免疫胶体金层析诊断（共8篇）
免疫胶体金层析诊断 篇1
免疫胶体金层析技术在20世纪80年代逐渐发展起来[1],是继酶标记、荧光标记和放射性标记之后又一个新的快速的抗原抗体免疫学技术。目前,该技术在医学领域的应用主要为检测病原[2]及针对病原在体内产生的抗体[3],或者妊娠诊断[4]等。动物疫病的诊断与人类医学诊断相比,往往要对较大的群体或需要到现场进行诊断,因此,更需要简便快捷的诊断方法。目前免疫胶体金层析技术已成为兽医疾病检测中应用最广泛的免疫学检测技术之一。
1胶体金免疫层析技术的原理及构造
免疫层析技术是以抗原抗体反应与色谱层析技术相结合的一种快速免疫分析方法。胶体金免疫层析技术通过将标记了胶体金的抗原或抗体固定在条状纤维素膜(membrane)上,以形成固相载体,然后将待测样品以液体形式加入到一端的样本垫(sample pad)之后,通过液体在硝酸纤维素膜上形成的毛细作用(capillary flow)而向前移动,同时使待测样品中的受测物与硝酸纤维素膜上的抗体或抗原发生特异性结合而形成免疫复合物。免疫复合物被富集在特定区域(test line),通过胶体金的颜色反应而得到直观的结果,而游离的标记物则越过检测带(control line)进入到末端的吸水垫(wicking pad),不呈现显色反应。胶体金免疫层析试纸条的构造模式见图1。
2胶体金免疫层析技术的分类及结果判断
胶体金免疫层析按照反应模式可以分为三类,即:间接法、夹心法和竞争抑制法[5]。其中夹心法又可分为双抗体夹心法和双抗原夹心法。对未知抗原的检测常采用双抗体夹心法和竞争抑制法,而对未知抗体的检测常采用双抗原夹心法和间接法。
3免疫胶体金技术在动物疾病中的应用
3.1传染病的诊断
3.1.1病毒病的诊断廖圆圆等[6]建立了间接胶体金免疫层析方法用于检测犬血清中RV Ig G抗体,该方法不仅敏感性高(可检出最低中和抗体效价水平0.5 IU/m L),且与商品ELISA检测试剂盒的总符合率达到99.4%。陈一鸣等[7]用研制的PRRS抗体试纸条与ELISA检测方法分别对36份血清样品进行检测,结果显示PRRS抗体试纸条的敏感度为81.5%,特异度为100%,符合率为86.1%,重复性良好。王中力等[8]构建了检测犬细小病毒(CPV)的间接胶体金免疫层析法,(GICA)敏感性为100%;特异性为97.3%;与HA检测结果符合率为98.3%,对犬重要传染性疾病(犬细小病毒病)的诊断提供了快速的检测方法。因此,胶体金免疫层析诊断方法适合于临床的快速诊断。
3.1.2细菌病的诊断刘凯等[9]构建了牛出血性败血症胶体金免疫层析快速诊断方法,该方法采用双抗体夹心法检测牛源巴氏杆菌,经优化后该方法与细菌检查结果一致性为100%,无交叉反应,稳定性可以维持半年。布日额等[10]建立了检测牛乳中致病性金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析方法,试纸条与致病性金黄色葡萄球菌分离鉴定法符合率为90.0%、与PCR试剂盒符合率为83.3%。李伟等[11]建立的炭疽杆菌芽孢胶体金层析检测技术,胡孔新等[12]建立的快速检测鼠疫杆菌抗原用的胶体金标记免疫层析方法,谌志强等[13]建立的大肠杆菌0157:H7胶体金免疫渗滤法等都能够快速有效地对细菌性疾病进行检测和诊断。
3.1.3寄生虫病的诊断王艳华等[14]将构建的胶体金试纸条检测人工感染弓形虫GJS株速殖子的7只兔,对兔血清进行检测,同时用弓形虫分泌的抗原进行IHA参照。结果显示,试纸条在第3 d即可检测出抗体,而IHA法则在第5 d才可检测出抗体,且该方法对猪瘟及猪衣原体病阳性血清均为阴性,无交叉反应性。曾小军等[15]建立了检测血吸虫的免疫胶体金技术,与IHA抗体检测技术比较,检出率分别为95.24%和100.00%;慢性血吸虫病患者的检出率分别为92.86%和94.64%。两种方法对于血吸虫的检出效能一致,而胶体金技术对于血吸虫的检出效率略低于IHA方法,可能与包被所使用的蛋白及抗体出现的时机相关。
3.2检验检疫检验检疫对于国家进出口货物,尤其是生物源物品的安全流通具有重要的作用,是关系到国家生物安全的一个重要环节。然而对于进出口关卡的样品进行检测,需要快速准确的检测方法,方能提高效率而不耽误货物中转及旅客流通。动物活体检疫、动物源性食品及流通过程中的监测,对消费者的消费安全和身体健康具有直接或者间接的影响,同时制约了动物防疫工作切实有效地开展。胶体金免疫层析技术可快速、有效地对现场进行诊断,并可给出诊断结果,对于检验检疫具有较大的现实意义。
4不同方法试验对比
4.1试验材料禽流感H5抗体快速检测卡,深圳康百得生物科技有限公司生产;H5血凝抑制试验抗原与阳性血清由哈尔滨兽医研究所生产;禽血清30份,随机在散养户中采集。
4.2试验数据从试验数据(见表1)可知,禽流感抗体快速检测卡与禽流感HI和HA试验所得出的结果基本一致,区别在于,禽流感HI和HA试验可以得出准确的数值,而H5抗体快速检测卡只能定性作出阴性或阳性结果判断。
5总结
免疫胶体金层析技术因操作简便、无须使用仪器设备、快速出结果等优点而被广泛应用于各个领域。动物疾病诊断不但可帮助畜牧养殖业的健康发展,更重要的可为消费者提供安全放心的动物源性食品。就动物疾病的免疫胶体金层析技术研发而言,选择何种反应方式、包被抗体或抗原的选择、检测抗原或者不同抗原刺激的抗体出现顺序等都需要考虑在内。对于细菌引起的疾病,因菌种之间可能存在一定的抗原交叉性,故需要注意诊断方法的特异性。与此同时,还需要尽可能提高试纸条的敏感性,而且对于一项新的检测技术,往往需要经过长时间的实践检验才能进入临床应用和推广。如果能很好地解决免疫胶体金层析试纸条检测方法的特异性、敏感性和稳定性,而研发出一种比较成熟的检测技术,无疑具有广阔的实际应用前景,同时也应成为广大科技工作者努力的方向。
免疫胶体金层析诊断 篇2
关键词：犬瘟热病毒；免疫胶体金；诊断
中图分类号：S85文献标识码：A文章编号：1674-0432（2011）-11-0197-1
犬瘟热（Canine Distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus, CDV）引起的犬科、鼬鼠科及部分浣熊科的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害消化系统、呼吸系统，有时也侵害神经系统，临床上以上呼吸道、胃肠道的卡他性炎症，非化脓性脑膜脊髓炎和双相热型为主要特征。Carrie首次报道CD病原为病毒，该病几乎遍布世界各地，被视为当前危害犬群最严重的疫病之一。我国是CD的多发地区，在全国各地均有发生，流行范围极广，发病率和死亡率均较高，对养犬业危害巨大。CDV属于副粘病毒科，麻疹病毒属成员，基因组为单股RNA，病毒粒子呈现圆形或不整形成。虽然CDV病原体只有一个血清型，但病型却复杂多样，临床上常与支气管败血波特杆菌、沙门氏菌、犬细小病毒、传染性肝炎病毒等病原混合感染或继发感染，所以给诊断带来了巨大困难。本文根据病例的临床症状、病理剖检和流行病学调查资料做出初步诊断的基础上，经血清学方法——免疫胶体金试纸条做出最终诊断。
1 病例
来自吉林省延边朝鲜族自图们市15例病例，病犬均死亡。采集病犬抗凝血，分离血清，同时采集各病变明显的组织，-20℃保存备用。
2 临床症状
病犬初期表现为体温升高，有时高达40℃以上，尿赤黄或更深，眼睛有脓性分泌物，精神颓废，食欲废绝。随后侵害波及呼吸系统，病犬表现为体温持续升高，鼻部干燥或龟裂，眼鼻脓性分泌物增多，常出现咳嗽，呼吸困难，肺部有罗音特征。因此发病初、中期，很容易被错误诊断为感冒或肺炎，应该予以其他方法进行鉴别。个别病犬出现呕吐和腹泻。病程后期常出现神经症状，如出现吠叫、头部震颤、四肢抽搐，严重时出现癫痫症状，最终因麻痹衰竭死亡而转归，病犬脚垫增厚、干裂也是后期的典型特征。如果进入后期，出现神经症状就很难治愈，即便是病愈，也会留下后严重的遗症。一般情况下病犬的病程为15-45d，出现神经症状的病犬均以死亡告终。
3 病理变化
由于CDV对犬的上皮细胞具有特殊亲和力，所以病变分部比较广泛。幼龄犬感染CDV后通常出现胸腺萎缩，而成年犬则多见结膜炎、鼻炎、气管及支气管炎和卡他性肠炎。进入后期的病犬如出现神经症状，则病犬的脚垫部皮肤多发生角质化或龟裂，中枢神经系统病变较为明显，如脑室扩张和脑膜内充血，以及脑脊髓液大量增加。病犬的神经组织内可见嗜酸性包涵体，多出现在细胞浆内，直径为1-5μm，而核内包涵体多位于神经节细胞、腺上皮细胞和上皮细胞。
4 诊断结果
为确保诊断的准确性，在诊断过程中采取了包涵体检查、荧光抗体检测和PCR检测等三种平行诊断。对15份疑似CD的病料进行镜检、血清学诊断和分子生物学诊断。其中免疫胶体金检测与PCR检测结果均为CD阳性，而荧光抗体检测CD阳性13例，包涵体检测CD阳性9例（表1）。
5 讨论
犬瘟热是犬类多发的一种常见病，对养犬业的危害非常之大，也是阻碍养犬业发展的重大传染病之一。这就要求养殖户要特别重视犬瘟热的发生和发展，一旦发生犬瘟热，为阻止病原体的蔓延，管理人员必须迅速将病犬从畜舍内隔离出来，用来苏儿或火碱等消毒试剂对率舍进行彻底消毒，避免病犬的调动和外来人员进入，对周边假定健康犬和受疫情威胁犬，可用犬瘟热病毒高免血清或单克隆抗体进行紧急接种，等疫情逐渐稳定后，再考虑注射犬瘟热疫苗。
患犬瘟热的耐过犬能获得坚强的免疫力。因此，按照犬的免疫规程进行合理的免疫接种，是预防本传染病的最好手段。目前，国内多采用犬六联弱毒疫苗和犬五联弱毒疫苗进行免疫接种。近些年，通过这些疫苗的应用，对我国军犬、警犬、宠物犬和实验用犬的病毒性疾病起了积极的预防作用。但由于是弱毒疫苗，存在散毒的可能，也给临床诊断带来了障碍。为了使诊断准确，避免单一检测手段的不准确性，临床上我们要采用包括血清学和分子生物学在内的多种检测方法联系应用，才能使诊断更加准确和确实。
参考文献
[1] 杨百亮,刘建泉.犬瘟热的荧光抗体技术诊断及治疗[J].黑龙江畜牧兽医,2005,(9):46-47.
[2] 王雷,夏咸柱,卫广森,等.犬腺病毒、犬细小病毒联合PCR方法的建立与应用[J].病毒学报,2003,(9):262-266.
[3] 刘大飞,王牟平,司微,等.犬细小病毒黑龙江株（CPV-YN）的分离、鉴定及致弱的研究[J].中国预防兽医学报,2010,(11):875-878.
免疫胶体金层析诊断 篇3
关键词：莴苣花叶病毒,胶体金免疫层析法,免疫试纸条
莴苣 (Lactuca sativa) , 为菊科莴苣属植物, 是一种常见的食用蔬菜, 可分为叶用和茎用两类, 中国南北各地以茎用莴苣 (莴笋) 栽培为主, 近年来叶用莴苣在北京及沿海一些城市发展迅速。莴苣花叶病毒 (Lettuce mosaic virus, LMV) 在世界莴苣产区广泛分布, 是危害莴苣的主要病毒, 曾给一些国家的莴苣生产造成严重损失。该病毒为马铃薯Y病毒属 (Potyvirus) 成员, 病毒粒体呈弯曲线状, 大小为750nm×13nm, 核酸为单分子正义RNA。其自然寄主有莴苣、苣荬菜 (Sonchus brachyotus) 、豌豆 (Pisum sativum L.) 、鹰嘴豆 (Cicer arietinum) 、野芥 (Sinapis arvensis L.) 、菠菜 (Spinacia oleracea L.) 、红花 (Carthamus tinctorius L.) 、蓝眼菊属 (Osteospermum spp.) 、勋章菊属 (Gazania spp.) 、柴胡 (Bupleurum falcatum) 和耳叶金鸡菊 (Coreopsis auriculata) 等[1,2,3]。LMV可通过汁液接种、蚜虫和种子等途径传播。国内外对其生物学特性[4,5,6]、血清学关系、抗病性和分子生物学等方面进行了研究[7,8,9,10]。
病毒的检测是病毒病防控的关键点, 虽然ELISA[11]及RT-PCR[12]等方法均可用于对LMV的检测, 但在大田生产上胶体金免疫层析试纸条因具有检测快速、准确和便捷等优点, 受到广泛关注, 美国Agdia公司、瑞士Bioreba公司已出售多种检测植物病毒的试纸条。该文通过病毒的提纯、抗血清的制备和胶体金试纸条的制作及测试, 以期建立LMV病毒的快速检测方法, 用于田间病害的诊断。
1 材料与方法
1.1 材料
供试的病毒毒原为LMV-PV-63分离物, 引自美国ATCC, LMV-PV-0799、LMV-PV-0901分离物引自德国DSMZ, 保存在昆诺阿藜 (Chenopodium quinoa) 上。供试马铃薯X病毒 (Potato virus X, PVX) 、马铃薯Y病毒 (Potato virus Y, PVY) 、马铃薯A病毒 (Potato virus A, PVA) 、葡萄A病毒 (Grapevine virus A, GVA) 、齿兰环斑病毒 (Odontoglossum ringspot virus, ORSV) 、黄瓜绿斑驳花叶病毒 (Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV) 、葡萄扇叶病毒 (Grapevine fanleaf virus, GFLV) 和烟草环斑病毒 (Tobacco ringspot virus, TRSV) 为中国检验检疫科学研究院植物检疫研究所收集的毒原。主要试剂和设备为羊抗兔抗体 (军事医学科学院微生物流行病研究所) 、碱性磷酸酯酶标记的山羊抗兔抗体 (中杉金桥公司) 、LMV双抗体夹心酶联诊断试剂盒 (美国Agdia公司) 、层析膜 (Whatman公司的Immunopore RP膜) 、Beckman Coulter Avanti J-26XPI高速离心机、Beckman Coulter Optima L-100XP超速离心机、JEM-1400透射电子显微镜, BioDot XYZ 3050三维喷点平台和BioDot CM4000切条机。
1.2 方法
1.2.1 病毒的提纯
LMV-ATCC-PV63在昆诺阿藜上繁殖, 作病毒提纯用, 提纯方法参照文献[13]。
1.2.2 多克隆抗体的制备和效价测定
免疫用的实验动物为新西兰白兔。提纯病毒和弗氏完全佐剂乳化后, 后腿肌肉注射1次, 其后病毒和弗氏不完全佐剂乳化后, 后腿肌肉注射4次, 每次注射间隔期为10d, 末次注射10d后采血。用间接ELISA方法测定抗血清的效价, 抗血清用1 mL HiTrap Protein G (GE公司) 柱纯化获得IgG。
1.2.3试纸条的检测和结果判定
试纸条的制作参照文献[14]。取出试纸条将具有胶体金复合物端插入300~400μL离心后的检测样品中, 10min左右判断结果。若试纸条仅质控C线出现紫红色线而检测T线未显色, 结果为阴性;若试纸条上C线和T线均出现紫红色, 结果为阳性;若试纸条C线和T线都没有显色, 则说明此试纸条已经失效, 结果无效。
2 结果与分析
2.1 病毒提纯结果
提纯的LMV经紫外测定, 呈典型的核蛋白吸收曲线 (见图1) , OD260=3.851, OD280=2.206, OD260/OD280=1.75。100g病叶提纯后可获得1.5mg病毒, 提纯的病毒用2%醋酸双氧铀负染后在透射电子显微镜观察到长度约750nm的弯曲线状病毒粒体 (见图2) 。
2.2 抗血清的效价
LMV抗血清用间接ELISA测定, 检测提纯病毒 (浓度3μg·mL-1) 的效价高达1/512 000, 检测昆诺阿藜病汁液 (稀释10倍) 效价为1/128 000, 健康昆诺阿藜 (稀释10倍) 的本底反应低 (见表1) 。
2.3 试纸条检测灵敏度
试纸条检测提纯LMV灵敏度可达1μg·mL-1 (见图3) , 缓冲液对照T线未显色;检测昆诺阿藜病汁液可稀释1 000倍 (W/V) , 健康对照T线未显紫红色, 有叶绿素吸附 (见图4) 。
从左至右分别为:提纯的病毒 (10、1、0.1、0.01、0.001μg·mL-1) , 缓冲液对照。From left to right show purified LMV (10, 1, 0.1, 0.01, 0.001μg·mL-1) and Buffer (CK) .
从左至右分别为:昆诺阿藜健康汁液 (10-1) , 昆诺阿藜病汁液 (10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6) 。From left to right show Healthy C.quinoa (10-1) , LMV infected C.quinoa (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6) .
2.4 试纸条特异性测试
用莴苣花叶病毒试纸条检测LMV的3个分离物 (PV-63、PV-0907、PV-0799) , C线和T线均出现紫红色, 结果呈阳性反应 (见图5) 。
用莴苣花叶病毒试纸条检测其它8种病毒, C线均出现紫红色的线, 检测T线未出现紫红色, 检测结果为阴性, 但其中6种病毒 (PVY、PVA、GVA、CGMMV、GFLV、TRSV) 的T线上出现不同程度的叶绿素非特异性吸附 (见图6) 。
从左至右分别为:LMV-PV-63、LMV-PV-0907、LMV-PV-0799。From left to right show LMV-PV-63, LMV-PV-0907, LMV-PV-0799.
从左至右分别为:PVX、PVY、PVA、GVA、ORSV、CGMMV、GFLV、TRSV。From left to right show PVX, PVY, PVA, GVA, ORSV, CGMMV, GFLV, TRSV.
2.5 田间采集样品的测试
从田间采集来的莴苣叶片30份, 按1∶10 (W/V) 稀释, 用试纸条进行测试, 结果2份为阳性, 28份为阴性, 经ELISA方法确认, 两者结果相符。
3 结论与讨论
研究所制作的LMV胶体金免疫层析试纸条检测提纯病毒的灵敏度可达1μg·mL-1, 检测病汁液可稀释1 000倍, 试纸条可特异性检测到LMV的3个分离物, 与PVX等8种其它病毒无交叉反应。
病毒的提纯和高质量抗血清制备是成功制作胶体金试纸条的前提, 课题组制作的试纸条有时T线上会出现叶绿素吸附的绿色线, 在结果判断时要引起注意, 为避免误判, 必要时可用其它方法对结果加以验证。出现的植物体内色素的非特异性吸附问题, 今后可通过对试纸条制作的工艺或样品的前处理加以改进, 以消除叶绿素等对检测结果的影响。
免疫胶体金层析诊断 篇4
胶体金免疫层析技术分析
所谓的胶体金, 其实就是氯金酸溶液在还原剂的作用下, 聚合成特定大小的金颗粒, 并且在静电作用下生成稳定胶体溶液。这些金颗粒具有较高的电子密度, 聚集成一定密度后就会以肉眼可见的粉红色斑点形式出现, 可以用作免疫层析试验的指示物。
在应用胶体金免疫层析技术时, 需要将特异性抗原或抗体固定在膜上, 利用毛细作用使样品在层析条上游动, 从而使其与受体发生免疫反应。而在这一过程中, 免疫复合物将被截留在检测带内, 所以能得到直观的试验结果。
在食品检测中, 利用该技术能够完成蛋白质、药物、毒素和病菌等多种物质的检测, 并且具有成本低、反应快和低交叉反应性的优势。
胶体金免疫层析技术在食品检测中的运用
食品安全事件出现, 往往会给社会带来巨大经济损失。所以, 近几年相关行业加快了食品检测技术的研究, 以期利用更先进的技术完成食品的有效检测。而胶体金免疫层析技术具有成本低、反应快和低交叉反应性的优点, 因此, 有必要对该技术在食品检测中的问题展开分析, 从而更好地促进食品检测技术发展。
在食品质量检测中的运用
从组成成分来看, 食品中含有蛋白质、水分、糖类、维生素和脂肪等物质。其中, 大部分都属于有机高分子物质, 可以使用胶体金免疫层析技术进行检测。在检测过程中, 一般会进行食品的半定量分析, 从而实现对食品成分的快速检测。例如, 奶牛分娩后最初几天分泌的乳汁为牛初乳, 含有大量非营养性功能组分, 保健价值提高。而在牛初乳中, Ig G含量与生物活性物质含量呈正相关关系, 所以可以使用胶体金进行标准牛Ig G的标记, 然后将其当成竞争抗原。通过将市面上牛乳样品中的Ig G和标记的标准牛Ig G相比, 就可以反映样品质量。
在食品安全检测中的运用
1在农兽药残留检测中的运用
使用胶体金免疫层析技术, 可以对食品中的农药、兽药和其他生物毒素残留进行检测。例如, 使用胶体金标记的抗氟喹诺酮类抗体进行胶体金制备, 就可以对牛奶中的11种氟喹诺酮类药物残留进行检测。而使用胶体金免疫层析技术将水样品和植物样品的实际检出限相比, 也能够完成一些农药物质的检测。相较于其他检测方法, 使用该技术不仅不需要使用大型仪器设备, 同时还具有简单、快速和方便的特点, 所以在食品农兽药检测方面得到了广泛使用。
2在非食品添加成分检测中的运用
在非食品添加成分检测方面, 胶体金免疫层析技术也得到运用。例如, 在三聚氰胺这种化工物质的检测上, 使用胶体免疫层析技术可以对乳制品中的三聚氰胺进行定性和定量检测, 而使用的试纸条具有较好的稳定性、重复性和灵敏度。在苏丹红I的检测上, 可以使用利用胶体金免疫层析技术制作成的苏丹红I测试纸条, 然后使用金标抗原方法将抗体固定在NC膜上, 就可以对食品中的苏丹红I进行定量检测。
3在霉菌毒素检测中的运用
食品中如果含有霉菌毒素等物质, 易导致人体和动物产生病理变化, 继而给人类健康带来严重危害。使用胶体金免疫层析技术, 能够有效鉴定黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和葡萄球菌肠毒素等多种霉菌毒素。例如, 在检测黄曲霉毒素B1时, 使用胶体金免疫层析试纸法进行检测, 可以与高效液相色谱法达到90.5%的相符率。同时, 使用该方法能够实现现场快速检测, 并且可以用于粮食中的黄曲霉毒素B1的初筛。此外, 使用该技术还能鉴定巧克力奶、婴儿奶粉和鲜牛奶等物质中的葡萄球菌肠毒素, 毒素最低检出限为10 mg/L。
4在致病菌检测中的运用
食品中的致病菌含量一旦超标, 就很可能导致食用者生病。目前, 食源性致病菌的检测仍是按照细菌分离、培养及生化鉴定的方法进行检测。这种方法耗时长、操作繁琐、环境和主观因素影响较大, 从而给食品检测带来较多不便。而使用胶体金免疫层析技术, 则能够解决该方面检测的操作复杂、灵敏度低和特异性低的问题。例如, 在大肠杆菌检测方面, 进行胶体金结合垫的制备只需要进行2次离心就可以消除标记过程中多余抗体。相较于其他方法, 胶体金免疫层析技术明显能够提高结合垫的性能和检验灵敏度。
结论
免疫胶体金层析诊断 篇5
胶体金免疫层析技术(Gold immunochromatographic assay,GICA)是近年来发展迅速的一项免疫标记技术,它以抗原抗体特异性结合为基础、大孔径微孔滤膜为载体、胶体金为固相标记物来定性检测样本中的待测物质[6]。因其快速、便捷,因此继氯霉素残留微生物检测法[7,8]、理化分析法(高效液相色谱法[9]、气相色谱法[10]、液相色谱-串联质谱法[11]等)和酶联免疫吸附法[12,13]后,GICA分析法逐渐被广泛应用于氯霉素检测中。本文对胶体金试纸条检测动物组织中氯霉素的残留进行了研究,为氯霉素残留监控提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
猪肉、鸡肉、鱼、虾(市售);氯霉素快速检测试纸(北京勤邦生物技术有限公司),其中包括冻干有氯霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂、试纸条和样品复溶液;氯霉素标准品(美国Sigma公司),纯度≥99%;乙酸乙酯、乙腈、正己烷(北京化学试剂公司),分析纯。
8010S匀浆机(上海斯伯明仪器设备有限公司);2000SBL电子天平(美国Setra公司);QL-901漩涡混合器(海门市其林贝尔仪器制造有限公司);Anke GL-20G-Ⅱ高速离心机(上海安亭科学仪器有限公司);DSY-Ⅲ氮吹仪(北京金科精华苑科技有限公司);微量移液器(美国Thermo公司);Acquity液相色谱串联质谱仪配有电喷雾离子源(美国Waters公司)。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理
取已去脂肪的组织样品10 000 r/min均质1 min;称取(5±0.05)g均质样品至50 m L聚苯乙烯离心管中,加入8 m L乙酸乙酯,漩涡混合器涡动2 min,室温(20～25℃)4 000 r/min离心5 min;移取全部上层有机相至10 m L干净的玻璃试管中,于50～60℃水浴氮气流下吹干;加入1mL正己烷,用漩涡混合器涡动1 min,再加1 m L样品复溶液,用漩涡混合器涡动30 s,室温(20～25℃)4 000 r/min离心5 min;除去上层有机相,取下层无机相用于分析。
1.2.2 检测步骤
将原包装预先平衡至室温,打开后取出所需数目的微孔试剂和试纸条,并做好标记;用微量移液器移取200 L待检组织提取液于微孔中,缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀,室温(20～25℃)孵育5min;将标记好的试纸条插入微孔中-印有“MAX”线端朝下,使之充分浸入溶液中;室温(20～25℃)孵育10 min后,取出试纸条,根据检测线和质控线是否出现红色条带即可判定结果。检测结果示意图及其说明见图1。
注:(1)阴性(-):T线显色强于C线或与C线无明显差异;(2)阳性(+):T线显色明显弱于C线显色;(3)无效:未出现C线。
2 结果与分析
2.1 样本检测限试验
采用1.2.1所述的样品前处理方法时,在空白样品中分别添加氯霉素标准品至终浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.6 g/kg。取三批试纸条进行检测,每批测定5个重复,结果见表1,部分试验结果见图2。
由表1可知,氯霉素快速检测试纸条测定猪肉、鸡肉、鱼、虾样品中氯霉素含量的检测限为0.3 g/kg。
注:从左到右氯霉素添加浓度依次为0、0.1、0.2、0.3、0.6 g/kg。
2.2 假阳性率、假阴性率试验
取阴性猪肉、鸡肉、鱼、虾样品及其对应的阳性样品(氯霉素添加浓度为0.3 g/kg)各20份,按1.2.1所述的方法将样品前处理后用三批试纸条分别进行检测。结果发现,阴性样本的检测结果均为阴性,阳性样本的检测结果均为阳性,可见试纸条的阴阳性符合率达到100%,假阳性率、假阴性率都为0。
2.3 特异性试验
将链霉素、青霉素、四环素、恩诺沙星、磺胺二甲基嘧啶5种抗生素溶于pH7.2、0.2 mol/L的磷酸盐缓冲液,配成浓度为500 g/L的溶液,按1.2.2所述步骤用试纸条进行检测。结果发现,5种抗生素的C线和T线均显色,显示阴性结果,表明本试纸条对其他抗生素无交叉反应,具有较好的特异性。
2.4 与仪器方法的比较
用试纸条方法和国标方法《GB/T 22338-2008动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定》(液相色谱-串联质谱法对氯霉素的检出限为0.1 g/kg)[14],分别对空白猪肉、鸡肉、鱼、虾样本及添加不同浓度组氯霉素药物(浓度分别为0、0.05、0.5、1.0)的加标样本进行测定,每组两个平行,结果见表2。
由表2可知,氯霉素添加浓度为0、0.05 g/kg时,试纸条检测结果均为阴性(-),LC-MS/MS法检测结果未检出,即低于仪器方法检测限;添加浓度为0.5、1.0 g/kg时,试纸条和LC-MS/MS法检测结果均为阳性,可见两种方法的测定结果基本一致,符合度达到100%,该试纸条可用于动物组织中氯霉素残留的快速筛选。
3 结论
本研究采用胶体金法对动物组织中的氯霉素残留进行检测,试纸条对猪肉、鸡肉、鱼、虾样本的最低检测限为0.3 g/kg,检测阴、阳性样本时,假阳性率和假阴性率皆为0;对其他抗生素无交叉反应,特异性较好;在测定氯霉素含量为0、0.05、0.5、1.0 g/kg的加标样本时,检测结果与液相色谱-串联质谱法一致,符合度达到100%。
本研究所使用的胶体金试纸条将胶体金标记的抗体直接冻干在微孔试剂中,在检测过程中,能够使金标抗体与待检样品液充分接触,充分反应,从而减少误差,增加整个体系的反应灵敏度,易于对样品中的药物残留情况进行分析。尽管结构的改进提高了试纸条的灵敏度,但由于通过颜色判断结果比较主观,可能出现假阳性问题,因此对于阳性样本,还需要用LC-MS/MS等仪器方法进行确证。
摘要：应用胶体金免疫层析法对动物组织中的氯霉素残留进行检测,研究该方法的灵敏度、假阳性率、假阴性率及特异性。结果表明,用胶体金免疫层析法测定猪肉、鸡肉、鱼、虾中的氯霉素,检测限均为0.3g/kg,假阳性率和假阴性率皆为0%;方法的特异性较好,对其他抗生素无交叉反应;检测加标样本的结果与液相色谱-串联质谱法基本一致。可见,该方法简便、快速、准确、稳定,可作为动物组织中氯霉素残留现场快速检测的一种有效手段。
免疫胶体金层析诊断 篇6
1. 危险化学品的分类
凡具有爆炸、易燃、毒害、腐蚀、放射性等危险性质, 在运输、装卸、生产、使用、储存、保管过程中, 在一定条件下能引起燃烧、爆炸, 导致人身伤亡和财产损失等事故的化学物品, 统称为危险化学品[1]。
危险化学品按照《危险货物分类和品名编号》进行分类, 共分九类, 分别是:第一类:爆炸品。第二类:气体。第三类:易燃液体。第四类:易燃固体、易于自燃的物质、遇水放出易燃气体的物质。第五类:氧化性物质和有机过氧化物。第六类:毒性物质和感染性物质。第七类:放射性物质。第八类:腐蚀性物质。第九类:杂项危险物质和物品[1]。
根据危险化学品的易燃、易爆、有毒、腐蚀等危险特性, 危险化学品事故可划分为:危险化学品火灾事故;危险化学品爆炸事故;危险化学品中毒和窒息事故, 危险化学品灼伤事故;危险化学品泄漏事故;其他危险化学品事故[2]。
2. 经典的危险化学品定量分析检测技术
危险化学品检测方法多采用高精度的仪器设备检测, 按照仪器分析的基本原理主要有:光学分析法、电化学分析法、色谱分析法、生物传感技术和其他分析法 (见表1) 。
(1) 光学分析法。
光学分析法是基于光作用于物质后产生的辐射信号或所引起的变化来进行分析的方法, 可分为光谱法和非光谱法两类。
(1) 紫外-可见分光光度法。
紫外-可见分光光度法:是基于物质对紫外-可见光辐射的选择性吸收来进行分析测定的方法。本法具有快速、简便、重现性好等优点, 但由于干扰因素较多, 选择性较差, 多用于汞、铅、镉的测定。
(2) 石墨炉原子吸收法。
利用石墨管高温下使样品原子化, 通过炉内光路产生吸收的原理来测定。该法具有灵敏度高, 选择性好, 方法简便, 分析速度快等优点, 但石墨管耗价昂贵, 且不能同时测定多个元素[3,4,5,6]。Caldas等 (2009) 利用石墨炉原子吸收法检测巴西朗姆酒中砷、铜、铅的含量。Janyeid Karla Castro Sousab等 (2008) 利用石墨炉原子吸收法在石油样品中检测铜的含量。
(3) 火焰原子吸收法。
火焰原子吸收法是由化学火焰提供能量, 使被测元素原子化。该法应用最早, 而且至今仍在广泛使用 (北京大学化学系, 1997) 。Shokrollahi等 (2008) 利用火焰原子吸收法测定在各种环境样品中Cu2+的含量。Bakirdere等 (2008) 利用火焰原子吸收法测定了在路边土壤和植物样品中铅、镉、铜的含量。
(4) ICP-AES法 (电感藕合等离子体原子发射光谱分析法) 。
ICP-AES法是电感藕合等离子炬管为激发光源的一种光谱分析方法。ICP激发光源是一种具有6000~7000K的高温激发光源, 由高频放电产生的。外形与化学火焰相似的电火源, 其激发光源 (炬管) 为分析试样组份元素提供蒸发。原子化或激发的能量, 是原子发射光谱仪中一个极其重要的组成部分。试样溶液经雾化后, 随载气氩带入炬焰的中心通道中而被原子化和激发, 产生多元素分析谱线[7,8,9]。
(5) 荧光分析法。
某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。物质的激发光谱和荧光发射光谱, 可以用作该物质的定性分析。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时, 物质在一定浓度范围内, 其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系, 可以用作定量分析。荧光分析法的灵敏度一般较紫外分光光度法或比色法高。
(6) 原子荧光分析法。
在一定条件下, 气态原子吸收辐射光后, 本身被激发成激发态原子, 处于激发态上的原子不稳定, 跃迁到基态或低激发态时, 以光子的形式释放出多余的能量, 根据所产生的原子荧光的强度即可进行物质组成的测定。物质的基态原子受到光的激发后, 会释放出具有特征波长的荧光, 据此可对物质进行定性分析。物质的定量分析可通过测定原子荧光的强度来实现[10]。
(2) 电化学分析法。
电化学分析是应用电化学原理和实验技术建立的分析方法。通常是将待测组分以适当的形式置于化学电池中, 然后测量电池的某些参数或这些参数的变化进行定性和定量分析。但因检出灵敏度低, 特异性差, 而且操作麻烦费时, 不能满足测定的要求。一般不用来检测重金属。
(3) 色谱分析法。
色谱法是一种极有效的分离技术, 借助两相间分配系数的差异而使混合物中各组分分离, 并对组分进行测定的方法。色谱法的特点是:高效能、高灵敏度、高选择性和分析速度快。
气相色谱法是以气体为流动相, 以涂在惰性载体或柱内壁上的高沸点有机化合物或表面活性吸附剂为固定相的柱色谱分离技术。作为气相色谱分析的化合物的要求具有挥发性和热稳定性, 因此无机物作为气相色谱分析, 首先要转变其化学形式使其具有挥发性及热稳定性。金属离子与一些有机试剂作用生成的螯合物符合此要求, 金属螯合物的特点是可以定量反应, 容易得到纯化合物, 适合于环境污染物的痕量分析[11]。伊拉克发生的误食含有有机汞种子的中毒事件中甲基汞的监测就是采用气相色谱法检测的。
(4) 其他分析法。
质谱法是将待测物质的分子转变成带电粒子, 利用稳定的磁场使带电粒子按照质量大小顺序分离开来, 形成有规则并可以检测的质谱[12]。等离子体质谱法 (Inductively coupled plasma mass spectrometry) 的应用被认为是20世纪80年代痕量元素及同位素分析的一项重要进展。
(5) 生物传感技术。
生物传感器是高科技的电子技术和生物工程技术相结合的产物, 由固定化并具有化学分子识别的生物材料、换能器件及信号放大装置构成, 能够选择性地对样品中的待测物发出响应, 并把待测物质的浓度转化为电信号, 根据电信号大小定量测出待测物质的浓度。生物传感器的选择性的好坏完全取决于它的分子识别原件, 而其他性能则和它的整体组成有关。
Andrew等 (1998) 利用光学纤维反射传感器固定化Br-PADAP估测重金属的含量, 对重金属锌的检测灵敏度可达31ppb, 而检测时间只有6min。Kukla等 (1999) 利用胆碱酯酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等多酶系统来制成多酶电化学传感器, 以酶膜残留的活性来判断重金属含量。Ibolya等 (2000) 利用发光酶固定化生物传感器来检测重金属汞、镉、铜、锌, 检测限约为10-15μmol/L。Alexander等 (2000) 利用含有荧光基因细菌发出的荧光检测重金属砷。Lehmann (2000) 和Riether等 (2001) 开发出一种专门测量铜离子的电流型生物传感器。生物传感器的研究和开发在重金属残留分析领域相对滞后, 这种酶电极的主要缺陷是灵敏度不太高, 特异性不强, 回收率低, 重复性较差, 电极使用寿命短难以真正满足重金属残留快速检测的要求, 实际应用也不多。
3. 胶体金免疫层析技术
(1) 方法简介。
图1胶体金免疫层析试纸条结构
胶体金免疫层析技术是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。它的原理是:以条状纤维层析材料为固相, 通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动, 并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体 (抗原或抗体) 发生高特异性、高亲和性的免疫反应, 层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域 (检测带) , 运用可目测的标记物 (胶体金) 而得到直观的实验现象 (显色) 。而游离标记物则越过检测带, 与结合标记物自动分离 (见图1) 。这种分析技术具有操作简单快速, 可单份测定, 无须特殊仪器等优点, 适合于各种快速检测场合, 尤其适用于在事故发生过程中对危险化学品进行快速检测[13]。
(2) 胶体金免疫层析技术的发展。
胶体金用于免疫学检测研究是20世纪80年代发展起来的一项新技术, Muller等 (1980) 应用该技术对牛痘病毒进行了免疫电镜研究, Geoghegan等 (1980) 和Leuvering等 (1981) 应用胶体金进行了被动凝集试验, Leuvering等 (1983) 利用胶体金做了人妊娠诊断研究, Manara等 (1982) 用过氧化物酶和金染色进行了细胞膜双标记的免疫电镜研究, Wybran等 (1985) 应用金染色对淋巴细胞亚群做了计数研究。总之, 胶体金在免疫检测中的初步应用已显示了广阔前景[14]。
(3) 胶体金免疫层析技术在检测危险化学品中的应用。
(1) 重金属的检测。
国内外已经建立了针对有机污染物的免疫胶体金检测方法, 并且将该方法用于重金属离子的分析检测, 迄今为止, 免疫胶体金检测技术已经成功用于水中的铟、汞、镉、铅和铀等的检测。
刘斌等研究了纳米Ti O2分离富集水样中痕量镉的最佳反应条件, 应用自制抗Cd (Ⅱ) -i EDTA (Isothiocya-nobenzyi-EDTA) 螯合物的单克隆抗体, 建立了快速检测环境水样中重金属镉残留的胶体金免疫层析法。对实测样品的检测耗时约90min, 该方法对Cd的定量下限可达5μg/L, 适用于环境水样中的检测[15]。
向军俭等研制检测水样品中镉离子残留的胶体金免疫层析快速检测试纸条, 对试纸条进行灵敏度、特异性和稳定性验证, 并检测添标水样。结果制备的试纸条对镉离子的最低检测限为100 ng/ml;除了与Hg2+-EDTA有交叉反应外与Fe3+、Pb2+、Cu2+等类似物无交叉反应;试纸条在常温下放置8周稳定性良好;检测添标水样的结果与ICP-AES的检测结果一致, 可作为水样中重金属镉离子残留现场检测和监控的有效手段[16]。
(2) 农药的检测。
万积成等通过研究胶体金法与气相色谱法在检测毒死蜱中的应用, 证实胶体金试纸条在检测蔬菜中毒死蜱残留的可靠性。与气相色谱法相比较, 胶体金试纸检测毒死蜱操作简便、观察直观、快速、省时, 其特异性、敏感性较高, 可作为毒死蜱农药残留自我检测的手段[17]。
万积成等采用胶体金法半定量方法检测的试样, 再用液相色谱-串联质谱法定量检测试样中吡虫啉。结果发现胶体金试纸检测为阳性与阴性样品经液相色谱-串联质谱检测的符合率达到了100%。添加的cut off值样品的回收率为88.4%。结论:与液相色谱-串联质谱相比较, 胶体金法检测吡虫啉具有操作简便、直观、快速、省时的特点, 其特异性、敏感性较高, 适用性强, 可作为吡虫啉农药残留自我检测的手段应用[18]。
赵友全等利用甲霜灵胶体金试纸条用于现场快速检测进出口蔬菜甲霜灵农药残留量。在对试纸条光谱测量分析的基础上, 研制出一种基于图像测量的便携式甲霜灵试纸条显色分析仪器, 该仪器集成了样品滴定、定时检测、显色度分析、身份认证等多种功能, 实现了试纸条的自动检测、显色度数值分析和数据存储[19]。
肖琛等应用胶体金免疫层析技术研制出一种准确、快速、简便检测氰戊菊酯农药残留的试纸条。实验结果表明, 该快速检测试纸条100%抑制浓度为800ng/m L (检测线无色) , 检测时间为10min, 批次内和批次间重复性为100%。采用该试纸条检测农产品中残留的氰戊菊酯特异性强、灵敏度高而且无需特殊仪器设备, 适用于农产品中氰戊菊酯残留的快速检测[20]。
(3) 表2列出了小分子相关的文章。
4. 结语
免疫胶体金层析诊断 篇7
1 材料与方法
1.1 主要试剂和仪器
氯金酸(美国Sigma公司)、柠檬酸三钠(天津化学试剂厂)、AFB1标准抗原(美国Sigma)、AFB1单克隆抗体(英国Abcam)、羊抗鼠Ig G(美国Sigma)、卵血清蛋白(OVA,ORGANICS,USA)、牛血清白蛋白(BSA,BIOSHARP)、羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)、二甲基甲酰胺(DMF)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)、三羟甲基氨基甲烷(Tris)(国药集团化学试剂有限公司)、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠、氯化钾(天津市科密欧化学试剂有限公司),所用试剂均为分析纯;实验用水均为Milli Q纯水、硝酸纤维膜、玻璃纤维膜、吸水滤纸(上海金标生物科技有限公司);恒温磁力搅拌器、UV1601紫外可见分光光度计(日本岛津)、HC-2514高速离心机(科大创新股份有限公司中佳分公司)、水浴恒温回流装置和旋转蒸发仪。
1.2 配制的溶液
1 g/L氯金酸溶液、0.1 g/L氯金酸溶液、10 g/L柠檬酸三钠溶液、0.01 mol/L,p H=7.4磷酸盐缓冲液(PBS)、0.1 mol/L K2CO3溶液、金标垫处理液和硝酸纤维素(NC)膜封闭液,共7种。
1.3 胶体金的制备(柠檬酸三钠还原法[4])及鉴定
1.3.1 胶体金的制备
将玻璃器皿全部清洗干净,并用铬酸浸泡过夜,清洗干净后放入烘干机中烘干。取5份0.1 g/L氯金酸水溶液100 ml分别于250 ml锥形瓶中,标号分别为①、②、③、④、⑤,瓶中放有数粒防爆珠,于恒温磁力搅拌器中加热至沸腾,在手动晃动下逐滴加入10 g/L柠檬酸三钠溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 ml,继续晃动加热10 min,取下锥形瓶继续晃动10 min,期间观察颜色变化。待室温冷却后,将所得5份胶体金溶液转移至棕色试剂瓶中4℃下保存备用。
1.3.2 胶体金的鉴定
①目测法:用肉眼观察所制得的胶体金溶液,观察其颜色、均匀度和透明度。②紫外法:用紫外可见分光光度计在可见光范围内(400~600nm)对胶体金溶液进行波长扫描分析,获得胶体金可见光区吸收光谱,记录最大吸收波长。③p H值的测定:由于金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞,故不能用p H计测定胶体金溶液的p H值,一般使用精密p H试纸。
1.4 AFB1人工抗原的制备及鉴定
1.4.1 AFB1肟(AFB1O)的制备
AFB1O的制备是根据Morgan等[5]报道的原理,参考陈福生等[6,7]的方法。具体制备方法为:1 mg的AFB1和2 mg的羧甲基羟胺半盐酸盐(CMO)溶于1.5 ml吡啶甲醇双蒸水混合液中(0.25 ml吡啶+1 ml甲醇+0.25 ml双蒸水),控温(85℃)回流反应4 h,用TLC检测反应进程,室温搅拌过夜。旋转蒸发仪将溶剂旋干剩余0.25 ml体积,加入1 ml水,用2 mol/L的H2SO4调节p H=4,溶液变浑浊,用5 ml乙酸乙酯萃取二、三次,合并有机相(10 ml),并用水洗涤2次,浓缩旋干液体,得黄色油状半固态物质即是AFB1O。
1.4.2 TLC鉴定肟化
将肟化后沉淀物用少量甲醇溶解,以氯仿∶甲醇=9∶1为展开剂,Rf(TLC中溶质迁移距离与流动相迁移距离之比)值为0.20左右的是AFB1O(Rf=0.8左右的组分是没有转化的AFB1)。
1.4.3 包被抗原的合成
采用EDC法合成包被抗原,合成原理见图1。方法为1 mg AFB1O溶解于0.2 ml二甲基甲酰胺和水(DMF:H2O=6∶9)的混合溶液,加入10 mg EDC,25℃避光活化4h,再补加10 mg EDC。称3.5 mg OVA,用0.13 mol/L的Na HCO3溶液制成10%OVA活化溶液,将OVA溶液逐滴加入上述反应液中,室温搅拌反应24 h。反应产物在4℃搅拌下用PBS透析3 d,每天换液3~6次,透析后得到纯化的AFB1-OVA。
注:EDC-1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳=亚胺盐酸盐;AFB1—黄曲霉毒素B1
1.4.4 紫外扫描鉴定
用含3%甲醇的PBS稀释OVA标准溶液及AFB1-OVA溶液,用甲醇∶PBS(V∶V=1∶4)稀释AFB1标准溶液,利用紫外分光光度计测定其浓度和特征峰,然后调节AFB1-OVA溶液的蛋白质浓度与OVA标准溶液一致,在波长200~400 nm范围内进行紫外扫描,根据吸收峰的变化判断偶联是否成功。
1.5 胶体金-AFB1单抗复合物的制备
1.5.1 测定胶体金标记抗体最低稳定量
操作方法[9]如表1所示。取8支试管,分别加入1 ml胶体金溶液;用0.01 mol/L PBS将单抗稀释成0.1 mg/ml,各取0、2、5、7、10、11、12、14μg,按顺序加入各管中,混匀,静置5 min后,再向上述各管中加入100μl 10%的Na Cl溶液,混匀,静置30 min。
肉眼观察:根据加入抗体后胶体金颜色的变化判断,以颜色不再变化的试管的添加量初步确定为单抗最低标记量。
紫外可见分光光度计测定:测定520 nm波长处的吸光度值(A520值)。以A520值为纵坐标,试管号为横坐标做一曲线,取A520值达到最大不再变化时所对应的抗体蛋白用量为稳定胶体金的最低蛋白用量,在此基础上再加10%~20%即为稳定胶体金的抗体蛋白实际用量。
1.5.2 测定胶体金标记抗体最适p H值
由于试验胶体金溶液为1 ml,直接调p H值不易控制,胶体金溶液容易损坏p H计的电极,参照文献[4]方法,最终以加入0.1 mol/L K2CO3的量为标准。表2中每管胶体金为1 ml;蛋白质的量为最适稳定量。取一系列试管按照表2进行操作,当分别加入100μl 10%的Na Cl溶液后,混匀静置过夜后,弃去沉淀,测定A520值,将结果绘制成图。
1.5.3 胶体金的标记抗体及纯化[10]
根据胶体金标记抗体最适稳定量,计算出标记胶体金总量所需的抗体总量,用PBS将抗体稀释到1 ml,采用低温高速离心法纯化胶体金。
1.5.4 金标抗体的紫外扫描鉴定
用紫外可见分光光度计在可见光范围内(400~600 nm)对胶体金溶液及AFB1金标抗体溶液进行波长扫描分析,获得胶体金及AFB1金标抗体在可见光区吸收光谱,记录最大吸收波长,根据吸收峰的变化判断结合是否成功。
1.6 胶体金标记抗体的处理
1.6.1 玻璃纤维膜的处理
将剪裁好的玻璃纤维膜(长约2 cm,宽约1.2 m)浸泡于胶体金标记垫处理液中,37℃水浴30 min,取出,平铺于纱网上37℃干燥三四小时(充分干燥),放于4℃密封保存备用。在处理后的玻璃纤维膜上按每1.2 cm×1.0 cm滴加120μl胶体金标记抗体溶液,2 min后37℃干燥2 h,放于4℃密封保存备用。
1.6.2 胶体金标记抗体稀释度的确定
纯化的胶体金标记抗体作8、10、15、20、40倍5个不同稀释度后,在其他条件不变的情况下,与固定浓度的抗原组装成试纸条,观察显色情况。根据反应结果,确定最适金标记抗体稀释度。
1.7 NC膜的选择
选取3种进口的NC膜,型号分别为Millipore135、Sartorius CN140、Millipore180,均包被相同浓度的AFB1-OVA和羊抗鼠Ig G,两者相距5 mm,与同浓度金标垫组装成试纸条,测其在PBS中的结果,比较NC膜的性能和测试效果。
1.8 胶体金免疫层析试纸的初步组装及测试原理
1.8.1 组装示意图
最终组装示意图见图2。
1.8.2 测试原理
将AFB1抗体标记于胶体金的作为免疫胶体金,将AFB1-OVA包被于NC膜作为检测线,将羊抗鼠抗体包被于检测线后侧作为质控线。加样检测,若样品中含有AFB1时,首先与免疫胶体金结合形成复合物,此复合物向前涌动到检测线位置,免疫胶体金表面位点由于被AFB1占居而使其不能与检测线的AFB1-OVA结合,此时检测线位置由于不能拦截胶体金而不显色或显色弱,将此检测结果视为阳性,而当样品中不含AFB1时,免疫胶体金涌动到检测线位置时将被AFB1-OVA捕获,胶体金聚集于检测线上将呈现肉眼可见的红色条带,此检测结果视为阴性;当检测线与质控线均无红色条带出现时,说明试纸条失效。见图3。
1.9 试纸条的性能测定
1.9.1 灵敏度试验
将AFB1标准品配制为1.0 mg/ml的贮备液,用甲醇∶PBS(V∶V=1∶4)配制成0、100、200 ng/ml的标准系列溶液。用金标试纸条测试上述标准系列溶液,10~15min内观察,质控线显红色而检测线不显色者为阳性(+),两条红色线者为阴性(-)。
2 结果与讨论
2.1 胶体金鉴定
2.1.1 目测法
用肉眼观察所制得的胶体金溶液,观察其颜色、均匀度和透明度。良好的胶体金应该是清亮透明的,若制备的胶体金混浊或液体表面有漂浮物,表明此次制备胶体金不成功。胶体金颗粒直径不同,其光散射作用也不同,所以制备出不同粒径的胶体金溶胶时,由于其光散射作用的不同使其在外观上呈现的颜色也会有较大差异[11,12]。微小颗粒胶体呈红色,但不同大小的胶体呈色有一定的差别。最小的胶体(2~5 nm)是橙黄色的,中等大小的纳米金溶胶(10~20 nm)是酒红色的,较大颗粒的纳米金溶胶(30~80 nm)则是紫红色的[13,14]。用肉眼观察本实验所制备的胶体金溶液见图4,可见②~⑤管的颜色相差不大,均为酒红色,清亮透明,无悬浮物;而①管的颜色为紫红色,亦清亮透明,无悬浮物。初步推测其粒径在10~20 nm范围,与参考文献相符,初步判断其符合实验要求,有进一步鉴定的价值。
注:①10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.0 ml,紫红色;②10 g/L柠檬酸三钠溶液添加2.0 ml,酒红色;③10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.5 ml,酒红色;④10 g/L柠檬酸三钠溶液添加2.5 ml,酒红色;⑤10 g/L柠檬酸三钠溶液添加3.0 ml,酒红色
2.1.2 紫外法
扫描胶体金的吸收光谱,是一种简单有效的胶体金质量鉴定方法。金纳米微粒溶液呈现出颜色主要是因为等离子体共振吸收,而这个吸收与胶体金纳米微粒的形态以及结构等有关。所以通过紫外可见光谱,可以得到颗粒粒度以及结构等信息。将冷却后的胶体金溶液,以双蒸水作对照,用紫外可见光分光光度计在400~600 nm范围内进行扫描,测定吸收曲线和吸收峰,确定最大吸收峰。纳米胶体金溶胶在可见光范围内有一单一光吸收峰,这个光吸收峰的最大吸收波长(λmax)在510~550 nm范围内,随纳米胶体金溶胶颗粒大小而变化,大颗粒纳米胶体金溶胶的λmax偏向于长波长;反之,小颗粒纳米胶体金溶胶的λmax则偏于短波长;吸收峰宽度越小,标准偏差越小,说明颗粒越均匀;吸收峰宽度越大,标准偏差越大,说明颗粒越不均匀,可能会出现椭圆形或多三角形颗粒[15]。本实验所制备的5组胶体金溶液在400~600 nm扫描图谱见图5。
10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.0 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为529 nm;10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.5 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为518nm;10 g/L柠檬酸三钠溶液添加2.0 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为518 nm;10 g/L柠檬酸三钠溶液添加2.5 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为517 nm;10 g/L柠檬酸三钠溶液添加3.0 ml时,紫外扫描的最大吸收峰波长为517 nm。可知,10 g/L柠檬酸三钠溶液添加1.5、2.0、2.5、3.0 ml时,最大吸收峰波长均在520 nm左右,符合做AFB1胶体金免疫层析法检测试纸条的要求。
2.1.3 p H值的测定
由于胶体金颗粒容易吸附于电极上使之堵塞,故不能用p H计测定胶体金溶液的p H值,一般使用精密p H试纸。用柠檬酸三钠还原法制备的胶体金,在柠檬酸三钠还原剂的作用下,氯金酸(HCl4)水溶液中的金离子还原成金原子,并聚集成一个微小的晶体金核,同时晶核周围吸附一定的氯金酸离子、氢离子和柠檬酸离子形成吸附层,依靠静电作用形成稳定的胶体溶液。因此制备的胶体金应该呈酸性。用精密p H试纸测定胶体金的p H值为5.8。
2.2 AFB1人工抗原的制备及鉴定
2.2.1 AFB1的肟化
由于AFB1本身上没有与蛋白质偶联的活性基团,所以在制备人工抗原前,要对其进行改造,本实验在Morgan等的基础上,在复合催化剂嘧啶、甲醇、水的催化下,用CMO将AFB1改造成含有羧基的AFB1O。实验过程中,肟化改造的进行,是通过回流装置控温进行,温度始终控制在85℃,回流进行4 h,而后室温冷却过夜。
2.2.2 TLC鉴定肟化
肟化反应进程中监测反应进展情况时,采用的是TLC法,因为AFB1经过肟化后,形成的肟化物AFB1O他们在不同的展开剂下,展开的距离是不同的。利用这个性质可以判断实验过程中,反应物AFB1向反应产物AFB1O的转化程度。在以氯仿∶甲醇=9∶1为展开剂下,在Rf=0.20左右的是AFB1O,Rf=0.8左右是没有转化的AFB1,当荧光斑点在0.2左右有强荧光,而在0.8却没有或很弱的荧光斑点出现时,就能说AFB1基本全部分转化成AFB1O。通过TLC法,可以定性判断反应的进程。
本实验结果如图6所示,Rf值为0.24,故本实验肟化进程完全。
注:TCL—薄层色谱法;AFB1O—典曲霉素B1肟
2.2.3 包被原的合成及鉴定
利用紫外扫描仪在200~400 nm波长范围进行扫描,结果见图7。OVA的最大吸收峰在280.5 nm,AFB1在224、266.5、364 nm处有吸收峰,OVA与AFB1偶联后,偶联物紫外扫描吸收光谱与OVA及AFB1吸收光谱有明显区别,说明有新物质生成。
注:AFB1—黄曲霉素B1;OVA—卵血清蛋白
进一步用新合成的AFB1-OVA组装试纸条,鉴定合成的人工抗原是否成功。结果见图8。以PBS作为阴性测试,质控线和测试线均显示深红色,为阴性结果,表明合成的人工抗原是成功的,可以为后续的实验利用。
注:AFB1—黄曲霉素B1;OVA—卵血清蛋白
2.3 胶体金-黄曲霉毒素B1单抗复合物的制备
2.3.1 胶体金标记抗体最低稳定量的确定
胶体金是一种带负电的疏水性颗粒,未加单抗或当加入的单抗量不足以吸附完胶体金时,加入Na Cl后,由于盐离子效应会改变胶体的性质,出现由红变蓝的聚沉现象。观察各管中胶体金溶液变化,加入蛋白量不足的溶液颜色依次由蓝变红,而加入蛋白量达到或超过时的溶液则保持红色不变。由图9可见,本实验中从每毫升胶体金溶液中单抗添加量等于或大于11μg/ml时,胶体金抗体蛋白结合物吸的光度值不再发生较大的变化,趋于平稳,说明胶体金颗粒对抗体蛋白的吸附基本达到饱和。稳定胶体金的最低蛋白用量为11μg/ml抗体蛋白,在此基础上再增加10%~20%即为待标记抗体蛋白的实际用量。最终确定实际用量为13μg/ml抗体蛋白。
注:对照—AFB1单抗0μg,灰黑色;①—AFB1单抗2μg,灰黑色;②—AFB1单抗5μg,紫灰色;③—AFB1单抗7μg,紫灰色;④—AFB1单抗10μg,紫色;⑤—AFB1单抗11μg,酒红色;⑥—AFB1单抗12μg,酒红色;⑦—AFB1单抗14μg,酒红色
2.3.2 胶体金标记抗体最适p H值的确定
不同p H值条件下胶体金标记抗体的结果见图10。由图10可知在4号管时(添加0.1 mol/L K2CO3量为20μl/ml)胶体金标记抗体蛋白得到的胶体金抗体蛋白结合物的吸光度值最高,说明胶体金颗粒和抗体蛋白吸附较好,从4~7管,测得的数值基本没有变化。故而选用4号管所对应的0.1 mol/L K2CO3量调节胶体金溶液至最适p H值。
2.3.3 胶体金标记抗体鉴定
胶体金标记后,颗粒直径变大,其最大吸收波长将发生红移,所以可以通过测定标记前后胶体金的最大吸收峰来鉴定其是否标记成功;另外,可以将羊抗鼠Ig G包被到NC膜上,将金标抗体与其反应,观察结果,进而鉴定标记是否成功。
本实验采用紫外可见光扫描法对复合物进行了鉴定,最大吸收波长由原来的518 nm移至525 nm,证明胶体金标记AFB1单克隆抗体成功。见图11。
注:AFB1—黄曲霉素B1
2.4 胶体金标记抗体稀释度的确定
用稀释液将胶体金标AFB1抗体稀释不同的倍数,用其制备结合垫并组装试纸条,利用试纸条检测阴性样品,见表3。由表3可知,金标AFB1抗体以1∶8、1∶10和1∶15倍稀释时,试纸条均显示清晰条带,稀释倍数高于1∶15时,条带变淡直至消失。确定金标AFB1抗体的最适稀释倍数为1∶15。
注:AFB1—黄曲霉素B1;++显色深;+显色浅;-不显色。
2.5 NC膜的选择
选取3种进口的NC膜,型号分别为Millipore180、Millipore 135和Sartorius CN 140,其他条件均相同,测其在PBS中的结果,比较跑板速度和显色结果。若跑板速度太快会导致抗原、抗体结合不充分,使信号减弱,表现为T线不明显;若跑板速度太慢则会延迟检测结果,且胶体金标记后的抗体易滞留在膜上,使背景不干净。跑板速度和膜的固有性质有关,如孔径、疏水性等。
从试纸条展开速度和显色结果看,3种NC膜的测试结果差异不明显,但因为Millipore 135显色相对较浅,Sartorius CN 140背景色较深,脆性强,易折断;Millipore180膜显色较深,较少背景色,综合考虑,最后选择Milii Pore 180硝酸纤维素膜作为试纸条的层析材料。
2.6胶体金免疫层析试纸条的初步测试
利用本实验所制备的试纸条,检测用甲醇∶PBS(V∶V=1∶4)配制成0、100、200 ng/ml的AFB1标准系列溶液。结果见图12。质控线均显深红色;AFB1标准品浓度为0 ng/ml时,检测线显深红色;AFB1标准品浓度为100 ng/ml时,检测线显浅红色;AFB1标准品浓度为200 ng/ml时,检测线几乎不显色。说明本实验所制备的试纸条的检测限为200 ng/ml。须进一步优化包被抗原AFB1-OVA的量、羊抗鼠Ig G的浓度及胶体金标抗体的稀释倍数等,以提高试纸条的检测性能。并进一步检测试纸条的检测性能,包括试纸条的特异性、灵敏度、检测限、重现性、稳定性、假阳性率、假阴性率等。并进一步检测食品及谷物中AFB1,与ELISA法等其他检测方法作对比。
注:①AFB1标准品浓度为0 ng/ml,检测线呈深红色;②AFB1标准品浓度为100 ng/ml,检测线呈浅红色;③AFB1标准品浓度为200 ng/ml,检测线几乎不显色
3 结论
本课题采用自偶联完全抗原AFB1-OVA作为包被抗原,以胶体金为示踪剂标记抗体,制备了检测AFB1的胶体金免疫层析试纸条,试纸条的检测限为200 ng/ml。本课题所制备的试纸条作为一种快速筛查的手段,既可节省检测成本,又可使广大基层单位开展AFT的检测和监控工作,具有重要的经济价值,对AFT免疫检测方法的研究具有一定的推进作用。
胶体金免疫层析检测方法虽没有传统的ELISA检测法的灵敏性高,但胶体金试纸条检测速度快、灵敏性特异性相对较好,且与其他毒素无交叉反应,携带方便,适用于现场大批量的检测,是极具发展前景的一种检测方法,此方法在快速诊断中将有着广阔的应用前景。
作者声明
本文无实际或潜在的利益冲突
摘要：目的 制备黄曲霉毒素B1胶体金免疫层析试纸条。方法 用柠檬酸三钠还原法制备胶体金溶胶,用目测法、紫外可见分光光度法及精密p H试纸对其进行鉴定表征;并采用碳二亚氨法(EDC)将黄曲霉毒素B1(AFB1)偶联于载体蛋白卵血清蛋白(OVA)上,合成包被抗原AFB1-OVA。通过目测法及紫外-可见分光光度法优化标记胶体金的最佳黄曲霉毒素B1单克隆抗体浓度和pH,最后将包被有抗原AFB1-OVA和羊抗鼠Ig G的硝酸纤维素膜和干燥的吸附有金标抗体的玻璃纤维膜组装成试纸条,初步利用竞争性免疫层析原理检测标准品黄曲霉毒素B1。结果 制备的胶体金澄清透亮,呈酒红色,无聚集现象,最大吸收波长为518 nm,呈酸性(p H=5.8)。OVA与AFB1偶联后,偶联物紫外扫描吸收光谱与OVA及AFB1吸收光谱有明显区别,说明有新物质生成。进一步用新合成的AFB1-OVA组装试纸条,检测阴性样品,两线均显深红色,为阴性结果,表明合成的人工抗原成功;胶体金标记黄曲霉毒素B1单克隆抗体最适标记p H为1 ml胶体金溶液中添加0.1 mol/L K2CO3量为20μl,最适蛋白浓度为13μg/ml;初步组装试纸条并检测一定浓度的AFB1标准品,结果表明,试纸条的检测限为200 ng/ml。结论 制备的胶体金符合试纸条所用胶体金的要求;并成功制备AFB1胶体金免疫层析法测定试纸条,但尚须进一步优化条件以提高试纸条的检测性能。
免疫胶体金层析诊断 篇8
胶体金免疫层析技术(Gold immunochromatographic assay,GICA)是近年来发展迅速的一项免疫标记技术,它以抗原抗体特异性结合为基础、大孔径微孔滤膜为载体、胶体金为固相标记物来定性检测样本中的待测物质[6]。因其快速、便捷,因此继抗生素微生物检测法[7,8]、理化分析法(高效液相色谱法[1,9]、液质联用法[10,11]、气相色谱法[12]、分光光度法[13]等)和免疫测定法(酶联免疫法[14]、放射免疫法[15]等)后,GICA分析法逐渐被广泛应用于牛奶中抗生素残留检测中[6,16,17]。本试验利用胶体金免疫层析法对牛奶中的磺胺类药物残留进行检测,为磺胺类药物的残留监控提供依据。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
(1)市售牛奶、磺胺类药物快速检测试纸(北京勤邦生物技术有限公司)其中包括微孔试剂和试纸条、磺胺类药物标准品(美国Sigma公司)纯度≥99%。(2)微量移液器(单道20~200μl、100~1000μl、多道50~300μl美国Thermo公司)、Acquity液相色谱串联质谱仪配有电喷雾离子源(美国Waters公司)。
1.2 方法
1.2.1 样品前处理
使用前将待检奶样恢复至室温。(注:牛奶样品必须为均匀液体,不能有结块、发酸和沉淀)。
1.2.2 检测步骤
将原包装预先平衡至室温,打开后取出所需数目的微孔试剂和试纸条,并做好标记;用微量移液器吸取200μl待检牛奶样品溶液于微孔中,缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀;将标记好的试纸条插入微孔中印有“MAX”线端朝下,使之充分浸入溶液中;室温(20~25℃)孵育5min后,取出试纸条,判定结果。
1.2.3 结果判断
阴性(-):C线和T线都显色,无论颜色深浅,均表示牛奶样品中磺胺类药物浓度低于检测限。阳性(+):C线显色,T线不显色,表示牛奶样品中磺胺类药物浓度高于或等于检测限。无效:未出现C线,表明不正确的操作过程或试纸条已变质失效。在此情况下,应用新的试纸重新测试。
2 结果与分析
2.1 灵敏度试验
采用样品前处理方法,在空白样品中分别添加磺胺类药物标准品至一定的终浓度,然后取三批试纸条进行检测,每批测定5个重复,结果见表1,部分实验结果见图1。
由表1可知,磺胺类药物快速检测试纸条测定牛奶中磺胺类药物残留的检测限分别为:磺胺嘧啶60μg/L、磺胺二甲基嘧啶20μg/L、磺胺喹噁啉80μg/L、磺胺氯哒嗪30μg/L、磺胺间二甲氧嘧啶50μg/L、磺胺间甲氧嘧啶50μg/L、磺胺甲噁唑80μg/L、磺胺苯酰50μg/L、磺胺对甲氧嘧啶30μg/L、磺胺异噁唑10μg/L、磺胺甲氧哒嗪70μg/L、磺胺多辛70μg/L。
(从左到右:磺胺嘧啶添加浓度依次为0、30、60、120μg/L)
2.2 假阳性率试验
用3个批次的磺胺类药物胶体金试纸条对50份阴性牛奶样品进行检测,结果见表2。该50份阴性牛奶样品中有1份为阳性,其余全为阴性,假阳性率为2%。
2.3 假阴性率试验
用3个批次的磺胺类药物胶体金试纸条对50份分别添加磺胺嘧啶至浓度60μg/L,磺胺二甲基嘧啶至浓度20μg/L,磺胺喹噁啉、磺胺甲噁唑至浓度80μg/L,磺胺氯哒嗪、磺胺对甲氧嘧啶至浓度30μg/L,磺胺间二甲氧嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶、磺胺苯酰至浓度50μg/L,磺胺异噁唑至浓度10μg/L、磺胺甲氧哒嗪、磺胺多辛至浓度70μg/L的阳性牛奶样品进行检测,结果见表2。该50份阳性牛奶样品的检测结果均为阳性,假阴性率为0。
2.4 特异性试验
将恩诺沙星、诺氟沙星、氧氟沙星、氯霉素、卡那霉素、庆大霉素、四环素、金霉素、土霉素、强力霉素溶于p H7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液,配成浓度为500μg/L的溶液,用试纸条进行检测。结果发现,C线和T线均显色,显示阴性结果,表明本试纸条对其他抗生素无交叉反应,具有较好的特异性。
2.5 与仪器方法比较
随机抽取50份牛奶样本,用试纸条方法和国标方法《GB/T 21316—2007动物源性食品中磺胺类药物残留量的测定液相色谱-质谱/质谱法》分别进行检测。结果筛选出3份阳性样本,试纸条结果均为C线显示出红色条带,T线不显色;仪器结果分别为105.2μg/L、180.7μg/L和110.3μg/L。可见,GICA法和LC-MS/MS法测定结果基本一致,符合度达到100%,适用于牛奶样本中磺胺类药物残留的检测。
3 结论
本研究采用胶体金免疫层析法对牛奶中的磺胺类药物残留进行检测,检测限分别为磺胺嘧啶60μg/L、磺胺二甲基嘧啶20μg/L、磺胺喹噁啉80μg/L、磺胺氯哒嗪30μg/L、磺胺间二甲氧嘧啶50μg/L、磺胺间甲氧嘧啶50μg/L、磺胺甲噁唑80μg/L、磺胺苯酰50μg/L、磺胺对甲氧嘧啶30μg/L、磺胺异噁唑10μg/L、磺胺甲氧哒嗪70μg/L、磺胺多辛70μg/L,检测阴、阳性样本时,假阳性率为2%,假阴性率为0;对其他抗生素无交叉反应,特异性较好;与液相色谱-质谱/质谱法相比,检测结果一致,符合度达到100%。
本研究所使用的胶体金试纸条是在传统的试纸条基础上进行了改进。将胶体金标记的抗体直接冻干在微孔试剂中,在检测过程中,能够使金标抗体与待检样品液充分接触,充分反应,从而减少误差,增加整个体系的反应灵敏度,易于对样品中的药物残留情况进行分析;同时,摈弃了传统试纸条的塑料卡壳,仅以“裸条”形式装于试剂桶中,节约空间,减少生产和运输成本。尽管结构的改进提高了试纸条的灵敏度,但由于通过颜色判断结果比较主观,可能出现假阳性问题,因此对于阳性样本,还需要用LC-MS/MS等仪器方法进行确证。
摘要：应用胶体金免疫层析法对牛奶中的磺胺类药物残留进行检测,研究该方法的灵敏度、假阳性率、假阴性率及特异性。结果表明,用胶体金免疫层析法测定牛奶中的磺胺类药物,检测限分别为磺胺嘧啶60μg/L、磺胺二甲基嘧啶20μg/L、磺胺喹噁啉80μg/L、磺胺氯哒嗪30μg/L、磺胺间二甲氧嘧啶50μg/L、磺胺间甲氧嘧啶50μg/L、磺胺甲噁唑80μg/L、磺胺苯酰50μg/L、磺胺对甲氧嘧啶30μg/L、磺胺异噁唑10μg/L、磺胺甲氧哒嗪70μg/L、磺胺多辛70μg/L,假阳性率为2%,假阴性率为0;方法的特异性较好,对其他抗生素无交叉反应;检测实际样本的结果与液相色谱-质谱/质谱法基本一致。可见,该方法简便、快速、准确、稳定,适用于牛奶中磺胺类药物残留的现场快速检测。