胶体金检测卡（共10篇）
胶体金检测卡 篇1
我国是乙型肝炎的高发区, HbsAg携带率0.1～15%[1], 又是经血液传播性疾病, 所以卫生部把HbsAg检测作为无偿献血的检测项目之一。GICA[2]检测HbsAg具有简便、快捷、结果直观、可单份操作等优点, 能满足快速检验的需要, 尤其为无偿献血者现场采血前检测HbsAg提供了便利的条件, 目前已广泛使用。但实际工作中可能存在反应迟缓和漏检现象。由于各厂家采用的固相微孔膜、包被和金标记抗体以及成品试条制备工艺有所不同, 以致各种GICA试条对HBsAg检测性能和结果出现差异。我们就已在国内使用的4种品牌8个批号的GICA试条对HBsAg检测性能及有关技术参数进行了试验比较和评价。
1 资料与方法
1.1 材料
1.1.1 检测HBsAg的GICA试条
4种品牌、8个批号, 分别称为试条1 (批号P006和6926, 规格5.5 mm) ;试条2 (批号980908, 规格3.3mm) ;试条3 (批号9811059和98120711, 规格3.3 mm) ;试条4 (批号8092801、8122901和9022001, 规格3.3 mm) 。
1.1.2测定HBsAg的EIA试剂盒
共4种, 分别为上海实业科华生物技术有限公司, 厦门新创科技有限公司, 上海荣盛生物技术有限公司和深圳华元医药生物工程公司产品。
1.1.3 HBsAg定值质控样品
购于北京全国临床检验中心 (批号9901, 分别为1、2、5 ng/ml) 。
1.1.4 酶标仪
美国Bio-Rad450型。
1.1.5 标本来源
采集无偿献血者和来本院就诊患者的末梢全血1190份、血清968份。
1.2 方法
1.2.1 敏感性试验
对定值为1 ng、2 ng、5 ng/ml的3种HBsAg质控样品和2158份受检全血或血清标本, 采用4种GICA试条和4种酶免疫 (EIA) 试剂盒同时测定。GICA法测定血清HBsAg是将各试条的加样区直接浸入血清中30s, 取出后平放静置。全血HBsAg测定则采用受检者末梢全血3滴直接滴加于每一试条加样区, 待渗透约1min后, 插入含0.3 ml生理盐水的小试管中静置。两种测定均在30min内间断观察并记录A值。定值样品测定与血清HBsAg测定相同。
1.2.2 特异性试验
收集80份经EIA测定HBsAg为阴性的血清标本, 分别从4种GICA试条中各任意抽取20条进行复检。另收集6份EIA初始测定HBsAg出现前带反应 (实际为抗原过量而呈弱阳性, A值0.216～0.328) , 但GICA测定为强阳性的血清标本, 经稀释后再用EIA复检, 以此2种试验观察GICA测定HBsAg的特异性。
1.2.3 GICA试条的渗透速度和均一性试验
从每一种品牌的不同批号中任意抽取10条GICA试条, 分别浸入同一份混合血清中, 以试条加样区接触血清开始计时, 30s后取出, 平放静置观察, 待血清渗透至对照线出现肉眼可见颜色时, 记录时间, 并以各自10条的平均时间作为渗透速度的指标。均一性观察是在测定受检标本时, 连带观察100条每一品牌或不同批号GICA试条, 以标本在滤膜上渗透时出现明显的未浸湿的斑块, 或浸液后15min以上不能到达对照线的试条判为不均一, 计算各自百分率作为试条的均一性指标。
1.2.4 其他相关性试验与观察
①对GICA试条用于全血与血清标本测定HBsAg的敏感性做比较试验;②观察试条保存条件对测定结果的影响;③对GICA和EIA测定HBsAg时, 每份所需试剂成本和检测时间分别进行测算并比较。
2 结果
2.1 采用4种GICA试条和4种EIA试剂盒, 对3种HBsAg定值的质控品和2158份受检血标本测定HBsAg的结果见表1, 2。
注:*为定性试验结果阴性, 其余为阳性
注:血清HBsAg浓度约为51 200 ng/ml, 而GICA测定都显强阳性
2.2 EIA法测定80份HBsAg阴性的血清标本, 经4种GICA复检结果均为阴性。6份EIA初始测定HBsAg出现前带反应呈弱阳性的血清标本 (A值0.216～0.382) , 经稀释后重测均为强阳性 (A值1.169～>2.500) , 其中1份作倍比稀释最高至1∶25 600, 其A值为0.240, 与定值样品比较, 推算该份。
2.3 GICA试条的渗透速度和均一性试验结果见表3。
2.4 用GICA试条4测定1 139份献血员的全血HBsAg阴性标本, 采血后收集血清经EIA全部复检, 检出的47份阳性血清, 再用同批号GICA试条重新测定, 检出阳性6份。另外试验观察到密封包装开封后的试条在4℃存放时, 由于受潮, 在使用此种试条检测时, 对照线和阳性反应色带均变弱, 甚至不出现, 使测定敏感度下降或失效。
2.5 经测算GICA试条每份成本费为4.0～6.2元, 测定用时间5～30min;每份EIA试剂的成本费1.0～1.2元, 测定所需时间1.5～2h。
3 讨论
GICA检测HBsAg具有简便、快速、可单份操作的优点[3], 能满足就诊者急诊检验的需要, 尤其为无偿献血者现场采血前检测HB-sAg提供了便利条件。因此, 许多实验室采用GICA法测定HBsAg的兴趣与需求不断增加。目前, 国内一些试剂厂商纷纷推出或代理国内外商品化的GICA试条, 但各生产厂家制备试条的固相微孔膜、包被方法和金标记用抗体以及工艺技术上存在差异, 使HBsAg的测定结果受到一定影响。就此, 我们选用国内代理商的4种GICA先后8个批号试条对测定HBsAg的性能、结果等技术性参数作了比较及评价, 为实验室的选用提供参考。
本研究选择了3种低定值的HBsAg质控样品和2 158份待检测HBsAg的全血或血清标本, 先后采用4种GICA试条和4种EIA试剂盒对每份样本经2种方法同时测定并比较。GICA对HBsAg的最小检出量是1～5 ng/ml, EIA的最小检出量均≤1 ng/ml (表2) ;GICA对HBsAg的检出率为EIA的95.6～98.7%, 平均为96.2% (表2) 。结果表明GICA法的敏感性低于EIA法, 与文献报道大致相同[3]。与EIA比较, GICA检测HBsAg一般不出现假阳性;对抗原量过大的标本未发现前带反应。表明GICA检测HBsAg具有高特异性。
GICA检测HBsAg虽然适用于单份标本测定和急诊检验, 对现场采血前献血员的筛选有其实用价值, 但由于测定的敏感度低于EIA法, 加上其成本是EIA法的4～5倍, 使GICA的应用将受到一定的限制。由于其灵敏度 (≥1ng/ml) 低于EIA (≤1ng/ml) 也可部分检测[4], 存在一定漏检。为了确保临床用血的安全, 经GICA初筛测定为HBsAg阴性的供血, 仍需用EIA进行复检。如时间允许, 患者就诊和献血员筛选应首选EIA检测HBsAg, 可提高检出率, 并大大降低检测费用。
从4种GICA试条的渗透速度和发生不均匀的比率结果可以看出, 试条测定HBsAg的敏感性与两者存在一定的相关性。对于不同品牌或同一品牌不同批号试条的敏感性、渗透速度和微孔膜不均一性的差异, 可能与各厂家所用的材料和制备工艺技术有关。GICA测定全血与血清HBsAg的结果表明, 血清比全血的检出率要高, 必要时可选用血清测定。另外, 选用敏感性高, 渗透速度快, 微孔膜均一性好, 且密封、干燥保存的高质量试条, 可保证HBsAg检测结果的准确性。
通过上述分析, 为提高胶体金法的检出率, 减少漏检率, 首先应增强操作人员的责任心, 严格按照试剂说明书操作, 严格控制反应时间、反应条件, 在温度较低情况下, 可以适当延长反应时间等。在以后工作中, 如果能进一步研究漏检现象, 并且做好防范工作, 胶体金法可以在血液初筛方面有更广泛的应用。
参考文献
[1]唐海琼.胶体金免疫层析法检测HbsAg的临床价值[J].广西医学, 2008, 1 (30) :76~77.
[2]何小维, 赵喜红, 刘晓云.等.胶体金快速诊断技术的研究进展[J].中国人兽共患学报, 2007, 23 (1) :86~88.
[3]周继文, 戎广亚, 杨守纯, 等.胶体金免疫层析法检测乙型肝炎病毒表面抗原[J].中华医学检验杂志, 1998, 21:30~32.
[4]包青春, 杨国香, 李凤娥.胶体金检测HbsAg漏检原因分析[J].内蒙古医学杂志, 2008, 40 (2) :187~188.
胶体金检测卡 篇2
水产品中氯霉素的快速检测
胶体金免疫层析法
（KJ201905）
范围
本方法规定了水产品中氯霉素的胶体金免疫层析快速检测方法。
本方法适用于水产品中氯霉素的快速测定。
原理
本方法的测定以竞争抑制免疫层析原理为基础。样品中的氯霉素经有机试剂提取，固相萃取小柱净化，浓缩复溶后，氯霉素与胶体金标记的特异性单克隆抗体结合，抑制了抗体和微孔膜检测线（T线）上抗原的结合，从而导致检测线颜色深浅的变化。通过检测线与控制线颜色深浅比较，对样品中氯霉素含量进行定性判定。
试剂和材料
除另有规定外，本方法所用试剂均为分析纯，水为
GB/T
6682
规定的二级水。
3.1
试剂
3.1.1
正己烷。
3.1.2
丙酮。
3.1.3
乙酸乙酯。
3.1.4乙腈
3.1.5磷酸二氢钠，NaH2PO4·2H2O。
3.1.6磷酸氢二钠，Na2HPO4·12H2O。
3.1.7
氯化钠
3.1.8
复溶液：称取0.12
g磷酸二氢钠
(3.1.5)置于100
mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液A；称取磷酸氢二钠7.16
g
(3.1.6)置于100
mL容量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，制成溶液B。取溶液A
2.8
mL、溶液B
7.2
mL、氯化钠(3.1.7)0.85
g，用水溶解并稀释至100
mL，得磷酸盐缓冲液，即为复溶液。
3.1.9丙酮-正己烷（1+9）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比1：9混匀。
3.1.10丙酮-正己烷（6+4）：丙酮（3.1.2）、正己烷（3.1.1）按体积比6：4混匀。
3.2
标准物质
氯霉素标准物质的中文名称、英文名称、CAS登录号、分之式、相对分子质量见表1，纯度≥98.6%。
表1
氯霉素参考物质中文名称、英文名称、CAS登录号、分子式、相对分子质量
中文名称
英文名称
CAS登录号
分子式
相对分子量
氯霉素
Chloramphenicol
56-75-7
C11H12Cl2N2O5
323.13
注：或等同可溯源物质。
3.3标准溶液配制
3.3.1
氯霉素标准储备液（1
mg/mL）：精密称取氯霉素标准物质（3.2）10
mg，置于10
mL容量瓶中，用乙腈（3.1.4）溶解并稀释至刻度，摇匀，制成浓度为1
mg/mL的氯霉素标准储备液。4℃避光保存，有效期6个月。
3.3.2
氯霉素标准中间液A（10
μg/mL）：精密量取氯霉素标准储备液（1
mg/mL）（3.3.1）0.1
mL，置于10
mL
容量瓶中，用乙腈（3.1.4）稀释至刻度，摇匀，制成10
μg/mL的氯霉素标准中间液A。4℃避光保存，有效期3个月。
3.3.3
氯霉素标准工作液（0.01
μg/mL）：精密移取氯霉素标准中间液A（10
μg/mL）（3.3.2）0.01
mL分别置于10
mL容量瓶中，用乙腈稀释至刻度，摇匀，制成浓度为0.01
μg/mL的氯霉素标准工作液。临用新配。
3.4材料
3.4.1固相萃取小柱：Cleanert
Silica，200
mg/6mL。LOT：0170198。
3.4.2免疫胶体金试剂盒（在2～30℃、干燥阴凉条件下保存，在产品有效期内使用）。
3.4.2.1
金标微孔。
3.4.2.2
试纸条或检测卡。
仪器和设备
4.1
移液器：200
μL、1
mL和5
mL。
4.2
涡旋混合器。
4.3
离心机：转速≥4000
r/min。
4.4
电子天平：感量分别为
0.01
mg和
0.01
g。
4.5
样品浓缩仪：如有需要。
4.6
环境条件：
温度：15～25℃，相对湿度：≤60%。
5分析步骤
5.1试样制备
取具有代表性样品约500
g，充分粉碎混匀，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样和留样，密封，标记，于常温保存。
5.2试样提取和净化
准确称取试样6
g（精确至0.01
g）置于50
mL具塞离心管中，依次加入1
mL水和8
mL乙酸乙酯（3.1.3），涡旋提取5
min，以4000
r/min离心5
min。转移全部乙酸乙酯层于50
mL具塞离心管中，加入正己烷25
mL，氯化钠1
g涡旋混匀，4000
r/min
离心1
min，上清液待净化。5
mL丙酮-正己烷（1+9）（3.1.9）淋洗LC-Si硅胶小柱，弃去淋洗液，将待净化溶液转移到固相萃取小柱上，弃去流出液，用5
mL丙酮-正己烷（6+4）（3.1.10）洗脱，收集洗脱液，洗脱液于40℃氮气吹干，精密加入600
µL复溶液（3.1.8），涡旋混合1
min，作为待测液。
5.3
测定步骤
5.3.1
检测卡与金标微孔测定步骤
吸取150
µL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸
5～10次使混合均匀，室温温育3
min；温育结束后，将金标微孔中溶液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8
min，对结果进行判定。
5.3.2
试纸条与金标微孔测定步骤
吸取150
µL样品待测液于反应微孔（3.4.2.1）中，抽吸5～10次使混合均匀，室温温育3
min；温育结束后，将检测试纸条（3.4.2.2）吸水海绵端垂直向下插入反应微孔中，室温温育3
min，从微孔中取出试纸条，去掉试纸条下端的吸水海绵，并于5
min内进行结果判定。
5.3.3
检测卡测定步骤
吸取150
µL样品待测液滴加到检测卡（3.4.2.2）上的加样孔中，室温温育5～8
min，对结果进行判定。
5.4质控试验
每批样品应同时进行空白试验和加标质控试验。
5.4.1
空白试验
称取空白试样，按照5.2和5.3步骤与样品同法操作。
5.4.2
加标质控试验
准确称取空白样品6
g或适量（精确至0.01
g）置于15
mL具塞离心管中，加入180
μL氯霉素标准工作液（0.01
μg/mL）（3.3.3），使氯霉素浓度为0.3
μg/kg，一式2份，按照
5.2和5.3步骤与样品同法操作。
结果判定要求
通过对比控制线和检测线的颜色深浅进行结果判定。由于长时间放置会引起检测线颜色的变化，需在规定时间内进行结果判定。目视结果判读依据如图1所示。
6.1
无效
控制线（C线）不显色，表明不正确操作或试纸条/检测卡无效。
6.2
阳性结果
检测线（T线）不显色或检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色浅，表明样品中氯霉素含量高于方法检测限，判定为阳性。
6.3
阴性结果
检测线（T线）颜色比控制线（C线）颜色深或者检测线（T线）颜色与控制线（C线）颜色相当，表明样品中氯霉素含量低于方法检测限，判定为阴性。
6.4质量控制要求
空白试验测定结果应为阴性，加标质控试验测定结果应为阳性。
结论
如被测样品中氯霉素检测结果为阳性时，应采用确证方法进行确证检测。
性能指标
8.1
检测限
氯霉素为0.1
μg/kg。
8.2
灵敏度
灵敏度应≥98%。
8.3
特异性
特异性应≥90%。
8.4
假阴性率
假阴性率应≤1%。
8.5
假阳性率
假阳性率应≤10%。
注：性能指标计算方法见附录A
9其他
本方法所述试剂、试剂盒信息及操作步骤是为给方法使用者提供方便，在使用本方法时不做限定。方法使用者在使用替代试剂、试剂盒或操作步骤前，须对其进行考察，应满足本方法规定的各项性能指标。
本方法参比标准为GB/T
22338-2008
动物源性食品中氯霉素类药物残留量测定
(包括所有修改单)。
附录
A
定性方法性能计算表
样品情况a
检验结果b
总数
阳性
阴性
阳性
N11
N12
N1.=N11+N12
阴性
N21
N22
N2.=N21+N22
总数
N.1=N11+N21
N.2=N12+N22
N=N1.+N2.或N.1+N.2
显著性差异(χ2)
χ2=(|N12-N21|-1)2/(N12+N21),自由度（df）=1
灵敏度（p+）
p+=N11/N1.特异性（p-）
p-=N22/N2.假阴性率(pf-)
pf-=N12/N1.=1-灵敏度
假阳性率(pf+)
pf+=N21/N2.=1-特异性
相对准确度
（N11+N22）/(N1.+N2.)
注：N:任何特定单元的结果数，第一个下标指行，第二个下标指列。例如：N11表示第一行，第一列，N1.表示所有的第一行，N.2表示所有的第二列；N12表示第一行，第二列。
a由基准方法检验得到的结果；
b由本方法检验得到的结果。灵敏度的计算使用确认后的结果。
本方法负责起草单位：山西省食品药品检验所。
验证单位：陕西省食品药品检验所、广东省药品检验所、四川省食品药品检验检测院。
胶体金检测卡 篇3
【关键词】酶联免疫吸附试验法；胶体金免疫层析法；乙肝表面抗原
【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）03-0225-01
乙型病毒性肝炎，简称乙肝，是一种由乙型肝炎病毒（HBV）感染机体后所引起的疾病，是当前严重危害人类身体健康的传染病。乙型病毒肝炎表面抗原（HBsAg）阳性是感染乙肝病毒的重要指标。酶联免疫吸附试验（ELISA）法是目前我国检测乙肝HBsAg最为普及的方法，应用时间较早，而胶体金免疫层析法是近年来采用的免疫学检测方法。本组研究资料采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法和胶体金免疫层析（GICA）法对768份18～65岁人群血清进行HBsAg检测，并对比检测结果。现报告如下：
1材料与方法
1.1标本来源
抽取18～65岁人群血清768份，采集无溶血、无脂浊的静脉血标本3～5ml，室温静置30min后，4000r∕min离心5min，充分分离血清待检。
1.2仪器与试剂
乙肝五项胶体金快速检测板由上海科华生物科技有限公司提供，HBsAg试纸条由蓝十字生物药业有限公司提供；ELISA检测试剂由珠海丽珠生物科技有限公司公司提供；TDL-42A低速离心机；Unto-FLiudo全自动酶标洗板机；Unto-2010酶标仪。
1.3方法
1.3.1胶体金免疫层析法 将GICA试纸条浸入待测标本，标本不可浸没标志线，浸入时间约为10分钟，根据对照线位置出现的红线条数判定结果。如对照线与检测线间位置出现1条红线为阴性，对照线与检测线间位置出现2条红线为阳性。
1.3.2酶联免疫吸附试验（ELISA）法 于相应孔中用加样器分别加入质控品、待检标本及阳性、阴性对照血清，并做好标记，然后往每个孔中加入酶标抗体，混匀，置于37°C条件下1h，严格按照说明书经洗版、添加底物，并在37°C条件下避光15min，加终止液停止反应。使用酶标仪检测OD值，并计算S∕CO值。若S∕CO≥1.0则表示实验结果为阳性，若S∕CO<1.0则表示实验结果为阴性。
1.4统计学方法
采用SPSS 17.0统计软件分析，计数资料采用百分率表示，行χ2 检验，P<0.05为差异有统计学意义。
2结果
两组方法检测HBsAg的阳性率比较：共检测768份血清标本， 两种方法检测HBsAg均阴性的712份，均阳性的32份，两种方法检测的符合率为97.39%。胶体金免疫层析法检测出HBsAg阳性标本42份，HBsAg阳性率5.47%（42∕768）。ELISA 法检测出HBsAg阳性标本46份，HBsAg阳性率为5.98%（46∕768），两种方法阳性检出率差异无统计学意义（P>0.05）。根据特异度、灵敏度计算公式，灵敏度= A / （ A + C ）×100%；特异度= D/ （ B + D）×100%。A-真阳性数，B-假阳性数，C-假阴性数，D-真阴性数。得出：胶体金免疫层析法的灵敏度为69.57%，特异度为98.61%。
ELISA法和胶体金免疫层析法检测结果
胶体金免疫层析法ELISA法合计阳性+阴性﹣阳性+321042阴性﹣14712726合计467227683讨论
乙肝病毒性肝炎是严重危害人体健康的一种病毒性肝炎，由乙型肝炎病毒（HBV）感染引起，血液、性接触、日常生活接触和母-婴垂直传播是HBV传播的主要方式。1965年Biumberg等首次发现乙型肝炎病毒（HBV）的表面抗原（HBsAg），其现已成为HBV感染的重要标志，可作为乙肝病毒性肝炎的重要诊断依据。目前实验室检测乙肝HBsAg的方法有很多，如化学发光微粒子免疫分析法（CMIA）、荧光定量聚合酶链反应法（FQ-PCR）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、胶体金免疫层析（GICA）法等。酶联免疫吸附试验（ELISA）法是目前我国检测乙肝HBsAg最为普及的方法，其主要是在液相中經扩散作用，逐渐与固相表面的抗体结合，同时标记抗体也需要此过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物，此外还需要洗涤过程和显色反应[1]。其灵敏性和特异性较高，结果可靠，但其操作程序较繁琐复杂，检测所需要的时间较长。胶体金免疫层析法是近年来出现的一种免疫学标记物检测新技术，这种检测技术不需要仪器，高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中，待测抗原流经微孔与固定的抗原接触很快完成反应，检测所需要的时间较短，操作简单便捷，有较高的特异度，尤其适用于基层医疗卫生单位。但由于反应时间短，会造成弱阳性的漏检。本组研究资料分别采用酶联免疫吸附试验法和胶体金免疫层析法检测乙肝表面抗原，两种方法检测出的HBsAg阳性率分别为5.98%、5.47%，差异无统计学意义（P>0.05）。胶体金免疫层析法的灵敏度和特异度分别为69.57%、98.61%。综上所述，胶体金免疫层析法检测乙肝表面抗原操作简便快捷，检测的特异度高，但其灵敏度还有待提高。
参考文献
胶体金检测卡 篇4
关键词：体外诊断试剂,胶体金法,技术审评要点
0.前言
胶体金试剂由于其快速、便捷、不需特殊设备、结果判断直观使其在医学检验领域得到了迅猛的发展,特别是在床旁诊断和家庭使用中发挥着越来越重要的作用。该类产品生产厂家众多,大小参差不齐,产品质量水平差距也较大。该类产品审评目前在国内没有统一的行业标准和相关指南,下面结合笔者多年的审评经验对审评中的重点问题进行分析。
1.适用范围
本文所述适用于依据《体外诊断试剂注册管理办法》(国家食品药品监督管理总局令第5号) (以下简称《办法》)管理类别为Ⅱ类的、基于抗原抗体反应原理的胶体金免疫层析法进行定性检测的体外诊断试剂(盒)。其中所述“定性”是指只给出阴性或阳性(有反应或无反应、是或非、 有或无、正常或异常)两种可能的结果。至于定量、 半定量检测试剂(盒)不在本文讨论范围之内。
2.产品技术要求
产品技术要求应符合《体外诊断试剂注册管理办法》和《医疗器械产品技术要求编写指导原则》的相关规定。试剂(盒)性能指标主要包括: 外观、膜条宽度、液体移行速度、最低检测限(分析灵敏度)、特异性、重复性、批间差等。检验方法中应明确说明采用的参考品 / 标准品、样本制备方法、使用的试剂批次和数量、试验次数、计算方法。下面对几个关键性能指标的关注点进行说明 :
2.1最低检测限(分析灵敏度)
检出限是定性检测试剂 ( 盒 ) 的一项关键指标,其浓度点的选择应符合临床实际诊断意义。 为了避免在临床应用时出现过多的“假阳性”结果,企业在确定该产品的检出限时应结合其实际的临界值,建议不应把两者浓度差设定的过大。 在评价该项指标时,不但要验证检出限浓度点的阳性符合率情况,还要验证阴性参考品的符合情况。如申报产品有相应的国家参考品,则企业内部阳性 / 阴性参考品应参考国家参考品的项目设置。在不低于国家参考品要求的前提下,申请人应根据产品性能验证的实际情况自行设置合理的企业内部参考品。申请人应对内部阳性 / 阴性参考品的来源、抗体浓度等信息进行精确的实验验证,并提交详细的验证资料。
2.2分析特异性
(1)交叉反应
对抗原结构相近或临床症状相似的其他相关抗体血清进行交叉反应研究。申请人应提交所有用于交叉反应验证的病原体来源、浓度确认等信息。
(2)干扰物质
对样本中常见的内源性干扰物质进行检测, 如溶血、高脂、黄疸等,说明样本的制备方法及干扰实验的评价标准,确定可接受的干扰物质极限浓度。
2.3重复性
检测重复性指标时建议采用临界值附近的样品进行多次检测,然后计算同一份样品多次检测的结果或其精确性。在分析试剂重复性时,不应使用强阳性样品或明显阴性的样品,否则无法客观地评价其检测效果。
2.4批间差
取三个批号的试纸,每个批号抽取相同数量, 按照说明书步骤操作,对重复性进行检测,三个批号测试条的结果应一致,显色度均一。
3.产品说明书
3.1产品名称
试剂(盒)通用名称由三部分组成 :被测物名称、用途、方法或原理。例如 :人绒毛膜促性腺激素(HCG)检测试剂(胶体金法)。
3.2预期用途
第一段内容详细说明产品的预期用途,如试剂(盒)用于体外定性检测人血清、血浆、全血、 尿液等样本的被测物水平,适用的样本类型应结合实际的临床研究情况进行确认。
第二段内容说明与预期用途相关的临床适应症及背景情况,说明相关的临床或实验室诊断方法等。
3.3主要组成成分
(1)应说明试剂 ( 盒 ) 包含组分名称、数量、 比例或浓度等信息。(2)试剂 ( 盒 ) 中不包含但对该项检测必须的组分,企业应明确其相关信息。 (3)试剂 ( 盒 ) 中各组分不同批号间如果可以互换, 应明确说明并提交相关验证材料。
3.4储存条件及有效期
(1)对试剂 ( 盒 ) 的效期稳定性、开封稳定性等信息做详细介绍。包括环境温湿度、避光条件等。(2)开封后未使用产品允许暴露于空气中的温湿度及期限等条件予以明确。(3)不同组分保存条件及有效期不同时,应分别说明,产品总有效期以其中最短的为准。
注:保存条件不应有模糊表述,如“常温”、“室温”。稳定期限建议以月或日为单位。
3.5样本要求
重点明确以下内容 :(1)样本采集前对患者的要求 :如采集时间、采集顺序等,是否受临床症状、用药情况等因素的影响。(2)样本采集 : 说明采集方法及样本类型,如有血浆或全血样本,应注明对抗凝剂的要求。(3)样本处理及保存:样本处理方法、保存条件及期限、运输条件等冷藏 / 冷冻样本检测前是否须恢复室温、冻融次数、对储存样本的添加剂要求等。(4)已知的干扰物。
3.6检验方法
(1)详细说明试验原理、方法,必要时可采用图示方法描述。(2)应明确试验环境温湿度、 测试时间 ( 如观察时间、失效时间等 ),以及样本的复温要求等试验过程中的注意事项。不同型号产品,加样方法如有差异,建议分别以图示方式描述清楚。
3.7检验结果的解释
详细描述对检测结果的判定 ( 无效、阴性、 阳性等 ),建议结合不同情况加以图示说明。
3.8检验方法局限性
综合产品的预期用途、临床背景、检测方法及适用范围等信息,对可能出现的局限性进行相关说明,举例如下 :
(l)本产品检测结果仅供临床参考,不应作为临床诊治的唯一依据,对患者的临床管理应结合其症状 / 体征、病史、其他实验室检查、治疗反应等信息综合考虑。(2)本产品检测原理为基于抗原抗体反应的胶体金免疫层析法,可能会受到一些特殊样本的影响而导致假阳性结果。(3) 高浓度样本可能会出现H00K效应而导致假阴性, 应将其稀释后再检测。应注明对稀释液的要求、 最佳或最大稀释比例。(4)建议对申报试剂临床研究中的病例人群特征进行说明,并对适用人群的性别、年龄、地域等特征进行明示。
3.9注意事项
应至少包括以下内容 :(1)本试剂 ( 盒 ) 的检测结果仅供临床参考,患者的临床诊治应结合其症状 / 体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。(2)由于方法学或抗体特异性等原因,使用不同生产商的试剂对同一份样本进行检测可能会得到不同的测试结果,因此,在病程监测过程中,用不同试剂检测所得结果不应直接相互比较,以免造成错误的医学解释,建议实验室在发给临床医生的检测报告注明所用试剂特征。(3)样本 :采集时间要求、与用药的先后顺序或用药后时间间隔等 ;对所有样本和反应废弃物都应视为传染源对待。
4.临床评价资料
生产企业应按照《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》及《体外诊断试剂注册管理办法》 的要求进行产品临床试验,应注意以下要求 :
4.1研究方法
有同类产品上市的一般选择与已上市的同类产品进行临床研究。对比产品应选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品,证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。研究对象应包括两组,一组是用对比试剂确定为阳性的异常组,另一组是用对比试剂确定为阴性的对照组。
对于新研制体外诊断试剂而言,选择适当的受试者,采用试验用体外诊断试剂与诊断该疾病的“金标准”进行盲法同步比较。
4.2临床研究单位的选择
第二类体外诊断试剂申请人应当选定不少于2家(含2家)临床试验机构,按照有关规定开展临床试验,临床试验机构应获得国家食品药品监督管理总局资质认可。
4.3病例选择及样本类型
4.3.1临床试验样本量的确定 :注册申请人(简称申请人)或 / 临床研究者应根据产品临床使用目的,与该产品相关疾病的临床发生率确定临床研究的样本量。在符合指导原则有关最低样本量要求的前提下,还应符合统计学要求。
1临床研究的总样本数至少为200例(新研制体外诊断试剂产品的临床试验样本量要求同第三类产品)。2阳性样本不少于总样本的30%。包含阳性、阴性样本,样本数目应尽可能原分布,尽可能收集 / 获取临界值的样本,并考虑弱阳性样本。
4.3.2应明确临床样本的采集要求。
1尽可能采用新鲜样品,避免贮存。2对检测结果有明显干扰作用的样本,如溶血、脂血、 黄疸样本尽量避免使用。
4.3.3试验方案中应确定严格的病例或样本纳入 / 排除标准,任何已经入选的病例或样本再被排除出临床研究都应记录在案并明确说明原因。
4.4统计学分析
对临床试验结果的统计应选择合适的统计方法,如阴 / 阳性符合率、检测结果一致性分析等。
对于本类产品对比实验的等效性研究,常选择交叉四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果,对定性结果进行四格表卡方或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性,统计学分析应可以证明两种方法的检测结果无明显统计学差异。 在临床研究方案中应明确统计检验假设,即评价考核试剂与参比试剂是否等效的标准。
如直接与临床金标准比对,则除了进行上述统计分析外,还应进行临床特异性、敏感性的相关分析。
4.5结果差异样本的验证
在数据收集过程中,对两种试剂检测结果不一致的样本,应采用“金标准”方法或临床上普遍认为质量较好的第三种同类试剂进行复核,同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。
5.结语
胶体金检测卡 篇5
关键词：犬瘟热病毒；免疫胶体金；诊断
中图分类号：S85文献标识码：A文章编号：1674-0432（2011）-11-0197-1
犬瘟热（Canine Distemper, CD）是由犬瘟热病毒（Canine Distemper Virus, CDV）引起的犬科、鼬鼠科及部分浣熊科的一种急性、高度接触性传染病，主要侵害消化系统、呼吸系统，有时也侵害神经系统，临床上以上呼吸道、胃肠道的卡他性炎症，非化脓性脑膜脊髓炎和双相热型为主要特征。Carrie首次报道CD病原为病毒，该病几乎遍布世界各地，被视为当前危害犬群最严重的疫病之一。我国是CD的多发地区，在全国各地均有发生，流行范围极广，发病率和死亡率均较高，对养犬业危害巨大。CDV属于副粘病毒科，麻疹病毒属成员，基因组为单股RNA，病毒粒子呈现圆形或不整形成。虽然CDV病原体只有一个血清型，但病型却复杂多样，临床上常与支气管败血波特杆菌、沙门氏菌、犬细小病毒、传染性肝炎病毒等病原混合感染或继发感染，所以给诊断带来了巨大困难。本文根据病例的临床症状、病理剖检和流行病学调查资料做出初步诊断的基础上，经血清学方法——免疫胶体金试纸条做出最终诊断。
1 病例
来自吉林省延边朝鲜族自图们市15例病例，病犬均死亡。采集病犬抗凝血，分离血清，同时采集各病变明显的组织，-20℃保存备用。
2 临床症状
病犬初期表现为体温升高，有时高达40℃以上，尿赤黄或更深，眼睛有脓性分泌物，精神颓废，食欲废绝。随后侵害波及呼吸系统，病犬表现为体温持续升高，鼻部干燥或龟裂，眼鼻脓性分泌物增多，常出现咳嗽，呼吸困难，肺部有罗音特征。因此发病初、中期，很容易被错误诊断为感冒或肺炎，应该予以其他方法进行鉴别。个别病犬出现呕吐和腹泻。病程后期常出现神经症状，如出现吠叫、头部震颤、四肢抽搐，严重时出现癫痫症状，最终因麻痹衰竭死亡而转归，病犬脚垫增厚、干裂也是后期的典型特征。如果进入后期，出现神经症状就很难治愈，即便是病愈，也会留下后严重的遗症。一般情况下病犬的病程为15-45d，出现神经症状的病犬均以死亡告终。
3 病理变化
由于CDV对犬的上皮细胞具有特殊亲和力，所以病变分部比较广泛。幼龄犬感染CDV后通常出现胸腺萎缩，而成年犬则多见结膜炎、鼻炎、气管及支气管炎和卡他性肠炎。进入后期的病犬如出现神经症状，则病犬的脚垫部皮肤多发生角质化或龟裂，中枢神经系统病变较为明显，如脑室扩张和脑膜内充血，以及脑脊髓液大量增加。病犬的神经组织内可见嗜酸性包涵体，多出现在细胞浆内，直径为1-5μm，而核内包涵体多位于神经节细胞、腺上皮细胞和上皮细胞。
4 诊断结果
为确保诊断的准确性，在诊断过程中采取了包涵体检查、荧光抗体检测和PCR检测等三种平行诊断。对15份疑似CD的病料进行镜检、血清学诊断和分子生物学诊断。其中免疫胶体金检测与PCR检测结果均为CD阳性，而荧光抗体检测CD阳性13例，包涵体检测CD阳性9例（表1）。
5 讨论
犬瘟热是犬类多发的一种常见病，对养犬业的危害非常之大，也是阻碍养犬业发展的重大传染病之一。这就要求养殖户要特别重视犬瘟热的发生和发展，一旦发生犬瘟热，为阻止病原体的蔓延，管理人员必须迅速将病犬从畜舍内隔离出来，用来苏儿或火碱等消毒试剂对率舍进行彻底消毒，避免病犬的调动和外来人员进入，对周边假定健康犬和受疫情威胁犬，可用犬瘟热病毒高免血清或单克隆抗体进行紧急接种，等疫情逐渐稳定后，再考虑注射犬瘟热疫苗。
患犬瘟热的耐过犬能获得坚强的免疫力。因此，按照犬的免疫规程进行合理的免疫接种，是预防本传染病的最好手段。目前，国内多采用犬六联弱毒疫苗和犬五联弱毒疫苗进行免疫接种。近些年，通过这些疫苗的应用，对我国军犬、警犬、宠物犬和实验用犬的病毒性疾病起了积极的预防作用。但由于是弱毒疫苗，存在散毒的可能，也给临床诊断带来了障碍。为了使诊断准确，避免单一检测手段的不准确性，临床上我们要采用包括血清学和分子生物学在内的多种检测方法联系应用，才能使诊断更加准确和确实。
参考文献
[1] 杨百亮,刘建泉.犬瘟热的荧光抗体技术诊断及治疗[J].黑龙江畜牧兽医,2005,(9):46-47.
[2] 王雷,夏咸柱,卫广森,等.犬腺病毒、犬细小病毒联合PCR方法的建立与应用[J].病毒学报,2003,(9):262-266.
[3] 刘大飞,王牟平,司微,等.犬细小病毒黑龙江株（CPV-YN）的分离、鉴定及致弱的研究[J].中国预防兽医学报,2010,(11):875-878.
胶体金检测卡 篇6
胶体金免疫层析技术分析
所谓的胶体金, 其实就是氯金酸溶液在还原剂的作用下, 聚合成特定大小的金颗粒, 并且在静电作用下生成稳定胶体溶液。这些金颗粒具有较高的电子密度, 聚集成一定密度后就会以肉眼可见的粉红色斑点形式出现, 可以用作免疫层析试验的指示物。
在应用胶体金免疫层析技术时, 需要将特异性抗原或抗体固定在膜上, 利用毛细作用使样品在层析条上游动, 从而使其与受体发生免疫反应。而在这一过程中, 免疫复合物将被截留在检测带内, 所以能得到直观的试验结果。
在食品检测中, 利用该技术能够完成蛋白质、药物、毒素和病菌等多种物质的检测, 并且具有成本低、反应快和低交叉反应性的优势。
胶体金免疫层析技术在食品检测中的运用
食品安全事件出现, 往往会给社会带来巨大经济损失。所以, 近几年相关行业加快了食品检测技术的研究, 以期利用更先进的技术完成食品的有效检测。而胶体金免疫层析技术具有成本低、反应快和低交叉反应性的优点, 因此, 有必要对该技术在食品检测中的问题展开分析, 从而更好地促进食品检测技术发展。
在食品质量检测中的运用
从组成成分来看, 食品中含有蛋白质、水分、糖类、维生素和脂肪等物质。其中, 大部分都属于有机高分子物质, 可以使用胶体金免疫层析技术进行检测。在检测过程中, 一般会进行食品的半定量分析, 从而实现对食品成分的快速检测。例如, 奶牛分娩后最初几天分泌的乳汁为牛初乳, 含有大量非营养性功能组分, 保健价值提高。而在牛初乳中, Ig G含量与生物活性物质含量呈正相关关系, 所以可以使用胶体金进行标准牛Ig G的标记, 然后将其当成竞争抗原。通过将市面上牛乳样品中的Ig G和标记的标准牛Ig G相比, 就可以反映样品质量。
在食品安全检测中的运用
1在农兽药残留检测中的运用
使用胶体金免疫层析技术, 可以对食品中的农药、兽药和其他生物毒素残留进行检测。例如, 使用胶体金标记的抗氟喹诺酮类抗体进行胶体金制备, 就可以对牛奶中的11种氟喹诺酮类药物残留进行检测。而使用胶体金免疫层析技术将水样品和植物样品的实际检出限相比, 也能够完成一些农药物质的检测。相较于其他检测方法, 使用该技术不仅不需要使用大型仪器设备, 同时还具有简单、快速和方便的特点, 所以在食品农兽药检测方面得到了广泛使用。
2在非食品添加成分检测中的运用
在非食品添加成分检测方面, 胶体金免疫层析技术也得到运用。例如, 在三聚氰胺这种化工物质的检测上, 使用胶体免疫层析技术可以对乳制品中的三聚氰胺进行定性和定量检测, 而使用的试纸条具有较好的稳定性、重复性和灵敏度。在苏丹红I的检测上, 可以使用利用胶体金免疫层析技术制作成的苏丹红I测试纸条, 然后使用金标抗原方法将抗体固定在NC膜上, 就可以对食品中的苏丹红I进行定量检测。
3在霉菌毒素检测中的运用
食品中如果含有霉菌毒素等物质, 易导致人体和动物产生病理变化, 继而给人类健康带来严重危害。使用胶体金免疫层析技术, 能够有效鉴定黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和葡萄球菌肠毒素等多种霉菌毒素。例如, 在检测黄曲霉毒素B1时, 使用胶体金免疫层析试纸法进行检测, 可以与高效液相色谱法达到90.5%的相符率。同时, 使用该方法能够实现现场快速检测, 并且可以用于粮食中的黄曲霉毒素B1的初筛。此外, 使用该技术还能鉴定巧克力奶、婴儿奶粉和鲜牛奶等物质中的葡萄球菌肠毒素, 毒素最低检出限为10 mg/L。
4在致病菌检测中的运用
食品中的致病菌含量一旦超标, 就很可能导致食用者生病。目前, 食源性致病菌的检测仍是按照细菌分离、培养及生化鉴定的方法进行检测。这种方法耗时长、操作繁琐、环境和主观因素影响较大, 从而给食品检测带来较多不便。而使用胶体金免疫层析技术, 则能够解决该方面检测的操作复杂、灵敏度低和特异性低的问题。例如, 在大肠杆菌检测方面, 进行胶体金结合垫的制备只需要进行2次离心就可以消除标记过程中多余抗体。相较于其他方法, 胶体金免疫层析技术明显能够提高结合垫的性能和检验灵敏度。
结论
胶体金检测卡 篇7
关键词：HBsAg,HCV抗体,TP抗体,HIV-1/2抗体,胶体金法,酶联免疫吸附试验
急诊手术作为抢救患者生命的常用手段, 临床上常用;腔镜门诊每日要为患者行内镜检查。按照相关规定, 术前需要检测患者血液中HBs Ag、HCV抗体、TP抗体和HIV-1/2抗体, 为使患者尽快手术或检查, 检验科需在最短时间 (30min内) 内完成上述指标检测, 为临床提供结果。我院对2010年5月—2011年4月1 455例急诊手术和门诊内镜检查患者的血液标本, 用胶体金试剂和酶联免疫吸附试验 (ELISA) 试剂同时检测HBs Ag、HCV抗体、TP抗体和HIV-1/2抗体, 现报告如下。
1 材料与方法
1.1 标本来源
采集我院急诊手术和门诊做内镜检查患者静脉血3~5 m L, 分离血清。其中急诊手术565例 (男472例, 女93例) , 内镜检查890例 (男586例, 女304例) 。
1.2 试剂
HBs Ag检测试剂 (胶体金法) 、HCV抗体检测试剂 (胶体金法) 、TP抗体检测试剂 (胶体金法) 和HIV-1/2抗体检测试剂 (胶体金法) 均为天津中新科炬生物制药有限公司产品;HBs Ag检测试剂 (ELISA法) 为潍坊三维生物工程集团有限公司产品, HCV抗体检测试剂 (ELISA法) 和TP抗体检测试剂 (ELISA法) 为北京现代高达生物技术有限责任公司产品, HIV-1/2抗体检测试剂 (ELISA法) 为上海荣盛生物药业有限公司产品。上述公司生产的试剂均为国家“批批检”合格的产品。
1.3 质控品
质控血清HBs Ag、HCV抗体、TP抗体和HIV-1/2抗体用省临床检验中心室内质控品。
1.4 主要仪器
酶标仪为山东高密彩虹分析仪器有限公司GF-M3000型, 洗板机为北京普朗新技术有限公司DNX-9620型。
1.5 方法
对临床送检的血液标本分离血清后, 按照各自说明书要求的操作方法、结果判读严格操作。分别用胶体金法和ELISA法检测HBs Ag、HCV抗体、TP抗体和HIV-1/2抗体, 对两种方法检测均为阴性的结果报告阴性;两法检测均为阳性者HBs Ag、HCV抗体、TP抗体结果报告为阳性, HIV-1/2抗体按规定将标本送至市疾病预防控制中心实验室确认;对出现的胶体金法呈阳性, ELISA法呈阴性的标本, 分别用两法进行双份复检, 若结果仍为胶体金法阳性、ELISA法阴性者, HBs Ag、HCV抗体、TP抗体作为可疑者, 向临床报告结果可疑后, 备案并建议患者3个月后复查, HIV-1/2抗体则将标本送市疾病预防控制中心排除。
2 结果
1 455例急诊术前和内镜检查前患者标本的HBs Ag、HCV抗体、TP抗体和HIV-1/2抗体胶体金法、ELISA法检测结果, 见表1。
3 讨论
HBs Ag是病毒外膜的主要组成蛋白, 是HBV感染最主要的血清学检测指标, HBs Ag阳性一般意味着HBV感染的存在。HCV抗体阳性的患者常伴机体免疫功能低下, 导致血清转化延迟或HCV抗体慢性感染患者治疗过程中抗体检测“窗口期”延长, HCV抗体筛查存在漏检现象。梅毒螺旋体 (TP) 是引起梅毒的病原体, 人体感染TP后可引起一系列血清免疫学反应, 产生两种抗体, 一类是磷脂反应素即非特异性抗体, 另一类是针对TP特异性抗原而产生的特异抗体[1], 主要是Ig M和Tg G。人类免疫缺陷病毒 (HIV) 感染流行难以控制已成为一个世界性问题, 严重威胁人类健康, 其主要原因是基因的高度变异性。我国正常人群中HBs Ag阳性率约为10%左右, HCV抗体感染率为3.5%, 梅毒为近10年来我国性病增长速度最快的病种, HIV感染呈逐年上升趋势。胶体金快速诊断试剂条作为一种新型体外诊断技术近年来发展迅速, 其方便、快捷的特点在生物医学领域, 特别是临床检验中得到广泛应用。
本组结果表明, HBs Ag、HCV抗体、TP抗体和HIV-1/2抗体胶体金法与ELISA法检测阴性符合率均为100%, 阴性符合率高。胶体金法操作简单、特异度高、反应速度快, 对急诊手术和门诊需快速诊疗患者的检测意义重大。应用胶体金法快速检测HBs Ag、HCV抗体、TP抗体和HIV-1/2抗体, 在最短时间内明确患者术前或诊疗前身体内四种病毒是否存在的实验室依据, 一是明确患者本身原先患病责任, 二是结果将提示临床医护人员在诊治过程中采取必要的消毒、隔离措施及医院感染的预防[2]。
本组结果表明, HBs Ag、HCV抗体、TP抗体和HIV-1/2抗体胶体金法与ELISA法检测阳性符合率平均在95%以上, 阳性符合率高。且胶体金法对ELISAI法阳性率为103%, 这与胶体金法设计的高敏感性有关[3], 这种方法学上的高敏感性, 可尽量避免临床工作中偶见的“假阴性”而漏检。而对于胶体金法出现的“假阳性”, ELISA法的高特异性给予弥补。当两法结果不一致时, 考虑到“窗口期”因素存在和抗原抗体效价的低水平, 我们建议不能一概肯定或否定, 应作为可疑病例备案, 2个月~3个月后复检。
综上所述, 我们认为应用HBs Ag、HCV抗体、TP抗体和HIV-1/2抗体胶体金法试剂在急诊术前和门诊内镜检查前对患者行四种病毒快速筛查, 可以满足临床快速诊疗需求, 提高医院感染防护意识, 保护医患双方权益, 同时也保证了临床实验室工作质量。
参考文献
[1]雷皖秋.金标试纸条联合快速检测HBsAg/TP法在无偿献血中的应用探讨[J].中国输血杂志, 2006, 19 (6) :461-466.
[2]万柏珍, 徐雅平, 王石云, 等.输血前患者检测传染病指标的重要意义[J].中国误诊学杂志, 2005, 5 (15) :2913.
胶体金检测卡 篇8
关键词：免疫胶体金技术,马铃薯,病毒检测
免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique,ICG) 是一种快速、简便、结果容易判定的新型免疫标记技术。1971年Faulk和Taylon[1]首次利用免疫胶体金技术检测细菌表面抗原的分布,经过30多年的发展,人们发现胶体金可以与蛋白质等多种生物大分子结合,广泛地用于免疫学、组织学、病理学、细胞生物学等领域[2],该技术现已成为当今最快速、最直观、最灵敏的免疫学检测技术之一。近年来,继DAS-ELISA方法广泛应用之后,免疫胶体金技术作为一种以胶体金为示踪标志物的马铃薯病毒新型免疫检测技术已在马铃薯病毒检测中得到了应用。现就免疫胶体金技术的原理、特点、马铃薯病毒检测中的应用和发展前景作以简要综述。
1 免疫胶体金技术基本原理
免疫胶体金技术主要利用抗原抗体结合的免疫学原理,以胶体金颗粒为抗原,有效地检测病毒抗体。由于胶体金颗粒可以与蛋白质等生物大分子结合,同时不同直径胶体金颗粒具有不同的颜色,所以可以通过观察颜色的变化快速判定结果。免疫胶体金标记技术主要包括:胶体金免疫层析诊断法(Gold-Immuno chromatography Assay,GICA)和免疫胶体金渗滤法 (Dot-immuno gold filtration assay,DIGF)[3]。目前,应用较多的是胶体金免疫层析诊断法中的免疫层析快速诊断试纸条技术,该方法还是进行定性或半定量检测的一种有效途径[4,5]。
2 胶体金的制备方法
目前制备胶体金溶液主要应用化学还原法,常用的还原剂有柠檬酸三钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等。在还原剂作用下,氯金酸可聚合成特定大小的金颗粒,即向一定浓度的金溶液内加入一定量的还原剂使金离子变成金原子,由于静电作用而成为稳定的胶体状态[6]。
2.1 制备胶体金
取0.01%氯金酸水溶液,加热至沸腾,迅速加入1%柠檬酸三钠水溶液,继续煮沸7~10 min,冷却后用双蒸水恢复到原体积,制备胶体金溶液。在胶体金制备过程中,胶体金颗粒的直径与加入还原剂的种类和浓度密切相关,不同还原剂制备不同大小的胶体金颗粒,例如:硼氢化钠还原法(2 nm)、白磷还原法(5 nm)、抗坏血酸还原法(8~12 nm)、柠檬酸-鞣酸还原法(3~15 nm)、柠檬酸三钠还原法(10~150 nm)。还原剂的浓度及还原能力越高,制备的胶体金颗粒就越小。以柠檬酸三钠作为还原剂为例,柠檬酸三钠用量越多,胶体金颗粒的直径越小,柠檬酸三钠的用量越少,胶体金颗粒的直径越大[7,8]。胶体金颗粒制备完成后,可以通过投射电子显微镜、肉眼观察和光谱法分析胶体金制备的质量。
2.2 胶体金标记及纯化
胶体金标记,就是蛋白质等高分子与胶体金颗粒结合的过程,在标记过程中pH是关键[9,10]。一般认为,在蛋白质的等电点(pI)略低或略高于等电点(0.5~1.0)的条件下,胶体金颗粒的吸附力最强,制成的胶体金蛋白质复合物也最稳定,标记过程可用浓度0.1 mol·L-1K2CO3、0.1 mol·L-1HCl(或0.1mol·L-1H3PO4)进行调节。通过系列稀释法找出能使胶体金稳定的蛋白质溶液的最低浓度,在此基础上再加10%左右,即为最佳标记量。将待标记蛋白以最佳标记量适当稀释后,缓慢滴加到胶体金中。由于标记好的胶体金中往往还含有未结合的蛋白质、未充分标记的胶体金以及标记过程中形成的各种聚合物,因此标记好的胶体金还需经过纯化才能使用,一般纯化方法有离心法和凝胶过滤法等[11]。
2.3 试纸条的制备和组装及储存
试纸条制备主要包括金标结合垫的制备和硝酸纤维素膜(NC)的包被过程,胶体金与垫结合的方式主要有浸泡法和定量非接触喷点法。NC膜的包被目前有划膜式和非接触式2种点样方式[12]。将稀释的马铃薯病毒抗体和抗胶体金标记后马铃薯病毒的抗体分别喷于NC膜上,作为检测线和控制线,干燥后再将NC膜、结合垫、吸收垫和样品垫依次粘在单面PVC板上,粘贴好后,用切割机将粘贴好的试纸板切成宽为0.4 cm试纸条,置于含有干燥剂的铝箔袋中密封,4℃保存。
2.4 胶体金试纸条的结果判定
胶体金试纸条的结果分为失效、阴性、阳性。失效:检测带(T)和质控带(C)均不出现色带,说明本试纸条已失效;阴性:检测带(T)不出现色带,质控带(C)出现一条颜色较深的色带,说明马铃薯样品无被检测病毒或有被检测病毒,但含量较低。阳性:检测带(T)和质控带(C)都出现了明显的色带,说明样品中的被检测病毒水平较高。检测带颜色越深,样品中的被检测病毒含量越高。
3 免疫胶体金在马铃薯病毒检测中的应用
DAS-ELISA技术一直是国际上通用的马铃薯病毒检测手段,但是我国马铃薯生产企业拥有检测能力的实验室较少,大部分不能够自检,在田检时发现病株不能及时拔除,因此,会扩大病毒传播范围,严重影响种薯质量,使企业遭受损失。而应用免疫胶体金技术制备的国产试纸条价格较低,特别广泛适用于田间和口岸现场检测等工作[13]。
同时,2006年,魏梅生等[14]采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒,标记马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒的兔多克隆抗体,所得胶体金试纸条10 min内即可出检测结果,两种试纸条相互测试,未出现交叉反应。用健康马铃薯和缓冲液对照测试,两种试纸条结果都为阴性。试验结果表明,所制作的马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒检测试纸条,对新鲜的烟草和马铃薯病叶的检测,具有特异性强、灵敏度高的特点。目前,免疫胶体金技术在马铃薯病毒检测中的应用刚刚起步,大部分研究仅处于实验室阶段,真正田间应用较少。
4 结论
胶体金检测卡 篇9
近年来, 虾病毒检测的方法发展迅速, 针对这两种对虾病毒的诊断手段除了临床症状观察法和病理学的传统诊断方法外, 还有免疫学、分子杂交、PCR等方法[1,7,8,9,10]。为了简化试验操作, 加快诊断速度, 提高检测敏感性, 我们开发利用胶体金免疫层析技术检测对虾WSSV和IHHNV病毒的PCR扩增产物进行检测。通过PCR引物的特殊修饰, 再用抗体识别修饰的PCR产物并在胶体金免疫检测试剂条上呈色, 实现病毒扩增产物的快速和高灵敏度的检测。目前, 国内外还没有应用PCR-胶体金免疫层析方法同步检测对虾WSSV和IHHNV的研究报道。本研究实现的两病毒同步检测, 简化了操作程序和时间, 有助于尽早发现病原, 尽早处理和预防, 最大可能地减少病毒病害所带来的经济损失。
1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 试验样品与质粒
含白斑综合征病毒 (WSSV) 的虾样品DNA、含传染性皮下和造血器官坏死病毒 (IHHNV) 的样品DNA和发病的对虾样品均由浙江省水产技术推广总站提供, 样品为2013年采集于浙江省各地对虾养殖场, 其中DNA于-20℃保存, 样品虾于-80℃保存。p MD-WSSV、p MD-I-HHNV阳性重组质粒由本试验室构建保存于-20℃。
1.1.2 试剂盒
对虾WSSV和IHHNV双检试剂盒 (PCR-胶体金法) (普望生物技术有限公司, 杭州) 包含虾基因组DNA快速提取试剂、WSSV PCR-MIX、IHHNV PCR-MIX和胶体金免疫试剂条等。
1.2 DNA提取
取样品虾腹足 (约25~50 mg) , 用试剂盒中对虾基因组DNA快速提取试剂, 根据说明书指导提取基因组DNA。
引物设计根据Gen Bank中公布的WSSV 4个不同的地理株 (录入号码为AF369029、AF332093、NC 003225、AF440570) 和IHHNV 7个不同的地理株 (录入号码为GQ411199、AF218266、JN377975、NC002190、JX840067、JX258653、EF633688) 的全基因组序列, 通过BLAST比对分析序列的保守区, 利用Primer3web[11]分别设计检测WSSV和IHHNV的2对特异性引物。WSSV和IHHNV引物的扩增产物片段大小分别为227 bp、241 bp。引物由上海生物工程有限公司合成和修饰。普通检测引物和修饰后的标记引物序列见表1。国家标准《对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒 (IHHNV) 检测PCR法 (GB/T25878-2010) 》和《白斑综合征 (WSD) 诊断规程第2部分:套式PCR检测法 (GB/T 28630.2-2012) 》中PCR检测WSSV和IHHNV的 (套式) 引物序列 (表1) 由上海生物工程有限公司合成。
1.3 PCR反应
试验中采用WSSV PCR-MIX和IHHNV PCR-MIX为杭州普望生物技术有限公司产品, 试验反应体系10.0μL, 其中9.0μL PCR-MIX (Hangzhou Proprium Biotech Company Limited) 包含PCR Buffer、d NTPs (d U plus) 、Mg SO4、WSSV或IHHNV的上下游引物、Uracil-DNA Glycosylase、Taq HS, 反应时每管添加1.0μL提取的对虾基因组DNA, 混匀后进行PCR反应。
本试验是在同一次PCR反应中, 采用同一个反应程序, 用不同的引物同步对DNA模板进行扩增。对同步二温式PCR反应的各参数 (退火温度、延伸时间、Mg2+和引物浓度) 进行优化, 筛选出同步PCR反应中最佳反应条件, 其PCR程序:37℃10 min, 一个循环;94℃10 min, 一个循环;94℃10 s, 60℃30 s, 35个循环;最后置于4℃。
1.4 PCR产物的检测和结果判断
1.4.1 电泳检测和结果判断
取5.0μL PCR反应产物, 以Marker (Gen Star Biosolutions) 作为DNA分子量标准在2%琼脂糖凝胶 (添加溴化乙锭染料) 中进行电泳检测, 电泳结束后置于紫外光检测仪下观察, 并用凝胶成像系统 (上海培清科技有限公司) 拍照。
1.4.2 胶体金免疫层析检测和结果判断
在PCR产物管中加入90.0μL PBS缓冲溶液, 混匀后垂直滴加到胶体金免疫检测试剂条 (杭州普望生物技术有限公司) 的加样孔中, 等待紫红色条带的出现, 测试结果在滴加样本起5~10 min内读取。
若C线和T线均显色检验结果呈阳性;若C线显色而T线不显色则检测结果呈阴性;若C线不显色则结果无法判断。
1.4.3 灵敏度试验
将试验室的阳性重组质粒p MD-WSSV、p MD-IHHNV作为模板, 用Thermo Scientific Nano Drop 1 000紫外分光光度计分别测定其含量后, 将质粒作10倍进行梯度稀释, 并对上述模板进行同步PCR扩增, 反应结束后用PBS缓冲液将扩增产物稀释, 滴加到胶体金检测板的加样孔中检测PCR-胶体金层析检测的敏感性。
1.5 灵敏度比较试验
PCR-胶体金层析检测法与国家标准PCR检测方法的。将试验室的WSSV和IHHNV阳性样品 (浙江省水产技术推广总站提供) 作为模板, 用Thermo Scientific Nano Drop 1000紫外分光光度计分别测定其含量后, 将WSSV和IHHNV阳性DNA模板分别作10倍、3倍进行梯度稀释, 并对上述模板进行同步PCR扩增, 反应结束后用PBS缓冲液将扩增产物稀释, 滴加到胶体金检测板的加样孔中检测PCR-胶体金层析检测的敏感性。而国家标准巢式PCR检测WSSV中用外引物和内引物扩增的目的片段分别为1 447 bp、941 bp, 国家标准中一步式PCR检测IHHNV目的片段为389 bp。
2 结果
2.1 WSSV和IHHNV的PCR检测方法的建立
以含白斑综合征病毒 (WSSV) 的虾样品DNA、含传染性皮下和造血器官坏死病毒 (IHHNV) 的虾样品DNA作为模板进行PCR反应, 以病虾样品DNA为模板, 用WSSV和IHHNV检测的普通引物和修饰引物均可分别扩增得到预期的大小为227bp、241 bp的片段, 健康虾样品DNA及阴性水对照则无对应条带 (图1) 。试验表明, 用生物素、地高辛修饰的WSSV和IHHNV检测引物均可进行正常的PCR反应, 并能够分别扩增得到目标片段。
2.2 WSSV和IHHNV的胶体金层析检测方法的建立
以病虾样品DNA为模板, 检测WSSV和IHH-NV的2对修饰引物 (上下游分别为生物素和地高辛) 扩增的PCR产物经胶体金层析检测C线和T线均显色, 检测结果均为阳性 (图2, 3, 样品1) ;以健康虾样品DNA为模板, 检测WSSV和IHHNV的2对修饰引物 (上下游分别为生物素和地高辛) 扩增的PCR产物经胶体金层析检测C线显色, T线不显色, 检测结果均为阴性 (图2, 3, 样品2) ;如用没有修饰的引物, 以病虾样品DNA、健康虾样品DNA为模板, 检测WSSV和IHHNV的2对普通引物扩增的PCR产物经胶体金层析检测均是C线显色, T线不显色, 检测结果均为阴性 (图2, 3, 样品3-4) 。
注:1.WSSV修饰引物扩增阳性样品;2.WSSV普通引物扩增阳性样品;3.WSSV修饰引物扩增水 (阴性对照) ;4.WSSV普通引物扩增水 (阴性对照) ;5.IHHNV修饰引物扩增阳性样品;6.IHHNV普通引物扩增阳性样品;7.IHHNV修饰引物扩增水 (阴性对照) ;8.IHHNV普通引物扩增水 (阴性对照) ;M.DNA ladder (Gene Star公司, 从下至上依次为:100、250、500、750、1 000、2 000、3 000、5 000 bps) 。
注:1.WSSV修饰引物扩增阳性样品胶体金层析检测;2.WSSV普通引物扩增阳性样品胶体金层析检测;3.WSSV修饰引物扩增水 (阴性对照) 的胶体金层析检测;4.WSSV普通引物扩增水 (阴性对照) 的胶体金层析检测。
注:1.IHHNV修饰引物扩增阳性样品胶体金层析检测;2.IHHNV普通引物扩增阳性样品胶体金层析检测;3.IHHNV修饰引物扩增水 (阴性对照) 的胶体金层析检测;4.IHHNV普通引物扩增水 (阴性对照) 的胶体金层析检测。
2.3 PCR-胶体金层析检测的敏感度较目前国家标准提高10-100倍
将试验室的阳性重组质粒p MD-WSSV、p MD-IHHNV作为模板分别测其含量后, 将上述核酸作10倍梯度进行稀释, 进行PCR检测。PCR产物的电泳图见图4、5。5×103拷贝PCR产物EB染色后可见明显条带。我们然后对以上已稀释模板进行PCR-胶体金层析检测, 发现50到5×108拷贝检测为阳性, 小于50拷贝为阴性 (图6, 7) 。因此, 我们的体系最低能够检测到约为50拷贝的WSSV核酸模板和50拷贝的IHHNV模板, 与电泳检测PCR产物相比较, 胶体金检测灵敏度可明显提高10~100倍。
注:样品的起始拷贝数1~10分别为:5×108;5×107;5×106;5×105;5×104;5×103;5×102;50;5;阴性对照。M:DNA ladder (Takara公司, 1 500 bp、1 000 bp、900 bp、800 bp、700 bp、600 bp、500 bp、400 bp、300 bp、200 bp、100 bp) 。
注:样品1~10的起始拷贝数同图4。
注:样品1-10的起始拷贝数同图4。
注:样品1-10的起始拷贝数同图4。
3 讨论
病毒的快速、准确、简便的检测方法是对虾病害控制的关键。通常的PCR检测策略只是检测对虾病毒的某一个种类, 但是在对虾养殖过程中会同时受到不同病毒的侵染[12]。同时检测不同病毒, 是彻底全面控制对虾病毒的关键的第一步。因此目前许多研究采用特殊的PCR方法, 包括多重PCR[13,14]和同步PCR[15]进行同时检测多种病毒。本文研究的同步PCR方法检测病毒的策略是先检索、比对、筛选它们在Gen Bank中的核酸序列, 再应用软件同时批量设计出退火温度等参数非常相近的引物, 采用在同一次PCR反应中, 在不同的反应管中同时分别扩增样品中DNA模板, 从而达到同时检测样品中携带多种病毒的情况。我们用生物素、地高辛修饰WSSV和IHHNV病毒的PCR扩增引物, 扩增后的双链PCR产物含有生物素和地高辛标记, 可以和胶体金层析检测板上的生物素和地高辛抗体结合而被检测到。该研究建立的同步PCR-胶体金层析检测方法具有广泛的适用性, 可推广到其他病毒的检测。检测的特异性来自于引物的特异性, 设计不同病毒的特异性引物可以扩增出其特定的目标片断, 达到对不同病毒的检测。
本研究使用的PCR-MIX中含有UNG (尿嘧啶-DNA糖基酶) , 目的是为了防止遗留污染。但是研究表明在利用PCR对WSSV病毒进行检测中, UNG的使用使其检测灵敏度降低了一个数量级[15]。虽然如此, 本试验结果显示我们所建立的方法检测病毒灵敏度达到了50~100个拷贝, 而OIE巢式PCR与GB巢式PCR方法的国标方法[16]分别只能检测到104和103个病毒拷贝[6]。本研究所建立的检测方法的灵敏度有明显的提高 (10~100倍) , 为水产诊断感染病毒奠定了基础。同时, 本研究中PCR产物的检测也采用简便、快速的胶体金层析技术, 与电泳相比较, 不仅省时、省力, 而且无毒、环保。我们的检测方法10分钟内即可用肉眼观察检测板的显色结果, 大大缩短了常规的利用电泳和溴化乙锭 (EB) 染色检测PCR产物的时间 (约2 h) , 并让工作人员避免了接触有毒和诱导突变的试剂, 免除基层检测试验室购买电泳设备和荧光检测系统的投资。
胶体金检测卡 篇10
1 农产品质量安全快速检测
目前, “食品安全关键技术”课题专项已列入我国“十五”国家重大科技项目, “农药、兽药残留检测技术”作为其关键课题之一, 以提高食品质量水平, 保障人民身体健康, 提高我国农业和食品工业的市场竞争力及我国食品安全科技工作在国际上的影响力。其中氯霉素等农兽药残留快速检测方法、试剂盒及相关设备已作为其重要研究内容, 受到广泛关注。目前免疫胶体金快速检测已经占据整个检测市场20%, 预计在2010年将达到40%~50%。
快速检测, 顾名思义是在短时间内提供结果, 准确的说是在几分钟内。这种检测法是一种廉价的、一次性的基于膜的检测方法, 它能提供分析物存在于液体样品的视觉证据, 这种检测可以是独立的试纸条, 也可以以装在塑料盒中的形式进行。总的来说, 做此项检测至少需要200μL的液体标本, 可在5~10min内完成。在临床检测中, 样品可能有尿、血液、血清、唾液或其他体液。在非临床检测中, 样本可能是由土壤、粉尘、植物或者食品制备的微量溶液。
2 胶体金快速诊断技术特点
目前, 随着现代单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术的发展, 新兴了一种新型检测技术———胶体金免疫层析法 (Colloidal Gold Immunochromatographic Strip Assay, GICA) , 该方法具有操作简单、特异性强、不需要添加额外设备、快速 (5~10min即可得到检测结果) 等特点, 其反应所需要的原料的全部或大部分均已整合到试剂中, 当待测样品 (尿液、血清或组织样处理液) 加入到样品膜上后, 由于微孔滤膜的毛细管作用, 使抗原抗体反应在固相膜上快速进行, 反应通常只需数分钟, 测试结果以肉眼可见的显色条带来判断。其显色反应是由于所标记的有颜色的颗粒在反应区域聚集而形成的。目前在临床诊断中得到了广泛应用, 如传染病、早孕、癌症等检测。近年来, 胶体金检测技术已开始应用于小分子物质的检测, 如毒素、药残留、环境监测等非临床检测领域, 目前国外已经开发出用于链霉素、磺胺嘧啶等兽药残留检测的试剂条。
胶体金快速检测试剂采用了免疫胶体金技术, 将特异性抗原结合物和抗体分别固定于硝酸纤维膜上, 并与胶体金标记的抗单克隆抗体及其他试剂组装成胶体金快速检测试剂板, 应用层析式免疫竞争原理, 特异性检测牛奶、水产品、动物性肌肉组织等样品中的农兽药残留。根据灵敏度的质量要求, 基层检测单位、水产和禽畜养殖企业及牛奶、蜂制品加工企业大规模样本筛选的实际情况, 将试剂盒的灵敏度定为1~5ng/g (ng/m L) , 作为样品定性或半定量检测之用。
3 胶体金快速检测试剂特点
相比目前其他检测试剂, 包括:ELISA检测试剂盒、乳胶凝集法、放免法 (RIA) 、HPLC、质谱法等, 胶体金快速检测试剂具有以下优点。一是价格低。产品生产流程简单, 生产成本低。二是质量高。胶体金方法制备而成的试剂特异性强、灵敏度高、重复性好。三是灵活可靠。大量多样化的测试片或试剂盒检测的产生, 适用的环境范围较宽松, 其能提供变异系数在5%或更小范围的可靠结果。四是操作简便。胶体金方法制备而成的试剂以胶体金作为指示标记, 定性结果准确、快速, 操作简便, 可分批或单个样品及时检测。五是易于推广使用。试剂易保存, 操作人员无需专业培训, 不需要配备专门的仪器设备, 按说明书即可完成操作。
4 结语
总之, 由于精良的胶体金试剂有更大的敏感性和特异性的需求, 对胶体金的生产和使用严格的操作才可能取得成功, 在大量快速检测设计中对更高敏感性、可靠性及重现性要求的增加使得胶体金作为农副产品中农药、兽药残留量的检测首选。
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