胶体金免疫层析试纸（精选7篇）
胶体金免疫层析试纸 篇1
摘要：为了制备检测犬瘟热病毒 (CDV) 和犬细小病毒 (CPV) 复合型胶体金免疫层析试纸, 试验采用辛酸-硫酸铵法纯化获得的单克隆抗体样品, 采用一膜包被2个抗体的方法, 用混合后的金标记抗貉源细小病毒VP2单克隆抗体和胶体金标记抗水貂源犬瘟热病毒单克隆抗体作为示踪物, 建立了CPV和CDV感染快速鉴别诊断试纸条。结果表明:本方法特异性强, 灵敏度高, 且操作简便、结果判定直观, 可以用于貉、貂、狐等毛皮动物CPV和CDV感染的检测与鉴别诊断。
关键词：犬瘟热病毒,犬细小病毒,重组蛋白VP2,单克隆抗体
犬瘟热是由犬瘟热病毒 (CDV) 引起的犬和肉食目中许多动物的一种高度接触传染性疾病, 以早期表现双相热、急性鼻卡他、支气管炎、卡他性肺炎、严重的胃肠炎和神经症状为特征, 少数病犬的鼻和足垫可发生角化过度。犬细小病毒感染是由犬细小病毒 (CPV) 引起的犬类动物的一种急性传染病, 特征为出血性肠炎或非化脓性心肌炎[1,2]。这类传染病常引起大批貉、貂和狐狸等动物发病[3], 除此之外, CDV、CPV还能感染多种野生肉食动物并导致其死亡。随着我国貉、貂和狐狸等毛皮动物饲养量的大幅度增加及异地交流的增多, 这两种传染病在我国毛皮动物中的发病率和致死率均有升高的趋势, 而且临床表现也与以往有所不同。目前, 这两种传染病是对我国毛皮动物养殖业危害最大的疫病, 受到了广泛的重视。免疫胶体金技术以其简便快速、特异性强、敏感性高、肉眼可判读结果、结果易保存、无需特殊仪器 (设备) 和试剂等优点, 已经被广泛应用于兽医临床疾病诊断和医学检验中[4,5]。本试验的研究目的是利用胶体金免疫层析技术独特的临床应用特点, 研制出一种快速、特异、灵敏、准确、安全、方便、经济的试纸条来诊断毛皮动物犬瘟热病毒和犬细小病毒感染。本试验的研究成果可以为基层兽医快速、准确诊断犬瘟热和犬细小病毒病提供有效工具。
1 材料与方法
1.1 单克隆抗体
抗貉源细小病毒VP2蛋白单克隆抗体 (2B3) 和抗水貂源犬瘟热病毒单克隆抗体 (1C6) , 河北省预防兽医重点实验室制备;兔抗鼠IgG (2 mg/mL) , 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。
1.2 主要试剂及耗材
硝酸纤维素膜、玻璃纤维素膜、样品垫、吸收垫、塑料底板, 购自MILLIPORE公司;BSA, Promega公司产品;氯金酸 (HAuCl4·4H2O) , 上海生工生物工程技术服务有限公司产品;胶体金, 河北省预防兽医重点实验室制备。
1.3 胶体金的制备
采用柠檬酸三钠还原法来制备胶体金, 具体操作方法为:用容量瓶量取100 mL的三蒸去离子水, 倒入500.0 mL的平底烧瓶中, 将烧瓶放在磁力加热搅拌器的加热套内, 放入磁力搅拌子, 打开搅拌旋钮 (调至适当速度) , 打开加热旋钮, 加热至沸腾;加入1.0 mL 1% HAuCl4溶液, 继续加热2 min;加入1.8 mL 1%柠檬酸三钠溶液, 继续加热 (浅黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后2 min内逐渐由黄色变为灰色, 再变为黑色, 最后变为红色或橙红色) ;待溶液变为亮红色或橙红色后, 再继续加热搅拌15 min;关掉加热旋钮, 自然冷却至室温。
1.4 胶体金的鉴定
用紫外-可见光分光光度计对制备好的胶体金溶液在紫外-可见光范围内进行扫描, 获得胶体金吸收光谱, 测定最大吸收波长、吸光度值。同时在透射电镜下观察胶体金颗粒的大小是否均匀一致, 有无椭圆形及多角形。
1.5 犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体 (2B3) 的标记条件
1.5.1 单克隆抗体 (2B3) 的最适标记胶体金pH值
取一系列小试管, 分别加入5 mL胶体金, 用0.1 mol/L K2CO3调节胶体金的pH值 (分别调为6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5, 9.0, 9.5, 10.0) ;然后在每种不同pH值的胶体金中分别加入1.0 mg/mL的单克隆抗体 (2B3) 100.0 μL, 用封口膜封闭试管口, 静置15 min;4 ℃、2 000 r/min离心10 min;取上清液用紫外-可见光分光光度计在可见光范围内 (400～600 nm) 进行扫描, 获得胶体金可见光吸收光谱, 测定最大吸收波长、吸光度值。以出现最大吸收峰时对应的胶体金pH值为最佳标记pH值。
1.5.2 单克隆抗体 (2B3) 最适标记量的确定
取一系列小试管, 分别加入5 mL胶体金, 用0.1 mol/L K2CO3调节胶体金至最适pH值, 分别加入不同体积 (20～50 μL) 的1.0 mg/mL单克隆抗体 (2B3) , 充分混匀;静置5 min后每管分别加入10%NaCl 1.0 mL, 摇匀;静止10 min后于4 ℃、2 000 r/min离心10 min。取上清液用紫外-可见光分光光度计在可见光范围内 ( 400～600 nm) 进行扫描, 获得胶体金可见光吸收光谱, 测定最大吸收波长、吸光度值。以出现最大吸收峰时对应的蛋白质用量为最小保护剂量, 在此基础上再加20%为稳定胶体金的抗体蛋白实际用量。
1.6 犬瘟热病毒单克隆抗体 (1C6) 的标记条件
按1.5所述方法确定犬瘟热病毒单克隆抗体 (1C6) 胶体金标记的最佳pH值、最适标记量等。
1.7 金标单克隆抗体复合物的制备与纯化
于50.0 mL的小烧杯中加入20.0 mL的胶体金, 调pH值至最佳标记pH值, 在搅拌的状态下缓慢加入一定量稀释好的1 mg/mL单克隆抗体, 搅拌30 min;加入10% BSA至终浓度为1%, 继续搅拌30 min;4 ℃放置2 h;将上述胶体金标记物分装于7.0 mL的离心管中, 以2 000 r/min离心15 min;吸出上清液, 以8 700 r/min离心45 min;弃去上清液, 加入标记洗涤液至原体积;再次以10 000 r/min离心30 min;弃去上清液, 加入标记洗涤液至原体积, 以10 000 r/min离心30 min;弃去上清液, 沉淀用1.00 mL标记洗涤液重悬, 置4 ℃冰箱, 备用。
1.8 犬细小病毒和犬瘟热病毒免疫层析快速检测试纸条的建立
试验采用侧向横流形式, 建立检测犬细小病毒和犬瘟热病毒胶体金免疫层析试纸条, 采用双抗夹心法以胶体金免疫层析试纸条检测病毒抗原, 见164页彩图1。
1.8.1 硝酸纤维素膜
选用Millipore HF135, 根据说明书进行操作, 膜的流速为 (135±34) s/cm, 孔径大约为0.45 μm, 分别以金标记抗犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体 (2B3) 及犬瘟热病毒单克隆抗体 (1C6) 作为检测试剂。先将抗犬细小病毒单克隆抗体和抗犬瘟热病毒单克隆抗体用包被缓冲液稀释后, 分别包被于硝酸纤维素膜Millipore HF135上, 于37 ℃温箱烘干, 备用。同时将金标记抗犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体 (2B3) 和犬瘟热病毒单克隆抗体 (1C6) 稀释后, 涂覆于金标垫, 37 ℃烘干、备用, 将样品垫、金标垫、硝酸纤维素膜、吸收垫依次黏附于背衬上组装成试纸条, 观察结果。
1.8.2 包被液和封闭液
根据他人研究结果选用含6%甲醇的0.01 mol/L PBS缓冲液 (pH值为7.2) 为包被缓冲液, 0.22 μm微孔滤膜过滤, 置4 ℃保存, 备用, 有效期为1周。封闭液采用2% BSA、1%吐温20、0.5%聚乙烯毗咯烷酮K30 (PVP K30) 、2.5%蔗糖、0.02% NaN3、0.01 mol/L PBS溶液 (pH值为7.4) , 0.22 μm微孔滤膜过滤, 置4 ℃保存, 备用。
1.8.3 CPV和CDV快速鉴别诊断试纸条的构建
如图1所示, 硝酸纤维素膜上包被有抗犬瘟热病毒单克隆抗体、抗犬细小病毒单克隆抗体和兔抗鼠IgG, 分别作为检测线1 (T1) 、检测线2 ( T2) 和质控线 (C) , 金标垫上涂覆有固态化的金标抗CPV VP2单克隆抗体和金标抗CDV单克隆抗体混合物作为示踪物。
向样品垫滴加样品后, 样品在毛细管作用下向前泳动, 当泳动至金标垫时, 固态化的金标抗CPV VP2单克隆抗体和金标抗CDV单克隆抗体迅速溶解释放, 一起向前泳动至T线, 若样品中同时含有CPV和CDV, 金标抗CDV单克隆抗体、CDV复合物与包被于硝酸纤维素膜上的抗犬瘟热病毒单克隆抗体 (T1) 形成金标抗CDV单克隆抗体-CDV-抗犬瘟热病毒单克隆抗体复合物而被截获, 金标抗CPV VP2单克隆抗体与CPV复合物与包被于硝酸纤维素膜上的犬抗犬细小病毒单克隆抗体 (T2) 形成金标抗CPV VP2单克隆抗体-CPV-抗犬细小病毒单克隆抗体复合物而被截获, 余下的金标抗体继续向前移动, 在C线形成红色条带, 判为CPV和CDV双阳性;若样品中只含有CDV, 则会在T1线及C线形成红色条带, 判为CDV阳性;若样品中只含有CPV, 则会在T2线及C线形成红色条带, 判为CPV阳性;反之, 若样品中既不含有CDV也不含有CPV, 金标抗CDV单克隆抗体和金标抗CPV VP2单克隆抗体与包被于硝酸纤维素膜上的犬抗犬瘟热病毒单克隆抗体和犬抗犬细小病毒单克隆抗体不能形成免疫复合物, 而穿过T线被C线截获, 形成红色条带, 判为阴性反应;若C线未出现, 则表明试纸条已失效。
1.8.4 各种生物材料最佳浓度的选择
根据上述构建的试纸条反应模式, 本研究对所选用的生物材料进行一系列的稀释后, 组装试纸条, 用于检测已知CPV和CDV, 以确定最佳反应条件。
1.8.5 试纸条特异性试验和敏感性试验
用制备的试纸条对已知的CDV、CPV等病毒进行特异性交叉试验, 同时设阴性对照。
用PBS对已知的CPV或CDV作倍比稀释, 分别用试纸条检测, 进行敏感性试验。
1.8.6 稳定性试验
制备的检测试纸条在37 ℃恒温培养箱中放置7 d, 与放置4 ℃冰箱中的试纸条重复检测已知的CDV、CPV样品, 再与新制备的试纸条比较观察有无差别。
1.9 免疫层析试纸条的初步应用
收集疑似犬瘟热的狐狸、貉、貂的眼泪、鼻拭子, 死亡病犬的脏器, 疑似犬细小病毒感染的狐狸、貉、貂粪便各120份用免疫层析试纸条进行检测, 各有阴性样品作为对照。
疑似患犬瘟热的狐狸、貉、貂的病料如眼泪 (鼻拭子) 和死亡的病犬脏器等样品每份取约0.5 g (mL) , 加生理盐水约0.5 mL, 制成混悬液;疑似患犬细小病毒感染的狐狸、貉、貂的粪便每份取约0.5 g, 加生理盐水约0.5 mL, 充分摇动后静置5 min (或离心) 。各取上清液滴在试纸条上, 5～10 min观察结果:在对照线处呈现1条红线为阴性, 在CDV处出现红线为CDV阳性, 在CPV处出现红线为CPV阳性, 在CDV处和CPV处均出现红线为CDV和CPV双阳性。
2 结果
2.1 胶体金的制备结果
本研究制备的胶体金通过肉眼观察, 结合紫外-可见分光光度计扫描和电镜照片比较, 对制备的胶体金进行鉴定, 最后确定外观呈清亮、透明的橙红色, 用紫外-可见分光光度计扫描其最大波长为522 nm。通过电镜观察可知, 颗粒大小均匀, 平均直径为18.5 nm的胶体金为最适合的胶体金。
2.2 单克隆抗体2B3和1C6胶体金标记的最佳pH值、最适标记量
犬细小病毒VP2蛋白单克隆抗体2B3的最适标记pH值为8.0, 当1 mL胶体金中单克隆抗体添加量为10 μg时, 对应的吸收峰最大, 在此基础上再加20%, 即最适标记量为12 μg/mL胶体金。由于都是鼠源单克隆抗体, 犬瘟热病毒单克隆抗体1C6胶体金标记的最佳pH值、最适标记量与单克隆抗体2B3相同。
2.3 各种生物材料最佳浓度的选择
2.3.1 CPV快速检测试纸条最佳生物材料浓度的选择
用构建好的试纸条, 对pH值为7.4的PBS和CPV样品进行检测, 结果表明, 当包被在硝酸纤维素膜上的抗CPV 单克隆抗体浓度为1.0 mg/mL, 兔抗鼠IgG浓度为0.5 mg/mL, 喷涂在金标垫上的胶体金标记抗CPV VP2单克隆抗体作5倍稀释, 涂覆量为5 μL/cm时结果最佳。
2.3.2 CDV快速检测试纸条最佳生物材料浓度的选择
用构建好的试纸条, 对pH值为7.4的PBS和CDV样品进行检测, 结果表明, 当包被在硝酸纤维素膜上的抗CDV 单克隆抗体浓度为1.5 mg/mL, 兔抗鼠IgG浓度为0.5 mg/mL, 喷涂在金标垫上的胶体金标记抗CDV单克隆抗体作5倍稀释, 涂覆量为5 μL/cm时结果最佳。
2.3.3 CPV和CDV快速鉴别诊断试纸条最佳生物材料浓度的选择
用构建好的试纸条, 对CPV样品和CDV样品进行检测, 结果表明, 当包被在硝酸纤维素膜上的抗CDV 单克隆抗体浓度为1.5 mg/mL, 抗CPV 单克隆抗体浓度为1.0 mg/mL, 兔抗鼠IgG浓度为0.5 mg/mL, 喷涂在金标垫上的胶体金标记抗CPV VP2单克隆抗体和胶体金标记抗CDV单克隆抗体作5倍稀释, 涂覆量为50 μL/cm时结果最佳。
2.3.4 CPV和CDV快速鉴别诊断试纸条的特异性试验结果
当样品中同时含有CPV和CDV时, 2条检测线 (T1和T2) 均呈阳性反应, 而当样品中只含有CPV或CDV时, 则只在对应的1条检测线上 (T1或T2) 呈现阳性反应, 阴性对照 (无T1和T2出现) 及其他犬类病毒均呈阴性反应, 重复5次后结果相同, 说明该方法具有高度的特异性。另外, 若C线未出现, 则表明试纸条无效, 见164页彩图2。
2.3.5 CPV快速检测试纸条的敏感性试验结果
用PBS对CPV (TCID50为9.4×105) 作倍比稀释, 分别用试纸条检测, 稀释至1∶512时试纸条仍呈阳性反应。
2.3.6 CDV快速检测试纸条的敏感性试验结果
用PBS 对CDV (TCID50为9.0×105) 作倍比稀释, 分别用试纸条检测, 当倍比稀释至1∶512时, 试纸条仍呈弱阳性反应。
2.3.7 快速检测试纸条的稳定性试验结果
将试纸条置37 ℃恒温培养箱中7 d, 与放置4 ℃冰箱中的试纸条做比较, 强阳性结果与弱阳性结果无明显差别, 与新制备试纸条测试结果完全相同。
2.4 初步应用结果
犬瘟热的检测结果:120份被检疑似患犬瘟热的狐狸、貉、貂的眼泪 (鼻拭子) 和死亡病犬的脏器等样品中, 经ELISA检测阳性为47份, 阴性为73份, 试纸条检测阳性为49份, 阴性为71份。结果见表1。
细小病毒性肠炎检测结果:在120份疑似患细小病毒病的狐狸、貉、貂的粪便中, HA检测阳性为50份, 阴性为70份;试纸条检测阳性为53份, 阴性为67份。结果见表2。
由表1和表2可见, 犬瘟热和细小病毒病检测符合率都比较高。
3 讨论
我国貉、貂、狐狸等毛皮动物饲养业发展迅速, 已成为畜牧业的重要组成部分。但随着集约化、规模化饲养的发展, 传染病在不断爆发流行, 发病率居高不下, 其中貉、貂、狐狸等毛皮动物犬瘟热、细小病毒性肠炎占主导地位, 是当前危害貉、貂、狐狸等毛皮动物饲养最主要的传染病。目前, 国内对貉、貂、狐狸等CDV、CPV 的检测研究相对集中于RT-PCR 和核酸探针的制备和应用[6,7], 但这些检测必须依赖于实验室设备, 不能满足现场检测的需求。因此, 为保证貉、貂、狐狸等毛皮动物饲养业的健康发展, 研制针对貉、貂、狐狸等毛皮动物犬瘟热、细小病毒性肠炎快速、准确的检测方法显得尤为迫切。
基于上述现状, 本研究通过杂交瘤技术获得了2 株高效价的抗貉源CPV和抗水貂源CDV 的单克隆抗体, 对单克隆抗体腹水纯化后进行金标记并制成胶体金检测试纸条, 经实验室初步检查, 该检测试纸条能够很好地将CDV、CPV 与貉、貂、狐狸等毛皮动物其他病毒有效区分, 具备了较好的检测特异性, 但检测灵敏度仍需进一步优化。在研制的免疫金检测CDV、CPV试纸条条件的摸索中, 柠檬酸三钠还原氯金酸形成胶体金颗粒大小和均一性直接关系到试纸的检测效果, 而烧制大小均一的金颗粒与溶液pH值[8]、反应物浓度、反应物混合方式、加入顺序、反应温度、反应器材质、器皿洁净程度等密切相关。另外, 以初步纯化的病毒作为待检抗原, 此检测原的成分相对于最终需检测的样品 (鼻腔、口腔和眼结膜分泌物等) 所含杂质要少, 以此作为抗原摸索的各种条件, 能否很好地反映并适用于临床样品的检测特性需要进一步地验证和摸索。胶体金免疫层析技术应用于动物病毒的检测, 要进一步提高敏感性、特异性, 实现定量、半定量检测及一卡对两种或多种病原的检测, 这是未来动物性病毒检测的一个发展方向。敏感性和特异性的提高可以从采用信号放大系统或采用一些新标记物实现;而半定量检测可通过复合多条不同灵敏度层析条的方式和观察各层析条的显色情况, 将待测物含量确定于某一浓度区间, 从而实现半定量检测。一卡多元化的检测可以用一膜包被多元抗体带的方法实现, 如李蓓蓓等[9]制备了检测新城疫病毒和禽流感病毒的复合型免疫层析检测试纸条, 在10 min内可以同时检测出新城疫病毒和禽流感病毒这两种致禽发病的重要病毒。
本研究以采用一膜包被2个抗体的方法, 用混合后的金标记抗CPV VP2单克隆抗体和胶体金标记抗CDV 单克隆抗体作为示踪物, 建立了CPV和CDV快速鉴别诊断试纸条, 结果表明其可以用于CPV和CDV的检测与鉴别诊断, 为临床上对CPV和CDV的快速、有效检测与鉴别诊断奠定了基础。
参考文献
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胶体金免疫层析试纸 篇2
关键词：莴苣花叶病毒,胶体金免疫层析法,免疫试纸条
莴苣 (Lactuca sativa) , 为菊科莴苣属植物, 是一种常见的食用蔬菜, 可分为叶用和茎用两类, 中国南北各地以茎用莴苣 (莴笋) 栽培为主, 近年来叶用莴苣在北京及沿海一些城市发展迅速。莴苣花叶病毒 (Lettuce mosaic virus, LMV) 在世界莴苣产区广泛分布, 是危害莴苣的主要病毒, 曾给一些国家的莴苣生产造成严重损失。该病毒为马铃薯Y病毒属 (Potyvirus) 成员, 病毒粒体呈弯曲线状, 大小为750nm×13nm, 核酸为单分子正义RNA。其自然寄主有莴苣、苣荬菜 (Sonchus brachyotus) 、豌豆 (Pisum sativum L.) 、鹰嘴豆 (Cicer arietinum) 、野芥 (Sinapis arvensis L.) 、菠菜 (Spinacia oleracea L.) 、红花 (Carthamus tinctorius L.) 、蓝眼菊属 (Osteospermum spp.) 、勋章菊属 (Gazania spp.) 、柴胡 (Bupleurum falcatum) 和耳叶金鸡菊 (Coreopsis auriculata) 等[1,2,3]。LMV可通过汁液接种、蚜虫和种子等途径传播。国内外对其生物学特性[4,5,6]、血清学关系、抗病性和分子生物学等方面进行了研究[7,8,9,10]。
病毒的检测是病毒病防控的关键点, 虽然ELISA[11]及RT-PCR[12]等方法均可用于对LMV的检测, 但在大田生产上胶体金免疫层析试纸条因具有检测快速、准确和便捷等优点, 受到广泛关注, 美国Agdia公司、瑞士Bioreba公司已出售多种检测植物病毒的试纸条。该文通过病毒的提纯、抗血清的制备和胶体金试纸条的制作及测试, 以期建立LMV病毒的快速检测方法, 用于田间病害的诊断。
1 材料与方法
1.1 材料
供试的病毒毒原为LMV-PV-63分离物, 引自美国ATCC, LMV-PV-0799、LMV-PV-0901分离物引自德国DSMZ, 保存在昆诺阿藜 (Chenopodium quinoa) 上。供试马铃薯X病毒 (Potato virus X, PVX) 、马铃薯Y病毒 (Potato virus Y, PVY) 、马铃薯A病毒 (Potato virus A, PVA) 、葡萄A病毒 (Grapevine virus A, GVA) 、齿兰环斑病毒 (Odontoglossum ringspot virus, ORSV) 、黄瓜绿斑驳花叶病毒 (Cucumber green mottle mosaic virus, CGMMV) 、葡萄扇叶病毒 (Grapevine fanleaf virus, GFLV) 和烟草环斑病毒 (Tobacco ringspot virus, TRSV) 为中国检验检疫科学研究院植物检疫研究所收集的毒原。主要试剂和设备为羊抗兔抗体 (军事医学科学院微生物流行病研究所) 、碱性磷酸酯酶标记的山羊抗兔抗体 (中杉金桥公司) 、LMV双抗体夹心酶联诊断试剂盒 (美国Agdia公司) 、层析膜 (Whatman公司的Immunopore RP膜) 、Beckman Coulter Avanti J-26XPI高速离心机、Beckman Coulter Optima L-100XP超速离心机、JEM-1400透射电子显微镜, BioDot XYZ 3050三维喷点平台和BioDot CM4000切条机。
1.2 方法
1.2.1 病毒的提纯
LMV-ATCC-PV63在昆诺阿藜上繁殖, 作病毒提纯用, 提纯方法参照文献[13]。
1.2.2 多克隆抗体的制备和效价测定
免疫用的实验动物为新西兰白兔。提纯病毒和弗氏完全佐剂乳化后, 后腿肌肉注射1次, 其后病毒和弗氏不完全佐剂乳化后, 后腿肌肉注射4次, 每次注射间隔期为10d, 末次注射10d后采血。用间接ELISA方法测定抗血清的效价, 抗血清用1 mL HiTrap Protein G (GE公司) 柱纯化获得IgG。
1.2.3试纸条的检测和结果判定
试纸条的制作参照文献[14]。取出试纸条将具有胶体金复合物端插入300~400μL离心后的检测样品中, 10min左右判断结果。若试纸条仅质控C线出现紫红色线而检测T线未显色, 结果为阴性;若试纸条上C线和T线均出现紫红色, 结果为阳性;若试纸条C线和T线都没有显色, 则说明此试纸条已经失效, 结果无效。
2 结果与分析
2.1 病毒提纯结果
提纯的LMV经紫外测定, 呈典型的核蛋白吸收曲线 (见图1) , OD260=3.851, OD280=2.206, OD260/OD280=1.75。100g病叶提纯后可获得1.5mg病毒, 提纯的病毒用2%醋酸双氧铀负染后在透射电子显微镜观察到长度约750nm的弯曲线状病毒粒体 (见图2) 。
2.2 抗血清的效价
LMV抗血清用间接ELISA测定, 检测提纯病毒 (浓度3μg·mL-1) 的效价高达1/512 000, 检测昆诺阿藜病汁液 (稀释10倍) 效价为1/128 000, 健康昆诺阿藜 (稀释10倍) 的本底反应低 (见表1) 。
2.3 试纸条检测灵敏度
试纸条检测提纯LMV灵敏度可达1μg·mL-1 (见图3) , 缓冲液对照T线未显色;检测昆诺阿藜病汁液可稀释1 000倍 (W/V) , 健康对照T线未显紫红色, 有叶绿素吸附 (见图4) 。
从左至右分别为:提纯的病毒 (10、1、0.1、0.01、0.001μg·mL-1) , 缓冲液对照。From left to right show purified LMV (10, 1, 0.1, 0.01, 0.001μg·mL-1) and Buffer (CK) .
从左至右分别为:昆诺阿藜健康汁液 (10-1) , 昆诺阿藜病汁液 (10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6) 。From left to right show Healthy C.quinoa (10-1) , LMV infected C.quinoa (10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6) .
2.4 试纸条特异性测试
用莴苣花叶病毒试纸条检测LMV的3个分离物 (PV-63、PV-0907、PV-0799) , C线和T线均出现紫红色, 结果呈阳性反应 (见图5) 。
用莴苣花叶病毒试纸条检测其它8种病毒, C线均出现紫红色的线, 检测T线未出现紫红色, 检测结果为阴性, 但其中6种病毒 (PVY、PVA、GVA、CGMMV、GFLV、TRSV) 的T线上出现不同程度的叶绿素非特异性吸附 (见图6) 。
从左至右分别为:LMV-PV-63、LMV-PV-0907、LMV-PV-0799。From left to right show LMV-PV-63, LMV-PV-0907, LMV-PV-0799.
从左至右分别为:PVX、PVY、PVA、GVA、ORSV、CGMMV、GFLV、TRSV。From left to right show PVX, PVY, PVA, GVA, ORSV, CGMMV, GFLV, TRSV.
2.5 田间采集样品的测试
从田间采集来的莴苣叶片30份, 按1∶10 (W/V) 稀释, 用试纸条进行测试, 结果2份为阳性, 28份为阴性, 经ELISA方法确认, 两者结果相符。
3 结论与讨论
研究所制作的LMV胶体金免疫层析试纸条检测提纯病毒的灵敏度可达1μg·mL-1, 检测病汁液可稀释1 000倍, 试纸条可特异性检测到LMV的3个分离物, 与PVX等8种其它病毒无交叉反应。
病毒的提纯和高质量抗血清制备是成功制作胶体金试纸条的前提, 课题组制作的试纸条有时T线上会出现叶绿素吸附的绿色线, 在结果判断时要引起注意, 为避免误判, 必要时可用其它方法对结果加以验证。出现的植物体内色素的非特异性吸附问题, 今后可通过对试纸条制作的工艺或样品的前处理加以改进, 以消除叶绿素等对检测结果的影响。
胶体金免疫层析试纸 篇3
胶体金免疫层析技术分析
所谓的胶体金, 其实就是氯金酸溶液在还原剂的作用下, 聚合成特定大小的金颗粒, 并且在静电作用下生成稳定胶体溶液。这些金颗粒具有较高的电子密度, 聚集成一定密度后就会以肉眼可见的粉红色斑点形式出现, 可以用作免疫层析试验的指示物。
在应用胶体金免疫层析技术时, 需要将特异性抗原或抗体固定在膜上, 利用毛细作用使样品在层析条上游动, 从而使其与受体发生免疫反应。而在这一过程中, 免疫复合物将被截留在检测带内, 所以能得到直观的试验结果。
在食品检测中, 利用该技术能够完成蛋白质、药物、毒素和病菌等多种物质的检测, 并且具有成本低、反应快和低交叉反应性的优势。
胶体金免疫层析技术在食品检测中的运用
食品安全事件出现, 往往会给社会带来巨大经济损失。所以, 近几年相关行业加快了食品检测技术的研究, 以期利用更先进的技术完成食品的有效检测。而胶体金免疫层析技术具有成本低、反应快和低交叉反应性的优点, 因此, 有必要对该技术在食品检测中的问题展开分析, 从而更好地促进食品检测技术发展。
在食品质量检测中的运用
从组成成分来看, 食品中含有蛋白质、水分、糖类、维生素和脂肪等物质。其中, 大部分都属于有机高分子物质, 可以使用胶体金免疫层析技术进行检测。在检测过程中, 一般会进行食品的半定量分析, 从而实现对食品成分的快速检测。例如, 奶牛分娩后最初几天分泌的乳汁为牛初乳, 含有大量非营养性功能组分, 保健价值提高。而在牛初乳中, Ig G含量与生物活性物质含量呈正相关关系, 所以可以使用胶体金进行标准牛Ig G的标记, 然后将其当成竞争抗原。通过将市面上牛乳样品中的Ig G和标记的标准牛Ig G相比, 就可以反映样品质量。
在食品安全检测中的运用
1在农兽药残留检测中的运用
使用胶体金免疫层析技术, 可以对食品中的农药、兽药和其他生物毒素残留进行检测。例如, 使用胶体金标记的抗氟喹诺酮类抗体进行胶体金制备, 就可以对牛奶中的11种氟喹诺酮类药物残留进行检测。而使用胶体金免疫层析技术将水样品和植物样品的实际检出限相比, 也能够完成一些农药物质的检测。相较于其他检测方法, 使用该技术不仅不需要使用大型仪器设备, 同时还具有简单、快速和方便的特点, 所以在食品农兽药检测方面得到了广泛使用。
2在非食品添加成分检测中的运用
在非食品添加成分检测方面, 胶体金免疫层析技术也得到运用。例如, 在三聚氰胺这种化工物质的检测上, 使用胶体免疫层析技术可以对乳制品中的三聚氰胺进行定性和定量检测, 而使用的试纸条具有较好的稳定性、重复性和灵敏度。在苏丹红I的检测上, 可以使用利用胶体金免疫层析技术制作成的苏丹红I测试纸条, 然后使用金标抗原方法将抗体固定在NC膜上, 就可以对食品中的苏丹红I进行定量检测。
3在霉菌毒素检测中的运用
食品中如果含有霉菌毒素等物质, 易导致人体和动物产生病理变化, 继而给人类健康带来严重危害。使用胶体金免疫层析技术, 能够有效鉴定黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和葡萄球菌肠毒素等多种霉菌毒素。例如, 在检测黄曲霉毒素B1时, 使用胶体金免疫层析试纸法进行检测, 可以与高效液相色谱法达到90.5%的相符率。同时, 使用该方法能够实现现场快速检测, 并且可以用于粮食中的黄曲霉毒素B1的初筛。此外, 使用该技术还能鉴定巧克力奶、婴儿奶粉和鲜牛奶等物质中的葡萄球菌肠毒素, 毒素最低检出限为10 mg/L。
4在致病菌检测中的运用
食品中的致病菌含量一旦超标, 就很可能导致食用者生病。目前, 食源性致病菌的检测仍是按照细菌分离、培养及生化鉴定的方法进行检测。这种方法耗时长、操作繁琐、环境和主观因素影响较大, 从而给食品检测带来较多不便。而使用胶体金免疫层析技术, 则能够解决该方面检测的操作复杂、灵敏度低和特异性低的问题。例如, 在大肠杆菌检测方面, 进行胶体金结合垫的制备只需要进行2次离心就可以消除标记过程中多余抗体。相较于其他方法, 胶体金免疫层析技术明显能够提高结合垫的性能和检验灵敏度。
结论
胶体金免疫层析试纸 篇4
1胶体金免疫层析技术的原理及构造
免疫层析技术是以抗原抗体反应与色谱层析技术相结合的一种快速免疫分析方法。胶体金免疫层析技术通过将标记了胶体金的抗原或抗体固定在条状纤维素膜(membrane)上,以形成固相载体,然后将待测样品以液体形式加入到一端的样本垫(sample pad)之后,通过液体在硝酸纤维素膜上形成的毛细作用(capillary flow)而向前移动,同时使待测样品中的受测物与硝酸纤维素膜上的抗体或抗原发生特异性结合而形成免疫复合物。免疫复合物被富集在特定区域(test line),通过胶体金的颜色反应而得到直观的结果,而游离的标记物则越过检测带(control line)进入到末端的吸水垫(wicking pad),不呈现显色反应。胶体金免疫层析试纸条的构造模式见图1。
2胶体金免疫层析技术的分类及结果判断
胶体金免疫层析按照反应模式可以分为三类,即:间接法、夹心法和竞争抑制法[5]。其中夹心法又可分为双抗体夹心法和双抗原夹心法。对未知抗原的检测常采用双抗体夹心法和竞争抑制法,而对未知抗体的检测常采用双抗原夹心法和间接法。
3免疫胶体金技术在动物疾病中的应用
3.1传染病的诊断
3.1.1病毒病的诊断廖圆圆等[6]建立了间接胶体金免疫层析方法用于检测犬血清中RV Ig G抗体,该方法不仅敏感性高(可检出最低中和抗体效价水平0.5 IU/m L),且与商品ELISA检测试剂盒的总符合率达到99.4%。陈一鸣等[7]用研制的PRRS抗体试纸条与ELISA检测方法分别对36份血清样品进行检测,结果显示PRRS抗体试纸条的敏感度为81.5%,特异度为100%,符合率为86.1%,重复性良好。王中力等[8]构建了检测犬细小病毒(CPV)的间接胶体金免疫层析法,(GICA)敏感性为100%;特异性为97.3%;与HA检测结果符合率为98.3%,对犬重要传染性疾病(犬细小病毒病)的诊断提供了快速的检测方法。因此,胶体金免疫层析诊断方法适合于临床的快速诊断。
3.1.2细菌病的诊断刘凯等[9]构建了牛出血性败血症胶体金免疫层析快速诊断方法,该方法采用双抗体夹心法检测牛源巴氏杆菌,经优化后该方法与细菌检查结果一致性为100%,无交叉反应,稳定性可以维持半年。布日额等[10]建立了检测牛乳中致病性金黄色葡萄球菌的胶体金免疫层析方法,试纸条与致病性金黄色葡萄球菌分离鉴定法符合率为90.0%、与PCR试剂盒符合率为83.3%。李伟等[11]建立的炭疽杆菌芽孢胶体金层析检测技术,胡孔新等[12]建立的快速检测鼠疫杆菌抗原用的胶体金标记免疫层析方法,谌志强等[13]建立的大肠杆菌0157:H7胶体金免疫渗滤法等都能够快速有效地对细菌性疾病进行检测和诊断。
3.1.3寄生虫病的诊断王艳华等[14]将构建的胶体金试纸条检测人工感染弓形虫GJS株速殖子的7只兔,对兔血清进行检测,同时用弓形虫分泌的抗原进行IHA参照。结果显示,试纸条在第3 d即可检测出抗体,而IHA法则在第5 d才可检测出抗体,且该方法对猪瘟及猪衣原体病阳性血清均为阴性,无交叉反应性。曾小军等[15]建立了检测血吸虫的免疫胶体金技术,与IHA抗体检测技术比较,检出率分别为95.24%和100.00%;慢性血吸虫病患者的检出率分别为92.86%和94.64%。两种方法对于血吸虫的检出效能一致,而胶体金技术对于血吸虫的检出效率略低于IHA方法,可能与包被所使用的蛋白及抗体出现的时机相关。
3.2检验检疫检验检疫对于国家进出口货物,尤其是生物源物品的安全流通具有重要的作用,是关系到国家生物安全的一个重要环节。然而对于进出口关卡的样品进行检测,需要快速准确的检测方法,方能提高效率而不耽误货物中转及旅客流通。动物活体检疫、动物源性食品及流通过程中的监测,对消费者的消费安全和身体健康具有直接或者间接的影响,同时制约了动物防疫工作切实有效地开展。胶体金免疫层析技术可快速、有效地对现场进行诊断,并可给出诊断结果,对于检验检疫具有较大的现实意义。
4不同方法试验对比
4.1试验材料禽流感H5抗体快速检测卡,深圳康百得生物科技有限公司生产;H5血凝抑制试验抗原与阳性血清由哈尔滨兽医研究所生产;禽血清30份,随机在散养户中采集。
4.2试验数据从试验数据(见表1)可知,禽流感抗体快速检测卡与禽流感HI和HA试验所得出的结果基本一致,区别在于,禽流感HI和HA试验可以得出准确的数值,而H5抗体快速检测卡只能定性作出阴性或阳性结果判断。
5总结
免疫胶体金层析技术因操作简便、无须使用仪器设备、快速出结果等优点而被广泛应用于各个领域。动物疾病诊断不但可帮助畜牧养殖业的健康发展,更重要的可为消费者提供安全放心的动物源性食品。就动物疾病的免疫胶体金层析技术研发而言,选择何种反应方式、包被抗体或抗原的选择、检测抗原或者不同抗原刺激的抗体出现顺序等都需要考虑在内。对于细菌引起的疾病,因菌种之间可能存在一定的抗原交叉性,故需要注意诊断方法的特异性。与此同时,还需要尽可能提高试纸条的敏感性,而且对于一项新的检测技术,往往需要经过长时间的实践检验才能进入临床应用和推广。如果能很好地解决免疫胶体金层析试纸条检测方法的特异性、敏感性和稳定性,而研发出一种比较成熟的检测技术,无疑具有广阔的实际应用前景,同时也应成为广大科技工作者努力的方向。
胶体金免疫层析试纸 篇5
近年来, 虾病毒检测的方法发展迅速, 针对这两种对虾病毒的诊断手段除了临床症状观察法和病理学的传统诊断方法外, 还有免疫学、分子杂交、PCR等方法[1,7,8,9,10]。为了简化试验操作, 加快诊断速度, 提高检测敏感性, 我们开发利用胶体金免疫层析技术检测对虾WSSV和IHHNV病毒的PCR扩增产物进行检测。通过PCR引物的特殊修饰, 再用抗体识别修饰的PCR产物并在胶体金免疫检测试剂条上呈色, 实现病毒扩增产物的快速和高灵敏度的检测。目前, 国内外还没有应用PCR-胶体金免疫层析方法同步检测对虾WSSV和IHHNV的研究报道。本研究实现的两病毒同步检测, 简化了操作程序和时间, 有助于尽早发现病原, 尽早处理和预防, 最大可能地减少病毒病害所带来的经济损失。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验样品与质粒
含白斑综合征病毒 (WSSV) 的虾样品DNA、含传染性皮下和造血器官坏死病毒 (IHHNV) 的样品DNA和发病的对虾样品均由浙江省水产技术推广总站提供, 样品为2013年采集于浙江省各地对虾养殖场, 其中DNA于-20℃保存, 样品虾于-80℃保存。p MD-WSSV、p MD-I-HHNV阳性重组质粒由本试验室构建保存于-20℃。
1.1.2 试剂盒
对虾WSSV和IHHNV双检试剂盒 (PCR-胶体金法) (普望生物技术有限公司, 杭州) 包含虾基因组DNA快速提取试剂、WSSV PCR-MIX、IHHNV PCR-MIX和胶体金免疫试剂条等。
1.2 DNA提取
取样品虾腹足 (约25~50 mg) , 用试剂盒中对虾基因组DNA快速提取试剂, 根据说明书指导提取基因组DNA。
引物设计根据Gen Bank中公布的WSSV 4个不同的地理株 (录入号码为AF369029、AF332093、NC 003225、AF440570) 和IHHNV 7个不同的地理株 (录入号码为GQ411199、AF218266、JN377975、NC002190、JX840067、JX258653、EF633688) 的全基因组序列, 通过BLAST比对分析序列的保守区, 利用Primer3web[11]分别设计检测WSSV和IHHNV的2对特异性引物。WSSV和IHHNV引物的扩增产物片段大小分别为227 bp、241 bp。引物由上海生物工程有限公司合成和修饰。普通检测引物和修饰后的标记引物序列见表1。国家标准《对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 (IHHNV) 检测PCR法 (GB/T25878-2010) 》和《白斑综合征 (WSD) 诊断规程第2部分:套式PCR检测法 (GB/T 28630.2-2012) 》中PCR检测WSSV和IHHNV的 (套式) 引物序列 (表1) 由上海生物工程有限公司合成。
1.3 PCR反应
试验中采用WSSV PCR-MIX和IHHNV PCR-MIX为杭州普望生物技术有限公司产品, 试验反应体系10.0μL, 其中9.0μL PCR-MIX (Hangzhou Proprium Biotech Company Limited) 包含PCR Buffer、d NTPs (d U plus) 、Mg SO4、WSSV或IHHNV的上下游引物、Uracil-DNA Glycosylase、Taq HS, 反应时每管添加1.0μL提取的对虾基因组DNA, 混匀后进行PCR反应。
本试验是在同一次PCR反应中, 采用同一个反应程序, 用不同的引物同步对DNA模板进行扩增。对同步二温式PCR反应的各参数 (退火温度、延伸时间、Mg2+和引物浓度) 进行优化, 筛选出同步PCR反应中最佳反应条件, 其PCR程序:37℃10 min, 一个循环;94℃10 min, 一个循环;94℃10 s, 60℃30 s, 35个循环;最后置于4℃。
1.4 PCR产物的检测和结果判断
1.4.1 电泳检测和结果判断
取5.0μL PCR反应产物, 以Marker (Gen Star Biosolutions) 作为DNA分子量标准在2%琼脂糖凝胶 (添加溴化乙锭染料) 中进行电泳检测, 电泳结束后置于紫外光检测仪下观察, 并用凝胶成像系统 (上海培清科技有限公司) 拍照。
1.4.2 胶体金免疫层析检测和结果判断
在PCR产物管中加入90.0μL PBS缓冲溶液, 混匀后垂直滴加到胶体金免疫检测试剂条 (杭州普望生物技术有限公司) 的加样孔中, 等待紫红色条带的出现, 测试结果在滴加样本起5~10 min内读取。
若C线和T线均显色检验结果呈阳性;若C线显色而T线不显色则检测结果呈阴性;若C线不显色则结果无法判断。
1.4.3 灵敏度试验
将试验室的阳性重组质粒p MD-WSSV、p MD-IHHNV作为模板, 用Thermo Scientific Nano Drop 1 000紫外分光光度计分别测定其含量后, 将质粒作10倍进行梯度稀释, 并对上述模板进行同步PCR扩增, 反应结束后用PBS缓冲液将扩增产物稀释, 滴加到胶体金检测板的加样孔中检测PCR-胶体金层析检测的敏感性。
1.5 灵敏度比较试验
PCR-胶体金层析检测法与国家标准PCR检测方法的。将试验室的WSSV和IHHNV阳性样品 (浙江省水产技术推广总站提供) 作为模板, 用Thermo Scientific Nano Drop 1000紫外分光光度计分别测定其含量后, 将WSSV和IHHNV阳性DNA模板分别作10倍、3倍进行梯度稀释, 并对上述模板进行同步PCR扩增, 反应结束后用PBS缓冲液将扩增产物稀释, 滴加到胶体金检测板的加样孔中检测PCR-胶体金层析检测的敏感性。而国家标准巢式PCR检测WSSV中用外引物和内引物扩增的目的片段分别为1 447 bp、941 bp, 国家标准中一步式PCR检测IHHNV目的片段为389 bp。
2 结果
2.1 WSSV和IHHNV的PCR检测方法的建立
以含白斑综合征病毒 (WSSV) 的虾样品DNA、含传染性皮下和造血器官坏死病毒 (IHHNV) 的虾样品DNA作为模板进行PCR反应, 以病虾样品DNA为模板, 用WSSV和IHHNV检测的普通引物和修饰引物均可分别扩增得到预期的大小为227bp、241 bp的片段, 健康虾样品DNA及阴性水对照则无对应条带 (图1) 。试验表明, 用生物素、地高辛修饰的WSSV和IHHNV检测引物均可进行正常的PCR反应, 并能够分别扩增得到目标片段。
2.2 WSSV和IHHNV的胶体金层析检测方法的建立
以病虾样品DNA为模板, 检测WSSV和IHH-NV的2对修饰引物 (上下游分别为生物素和地高辛) 扩增的PCR产物经胶体金层析检测C线和T线均显色, 检测结果均为阳性 (图2, 3, 样品1) ;以健康虾样品DNA为模板, 检测WSSV和IHHNV的2对修饰引物 (上下游分别为生物素和地高辛) 扩增的PCR产物经胶体金层析检测C线显色, T线不显色, 检测结果均为阴性 (图2, 3, 样品2) ;如用没有修饰的引物, 以病虾样品DNA、健康虾样品DNA为模板, 检测WSSV和IHHNV的2对普通引物扩增的PCR产物经胶体金层析检测均是C线显色, T线不显色, 检测结果均为阴性 (图2, 3, 样品3-4) 。
注:1.WSSV修饰引物扩增阳性样品;2.WSSV普通引物扩增阳性样品;3.WSSV修饰引物扩增水 (阴性对照) ;4.WSSV普通引物扩增水 (阴性对照) ;5.IHHNV修饰引物扩增阳性样品;6.IHHNV普通引物扩增阳性样品;7.IHHNV修饰引物扩增水 (阴性对照) ;8.IHHNV普通引物扩增水 (阴性对照) ;M.DNA ladder (Gene Star公司, 从下至上依次为:100、250、500、750、1 000、2 000、3 000、5 000 bps) 。
注:1.WSSV修饰引物扩增阳性样品胶体金层析检测;2.WSSV普通引物扩增阳性样品胶体金层析检测;3.WSSV修饰引物扩增水 (阴性对照) 的胶体金层析检测;4.WSSV普通引物扩增水 (阴性对照) 的胶体金层析检测。
注:1.IHHNV修饰引物扩增阳性样品胶体金层析检测;2.IHHNV普通引物扩增阳性样品胶体金层析检测;3.IHHNV修饰引物扩增水 (阴性对照) 的胶体金层析检测;4.IHHNV普通引物扩增水 (阴性对照) 的胶体金层析检测。
2.3 PCR-胶体金层析检测的敏感度较目前国家标准提高10-100倍
将试验室的阳性重组质粒p MD-WSSV、p MD-IHHNV作为模板分别测其含量后, 将上述核酸作10倍梯度进行稀释, 进行PCR检测。PCR产物的电泳图见图4、5。5×103拷贝PCR产物EB染色后可见明显条带。我们然后对以上已稀释模板进行PCR-胶体金层析检测, 发现50到5×108拷贝检测为阳性, 小于50拷贝为阴性 (图6, 7) 。因此, 我们的体系最低能够检测到约为50拷贝的WSSV核酸模板和50拷贝的IHHNV模板, 与电泳检测PCR产物相比较, 胶体金检测灵敏度可明显提高10~100倍。
注:样品的起始拷贝数1~10分别为:5×108;5×107;5×106;5×105;5×104;5×103;5×102;50;5;阴性对照。M:DNA ladder (Takara公司, 1 500 bp、1 000 bp、900 bp、800 bp、700 bp、600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp) 。
注:样品1~10的起始拷贝数同图4。
注:样品1-10的起始拷贝数同图4。
注:样品1-10的起始拷贝数同图4。
3 讨论
病毒的快速、准确、简便的检测方法是对虾病害控制的关键。通常的PCR检测策略只是检测对虾病毒的某一个种类, 但是在对虾养殖过程中会同时受到不同病毒的侵染[12]。同时检测不同病毒, 是彻底全面控制对虾病毒的关键的第一步。因此目前许多研究采用特殊的PCR方法, 包括多重PCR[13,14]和同步PCR[15]进行同时检测多种病毒。本文研究的同步PCR方法检测病毒的策略是先检索、比对、筛选它们在Gen Bank中的核酸序列, 再应用软件同时批量设计出退火温度等参数非常相近的引物, 采用在同一次PCR反应中, 在不同的反应管中同时分别扩增样品中DNA模板, 从而达到同时检测样品中携带多种病毒的情况。我们用生物素、地高辛修饰WSSV和IHHNV病毒的PCR扩增引物, 扩增后的双链PCR产物含有生物素和地高辛标记, 可以和胶体金层析检测板上的生物素和地高辛抗体结合而被检测到。该研究建立的同步PCR-胶体金层析检测方法具有广泛的适用性, 可推广到其他病毒的检测。检测的特异性来自于引物的特异性, 设计不同病毒的特异性引物可以扩增出其特定的目标片断, 达到对不同病毒的检测。
本研究使用的PCR-MIX中含有UNG (尿嘧啶-DNA糖基酶) , 目的是为了防止遗留污染。但是研究表明在利用PCR对WSSV病毒进行检测中, UNG的使用使其检测灵敏度降低了一个数量级[15]。虽然如此, 本试验结果显示我们所建立的方法检测病毒灵敏度达到了50~100个拷贝, 而OIE巢式PCR与GB巢式PCR方法的国标方法[16]分别只能检测到104和103个病毒拷贝[6]。本研究所建立的检测方法的灵敏度有明显的提高 (10~100倍) , 为水产诊断感染病毒奠定了基础。同时, 本研究中PCR产物的检测也采用简便、快速的胶体金层析技术, 与电泳相比较, 不仅省时、省力, 而且无毒、环保。我们的检测方法10分钟内即可用肉眼观察检测板的显色结果, 大大缩短了常规的利用电泳和溴化乙锭 (EB) 染色检测PCR产物的时间 (约2 h) , 并让工作人员避免了接触有毒和诱导突变的试剂, 免除基层检测试验室购买电泳设备和荧光检测系统的投资。
胶体金免疫层析试纸 篇6
1. 危险化学品的分类
凡具有爆炸、易燃、毒害、腐蚀、放射性等危险性质, 在运输、装卸、生产、使用、储存、保管过程中, 在一定条件下能引起燃烧、爆炸, 导致人身伤亡和财产损失等事故的化学物品, 统称为危险化学品[1]。
危险化学品按照《危险货物分类和品名编号》进行分类, 共分九类, 分别是:第一类:爆炸品。第二类:气体。第三类:易燃液体。第四类:易燃固体、易于自燃的物质、遇水放出易燃气体的物质。第五类:氧化性物质和有机过氧化物。第六类:毒性物质和感染性物质。第七类:放射性物质。第八类:腐蚀性物质。第九类:杂项危险物质和物品[1]。
根据危险化学品的易燃、易爆、有毒、腐蚀等危险特性, 危险化学品事故可划分为:危险化学品火灾事故;危险化学品爆炸事故;危险化学品中毒和窒息事故, 危险化学品灼伤事故;危险化学品泄漏事故;其他危险化学品事故[2]。
2. 经典的危险化学品定量分析检测技术
危险化学品检测方法多采用高精度的仪器设备检测, 按照仪器分析的基本原理主要有:光学分析法、电化学分析法、色谱分析法、生物传感技术和其他分析法 (见表1) 。
(1) 光学分析法。
光学分析法是基于光作用于物质后产生的辐射信号或所引起的变化来进行分析的方法, 可分为光谱法和非光谱法两类。
(1) 紫外-可见分光光度法。
紫外-可见分光光度法:是基于物质对紫外-可见光辐射的选择性吸收来进行分析测定的方法。本法具有快速、简便、重现性好等优点, 但由于干扰因素较多, 选择性较差, 多用于汞、铅、镉的测定。
(2) 石墨炉原子吸收法。
利用石墨管高温下使样品原子化, 通过炉内光路产生吸收的原理来测定。该法具有灵敏度高, 选择性好, 方法简便, 分析速度快等优点, 但石墨管耗价昂贵, 且不能同时测定多个元素[3,4,5,6]。Caldas等 (2009) 利用石墨炉原子吸收法检测巴西朗姆酒中砷、铜、铅的含量。Janyeid Karla Castro Sousab等 (2008) 利用石墨炉原子吸收法在石油样品中检测铜的含量。
(3) 火焰原子吸收法。
火焰原子吸收法是由化学火焰提供能量, 使被测元素原子化。该法应用最早, 而且至今仍在广泛使用 (北京大学化学系, 1997) 。Shokrollahi等 (2008) 利用火焰原子吸收法测定在各种环境样品中Cu2+的含量。Bakirdere等 (2008) 利用火焰原子吸收法测定了在路边土壤和植物样品中铅、镉、铜的含量。
(4) ICP-AES法 (电感藕合等离子体原子发射光谱分析法) 。
ICP-AES法是电感藕合等离子炬管为激发光源的一种光谱分析方法。ICP激发光源是一种具有6000~7000K的高温激发光源, 由高频放电产生的。外形与化学火焰相似的电火源, 其激发光源 (炬管) 为分析试样组份元素提供蒸发。原子化或激发的能量, 是原子发射光谱仪中一个极其重要的组成部分。试样溶液经雾化后, 随载气氩带入炬焰的中心通道中而被原子化和激发, 产生多元素分析谱线[7,8,9]。
(5) 荧光分析法。
某些物质受紫外光或可见光照射激发后能发射出比激发光波长较长的荧光。物质的激发光谱和荧光发射光谱, 可以用作该物质的定性分析。当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时, 物质在一定浓度范围内, 其发射光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系, 可以用作定量分析。荧光分析法的灵敏度一般较紫外分光光度法或比色法高。
(6) 原子荧光分析法。
在一定条件下, 气态原子吸收辐射光后, 本身被激发成激发态原子, 处于激发态上的原子不稳定, 跃迁到基态或低激发态时, 以光子的形式释放出多余的能量, 根据所产生的原子荧光的强度即可进行物质组成的测定。物质的基态原子受到光的激发后, 会释放出具有特征波长的荧光, 据此可对物质进行定性分析。物质的定量分析可通过测定原子荧光的强度来实现[10]。
(2) 电化学分析法。
电化学分析是应用电化学原理和实验技术建立的分析方法。通常是将待测组分以适当的形式置于化学电池中, 然后测量电池的某些参数或这些参数的变化进行定性和定量分析。但因检出灵敏度低, 特异性差, 而且操作麻烦费时, 不能满足测定的要求。一般不用来检测重金属。
(3) 色谱分析法。
色谱法是一种极有效的分离技术, 借助两相间分配系数的差异而使混合物中各组分分离, 并对组分进行测定的方法。色谱法的特点是:高效能、高灵敏度、高选择性和分析速度快。
气相色谱法是以气体为流动相, 以涂在惰性载体或柱内壁上的高沸点有机化合物或表面活性吸附剂为固定相的柱色谱分离技术。作为气相色谱分析的化合物的要求具有挥发性和热稳定性, 因此无机物作为气相色谱分析, 首先要转变其化学形式使其具有挥发性及热稳定性。金属离子与一些有机试剂作用生成的螯合物符合此要求, 金属螯合物的特点是可以定量反应, 容易得到纯化合物, 适合于环境污染物的痕量分析[11]。伊拉克发生的误食含有有机汞种子的中毒事件中甲基汞的监测就是采用气相色谱法检测的。
(4) 其他分析法。
质谱法是将待测物质的分子转变成带电粒子, 利用稳定的磁场使带电粒子按照质量大小顺序分离开来, 形成有规则并可以检测的质谱[12]。等离子体质谱法 (Inductively coupled plasma mass spectrometry) 的应用被认为是20世纪80年代痕量元素及同位素分析的一项重要进展。
(5) 生物传感技术。
生物传感器是高科技的电子技术和生物工程技术相结合的产物, 由固定化并具有化学分子识别的生物材料、换能器件及信号放大装置构成, 能够选择性地对样品中的待测物发出响应, 并把待测物质的浓度转化为电信号, 根据电信号大小定量测出待测物质的浓度。生物传感器的选择性的好坏完全取决于它的分子识别原件, 而其他性能则和它的整体组成有关。
Andrew等 (1998) 利用光学纤维反射传感器固定化Br-PADAP估测重金属的含量, 对重金属锌的检测灵敏度可达31ppb, 而检测时间只有6min。Kukla等 (1999) 利用胆碱酯酶、脲酶、葡萄糖氧化酶等多酶系统来制成多酶电化学传感器, 以酶膜残留的活性来判断重金属含量。Ibolya等 (2000) 利用发光酶固定化生物传感器来检测重金属汞、镉、铜、锌, 检测限约为10-15μmol/L。Alexander等 (2000) 利用含有荧光基因细菌发出的荧光检测重金属砷。Lehmann (2000) 和Riether等 (2001) 开发出一种专门测量铜离子的电流型生物传感器。生物传感器的研究和开发在重金属残留分析领域相对滞后, 这种酶电极的主要缺陷是灵敏度不太高, 特异性不强, 回收率低, 重复性较差, 电极使用寿命短难以真正满足重金属残留快速检测的要求, 实际应用也不多。
3. 胶体金免疫层析技术
(1) 方法简介。
图1胶体金免疫层析试纸条结构
胶体金免疫层析技术是一种将胶体金标记技术、免疫检测技术和层析分析技术等多种方法有机结合在一起的固相标记免疫检测技术。它的原理是:以条状纤维层析材料为固相, 通过毛细作用使样品溶液在层析条上泳动, 并同时使样品中的待测物与层析材料上针对待测物的受体 (抗原或抗体) 发生高特异性、高亲和性的免疫反应, 层析过程中免疫复合物被富集或截留在层析材料的一定区域 (检测带) , 运用可目测的标记物 (胶体金) 而得到直观的实验现象 (显色) 。而游离标记物则越过检测带, 与结合标记物自动分离 (见图1) 。这种分析技术具有操作简单快速, 可单份测定, 无须特殊仪器等优点, 适合于各种快速检测场合, 尤其适用于在事故发生过程中对危险化学品进行快速检测[13]。
(2) 胶体金免疫层析技术的发展。
胶体金用于免疫学检测研究是20世纪80年代发展起来的一项新技术, Muller等 (1980) 应用该技术对牛痘病毒进行了免疫电镜研究, Geoghegan等 (1980) 和Leuvering等 (1981) 应用胶体金进行了被动凝集试验, Leuvering等 (1983) 利用胶体金做了人妊娠诊断研究, Manara等 (1982) 用过氧化物酶和金染色进行了细胞膜双标记的免疫电镜研究, Wybran等 (1985) 应用金染色对淋巴细胞亚群做了计数研究。总之, 胶体金在免疫检测中的初步应用已显示了广阔前景[14]。
(3) 胶体金免疫层析技术在检测危险化学品中的应用。
(1) 重金属的检测。
国内外已经建立了针对有机污染物的免疫胶体金检测方法, 并且将该方法用于重金属离子的分析检测, 迄今为止, 免疫胶体金检测技术已经成功用于水中的铟、汞、镉、铅和铀等的检测。
刘斌等研究了纳米Ti O2分离富集水样中痕量镉的最佳反应条件, 应用自制抗Cd (Ⅱ) -i EDTA (Isothiocya-nobenzyi-EDTA) 螯合物的单克隆抗体, 建立了快速检测环境水样中重金属镉残留的胶体金免疫层析法。对实测样品的检测耗时约90min, 该方法对Cd的定量下限可达5μg/L, 适用于环境水样中的检测[15]。
向军俭等研制检测水样品中镉离子残留的胶体金免疫层析快速检测试纸条, 对试纸条进行灵敏度、特异性和稳定性验证, 并检测添标水样。结果制备的试纸条对镉离子的最低检测限为100 ng/ml;除了与Hg2+-EDTA有交叉反应外与Fe3+、Pb2+、Cu2+等类似物无交叉反应;试纸条在常温下放置8周稳定性良好;检测添标水样的结果与ICP-AES的检测结果一致, 可作为水样中重金属镉离子残留现场检测和监控的有效手段[16]。
(2) 农药的检测。
万积成等通过研究胶体金法与气相色谱法在检测毒死蜱中的应用, 证实胶体金试纸条在检测蔬菜中毒死蜱残留的可靠性。与气相色谱法相比较, 胶体金试纸检测毒死蜱操作简便、观察直观、快速、省时, 其特异性、敏感性较高, 可作为毒死蜱农药残留自我检测的手段[17]。
万积成等采用胶体金法半定量方法检测的试样, 再用液相色谱-串联质谱法定量检测试样中吡虫啉。结果发现胶体金试纸检测为阳性与阴性样品经液相色谱-串联质谱检测的符合率达到了100%。添加的cut off值样品的回收率为88.4%。结论:与液相色谱-串联质谱相比较, 胶体金法检测吡虫啉具有操作简便、直观、快速、省时的特点, 其特异性、敏感性较高, 适用性强, 可作为吡虫啉农药残留自我检测的手段应用[18]。
赵友全等利用甲霜灵胶体金试纸条用于现场快速检测进出口蔬菜甲霜灵农药残留量。在对试纸条光谱测量分析的基础上, 研制出一种基于图像测量的便携式甲霜灵试纸条显色分析仪器, 该仪器集成了样品滴定、定时检测、显色度分析、身份认证等多种功能, 实现了试纸条的自动检测、显色度数值分析和数据存储[19]。
肖琛等应用胶体金免疫层析技术研制出一种准确、快速、简便检测氰戊菊酯农药残留的试纸条。实验结果表明, 该快速检测试纸条100%抑制浓度为800ng/m L (检测线无色) , 检测时间为10min, 批次内和批次间重复性为100%。采用该试纸条检测农产品中残留的氰戊菊酯特异性强、灵敏度高而且无需特殊仪器设备, 适用于农产品中氰戊菊酯残留的快速检测[20]。
(3) 表2列出了小分子相关的文章。
4. 结语
胶体金免疫层析试纸 篇7
1 免疫胶体金技术用于弓形虫诊断的意义
为了寻找敏感、特异、快速的弓形虫病诊断方法,国内外学者在弓形虫病诊断方面进行了大量研究。目前,弓形虫病调查、诊断的方法有病原学方法、免疫学方法、分子生物学方法,其中弓形虫病病原学诊断常用的有涂片检查法、动物接种法和卵囊检查法,通过从病料中直接检查到速殖子或卵囊为确诊标准,检测较为困难,检出率低。免疫学诊断方法主要有染色试验(DT)、凝集试验(AT)、补体结合试验(CF)、间接血凝试验(IHA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫胶体金技术等。目前对动物弓形虫病的检测和诊断主要是采用弓形虫间接血凝试验(IHA),对人弓形虫病的检测和诊断主要采用弓形虫ELISA法,而多数诊断方法都存在抗体检出较晚,过程繁琐,操作复杂,灵敏度低,质量参差不齐,检测费用高等缺点,不利于临床大范围使用。随着现代分子生物学的不断发展,基因技术越来越多的被研究者用于弓形虫病的诊断,PCR技术已成为弓形虫病实验室诊断的重要手段。此技术需要专业人员操作,其特点是灵敏、特异并可在早期做出诊断,但操作方法繁琐,且费用较高,不易推广,目前还多停留在实验室研究应用上,用于探讨简便实用的弓形虫病检验新方法,提高弓形虫病检疫的时效性。
免疫胶体金检测技术是以胶体金为标记物,利用特异性抗原抗体反应,通过带颜色的胶体金颗粒来放大免疫反应系统,使反应结果在固相载体上直接显示出来,用于检测待测样品中的抗原或抗体,具有分子水平的免疫胶体金技术问世以来发展十分迅速,被作为诊断试剂广泛应用到临床。目前,国内外研究学者对人的免疫胶体金检测技术比较多,而用于动物方面的比较少,还没有进行商品化推广,本研究是建立诊断弓形虫病新方法的终极目标,为建立一种科学、快速、准确的检测和诊断方法,旨在研制一种用于检测弓形虫抗体的免疫胶体金快速试纸条以解决上述难题,为我国弓形虫病的诊断与防治、弓形虫与宿主关系、以及弓形虫的分子生物学等研究奠定良好基础。
2 国内外研究现状及分析
1922年捷克眼科医师Janku报告了1例弓形虫病,这是人类弓形虫病例的首次报告,弓形虫所致后天感染虽然在免疫力正常的宿主只引起轻微疾病,但是由于各种原因宿主免疫力下降时,隐性感染再燃,诱发严重的弓形虫脑炎。这是艾滋病(AIDS)患者重要死因之一,随着分子生物学的进展,许多学者对弓形虫进行了这方面的工作,一些研究成果已经或正在对弓形虫病的防控产生积极影响,但是在弓形虫病的诊断方面主要存在以下几方面的问题:用于诊断的抗原或抗体纯度不够高;大多数诊断技术还不成熟,只停留在.实.验室研究阶段;用于现场快速检测的商品化弓形虫病诊断试剂盒寥寥无几。今后应为检测提供可靠的诊断抗原或抗体,加快解决试剂的标准化问题,建立综合的检测系统来弥补单一检测系统的不足。
国内外普遍采用免疫学方法检测血清中的弓形虫Ig G和Ig M,所用抗原多是从感染动物中收集或经组织、细胞培养的弓形虫速殖子抗原。但这种制备速殖子抗原的方法昂贵费时,纯度低,试剂盒批间差异大,不易标准化。而在原核表达系统中表达特异的目的蛋白,因蛋白产量高、操作简单、费用低廉而被许多研究者选用。
免疫层析技术是近十年来迅速发展的一种将胶体金标记技术、免疫检测技术、层析分析技术、单克隆抗体技术和新材料技术等多种方法有机结合在一起的一种新型体外诊断简单技术。目前,胶体金试剂条对目的物质的检测多是以双抗夹心法、竞争抗体法和竞争抗原法制备而成。免疫层析胶体金试剂条所用抗体以单抗最好,为防止出现非特异反应导致结果误判,应尽量避免使用多抗,除非对多抗已将非特异反应彻底除掉。它具有简单、快速、结果明确、操作简单和无需特殊设备等优点,并有“浓缩的ELISA”之称,已成为临床及检疫诊断领域发展的一个新方向。
3 研究内容
3.1 弓形虫SAG2蛋白基因的克隆与原核表达
构建弓形虫SAG2基因的表达载体。经PCR、酶切鉴定表明,成功的构建了开放阅读框完整的弓形虫病毒基因的原核表达质粒。用IPTG诱导表达后,将全菌裂解,用SDS-PAGE和Western blot检测重组菌中外源蛋白的表达情况和免疫反应性。将重组菌裂解,包涵体变性,再通过透析将蛋白复性,将透析复性后的溶液经GST-Bind树脂纯化,最后用蛋白酶切除GST标签。
3.2 弓形虫SAG2蛋白单克隆抗体的制备
据试验要求选择两株单克隆抗体通过饱和硫酸铵沉淀-透析除盐法进行纯化,得到足够纯度和高活性的Ig G蛋白,用于胶体金免疫层析快速诊断方法的建立。
利用纯化的蛋白为抗原免疫小鼠(免疫时间分别为1d,15d,29d)。最后一次免疫3 d后,按常规方法进行,取脾细胞与处于对数生长期的SP2/0细胞融合。融合后的细胞用HAT培养基悬浮,3~5 d换加新鲜HAT,8~10 d后改用HT培养基,经常观察,适时换液和检测。经间接ELISA筛选能特异性分泌单抗的杂交瘤细胞株。分别从免疫小鼠、提供饲养细胞的小鼠采血,作为筛选单抗时对照用的阳性、阴性血清,然后进行单克隆抗体的大量制备。同法再制备阴性腹水,将收集的小鼠腹水或细胞培养上清用ELISA法鉴定单抗的免疫球蛋白类型及亚型。
3.3 弓形虫SAG2蛋白的胶体金免疫层析检测试纸的研制
在试纸条的塑料片上依次粘贴如下组分:加样区、反应区和吸附区三部分。加样区含有免疫胶体金颗粒,通常由玻璃纤维将免疫胶体金颗粒吸附在该区。反应区则喷涂或点加两条反应线,一条为检测线,一条为质控线。检测线用以检测此处的抗原物质与免疫胶体金颗粒的包被抗原抗体反应性。质控线则用以检测免疫胶体金颗粒上的包被蛋白质的活性及程度。反应区的材料主要是硝酸纤维素膜吸附区由较厚的滤纸或类似的吸水材料制成,将由加样区经反应区层析上来的剩余免疫胶体金颗粒等吸附于其中,该区提供层析的动力。免疫胶体金颗粒由加样区释放后,经反应区,部分继续到吸附该区,完成层析。并通过胶体金试纸条检测的敏感性试验、特异性试验、重复性试验、稳定性试验来测定试纸条的性能。
4 结论