备和胶体金试纸条的制作及测试, 以期建立LMV病毒的快速检测方法, 用于田间病害的诊断。
1 材料与方法
1.1 材料
供试的病毒毒原为LMV-PV-63分离物, 引自美国ATCC, LMV-PV-0799、LMV-PV-0901分离物引自德国DSMZ, 保存在昆诺阿藜 (Chenopodium quinoa) 上。供试马铃薯X病毒 (Potato virus X, PVX) 、马铃薯Y病毒 (Potato virus Y, PVY) 、马铃薯A病毒 (Potato virus A, PVA) 、葡萄A病毒 (Grapevine virus A, GVA) 、齿兰环斑病毒 (Odontoglossum ringspot virus, ORSV) 、黄瓜绿斑驳花叶病毒 (Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV) 、葡萄扇叶病毒 (Grapevine fanleaf virus, GFLV) 和烟草环斑病毒 (Tobacco ringspot virus, TRSV) 为中国检验检疫科学研究院植物检疫研究所收集的毒原。主要试剂和设备为羊抗兔抗体 (军事医学科学院微生物流行病研究所) 、碱性磷酸酯酶标记的山羊抗兔抗体 (中杉金桥公司) 、LMV双抗体夹心酶联诊断试剂盒 (美国Agdia公司) 、层析膜 (Whatman公司的Immunopore RP膜) 、Beckman Coulter Avanti J-26XPI高速离心机、Beckman Coulter Optima L-100XP超速离心机、JEM-1400透射电子显微镜, BioDot XYZ 3050三维喷点平台和BioDot CM4000切条机。
1.2 方法
1.2.1 病毒的提纯
LMV-ATCC-PV63在昆诺阿藜上繁殖, 作病毒提纯用, 提纯方法参照文献[13]。
1.2.2 多克隆抗体的制备和效价测定
免疫用的实验动物为新西兰白兔。提纯病毒和弗氏完全佐剂乳化后, 后腿肌肉注射1次, 其后病毒和弗氏不完全佐剂乳化后, 后腿肌肉注射4次, 每次注射间隔期为10d, 末次注射10d后采血。用间接ELISA方法测定抗血清的效价, 抗血清用1 mL HiTrap Protein G (GE公司) 柱纯化获得IgG。
1.2.3试纸条的检测和结果判定
试纸条的制作参照文献[14]。取出试纸条将具有胶体金复合物端插入300~400μL离心后的检测样品中, 10min左右判断结果。若试纸条仅质控C线出现紫红色线而检测T线未显色, 结果为阴性;若试纸条上C线和T线均出现紫红色, 结果为阳性;若试纸条C线和T线都没有显色, 则说明此试纸条已经失效, 结果无效。
2 结果与分析
2.1 病毒提纯结果
提纯的LMV经紫外测定, 呈典型的核蛋白吸收曲线 (见图1) , OD260=3.851, OD280=2.206, OD260/OD280=1.75。100g病叶提纯后可获得1.5mg病毒, 提纯的病毒用2%醋酸双氧铀负染后在透射电子显微镜观察到长度约750nm的弯曲线状病毒粒体 (见图2) 。
2.2 抗血清的效价
LMV抗血清用间接ELISA测定, 检测提纯病毒 (浓度3μg·mL-1) 的效价高达1/512 000, 检测昆诺阿藜病汁液 (稀释10倍) 效价为1/128 000, 健康昆诺阿藜 (稀释10倍) 的本底反应低 (见表1) 。
2.3 试纸条检测灵敏度
试纸条检测提纯LMV灵敏度可达1μg·mL-1 (见图3) , 缓冲液对照T线未显色;检测昆诺阿藜病汁液可稀释1 000倍 (W/V) , 健康对照T线未显紫红色, 有叶绿素吸附 (见图4) 。
从左至右分别为:提纯的病毒 (10、1、0.1、0.01、0.001μg·mL-1) , 缓冲液对照。From left to right show purified LMV (10, 1, 0.1, 0.01, 0.001μg·mL-1) and Buffer (CK) .
从左至右分别为:昆诺阿藜健康汁液 (10-1) , 昆诺阿藜病汁液 (10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6) 。From left to right show Healthy C.quinoa (10-1) , LMV infected C.quinoa (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6) .
2.4 试纸条特异性测试
用莴苣花叶病毒试纸条检测LMV的3个分离物 (PV-63、PV-0907、PV-0799) , C线和T线均出现紫红色, 结果呈阳性反应 (见图5) 。
用莴苣花叶病毒试纸条检测其它8种病毒, C线均出现紫红色的线, 检测T线未出现紫红色, 检测结果为阴性, 但其中6种病毒 (PVY、PVA、GVA、CGMMV、GFLV、TRSV) 的T线上出现不同程度的叶绿素非特异性吸附 (见图6) 。
从左至右分别为:LMV-PV-63、LMV-PV-0907、LMV-PV-0799。From left to right show LMV-PV-63, LMV-PV-0907, LMV-PV-0799.
从左至右分别为:PVX、PVY、PVA、GVA、ORSV、CGMMV、GFLV、TRSV。From left to right show PVX, PVY, PVA, GVA, ORSV, CGMMV, GFLV, TRSV.
2.5 田间采集样品的测试
从田间采集来的莴苣叶片30份, 按1∶10 (W/V) 稀释, 用试纸条进行测试, 结果2份为阳性, 28份为阴性, 经ELISA方法确认, 两者结果相符。
3 结论与讨论
研究所制作的LMV胶体金免疫层析试纸条检测提纯病毒的灵敏度可达1μg·mL-1, 检测病汁液可稀释1 000倍, 试纸条可特异性检测到LMV的3个分离物, 与PVX等8种其它病毒无交叉反应。
病毒的提纯和高质量抗血清制备是成功制作胶体金试纸条的前提, 课题组制作的试纸条有时T线上会出现叶绿素吸附的绿色线, 在结果判断时要引起注意, 为避免误判, 必要时可用其它方法对结果加以验证。出现的植物体内色素的非特异性吸附问题, 今后可通过对试纸条制作的工艺或样品的前处理加以改进, 以消除叶绿素等对检测结果的影响。
胶体金免疫层析技术 篇4
1病历摘要
患者由于不明原因出现腰酸痛, 未发生过软组织挫伤, 经检查未发现腰椎病变和肾脏病变, 在医生建议下服用六味地黄丸水滴丸进行尝试治疗, 自觉症状缓解。于第3天发现大便颜色变成黑褐色, 到我院就诊, 采用胶体金免疫法行大便潜血检测, 结果呈阳性, 临床怀疑可能出现肠胃道相关出血性疾病, 建议到上级医院进行胃镜、肠镜检查。上级医院检查结果均未发现病变, 此期间患者仍继续服用六味地黄丸水滴丸, 后又到我院就诊, 遂建议停药3天后再行潜血检测。患者于停用六味地黄丸水滴丸后第4天, 到我院再次进行大便潜血检测, 大便颜色转为正常, 潜血检测结果显示阴性。
2分析
本院采用的胶体金免疫潜血试纸生产厂家使用说明书中描述, 检测结果不受食物中动物血或铁剂等药物的干扰, 检测初始笔者未曾考虑存在药物干扰的可能性。但经过停药后复查结果的变化, 笔者认为本例患者存在药物干扰的可能性最大, 查阅文献均未见药物对胶体金免疫潜血检测干扰的相关报道, 于是联合检验员进行如下试验证实:
2.1取患者服用的云南腾冲制药厂生产的六味地黄丸水滴丸 (批号:130177) 1粒放入5ml试管中, 加入纯净水1ml, 置37℃水浴箱中30分钟使其充分溶解, 得黑褐色溶液, 取艾康生物医药 (杭州) 有限公司生产 (批号:201211191/3) 胶体金免疫潜血检测试纸一条, 按照大便潜血项目SOP文件要求进行检测。结果呈阳性, 证明六味地黄丸水滴丸中存在影响胶体金免疫潜血检测结果的因素;所得药物溶液颜色与患者大便颜色近似, 可以解释患者大便颜色改变缘由。
2.2六味地黄丸为中医传统补肾良方, 由熟地、山药、枣皮、茯苓、泽泻、丹皮六味中药组方而成。为探究具体哪一种药材产生的干扰, 我们取每种生药材1g置于5ml试管中, 加纯净水2ml, 于37℃水浴箱中静置4小时, 得药物浸出液, 取艾康生物医药 (杭州) 有限公司生产 (批号:2 0 1 2 1 1 1 9 1/3) 胶体金免疫潜血检测试纸条, 按照大便潜血项目SOP文件要求逐一进行潜血检测。熟地、山药、茯苓、泽泻、丹皮五味药物浸出液结果呈阴性, 枣皮药物浸出液结果呈阳性。至此, 可以得出是六味地黄丸组方中的枣皮是导致胶体金免疫潜血检测假阳性的根源。
2.3胶体金免疫潜血检测的原理为利用单克隆的抗人血红蛋白或抗人红细胞基质的单克隆抗体与人血红蛋白或人红细胞有高度特异性的特点[2], 检测粪便隐血, 不受动物的血、肉、含过氧化物酶的新鲜蔬菜、铁剂、维生素C的影响。枣皮性微温, 味酸、涩, 所含成分为皂甙、鞣酸等, 基本上不存在影响胶体金免疫潜血检测的化学成分。文献表明单克隆抗体法检测大便潜血, 可受不同p H值溶液等因素的影响, 在低p H值和高p H值下均可出现假阳性, 只有在p H值7.0时不存在假阴性或假阳性[3]。枣皮药物浸出液为一酸性溶液, p H值在2.0~3.0之间, 因此出现假阳性就有了合理的解释。
综上所述, 胶体金免疫潜血检测虽不受药物的影响, 但药物可以通过改变检测溶媒的p H值, 进而影响到结果。在利用胶体金免疫潜血试剂检测大便潜血时, 当遇到检测结果与患者症状体征不相符时, 不妨考虑患者的饮食、药物是否存在可以改变大便检测溶媒p H值的残物, 利用p H值试纸进行确认, 以尽量减少假阳性、假阴性结果, 增加检验结果的可靠性。
参考文献
[1]大便隐血 (FOB) 检测试剂 (胶体金) 法说明书.艾康生物医药 (杭州) 有限公司.
[2]叶应妩, 王毓三.全国临床检验操作规程[M].南京:东南大学出版社, 1991:125.
胶体金免疫层析技术 篇5
近年来, 虾病毒检测的方法发展迅速, 针对这两种对虾病毒的诊断手段除了临床症状观察法和病理学的传统诊断方法外, 还有免疫学、分子杂交、PCR等方法[1,7,8,9,10]。为了简化试验操作, 加快诊断速度, 提高检测敏感性, 我们开发利用胶体金免疫层析技术检测对虾WSSV和IHHNV病毒的PCR扩增产物进行检测。通过PCR引物的特殊修饰, 再用抗体识别修饰的PCR产物并在胶体金免疫检测试剂条上呈色, 实现病毒扩增产物的快速和高灵敏度的检测。目前, 国内外还没有应用PCR-胶体金免疫层析方法同步检测对虾WSSV和IHHNV的研究报道。本研究实现的两病毒同步检测, 简化了操作程序和时间, 有助于尽早发现病原, 尽早处理和预防, 最大可能地减少病毒病害所带来的经济损失。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验样品与质粒
含白斑综合征病毒 (WSSV) 的虾样品DNA、含传染性皮下和造血器官坏死病毒 (IHHNV) 的样品DNA和发病的对虾样品均由浙江省水产技术推广总站提供, 样品为2013年采集于浙江省各地对虾养殖场, 其中DNA于-20℃保存, 样品虾于-80℃保存。p MD-WSSV、p MD-I-HHNV阳性重组质粒由本试验室构建保存于-20℃。
1.1.2 试剂盒
对虾WSSV和IHHNV双检试剂盒 (PCR-胶体金法) (普望生物技术有限公司, 杭州) 包含虾基因组DNA快速提取试剂、WSSV PCR-MIX、IHHNV PCR-MIX和胶体金免疫试剂条等。
1.2 DNA提取
取样品虾腹足 (约25~50 mg) , 用试剂盒中对虾基因组DNA快速提取试剂, 根据说明书指导提取基因组DNA。
引物设计根据Gen Bank中公布的WSSV 4个不同的地理株 (录入号码为AF369029、AF332093、NC 003225、AF440570) 和IHHNV 7个不同的地理株 (录入号码为GQ411199、AF218266、JN377975、NC002190、JX840067、JX258653、EF633688) 的全基因组序列, 通过BLAST比对分析序列的保守区, 利用Primer3web[11]分别设计检测WSSV和IHHNV的2对特异性引物。WSSV和IHHNV引物的扩增产物片段大小分别为227 bp、241 bp。引物由上海生物工程有限公司合成和修饰。普通检测引物和修饰后的标记引物序列见表1。国家标准《对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 (IHHNV) 检测PCR法 (GB/T25878-2010) 》和《白斑综合征 (WSD) 诊断规程第2部分:套式PCR检测法 (GB/T 28630.2-2012) 》中PCR检测WSSV和IHHNV的 (套式) 引物序列 (表1) 由上海生物工程有限公司合成。
1.3 PCR反应
试验中采用WSSV PCR-MIX和IHHNV PCR-MIX为杭州普望生物技术有限公司产品, 试验反应体系10.0μL, 其中9.0μL PCR-MIX (Hangzhou Proprium Biotech Company Limited) 包含PCR Buffer、d NTPs (d U plus) 、Mg SO4、WSSV或IHHNV的上下游引物、Uracil-DNA Glycosylase、Taq HS, 反应时每管添加1.0μL提取的对虾基因组DNA, 混匀后进行PCR反应。
本试验是在同一次PCR反应中, 采用同一个反应程序, 用不同的引物同步对DNA模板进行扩增。对同步二温式PCR反应的各参数 (退火温度、延伸时间、Mg2+和引物浓度) 进行优化, 筛选出同步PCR反应中最佳反应条件, 其PCR程序:37℃10 min, 一个循环;94℃10 min, 一个循环;94℃10 s, 60℃30 s, 35个循环;最后置于4℃。
1.4 PCR产物的检测和结果判断
1.4.1 电泳检测和结果判断
取5.0μL PCR反应产物, 以Marker (Gen Star Biosolutions) 作为DNA分子量标准在2%琼脂糖凝胶 (添加溴化乙锭染料) 中进行电泳检测, 电泳结束后置于紫外光检测仪下观察, 并用凝胶成像系统 (上海培清科技有限公司) 拍照。
1.4.2 胶体金免疫层析检测和结果判断
在PCR产物管中加入90.0μL PBS缓冲溶液, 混匀后垂直滴加到胶体金免疫检测试剂条 (杭州普望生物技术有限公司) 的加样孔中, 等待紫红色条带的出现, 测试结果在滴加样本起5~10 min内读取。
若C线和T线均显色检验结果呈阳性;若C线显色而T线不显色则检测结果呈阴性;若C线不显色则结果无法判断。
1.4.3 灵敏度试验
将试验室的阳性重组质粒p MD-WSSV、p MD-IHHNV作为模板, 用Thermo Scientific Nano Drop 1 000紫外分光光度计分别测定其含量后, 将质粒作10倍进行梯度稀释, 并对上述模板进行同步PCR扩增, 反应结束后用PBS缓冲液将扩增产物稀释, 滴加到胶体金检测板的加样孔中检测PCR-胶体金层析检测的敏感性。
1.5 灵敏度比较试验
PCR-胶体金层析检测法与国家标准PCR检测方法的。将试验室的WSSV和IHHNV阳性样品 (浙江省水产技术推广总站提供) 作为模板, 用Thermo Scientific Nano Drop 1000紫外分光光度计分别测定其含量后, 将WSSV和IHHNV阳性DNA模板分别作10倍、3倍进行梯度稀释, 并对上述模板进行同步PCR扩增, 反应结束后用PBS缓冲液将扩增产物稀释, 滴加到胶体金检测板的加样孔中检测PCR-胶体金层析检测的敏感性。而国家标准巢式PCR检测WSSV中用外引物和内引物扩增的目的片段分别为1 447 bp、941 bp, 国家标准中一步式PCR检测IHHNV目的片段为389 bp。
2 结果
2.1 WSSV和IHHNV的PCR检测方法的建立
以含白斑综合征病毒 (WSSV) 的虾样品DNA、含传染性皮下和造血器官坏死病毒 (IHHNV) 的虾样品DNA作为模板进行PCR反应, 以病虾样品DNA为模板, 用WSSV和IHHNV检测的普通引物和修饰引物均可分别扩增得到预期的大小为227bp、241 bp的片段, 健康虾样品DNA及阴性水对照则无对应条带 (图1) 。试验表明, 用生物素、地高辛修饰的WSSV和IHHNV检测引物均可进行正常的PCR反应, 并能够分别扩增得到目标片段。
2.2 WSSV和IHHNV的胶体金层析检测方法的建立
以病虾样品DNA为模板, 检测WSSV和IHH-NV的2对修饰引物 (上下游分别为生物素和地高辛) 扩增的PCR产物经胶体金层析检测C线和T线均显色, 检测结果均为阳性 (图2, 3, 样品1) ;以健康虾样品DNA为模板, 检测WSSV和IHHNV的2对修饰引物 (上下游分别为生物素和地高辛) 扩增的PCR产物经胶体金层析检测C线显色, T线不显色, 检测结果均为阴性 (图2, 3, 样品2) ;如用没有修饰的引物, 以病虾样品DNA、健康虾样品DNA为模板, 检测WSSV和IHHNV的2对普通引物扩增的PCR产物经胶体金层析检测均是C线显色, T线不显色, 检测结果均为阴性 (图2, 3, 样品3-4) 。
注:1.WSSV修饰引物扩增阳性样品;2.WSSV普通引物扩增阳性样品;3.WSSV修饰引物扩增水 (阴性对照) ;4.WSSV普通引物扩增水 (阴性对照) ;5.IHHNV修饰引物扩增阳性样品;6.IHHNV普通引物扩增阳性样品;7.IHHNV修饰引物扩增水 (阴性对照) ;8.IHHNV普通引物扩增水 (阴性对照) ;M.DNA ladder (Gene Star公司, 从下至上依次为:100、250、500、750、1 000、2 000、3 000、5 000 bps) 。
注:1.WSSV修饰引物扩增阳性样品胶体金层析检测;2.WSSV普通引物扩增阳性样品胶体金层析检测;3.WSSV修饰引物扩增水 (阴性对照) 的胶体金层析检测;4.WSSV普通引物扩增水 (阴性对照) 的胶体金层析检测。
注:1.IHHNV修饰引物扩增阳性样品胶体金层析检测;2.IHHNV普通引物扩增阳性样品胶体金层析检测;3.IHHNV修饰引物扩增水 (阴性对照) 的胶体金层析检测;4.IHHNV普通引物扩增水 (阴性对照) 的胶体金层析检测。
2.3 PCR-胶体金层析检测的敏感度较目前国家标准提高10-100倍
将试验室的阳性重组质粒p MD-WSSV、p MD-IHHNV作为模板分别测其含量后, 将上述核酸作10倍梯度进行稀释, 进行PCR检测。PCR产物的电泳图见图4、5。5×103拷贝PCR产物EB染色后可见明显条带。我们然后对以上已稀释模板进行PCR-胶体金层析检测, 发现50到5×108拷贝检测为阳性, 小于50拷贝为阴性 (图6, 7) 。因此, 我们的体系最低能够检测到约为50拷贝的WSSV核酸模板和50拷贝的IHHNV模板, 与电泳检测PCR产物相比较, 胶体金检测灵敏度可明显提高10~100倍。
注:样品的起始拷贝数1~10分别为:5×108;5×107;5×106;5×105;5×104;5×103;5×102;50;5;阴性对照。M:DNA ladder (Takara公司, 1 500 bp、1 000 bp、900 bp、800 bp、700 bp、600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp) 。
注:样品1~10的起始拷贝数同图4。
注:样品1-10的起始拷贝数同图4。
注:样品1-10的起始拷贝数同图4。
3 讨论
病毒的快速、准确、简便的检测方法是对虾病害控制的关键。通常的PCR检测策略只是检测对虾病毒的某一个种类, 但是在对虾养殖过程中会同时受到不同病毒的侵染[12]。同时检测不同病毒, 是彻底全面控制对虾病毒的关键的第一步。因此目前许多研究采用特殊的PCR方法, 包括多重PCR[13,14]和同步PCR[15]进行同时检测多种病毒。本文研究的同步PCR方法检测病毒的策略是先检索、比对、筛选它们在Gen Bank中的核酸序列, 再应用软件同时批量设计出退火温度等参数非常相近的引物, 采用在同一次PCR反应中, 在不同的反应管中同时分别扩增样品中DNA模板, 从而达到同时检测样品中携带多种病毒的情况。我们用生物素、地高辛修饰WSSV和IHHNV病毒的PCR扩增引物, 扩增后的双链PCR产物含有生物素和地高辛标记, 可以和胶体金层析检测板上的生物素和地高辛抗体结合而被检测到。该研究建立的同步PCR-胶体金层析检测方法具有广泛的适用性, 可推广到其他病毒的检测。检测的特异性来自于引物的特异性, 设计不同病毒的特异性引物可以扩增出其特定的目标片断, 达到对不同病毒的检测。
本研究使用的PCR-MIX中含有UNG (尿嘧啶-DNA糖基酶) , 目的是为了防止遗留污染。但是研究表明在利用PCR对WSSV病毒进行检测中, UNG的使用使其检测灵敏度降低了一个数量级[15]。虽然如此, 本试验结果显示我们所建立的方法检测病毒灵敏度达到了50~100个拷贝, 而OIE巢式PCR与GB巢式PCR方法的国标方法[16]分别只能检测到104和103个病毒拷贝[6]。本研究所建立的检测方法的灵敏度有明显的提高 (10~100倍) , 为水产诊断感染病毒奠定了基础。同时, 本研究中PCR产物的检测也采用简便、快速的胶体金层析技术, 与电泳相比较, 不仅省时、省力, 而且无毒、环保。我们的检测方法10分钟内即可用肉眼观察检测板的显色结果, 大大缩短了常规的利用电泳和溴化乙锭 (EB) 染色检测PCR产物的时间 (约2 h) , 并让工作人员避免了接触有毒和诱导突变的试剂, 免除基层检测试验室购买电泳设备和荧光检测系统的投资。
胶体金免疫层析技术 篇6
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
氯金酸(美国Sigma公司)、柠檬酸三钠(天津化学试剂厂)、AFB1标准抗原(美国Sigma)、AFB1单克隆抗体(英国Abcam)、羊抗鼠Ig G(美国Sigma)、卵血清蛋白(OVA,ORGANICS,USA)、牛血清白蛋白(BSA,BIOSHARP)、羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)、二甲基甲酰胺(DMF)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)(国药集团化学试剂有限公司)、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾(天津市科密欧化学试剂有限公司),所用试剂均为分析纯;实验用水均为Milli Q纯水、硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、吸水滤纸(上海金标生物科技有限公司);恒温磁力搅拌器、UV1601紫外可见分光光度计(日本岛津)、HC-2514高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)、水浴恒温回流装置和旋转蒸发仪。
1.2 配制的溶液
1 g/L氯金酸溶液、0.1 g/L氯金酸溶液、10 g/L柠檬酸三钠溶液、0.01 mol/L,p H=7.4磷酸盐缓冲液(PBS)、0.1 mol/L K2CO3溶液、金标垫处理液和硝酸纤维素(NC)膜封闭液,共7种。
1.3 胶体金的制备(柠檬酸三钠还原法[4])及鉴定
1.3.1 胶体金的制备
将玻璃器皿全部清洗干净,并用铬酸浸泡过夜,清洗干净后放入烘干机中烘干。取5份0.1 g/L氯金酸水溶液100 ml分别于250 ml锥形瓶中,标号分别为①、②、③、④、⑤,瓶中放有数粒防爆珠,于恒温磁力搅拌器中加热至沸腾,在手动晃动下逐滴加入10 g/L柠檬酸三钠溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml,继续晃动加热10 min,取下锥形瓶继续晃动10 min,期间观察颜色变化。待室温冷却后,将所得5份胶体金溶液转移至棕色试剂瓶中4℃下保存备用。
1.3.2 胶体金的鉴定
①目测法:用肉眼观察所制得的胶体金溶液,观察其颜色、均匀度和透明度。②紫外法:用紫外可见分光光度计在可见光范围内(400~600nm)对胶体金溶液进行波长扫描分析,获得胶体金可见光区吸收光谱,记录最大吸收波长。③p H值的测定:由于金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞,故不能用p H计测定胶体金溶液的p H值,一般使用精密p H试纸。
1.4 AFB1人工抗原的制备及鉴定
1.4.1 AFB1肟(AFB1O)的制备
AFB1O的制备是根据Morgan等[5]报道的原理,参考陈福生等[6,7]的方法。具体制备方法为:1 mg的AFB1和2 mg的羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)溶于1.5 ml吡啶甲醇双蒸水混合液中(0.25 ml吡啶+1 ml甲醇+0.25 ml双蒸水),控温(85℃)回流反应4 h,用TLC检测反应进程,室温搅拌过夜。旋转蒸发仪将溶剂旋干剩余0.25 ml体积,加入1 ml水,用2 mol/L的H2SO4调节p H=4,溶液变浑浊,用5 ml乙酸乙酯萃取二、三次,合并有机相(10 ml),并用水洗涤2次,浓缩旋干液体,得黄色油状半固态物质即是AFB1O。
1.4.2 TLC鉴定肟化
将肟化后沉淀物用少量甲醇溶解,以氯仿∶甲醇=9∶1为展开剂,Rf(TLC中溶质迁移距离与流动相迁移距离之比)值为0.20左右的是AFB1O(Rf=0.8左右的组分是没有转化的AFB1)。
1.4.3 包被抗原的合成
采用EDC法合成包被抗原,合成原理见图1。方法为1 mg AFB1O溶解于0.2 ml二甲基甲酰胺和水(DMF:H2O=6∶9)的混合溶液,加入10 mg EDC,25℃避光活化4h,再补加10 mg EDC。称3.5 mg OVA,用0.13 mol/L的Na HCO3溶液制成10%OVA活化溶液,将OVA溶液逐滴加入上述反应液中,室温搅拌反应24 h。反应产物在4℃搅拌下用PBS透析3 d,每天换液3~6次,透析后得到纯化的AFB1-OVA。
注:EDC-1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳=亚胺盐酸盐;AFB1—黄曲霉毒素B1
1.4.4 紫外扫描鉴定
用含3%甲醇的PBS稀释OVA标准溶液及AFB1-OVA溶液,用甲醇∶PBS(V∶V=1∶4)稀释AFB1标准溶液,利用紫外分光光度计测定其浓度和特征峰,然后调节AFB1-OVA溶液的蛋白质浓度与OVA标准溶液一致,在波长200~400 nm范围内进行紫外扫描,根据吸收峰的变化判断偶联是否成功。
1.5 胶体金-AFB1单抗复合物的制备
1.5.1 测定胶体金标记抗体最低稳定量
操作方法[9]如表1所示。取8支试管,分别加入1 ml胶体金溶液;用0.01 mol/L PBS将单抗稀释成0.1 mg/ml,各取0、2、5、7、10、11、12、14μg,按顺序加入各管中,混匀,静置5 min后,再向上述各管中加入100μl 10%的Na Cl溶液,混匀,静置30 min。
肉眼观察:根据加入抗体后胶体金颜色的变化判断,以颜色不再变化的试管的添加量初步确定为单抗最低标记量。
紫外可见分光光度计测定:测定520 nm波长处的吸光度值(A520值)。以A520值为纵坐标,试管号为横坐标做一曲线,取A520值达到最大不再变化时所对应的抗体蛋白用量为稳定胶体金的最低蛋白用量,在此基础上再加10%~20%即为稳定胶体金的抗体蛋白实际用量。
1.5.2 测定胶体金标记抗体最适p H值
由于试验胶体金溶液为1 ml,直接调p H值不易控制,胶体金溶液容易损坏p H计的电极,参照文献[4]方法,最终以加入0.1 mol/L K2CO3的量为标准。表2中每管胶体金为1 ml;蛋白质的量为最适稳定量。取一系列试管按照表2进行操作,当分别加入100μl 10%的Na Cl溶液后,混匀静置过夜后,弃去沉淀,测定A520值,将结果绘制成图。
1.5.3 胶体金的标记抗体及纯化[10]
根据胶体金标记抗体最适稳定量,计算出标记胶体金总量所需的抗体总量,用PBS将抗体稀释到1 ml,采用低温高速离心法纯化胶体金。
1.5.4 金标抗体的紫外扫描鉴定
用紫外可见分光光度计在可见光范围内(400~600 nm)对胶体金溶液及AFB1金标抗体溶液进行波长扫描分析,获得胶体金及AFB1金标抗体在可见光区吸收光谱,记录最大吸收波长,根据吸收峰的变化判断结合是否成功。
1.6 胶体金标记抗体的处理
1.6.1 玻璃纤维膜的处理
将剪裁好的玻璃纤维膜(长约2 cm,宽约1.2 m)浸泡于胶体金标记垫处理液中,37℃水浴30 min,取出,平铺于纱网上37℃干燥三四小时(充分干燥),放于4℃密封保存备用。在处理后的玻璃纤维膜上按每1.2 cm×1.0 cm滴加120μl胶体金标记抗体溶液,2 min后37℃干燥2 h,放于4℃密封保存备用。
1.6.2 胶体金标记抗体稀释度的确定
纯化的胶体金标记抗体作8、10、15、20、40倍5个不同稀释度后,在其他条件不变的情况下,与固定浓度的抗原组装成试纸条,观察显色情况。根据反应结果,确定最适金标记抗体稀释度。
1.7 NC膜的选择
选取3种进口的NC膜,型号分别为Millipore135、Sartorius CN140、Millipore180,均包被相同浓度的AFB1-OVA和羊抗鼠Ig G,两者相距5 mm,与同浓度金标垫组装成试纸条,测其在PBS中的结果,比较NC膜的性能和测试效果。
1.8 胶体金免疫层析试纸的初步组装及测试原理
1.8.1 组装示意图
最终组装示意图见图2。
1.8.2 测试原理
将AFB1抗体标记于胶体金的作为免疫胶体金,将AFB1-OVA包被于NC膜作为检测线,将羊抗鼠抗体包被于检测线后侧作为质控线。加样检测,若样品中含有AFB1时,首先与免疫胶体金结合形成复合物,此复合物向前涌动到检测线位置,免疫胶体金表面位点由于被AFB1占居而使其不能与检测线的AFB1-OVA结合,此时检测线位置由于不能拦截胶体金而不显色或显色弱,将此检测结果视为阳性,而当样品中不含AFB1时,免疫胶体金涌动到检测线位置时将被AFB1-OVA捕获,胶体金聚集于检测线上将呈现肉眼可见的红色条带,此检测结果视为阴性;当检测线与质控线均无红色条带出现时,说明试纸条失效。见图3。
1.9 试纸条的性能测定
1.9.1 灵敏度试验
将AFB1标准品配制为1.0 mg/ml的贮备液,用甲醇∶PBS(V∶V=1∶4)配制成0、100、200 ng/ml的标准系列溶液。用金标试纸条测试上述标准系列溶液,10~15min内观察,质控线显红色而检测线不显色者为阳性(+),两条红色线者为阴性(-)。
2 结果与讨论
2.1 胶体金鉴定
2.1.1 目测法
用肉眼观察所制得的胶体金溶液,观察其颜色、均匀度和透明度。良好的胶体金应该是清亮透明的,若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物,表明此次制备胶体金不成功。胶体金颗粒直径不同,其光散射作用也不同,所以制备出不同粒径的胶体金溶胶时,由于其光散射作用的不同使其在外观上呈现的颜色也会有较大差异[11,12]。微小颗粒胶体呈红色,但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体(2~5 nm)是橙黄色的,中等大小的纳米金溶胶(10~20 nm)是酒红色的,较大颗粒的纳米金溶胶(30~80 nm)则是紫红色的[13,14]。用肉眼观察本实验所制备的胶体金溶液见图4,可见②~⑤管的颜色相差不大,均为酒红色,清亮透明,无悬浮物;而①管的颜色为紫红色,亦清亮透明,无悬浮物。初步推测其粒径在10~20 nm范围,与参考文献相符,初步判断其符合实验要求,有进一步鉴定的价值。
注:①10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.0 ml,紫红色;②10 g/L柠檬酸三钠溶液添加2.0 ml,酒红色;③10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.5 ml,酒红色;④10 g/L柠檬酸三钠溶液添加2.5 ml,酒红色;⑤10 g/L柠檬酸三钠溶液添加3.0 ml,酒红色
2.1.2 紫外法
扫描胶体金的吸收光谱,是一种简单有效的胶体金质量鉴定方法。金纳米微粒溶液呈现出颜色主要是因为等离子体共振吸收,而这个吸收与胶体金纳米微粒的形态以及结构等有关。所以通过紫外可见光谱,可以得到颗粒粒度以及结构等信息。将冷却后的胶体金溶液,以双蒸水作对照,用紫外可见光分光光度计在400~600 nm范围内进行扫描,测定吸收曲线和吸收峰,确定最大吸收峰。纳米胶体金溶胶在可见光范围内有一单一光吸收峰,这个光吸收峰的最大吸收波长(λmax)在510~550 nm范围内,随纳米胶体金溶胶颗粒大小而变化,大颗粒纳米胶体金溶胶的λmax偏向于长波长;反之,小颗粒纳米胶体金溶胶的λmax则偏于短波长;吸收峰宽度越小,标准偏差越小,说明颗粒越均匀;吸收峰宽度越大,标准偏差越大,说明颗粒越不均匀,可能会出现椭圆形或多三角形颗粒[15]。本实验所制备的5组胶体金溶液在400~600 nm扫描图谱见图5。
10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.0 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为529 nm;10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.5 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为518nm;10 g/L柠檬酸三钠溶液添加2.0 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为518 nm;10 g/L柠檬酸三钠溶液添加2.5 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为517 nm;10 g/L柠檬酸三钠溶液添加3.0 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为517 nm。可知,10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.5、2.0、2.5、3.0 ml时,最大吸收峰波长均在520 nm左右,符合做AFB1胶体金免疫层析法检测试纸条的要求。
2.1.3 p H值的测定
由于胶体金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞,故不能用p H计测定胶体金溶液的p H值,一般使用精密p H试纸。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金,在柠檬酸三钠还原剂的作用下,氯金酸(HCl4)水溶液中的金离子还原成金原子,并聚集成一个微小的晶体金核,同时晶核周围吸附一定的氯金酸离子、氢离子和柠檬酸离子形成吸附层,依靠静电作用形成稳定的胶体溶液。因此制备的胶体金应该呈酸性。用精密p H试纸测定胶体金的p H值为5.8。
2.2 AFB1人工抗原的制备及鉴定
2.2.1 AFB1的肟化
由于AFB1本身上没有与蛋白质偶联的活性基团,所以在制备人工抗原前,要对其进行改造,本实验在Morgan等的基础上,在复合催化剂嘧啶、甲醇、水的催化下,用CMO将AFB1改造成含有羧基的AFB1O。实验过程中,肟化改造的进行,是通过回流装置控温进行,温度始终控制在85℃,回流进行4 h,而后室温冷却过夜。
2.2.2 TLC鉴定肟化
肟化反应进程中监测反应进展情况时,采用的是TLC法,因为AFB1经过肟化后,形成的肟化物AFB1O他们在不同的展开剂下,展开的距离是不同的。利用这个性质可以判断实验过程中,反应物AFB1向反应产物AFB1O的转化程度。在以氯仿∶甲醇=9∶1为展开剂下,在Rf=0.20左右的是AFB1O,Rf=0.8左右是没有转化的AFB1,当荧光斑点在0.2左右有强荧光,而在0.8却没有或很弱的荧光斑点出现时,就能说AFB1基本全部分转化成AFB1O。通过TLC法,可以定性判断反应的进程。
本实验结果如图6所示,Rf值为0.24,故本实验肟化进程完全。
注:TCL—薄层色谱法;AFB1O—典曲霉素B1肟
2.2.3 包被原的合成及鉴定
利用紫外扫描仪在200~400 nm波长范围进行扫描,结果见图7。OVA的最大吸收峰在280.5 nm,AFB1在224、266.5、364 nm处有吸收峰,OVA与AFB1偶联后,偶联物紫外扫描吸收光谱与OVA及AFB1吸收光谱有明显区别,说明有新物质生成。
注:AFB1—黄曲霉素B1;OVA—卵血清蛋白
进一步用新合成的AFB1-OVA组装试纸条,鉴定合成的人工抗原是否成功。结果见图8。以PBS作为阴性测试,质控线和测试线均显示深红色,为阴性结果,表明合成的人工抗原是成功的,可以为后续的实验利用。
注:AFB1—黄曲霉素B1;OVA—卵血清蛋白
2.3 胶体金-黄曲霉毒素B1单抗复合物的制备
2.3.1 胶体金标记抗体最低稳定量的确定
胶体金是一种带负电的疏水性颗粒,未加单抗或当加入的单抗量不足以吸附完胶体金时,加入Na Cl后,由于盐离子效应会改变胶体的性质,出现由红变蓝的聚沉现象。观察各管中胶体金溶液变化,加入蛋白量不足的溶液颜色依次由蓝变红,而加入蛋白量达到或超过时的溶液则保持红色不变。由图9可见,本实验中从每毫升胶体金溶液中单抗添加量等于或大于11μg/ml时,胶体金抗体蛋白结合物吸的光度值不再发生较大的变化,趋于平稳,说明胶体金颗粒对抗体蛋白的吸附基本达到饱和。稳定胶体金的最低蛋白用量为11μg/ml抗体蛋白,在此基础上再增加10%~20%即为待标记抗体蛋白的实际用量。最终确定实际用量为13μg/ml抗体蛋白。
注:对照—AFB1单抗0μg,灰黑色;①—AFB1单抗2μg,灰黑色;②—AFB1单抗5μg,紫灰色;③—AFB1单抗7μg,紫灰色;④—AFB1单抗10μg,紫色;⑤—AFB1单抗11μg,酒红色;⑥—AFB1单抗12μg,酒红色;⑦—AFB1单抗14μg,酒红色
2.3.2 胶体金标记抗体最适p H值的确定
不同p H值条件下胶体金标记抗体的结果见图10。由图10可知在4号管时(添加0.1 mol/L K2CO3量为20μl/ml)胶体金标记抗体蛋白得到的胶体金抗体蛋白结合物的吸光度值最高,说明胶体金颗粒和抗体蛋白吸附较好,从4~7管,测得的数值基本没有变化。故而选用4号管所对应的0.1 mol/L K2CO3量调节胶体金溶液至最适p H值。
2.3.3 胶体金标记抗体鉴定
胶体金标记后,颗粒直径变大,其最大吸收波长将发生红移,所以可以通过测定标记前后胶体金的最大吸收峰来鉴定其是否标记成功;另外,可以将羊抗鼠Ig G包被到NC膜上,将金标抗体与其反应,观察结果,进而鉴定标记是否成功。
本实验采用紫外可见光扫描法对复合物进行了鉴定,最大吸收波长由原来的518 nm移至525 nm,证明胶体金标记AFB1单克隆抗体成功。见图11。
注:AFB1—黄曲霉素B1
2.4 胶体金标记抗体稀释度的确定
用稀释液将胶体金标AFB1抗体稀释不同的倍数,用其制备结合垫并组装试纸条,利用试纸条检测阴性样品,见表3。由表3可知,金标AFB1抗体以1∶8、1∶10和1∶15倍稀释时,试纸条均显示清晰条带,稀释倍数高于1∶15时,条带变淡直至消失。确定金标AFB1抗体的最适稀释倍数为1∶15。
注:AFB1—黄曲霉素B1;++显色深;+显色浅;-不显色。
2.5 NC膜的选择
选取3种进口的NC膜,型号分别为Millipore180、Millipore 135和Sartorius CN 140,其他条件均相同,测其在PBS中的结果,比较跑板速度和显色结果。若跑板速度太快会导致抗原、抗体结合不充分,使信号减弱,表现为T线不明显;若跑板速度太慢则会延迟检测结果,且胶体金标记后的抗体易滞留在膜上,使背景不干净。跑板速度和膜的固有性质有关,如孔径、疏水性等。
从试纸条展开速度和显色结果看,3种NC膜的测试结果差异不明显,但因为Millipore 135显色相对较浅,Sartorius CN 140背景色较深,脆性强,易折断;Millipore180膜显色较深,较少背景色,综合考虑,最后选择Milii Pore 180硝酸纤维素膜作为试纸条的层析材料。
2.6胶体金免疫层析试纸条的初步测试
利用本实验所制备的试纸条,检测用甲醇∶PBS(V∶V=1∶4)配制成0、100、200 ng/ml的AFB1标准系列溶液。结果见图12。质控线均显深红色;AFB1标准品浓度为0 ng/ml时,检测线显深红色;AFB1标准品浓度为100 ng/ml时,检测线显浅红色;AFB1标准品浓度为200 ng/ml时,检测线几乎不显色。说明本实验所制备的试纸条的检测限为200 ng/ml。须进一步优化包被抗原AFB1-OVA的量、羊抗鼠Ig G的浓度及胶体金标抗体的稀释倍数等,以提高试纸条的检测性能。并进一步检测试纸条的检测性能,包括试纸条的特异性、灵敏度、检测限、重现性、稳定性、假阳性率、假阴性率等。并进一步检测食品及谷物中AFB1,与ELISA法等其他检测方法作对比。
注:①AFB1标准品浓度为0 ng/ml,检测线呈深红色;②AFB1标准品浓度为100 ng/ml,检测线呈浅红色;③AFB1标准品浓度为200 ng/ml,检测线几乎不显色
3 结论
本课题采用自偶联完全抗原AFB1-OVA作为包被抗原,以胶体金为示踪剂标记抗体,制备了检测AFB1的胶体金免疫层析试纸条,试纸条的检测限为200 ng/ml。本课题所制备的试纸条作为一种快速筛查的手段,既可节省检测成本,又可使广大基层单位开展AFT的检测和监控工作,具有重要的经济价值,对AFT免疫检测方法的研究具有一定的推进作用。
胶体金免疫层析检测方法虽没有传统的ELISA检测法的灵敏性高,但胶体金试纸条检测速度快、灵敏性特异性相对较好,且与其他毒素无交叉反应,携带方便,适用于现场大批量的检测,是极具发展前景的一种检测方法,此方法在快速诊断中将有着广阔的应用前景。
作者声明
本文无实际或潜在的利益冲突
摘要：目的 制备黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析试纸条。方法 用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶胶,用目测法、紫外可见分光光度法及精密p H试纸对其进行鉴定表征;并采用碳二亚氨法(EDC)将黄曲霉毒素B1(AFB1)偶联于载体蛋白卵血清蛋白(OVA)上,合成包被抗原AFB1-OVA。通过目测法及紫外-可见分光光度法优化标记胶体金的最佳黄曲霉毒素B1单克隆抗体浓度和pH,最后将包被有抗原AFB1-OVA和羊抗鼠Ig G的硝酸纤维素膜和干燥的吸附有金标抗体的玻璃纤维膜组装成试纸条,初步利用竞争性免疫层析原理检测标准品黄曲霉毒素B1。结果 制备的胶体金澄清透亮,呈酒红色,无聚集现象,最大吸收波长为518 nm,呈酸性(p H=5.8)。OVA与AFB1偶联后,偶联物紫外扫描吸收光谱与OVA及AFB1吸收光谱有明显区别,说明有新物质生成。进一步用新合成的AFB1-OVA组装试纸条,检测阴性样品,两线均显深红色,为阴性结果,表明合成的人工抗原成功;胶体金标记黄曲霉毒素B1单克隆抗体最适标记p H为1 ml胶体金溶液中添加0.1 mol/L K2CO3量为20μl,最适蛋白浓度为13μg/ml;初步组装试纸条并检测一定浓度的AFB1标准品,结果表明,试纸条的检测限为200 ng/ml。结论 制备的胶体金符合试纸条所用胶体金的要求;并成功制备AFB1胶体金免疫层析法测定试纸条,但尚须进一步优化条件以提高试纸条的检测性能。
胶体金免疫层析技术 篇7
胶体金免疫层析技术(Gold immunochromatographic assay,GICA)是近年来发展迅速的一项免疫标记技术,它以抗原抗体特异性结合为基础、大孔径微孔滤膜为载体、胶体金为固相标记物来定性检测样本中的待测物质[6]。因其快速、便捷,因此继抗生素微生物检测法[7,8]、理化分析法(高效液相色谱法[1,9]、液质联用法[10,11]、气相色谱法[12]、分光光度法[13]等)和免疫测定法(酶联免疫法[14]、放射免疫法[15]等)后,GICA分析法逐渐被广泛应用于牛奶中抗生素残留检测中[6,16,17]。本试验利用胶体金免疫层析法对牛奶中的磺胺类药物残留进行检测,为磺胺类药物的残留监控提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
(1)市售牛奶、磺胺类药物快速检测试纸(北京勤邦生物技术有限公司)其中包括微孔试剂和试纸条、磺胺类药物标准品(美国Sigma公司)纯度≥99%。(2)微量移液器(单道20~200μl、100~1000μl、多道50~300μl美国Thermo公司)、Acquity液相色谱串联质谱仪配有电喷雾离子源(美国Waters公司)。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理
使用前将待检奶样恢复至室温。(注:牛奶样品必须为均匀液体,不能有结块、发酸和沉淀)。
1.2.2 检测步骤
将原包装预先平衡至室温,打开后取出所需数目的微孔试剂和试纸条,并做好标记;用微量移液器吸取200μl待检牛奶样品溶液于微孔中,缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀;将标记好的试纸条插入微孔中印有“MAX”线端朝下,使之充分浸入溶液中;室温(20~25℃)孵育5min后,取出试纸条,判定结果。
1.2.3 结果判断
阴性(-):C线和T线都显色,无论颜色深浅,均表示牛奶样品中磺胺类药物浓度低于检测限。阳性(+):C线显色,T线不显色,表示牛奶样品中磺胺类药物浓度高于或等于检测限。无效:未出现C线,表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效。在此情况下,应用新的试纸重新测试。
2 结果与分析
2.1 灵敏度试验
采用样品前处理方法,在空白样品中分别添加磺胺类药物标准品至一定的终浓度,然后取三批试纸条进行检测,每批测定5个重复,结果见表1,部分实验结果见图1。
由表1可知,磺胺类药物快速检测试纸条测定牛奶中磺胺类药物残留的检测限分别为:磺胺嘧啶60μg/L、磺胺二甲基嘧啶20μg/L、磺胺喹噁啉80μg/L、磺胺氯哒嗪30μg/L、磺胺间二甲氧嘧啶50μg/L、磺胺间甲氧嘧啶50μg/L、磺胺甲噁唑80μg/L、磺胺苯酰50μg/L、磺胺对甲氧嘧啶30μg/L、磺胺异噁唑10μg/L、磺胺甲氧哒嗪70μg/L、磺胺多辛70μg/L。
(从左到右:磺胺嘧啶添加浓度依次为0、30、60、120μg/L)
2.2 假阳性率试验
用3个批次的磺胺类药物胶体金试纸条对50份阴性牛奶样品进行检测,结果见表2。该50份阴性牛奶样品中有1份为阳性,其余全为阴性,假阳性率为2%。
2.3 假阴性率试验
用3个批次的磺胺类药物胶体金试纸条对50份分别添加磺胺嘧啶至浓度60μg/L,磺胺二甲基嘧啶至浓度20μg/L,磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑至浓度80μg/L,磺胺氯哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶至浓度30μg/L,磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯酰至浓度50μg/L,磺胺异噁唑至浓度10μg/L、磺胺甲氧哒嗪、磺胺多辛至浓度70μg/L的阳性牛奶样品进行检测,结果见表2。该50份阳性牛奶样品的检测结果均为阳性,假阴性率为0。
2.4 特异性试验
将恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、金霉素、土霉素、强力霉素溶于p H7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液,配成浓度为500μg/L的溶液,用试纸条进行检测。结果发现,C线和T线均显色,显示阴性结果,表明本试纸条对其他抗生素无交叉反应,具有较好的特异性。
2.5 与仪器方法比较
随机抽取50份牛奶样本,用试纸条方法和国标方法《GB/T 21316—2007动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》分别进行检测。结果筛选出3份阳性样本,试纸条结果均为C线显示出红色条带,T线不显色;仪器结果分别为105.2μg/L、180.7μg/L和110.3μg/L。可见,GICA法和LC-MS/MS法测定结果基本一致,符合度达到100%,适用于牛奶样本中磺胺类药物残留的检测。
3 结论
本研究采用胶体金免疫层析法对牛奶中的磺胺类药物残留进行检测,检测限分别为磺胺嘧啶60μg/L、磺胺二甲基嘧啶20μg/L、磺胺喹噁啉80μg/L、磺胺氯哒嗪30μg/L、磺胺间二甲氧嘧啶50μg/L、磺胺间甲氧嘧啶50μg/L、磺胺甲噁唑80μg/L、磺胺苯酰50μg/L、磺胺对甲氧嘧啶30μg/L、磺胺异噁唑10μg/L、磺胺甲氧哒嗪70μg/L、磺胺多辛70μg/L,检测阴、阳性样本时,假阳性率为2%,假阴性率为0;对其他抗生素无交叉反应,特异性较好;与液相色谱-质谱/质谱法相比,检测结果一致,符合度达到100%。
本研究所使用的胶体金试纸条是在传统的试纸条基础上进行了改进。将胶体金标记的抗体直接冻干在微孔试剂中,在检测过程中,能够使金标抗体与待检样品液充分接触,充分反应,从而减少误差,增加整个体系的反应灵敏度,易于对样品中的药物残留情况进行分析;同时,摈弃了传统试纸条的塑料卡壳,仅以“裸条”形式装于试剂桶中,节约空间,减少生产和运输成本。尽管结构的改进提高了试纸条的灵敏度,但由于通过颜色判断结果比较主观,可能出现假阳性问题,因此对于阳性样本,还需要用LC-MS/MS等仪器方法进行确证。
摘要：应用胶体金免疫层析法对牛奶中的磺胺类药物残留进行检测,研究该方法的灵敏度、假阳性率、假阴性率及特异性。结果表明,用胶体金免疫层析法测定牛奶中的磺胺类药物,检测限分别为磺胺嘧啶60μg/L、磺胺二甲基嘧啶20μg/L、磺胺喹噁啉80μg/L、磺胺氯哒嗪30μg/L、磺胺间二甲氧嘧啶50μg/L、磺胺间甲氧嘧啶50μg/L、磺胺甲噁唑80μg/L、磺胺苯酰50μg/L、磺胺对甲氧嘧啶30μg/L、磺胺异噁唑10μg/L、磺胺甲氧哒嗪70μg/L、磺胺多辛70μg/L,假阳性率为2%,假阴性率为0;方法的特异性较好,对其他抗生素无交叉反应;检测实际样本的结果与液相色谱-质谱/质谱法基本一致。可见,该方法简便、快速、准确、稳定,适用于牛奶中磺胺类药物残留的现场快速检测。