免疫胶体金法（精选5篇）
免疫胶体金法 篇1
乙肝表面抗原 (Hbs Ag) 指乙肝病毒外壳蛋白, 其自身无传染性, 一般和乙肝病毒同时存在, 因此, 乙肝病毒感染的标志之一为Hbs Ag[1]。有研究报告显示, 乙肝病毒传播的主要途径之一为输血感染, 为降低乙肝病毒经血液传播的风险, 可从提高输入的血液制品的质量着手, 其防范措施中较为有效的一种则为对献血者所献血液进行乙肝表面抗原的检测[2]。目前, 医学界针对乙肝表面抗原的检测方式具有多种, 其中以酶联免疫法和胶体金法两种检测方法较为常用, 但两种方式均存在一定的局限性。本文意在探讨、分析此两种检测方法的优缺点, 现报告如下。
资料与方法
2012 年5 月-2014 年11 月收集血液标本5 892份, 作为研究分析对象。将所选5 892份血液标本按检测方法分为酶联组 (2 946 份) 和胶体金组 (2 946 份) , 酶联组采用酶联免疫法进行检测, 胶体金组采用胶体金法进行检测。
方法: (1) 仪器和试剂:酶联免疫法中所使用的试剂盒为上海科华生物工程股份有限公司生产的乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒, 胶体金法检测中所使用的试剂盒为英科新创厦门科技有限公司所生产的乙型肝炎病毒表面抗原检测试剂盒, 酶标仪ST-360, 洗板机Autobio iwo-960。 (2) 酶联免疫法:酶联组中, 2 946份血液标本采用酶联免疫法进行检测, 向反应孔内分别加入待测样本及阴、阳性对照各75 μL, 封板后置37 ℃温浴箱温育60 min。温育后, 将酶结合物50 u L分别加入各反应孔中, 再次温育30 min, 温育结束后, 置洗板机上进行5 次洗涤后拍干, 依次加入显色剂A、B各50 μL, 震荡混匀后置温浴箱15 min。再将终止液50 μL加入各反应孔, 最后采用酶标仪进行比色, 正确读取吸光度值, 并进行相应的计算[3]。 (3) 胶体金法:胶体金组中2 946份血液标本采用胶体金法进行检测, 将60 μL血清用加样器吸取后, 慢慢滴到试纸条加样位置, 血清自动穿过滤膜, 移动到检测端, 室温放置10 min后, 观察所检测的结果[4]。
指标判定:ELISA法结果判定:S/COV≥1.0 HBs Ag结果为阳性;S/COV≤1.0 HBs Ag结果为阴性。胶体金法结果判定:检测线和对照线位置均出现紫红线HBs Ag结果为阳性;只对照线位置出现紫红线, HBs Ag结果为阴性。检验结果由操作者如实记录, 数据由专人进行整理并分析。
统计学方法:使用SPSS 13.0 软件分析、处理所得数据, 用χ2检验组间计数资料, 用t检验组间计量资料, P<0.05时, 数据差异具有统计学意义。
结果
检测后得知, 酶联组呈阳性197 份 (6.69%) 。胶体组呈阳性195 份 (6.62%) , 比较检测的阳性率, 两组数据的差异不存在统计学意义 (P>0.05) 。
两种方式检测结果均为阳性的血液标本194 份, 采用酶联免疫法检测为阳性, 但采用胶体金法检测为阴性的血液标本3份, 采用两种检测方式检测的结果同时为阴性的血液标本共计5 722份, 见表1。
用化学发光法 (CLIA) 检测, 此次检测中有4 例结果不一致的血液标本, 检测结果和酶联免疫法所检测的结果具有一致性。采用统计学进行数据分析, 胶体金法检测乙肝表面抗原假阴性率0.71%, 假阳性率0.25%, 而酶联免疫法的敏感性要高于胶体金法的敏感性, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。
讨论
两种检测方法分析:胶体金法:胶体金指氯金酸和还原剂等物质发生反应聚合成为相应大小的颗粒, 此种颗粒受到静电的影响, 形成胶体状态, 具有稳定性。弱碱状况下, 胶体金带负电荷, 与蛋白质分子正电荷基团结合, 此种结合为静电结合, 因此, 蛋白质生物特性不会受到影响, 除此之外, 胶体金技术存在较多优点, 如敏感特异、方便、快捷、试剂和设备不具有特殊性、稳定性强、结果直观等。酶联免疫法:酶联免疫法属于一种比较特殊的试剂检测方式, 是在免疫酶技术基础上发展起来的新型免疫测定技术。其中心意旨在于让酶复合物和抗体进行结合, 然后通过所显示出的颜色来进行检测。酶联免疫法的基本原理包含两点: (1) 让抗体或抗原与某种固相的载体进行结合, 同时需保持免疫活性; (2) 让抗体或抗原和某种酶链接成为酶标抗体或抗原, 同时保留酶活性和免疫活性。
现医学界最常用的检测乙肝表面抗原的方式之一为酶联免疫法, 在进行乙肝表面抗原的检测中具有较高的敏感性和特异性, 但也存在一定的缺点, 即操作复杂、繁琐, 同时, 在整个检测过程中导致结果受到影响的因素较多, 且对检测的人员和设备具有较高要求, 如检测者需有正确、熟练的操作技术等。胶体金法在进行乙肝表面抗原检测过程中所使用的试剂盒采用的是胶体金免疫层析技术, 此检测方式具有检测速度快、操作简单、试剂容易保存、医护人员的工作风险性可一定程度上得到降低等优势, 与此同时, 也存在一定缺点, 如灵敏度低等。
综上所述, 酶联免疫法和胶体金法在进行乙肝表面抗原的检测中, 均属于较可靠的方法。临床中, 在选择检测方式方法时, 需根据实际情况进行选择, 胶体金法检测时间较短, 初步筛选的时间可在一定程度上缩短, 检测效率较高, 在进行大规模的乙肝病毒筛选时, 则可首选此方案;酶联免疫法可用于二次检测胶体金法检测为阳性的标本, 准确率较高, 两者都具有较大的临床应用价值, 可大力推广。
参考文献
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免疫胶体金法 篇2
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2010年11月至2013年5月就诊的梅毒患者243例, 男136例, 女107例, 平均年龄 (41.2±10.3) 岁;其中早期潜伏梅毒37例, 一期梅毒52例, 二期梅毒68例, 三期梅毒44例, 临床治愈后复查42例。以上各期诊断严格依照《梅毒诊断标准》[1]。
1.2 检测方法
对243例患者全部以TRUST、ELISA与胶体金法进行联合筛查检测, 以3种试验中两种及以上试验阳性判别为联合筛查试验阳性, 全部标本以明胶颗粒凝集试验 (TPPA) 进行检测作为对照。TRUST试剂盒由上海荣盛科技有限公司提供、ELISA和胶体金试剂盒由厦门英科新创生物公司提供、TPPA试剂由日本富士株式会社提供, 所有试剂均在有效期内使用, 操作依据试剂盒说明书。
1.3 数据处理
用Excel 2007软件处理全部数据。分别计算4种方法检测各期梅毒阳性率;对联合筛查试验和对照试验各期梅毒检测结果进行比较。
2 结果
2.1 血清标本检测结果
243例各期梅毒患者血清标本4种方法检测结果见表1。对比发现, TRUST法潜伏期、三期梅毒阳性率低于其他3种方法, 一期和二期梅毒阳性率与其他3种方法比较差异无统计学意义 (P均>0.05) , 治愈后复查者阴转率则明显高于另3种方法 (P均<0.01) ;ELISA潜伏期梅毒阳性率低于胶体金法和TPPA, 但差异均无统计学意义 (P均>0.05) , 其余各期阳性率与二者相同;胶体金法潜伏期和一期梅毒阳性率略低于TPPA法, 三期梅毒阳性率低于ELISA和TPPA, 但差异均无统计学意义 (P均>0.05) 。
2.2 联合筛查试验和对照试验结果比较
243例各期梅毒患者血清标本联合筛查试验均为阳性, 对照试验仅潜伏期漏检1例, 其余各期亦均为阳性, 二者各期梅毒检出结果比较差异无统计学意义 (P>0.05) , 联合筛查试验和对照试验结果比较, 见表2。
3 讨论
梅毒感染途径多, 感染程度轻重不一, 多数患者感染后均有不同程度治疗史, 就诊时临床症状和体征往往不太典型, 使病原学试验难以检出, 因此血清学检查对梅毒的诊断以及判定病程的发展、痊愈和药物疗效具有十分重要的意义[2]。
TRUST为最常用的非梅毒螺旋体血清学试验, ELISA和TPPA为特异性梅毒螺旋体血清学试验, 胶体金法为检测抗体的快速诊断试验。经分析, 患者感染梅毒后, 血清中可出现两类抗体, 一是非特异性心磷脂抗体, 为Ig M和Ig A混合型反应素, 二是特异性梅毒螺旋体制动抗体, 其中特异性梅毒抗体在潜伏期即可产生[3], 非特异性抗体在一期梅毒阶段增加, 非特异性心磷脂抗体出现晚于特异性螺旋体抗体, 且在晚期梅毒及梅毒治疗后此类抗体可转阴。因此TRUST对早期一期梅毒、晚期梅毒、治疗后梅毒、潜伏期梅毒及神经性梅毒不敏感[4];一期梅毒抗体主要有Ig M型, 二期梅毒抗体有Ig M、Ig G型, 三期梅毒抗体主要有Ig G型[5]。ELISA主要检测梅毒混合型Ig G和Ig M抗体, 胶体金法运用纯化的梅毒螺旋体基因工程抗原, TPPA利用梅毒螺旋体天然抗原作为诊断抗原[6], 具有较高的灵敏度, 故三者对各期梅毒皆有较高的检出率, 对梅毒的早期诊断较好。
梅毒病程较长, 病情复杂, 单一检测方法存在一定的假阳性和假阴性, 必须结合病史和症状选择合适的检测策略[6]。为提高检出率, 尽早发现感染者, 降低病损及传播危害, 最大限度维护医患双方利益, 减少医患纠纷, 在梅毒的诊断中采用联合筛查是十分必要的。在组合方法的选择上, 应兼顾各期梅毒的检出效果、疗效观察和实验操作、管理等因素。TPPA虽为公认的梅毒确认实验, 但成本高, 主观判断因素强, 结果不易保存;而ELISA在敏感性、特异性、临床诊断结果上与TPPA无显著性差异[7,8], 其结果清晰易判, 不受主观因素影响, 能长期保存, 操作简单, 便于管理[4], 是作为常规试验的较好方法, 但其主要缺点是在梅毒治愈后长时间存在很高的阳性率, 甚至终身阳性, 不能判断梅毒正在活动与否, 不能检测疗效。TRUST虽然对早期梅毒的辅助诊断差, 但其抗体滴度的变化与梅毒的治疗呈正相关, 适于疗效的观察和复发的辅助诊断[3], 不能被ELISA所完全取代, 二者联合检测确有必要。此次研究, 以“TRUST+ELISA+胶体金”进行联合筛查, 各期梅毒检出率与TPPA对照组比较, 均无统计学意义, 表明以上3种方法联合筛查, 对各期梅毒均可取得良好的检出效果, 且因其中纳入了TRUST, 结合病史和临床症状, 还可监测病程和疗效。
参考文献
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免疫胶体金法 篇3
1 资料与方法
1.1 一般资料将2011 年1 月—2013 年5 月来我科就诊的180 例疑似丙型肝炎患者依据检验方法不同分为胶体金法检验组 (90 例) 和ELISA法检验组 (90 例) 。胶体金法检验组中共有丙型肝炎患者90 例, 其中男45 例, 占50.0%, 女45 例, 占50.0%;患者年龄在15 岁~67 岁之间, 平均年龄为 (36.3±13.11) 岁;有50 例的丙型肝炎患者以急诊方式入院, 占55.56%, 有40 例的丙型肝炎患者以平诊方式入院, 占44.44%。ELISA法检验组中共有丙型肝炎患者90 例, 其中男46 例, 占51.1%, 女44 例, 占48.9%;患者年龄在15 岁~68 岁之间, 平均年龄为 (36.7±12.99) 岁;有51 例的丙型肝炎患者以急诊方式入院, 占56.67%, 有39 例的丙型肝炎患者以平诊方式入院, 占43.33%。2 组患者在性别、年龄、病情方面差异均无统计学意义 (P>0.05) 。
1.2 方法
1.2.1 血清采样方法使用伴随分离胶的丙型肝炎病毒抗体检测专用管采取患者空腹时的静脉血5 m L, 及时做好离心工作, 将分离好的血清存储于-80°冰箱中保存, 以备检测用。
1.2.2 不同检测方法的判断标准对于胶体金检测法来说, 如果不论是检测线, 还是对照线, 同时伴随紫红色的条带时, 或者在检测线的地方都伴随不大明显的紫红色条带时, 即可将患者检测结果定为阳性;如果仅仅在对照线的位置伴随紫红色条带, 则将患者检测结果定为阴性;如果不论是检测线, 还是对照线, 同时都不出现任何变化时, 说明检测结果无效。
对于ELISA检测法来说, 当标本吸光度值S与标本临界值CO的比值大于或者等于1 的时候, 即可将患者检测结果定为阳性;当标本吸光度值S与标本临界值CO的比值小于1 的时候, 则将患者检测结果定为阴性。相对特异性以及灵敏性和准确性的相关计算参照文献中的方法[1,2]。
1.3 统计学方法计量资料用±s表示, 组间比较用t检验P<0.05 说明差异具有统计学意义。
2 结果
2.1 两种检测方法结果及对比2 组检测方法结果见表1。其中, 两种方法均阳性为54 例, 而仅前者阳性为8 例, 仅后者阳性为2 例。
2.2 两种检测方法时间及费用对比胶体金法检验组检查时间 (22.37±1.99) min、检测费用 (6.01±1.22) 元, 明显低于ELISA法检验组的检查时间 (117.88±1.64) min、检测费用 (16.71±2.32) 元, 上述两项指标的差异均有统计学意义 (t1=5.886, P1<0.05;t2=3.724, P2<0.05) 。
3 结果
丙型肝炎 (HCV) 是近年来临床上发病概率较高的一种肝类慢性疾病, 其发病原因是丙型肝炎病毒感染, 主要传播途径是血液[3,4,5]。经常伴随肝脏纤维化的症状, 有的甚至坏死。如果不及时对其进行控制, 很容易发展为肝硬化, 更有甚者发展为肝癌, 对患者身体健康和生活造成很大影响。因而探讨此症的有效检验方法从而在第一时间对其控制十分重要。目前, 临床上对此症的检验方法主要有胶体金法与ELISA法, 但二者的检验效果, 不同学者有着不同看法。有学者经过研究认为前者不仅便捷方便, 其灵敏度和特异性与后者相比差异也不大[6,7], 但也有学者认为, 前者在应用于临床的时候会受到时间、环境以及血样量的影响而致使结果不准, 在临床上应该以后者为主要检测方法, 将前者作为参考, 从而避免一些不必要的医疗纠纷发生[8]。
在本次研究中, 与ELISA法检验组检验方法相比, 胶体金法检验组的相对特异性是96.43% (54/56) , 相对灵敏性是79.41% (27/34) , 相对准确性为90.00% (81/90) 。胶体金法检验组检查时间 (22.37±1.99) min、检测费用 (6.01±1.22) 元, 明显低于ELISA法检验组的检查时间 (117.88±1.64) min、检测 (16.71±2.32) 元 (P<0.05) 。可见, 两种检验方法各有优缺点。
综上所述, 胶体金法与ELISA法应用于丙型肝炎患者的检验各有优缺点:前者检测费用低, 检测时间快;后者检测结果准确率高, 因而在临床上应该结合患者实际情况选择合理的检测方法。
摘要：目的 探讨胶体金法与酶联免疫吸附 (ELISA) 法应用于丙型肝炎患者血液病毒抗体中的检测效果。方法 将2011年1月—2013年5月来我科就诊的180例疑似丙型肝炎患者依据检验方法不同分为胶体金法检验组 (90例) 和ELISA法检验组 (90例) 。结果 胶体金法检验组的相对特异性是96.43% (54/56) , 相对灵敏性是79.41% (27/34) , 相对准确性为90.00% (81/90) 。胶体金法检验组检查时间 (22.37±1.99) min、检测费用 (6.01±1.22) 元, 明显低于ELISA法检验组的 (117.88±1.64) min、 (16.71±2.32) 元, 差异具有统计学意义 (P<0.05) 。结论 采用胶体金法与ELISA法应用于丙型肝炎患者的检验各有优缺点, 在临床上应该结合患者实际情况选择合理的检测方法。
关键词：丙型肝炎,血液病毒抗体,胶体金法,ELISA法,对比
参考文献
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免疫胶体金法 篇4
1 资料与方法
1.1 一般资料
收集2013年6月—2014年7月来自鸡西市矿业集团总医院确诊为200例RA患者, 所有患者均符合美国风湿病协会1987年修订的RA诊断标准[3];同时选择来该院进行健康体检的健康人员100例和非RA患者100例作为对照组;两组人员基本情况比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。血清标本抽取三组人员晨起空腹静脉血3~5 ml, 离心后血清标本储存预-70℃冰箱中待测。
1.2 试剂来源
抗CCP抗体检测胶体金法试剂盒由上海科新生物技术股份有限公司提供;抗CCP抗体 (ELISA法) 试剂盒为欧洲诊断试剂公司生产;仪器:安图96孔酶标仪, 25℃恒温箱, 科华洗板机。
1.3 检测方法
分别采用胶体金免疫层析法和间接ELISA法来检测患者血标本中是否含有抗CCP抗体。操作按照各自试剂盒说明书进行, 质控品、标准品均作复孔且与标本同时检测。质控品检测结果符合质控要求。抗CCP抗体检测试剂盒 (胶体金法) 采用高度特异性的抗原抗体反应及免疫层析分析技术, 测试时, 血清标本滴入加样处, 血清标本中的Ig G与预包被在聚酯膜上的胶体金标记的二抗结合, 结合物随之在毛细效应下横向层析。当血清中含有特异性抗CCP抗体时, 泳动到T线时被预先包被在硝酸纤维素膜上的抗原捕获, 出现阳性条带, 血清中若不含待测抗体时, 在T线处继续横向层析至C线, C线为预先包被非特异性抗原, 结合物在C线处被捕获, 此反应为非抗原特异性的反应, 作为对照条带, 因此无论血清是否含有特异性的抗CCP抗体均在C线处形成阳性条带。抗CCP抗体胶体金法检测结果参考范围为阴性, ELISA法:<25RU/m L。对于试验研究中测定结果明显不符的样本, 将比对方法或其它方法再次重复进行确认试验, 同时由临床试验方根据患者的具体相关临床症状和其它用以诊断该疾病的特异性指标报告加以分析, 提供不符样本的患者临床相关资料以便对临床研究结果进一步分析, 并作记录。
1.4 统计方法
该研究所有数据均使用SPSS 17.0统计学软件处理分析, 应用配对四格表卡方χ2检验, 使用Kaapa来检验两种检验方法检测结果的一致性, P<0.05表示比较差异有统计学意义
2 结果
2.1 胶体金法检测抗环瓜氨酸抗体的诊断灵敏度、特异性分析
通过对该研究三组人员采用胶体金法检测抗环瓜氨酸抗体诊断的灵敏度及特异性分析得知, 200例RA患者诊断的灵敏度为85%, 假阴性率为15%;100例健康献血者诊断的特异度为98%, 假阳性率为2%;100例非RA患者诊断诊断的特异性为97.0%, 假阳性率为3%, 健康献血者+非RA患者诊断的特异度为97.5%, 假阳性率为2.5%, 见表1。
2.2 胶体金法与ELISA法检测结果比较分析
通过对两种方法检测结果汇总统计分析, 计算两种检测方法的阳性符合率:169/171×100%=98.8%;阴性符合率:223/229×100%=98.4%;总符合率: (169+223) /200=98.0%;试剂盒一致性评价:由计算公式:Kappa=[N (A+D) - (γ1C1+γ2 C2) ]/[N2- (γ1C1+γ2C2) ], 其中γ1=A+B, C1=A+C, γ2=D+C, C2=B+D, N=A+B+C+D得出:Kappa=0.959262>0.75。P值的计算公式是P=2[1-Φ (z0) ]两者总符合率可以达到98.0%, 见表2。
3 讨论
类风湿性关节炎属于自身免疫性疾病, 病因尚未明了, 以慢性、对称性、多滑膜关节炎和关节外病变为主要临床表现, 是一种慢性全身性炎症性疾病。类风湿属于致残性疾病, 关节损害是类风湿患者最主要的病变, 患病2年即可出现不可逆的骨关节破坏, 如果不能诊治可出现严重的关节畸形, 有些病人也会出现血管损害。类风湿性关节炎 (RA) 在我国发病率约为0.3%, 女性患者居多。RA的早期诊断, 一直是各国医学专家关注的问题[4]。现行的美国风湿病学会 (ACR) 诊断标准主要依靠临床表现、X线以及类风湿因子 (RF) 检测。当患者达到诊断标准时, 患者已出现骨关节破坏, 而且, 类风湿因子缺乏特异性, 不利于早期诊断、早期干预治疗[5]。类风湿的早期诊断可依靠环瓜氨酸的检测。Nicola等[6]研究发现环瓜氨酸抗体与人的性别、年龄没有相关性, 但与早期类风湿密切相关。Schellekens[7]等研究了数百例有早期关节症状患者, 随访一年后在486人中发现149人 (31%) 为早期RA, 检测抗CCP抗体特异性达96%, 阳性预测值为84%。小关节侵蚀性病变有时会出现在系统性红斑狼疮和类风湿的早期。抗环瓜氨酸抗体与类风湿的临床症状及预后相关。Schellekens研究发现抗环瓜氨酸抗体阳性是侵蚀性关节损害的一个重要标志及危险因素, 并指出检测抗CCP抗体与联合检测抗CCP抗体和RF相比较, 对预测2年后侵蚀性关节损害无统计学差异。Vallbracht等[8]人的研究显示, RA病人在应用DMARDs和糖皮质激素冲击治疗期间, 抗CCP抗体的水平明显下降, 提示抗CCP抗体可作为临床判断疾病活动的指标, 并指导治疗。目前市场上商品化抗CCP抗体检测试剂盒也主要为ELISA试剂盒。ELISA法操作程序烦琐, 整个过程需三小时左右, 亦需要专业人员在实验室中进行实验操作, 并需酶标仪读取结果, 这在基层医疗机构的实验室和小型门诊中较难实现, 同时基于ELISA法易受温度和孵育时间等环境条件因素的影响, 对试验带来诸多不便[9]。胶体金免疫层析法 (GICA) 是应用胶体金标记技术, 以胶体金作为示踪物, 以条状纤维层析材料为固相, 通过毛细效应使样本溶液在层析条上层析, 使样本中的待测物与金标垫上胶体金标记物发生免疫反应, 并与条状纤维层析材料上的抗原 (或抗体) 发生免疫反应而被截留, 进而形成肉眼可见的红色条带, 得到直观的实验结果, 达到快速检测的目的。与其他检测方法相比, 胶体金免疫层析法方法 (GICA) 有以下优点: (1) 整个检测过程在5~10 min就能完成, 结果判断简单方便; (2) 操作人员无需专业培训, 操作简便, 能在门诊室、家庭用户及基层实验室推广使用; (3) 无需低温保存, 储运方便等; (4) 其检测性能如稳定性好, 能保存24个月;灵敏度与市售定性ELISA试剂盒相当, 能快速筛选阳性样本, 使得胶体金层析试剂条备受欢迎。
通常产生胶体金方法漏检原因考虑有以下几种:原因及方法学差异, 如层析过快, 抗原与抗体未来得及结合即已越过检测线;试纸条本身的质量问题;试剂本身的灵敏度较ELISA低;温度影响, 温度过低, 反应速度降低, 在5 min内弱阳性不能完全显色;加样量不足或过多;工作人员未按时间要求报结果等, 而ELISA法灵敏度高, 漏检度低, 但检测时间长, 操作复杂。人血清中含有内源性物质 (非特异性干扰物质) , 影响ELISA的测定结果, 并且血清中抗体与异质抗原间的交叉反应也能在ELISA中发生多种非特异性吸附作用, 导致假阳性的出现。
该产品将环瓜氨酸肽引入试纸条中, 能快速筛选出抗环瓜氨酸肽抗体阳性样本, 对快速辅助诊断类风湿关节炎起到积极作用, 实现基层实验室、即时检测、床边检测的需求, 同时利用ELISA法能够定量检测抗体浓度的优势, 对检测结果为阳性的患者作者建议用ELISA法定期监测抗CCP抗体浓度变化以监控疗效指导医生制定个性化治疗方案和判断预后[6]。
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免疫胶体金法 篇5
1 资料与方法
1.1 菌株来源
收集2008年3月～2009年2月从我院住院或门诊患者的痰液、清洁中段尿、脓液等各种临床标本中分离出的金黄色葡萄球菌75株,质控菌采用金黄色葡萄球菌ATCC25923,购于卫生部临床检验中心,以2010年CLSI为判断标准。
1.2 方法
将收集到的75株金黄色葡萄球菌分别采用苯唑西林(1μg/片)药敏纸片扩散法、乳胶凝集法及胶体金法检测。
1.2.1 苯唑西林药敏纸片扩散法
采用苯唑西林药敏纸片扩散法检测75株金黄色葡萄球菌,若苯唑西林药敏纸片抑制圈的直径≤10 mm,可判断为MRSA。苯唑西林药敏纸片由Oxoid公司提供,在有效期内使用。
1.2.2 乳胶凝集法
首先提取标本中的PBP2a蛋白,然后用包被有抗PBP2a单克隆抗体的乳胶颗粒进行凝集检测。乳胶试剂反应圈产生凝集时为PBP2a阳性,菌株为MRSA。乳胶凝集试剂由Oxoid公司提供,严格按照试剂说明书进行。
1.2.3 胶体金法
提取标本中的PBP2a蛋白,加样于检测试纸条,试纸条检测带和质控带均有显色条带则为阳性,即判断为MRSA,仅质控带显色条带的为阴性,如质控带未出现条带,则为体系失效[4]。采用北京青元盛康生物医药有限公司生产的MRSA胶体金法试剂盒,严格按说明书进行操作。
1.3 观察指标
观察苯唑西林药敏纸片扩散法、乳胶凝集法及胶体金法的检测MRSA的敏感度及检测时间并进行比较分析。
1.4 统计学方法
采用SPSS 13.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示,三组间比较采用方差分析,组间两两比较,采用LSD-t检验;计数资料用率表示,组间比较采用χ2检验,以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 三种方法检测MRSA敏感度及符合率情况
苯唑西林药敏纸片扩散法和胶体金法的检测敏感度均高于乳胶凝集法,但经χ2检验,差异无统计学意义(P>0.05);胶体金法与苯唑西林药敏纸片扩散法检测MRSA的符合率高达100.0%。见表1。
2.2 三种方法检测时间比较
苯唑西林药敏纸片扩散法的检测时间为(1080.6±36.3)min,乳胶凝集法的检测时间为(38.2±1.7)min,胶体金法的检测时间最短,仅为(9.2±0.4)min,胶体金法与苯唑西林药敏纸片扩散法及乳胶凝集法比较,差异有统计学意义(P<0.01)。
3 讨论
目前临床上由于MRSA的出现致使感染趋势不断上升,多重耐药性增加,现有的抗生素很难控制这些耐药菌株的感染,正确快速的检测MRSA并找出有效控制其感染的药物,是目前临床微生物工作的任务之一。本研究通过比较苯唑西林药敏纸片扩散法、乳胶凝集法及胶体金法判定MRSA株的情况,探讨胶体金法检测在判定MRSA株中的价值。
根据苯唑西林药敏纸片抑制圈≤10 mm来判断MRSA是一种简便的方法,但耗时长,而且容易受到如培养基、细菌接种量、药物浓度及培养时间的等诸多因素的影响。做好培养基的室内质控是准确判断MRSA的重要手段,但花费的时间更长,不利于为临床MRSA检测提供准确而快速的诊断。
乳胶凝集法快速、简便,且无需特殊仪器和技术,对临床早期检出MRSA很有帮助,但检测成本高,且因为PBP2a的低表达可能会产生假阴性[3]。
胶体金是一种常用的标记技术,是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术,有其独特的优点[5],近年已在各种生物学研究中广泛使用,在临床使用的免疫印迹技术中几乎都使用其标记。同时,在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中均可能用到。胶体金是金的水溶胶,胶体金法是指以胶体金为显色标记物的检法方法[6]。1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学,此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下,聚合成的一定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,形成带负电的疏水胶溶液,由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性。除了与蛋白质结合以外,胶体金还可以与许多其他生物大分子结合,如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状,如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应,加上结合物的免疫和生物学特性,使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。胶体金标记实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。杜玉萍等[7]以金黄色葡萄球菌菌体抗原免疫家兔获得多克隆抗血清,利用胶体金免疫层析技术,采用二步法检测金黄色葡萄球菌,建立的胶体金免疫层析试纸法能在60 min内完成检测,灵敏度实验结果显示其检测灵敏性为1×106 cfu/mL;特异性实验检测显示其与副溶血弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌小川型、O139型及569B型等菌无交叉反应,但与耶尔森氏菌、大肠杆菌标准株(ATCC25922)、铜绿假单胞菌标准株(ATCC27853)有一定交叉。有学者用胶体金标记产肠毒素金黄色葡萄球菌多价抗体,先制成胶体金探针,进而制成检测产肠毒素金黄色葡萄球菌免疫层析法(GICA)检测试纸条,用该法检测产肠毒素葡萄球菌,具有简便、快速、特异性好、无需仪器及细菌抗原无需进行特殊处理等优点,预示着本方法具有广阔的应用前景[8,9,10]。
本组实验结果显示,胶体金法和苯唑西林药敏纸片扩散法的符合率达100%,两者敏感性均高于乳胶凝集法,但差异无统计学意义(χ2=0.260,P>0.05),且胶体金法的检测时间最短,仅为(9.2±0.4)min。
综上所述,胶体金法是一种快速、准确的判定MRSA菌株的方法,值得进一步研究。
摘要：目的 探讨胶体金法检测在判定耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)菌株中的价值。方法 收集我院2008年3月2009年2月临床分离的75株金黄色葡萄球菌,分别采用苯唑西林药敏纸片扩散法、乳胶凝集法及胶体金法检测,比较分析检测结果。结果 胶体金法的敏感度与苯唑西林药敏纸片扩散法及乳胶凝集法相比,差异无统计学意义(χ2=0.260,P>0.05);胶体金法与苯唑西林药敏纸片扩散法的符合率为100.0%;胶体金法、乳胶凝集法和苯唑西林药敏纸片扩散法的检测时间分别为(9.2±0.4)min、(38.2±1.7)min和(1080.6±36.3)min,胶体金法的检测时间最短,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 胶体金法是一种快速、准确的判定MRSA菌株的方法,值得进一步研究。
关键词：金黄色葡萄球菌,耐甲氧西林金黄色葡萄球菌,胶体金,苯唑西林药敏试验,乳胶凝集法
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