免疫电镜技术

免疫电镜技术（精选4篇）

免疫电镜技术 篇1

摘要：免疫电镜技术通过将免疫学与超微结构形态学相结合, 利用抗原—抗体的专化性反应对抗原或抗体进行精确定位。介绍免疫电镜技术的原理、发展阶段及其在植物病毒研究中的应用。

关键词：免疫电镜技术,病原检测,病毒定位

免疫电镜技术 (Immune electron microscopy, IEM) 又称为免疫细胞化学技术 (Immunocytochemistry) , 出现于20世纪50年代。Singer (1959) 首次将铁蛋白作为标记物, 用于透射电镜观察取得了成功。随后, Nakane和Pierce (1966) 成功使用辣根过氧化酶 (HRP) 标记抗体来显示抗原—抗体反应部位。随着电镜技术的不断发展和完善, 免疫电镜技术已被广泛应用于病害诊断、病原鉴定和机理研究等许多领域。本文主要就免疫电镜技术的原理、发展阶段及其在植物病毒研究中的应用等进行概述。

1 免疫电镜技术的原理与分类

1.1 原理

利用带有特殊标记的抗体与相应抗原相结合形成具有一定的电子密度的复合物, 其能在电镜下观测出相应抗原所在部位。

1.2 发展阶段

免疫电镜技术的发展经历了3个阶段:铁蛋白标记免疫电镜技术、酶免疫电镜技术和胶体金免疫电镜定位技术。

(1) 铁蛋白标记免疫电镜技术。铁蛋白是一种含铁量约23%, 直径为12~14 nm, 大小约750 k Da的球形蛋白, 其核心是由4个铁亚基组成的高电子密度氢氧化铁胶态分子团, 外层由24个蛋白质亚单位组成近似球形的外壳[1~2]。铁蛋白通过双功能交联剂与抗体、葡萄球菌A蛋白 (SPA) 等共价结合, 具有分辩率高、散射能力强、可对抗原抗体复合物定位进行准确描述等特点[3]。但由于Fe原子的分子量太大, 难以透过细胞膜和组织, 因此只适用于细胞表面抗原定位。

(2) 酶免疫电镜技术。酶免疫电镜技术是利用酶高效率的催化作用对其底物的反应形成不同的电子密度, 运用电子显微镜观察, 确定酶的存在, 从而对抗原进行定位。目前, 常用的标记抗体的酶有辣根过氧化物酶 (HRP) 、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶、细胞色素C、微过氧化物酶等。酶免疫电镜技术不仅敏感性高, 定位准确, 能反映抗原的大小、形态及其强弱和位置。而且, 同一标本可先用光镜检查, 再进行电镜观察, 从而将光镜水平和电镜水平衔接起来。由于所用酶分子量较小, 易于透过细胞膜, 因此能对细胞内外的抗原进行定位。但是酶反应产物比较弥散, 分辨率低于铁蛋白和胶体金等颗粒性标记物。

(3) 胶体金免疫电镜定位技术。胶体金与铁蛋白一样具有高电子密度, 在电镜下比铁蛋白颗粒更致密, 易于辨认[4], 并且胶体金容易和毒素、葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白G、牛血清蛋白、酶、糖蛋白、抗生素、凝集素等大分子物质相结合[5~6]。根据这一特性Faulk和Taylor[7] (1971) 年首次将沙门氏菌的抗血清与胶体金颗粒结合, 运用直接免疫细胞化学技术成功检测到该病菌, 实现了病原物抗原在电镜水平的定位。Danscche等 (1981) 对该方法进行了改进, 通过使用银显液增强金颗粒的可见度, 提高了检测的灵敏性。在此基础上, Holgate等[8]将免疫金染色与银显影进行结合, 创立了免疫金银染色法 (immunogold staining IGS) 。近年来, 胶体金标记免疫电镜技术得到不断改进和发展, 己经广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等研究领域, 也成为植物免疫细胞化学分析中应用最广泛的一项技术。

2 免疫电镜技术在植物病毒研究中的应用

2.1 病毒诊断

傅仓生等[9]制备出颗粒大小适于植物病毒的胶体金的制备方法, 并以此胶体金与A蛋白结合的复合物为探针, 检测了烟草花叶病毒 (Tobacco mosaic virus, TMV) 。胡东维等[10]通过胶体金免疫电镜对郁金香杂色综合症病原进行了鉴定和检测。陈建平等[11]将胶体金免疫电镜技术用于检测感病汁液中线状病毒、球状病毒以及杆状病毒, 提高了抗血清对病毒的捕获能力。孙晓璐等[12]通过捕获法检测出甜菜坏死黄脉病毒和甜菜黑色焦枯病毒。陈剑平[13]运用胶体金与A蛋白相结合的探针对大麦黄花叶病毒 (Barley yellow mosaic virus, Ba YMV) 、大豆花叶病毒 (Soybcan mosaic virus, SMV) 和黄瓜花叶病毒 (Cucumber mosaic virus, CMV) 进行了电镜检测。

2.2 细胞定位

通过特殊标记的抗体与相应抗原相结合, 在免疫电镜下能够从亚细胞水平对所标记的抗原进行精准定位。Lin等[14] (1983) 结合组织超薄切片, 明确了大麦条纹花叶病毒 (barly strip mosaic virus, BSMV) 分布于小麦叶片细胞中, 并指出该技术适合于所有具备抗体的抗原蛋白的细胞内定位, 使得该技术在植物病毒的细胞定位研究上得到广泛应用。沈明山等[15] (1993) 运用免疫酶标超薄切片技术发现水仙花叶病毒 (Narcissus mosaic Virus, NMV) 分布于水仙病株叶片和鳞茎盘的细胞质和细胞核中。崔晓峰等[16]对烟草曲茎病毒 (Tobacco curly shoot virus, Tb CSV) 的复制蛋白 (Rep) 进行标记, 发现其存在于病株的细胞核中。此外, 秦红艳等[17]对甘蔗花叶病毒 (Sugarcane mosaic virus, SCMV) 进行标记后发现, 在玉米茎和叶脉的韧皮部筛管的细胞壁中有用于标记的金颗粒。

2.3 其他方面

免疫电镜技术可用于揭示病毒编码的蛋白在病毒的传播、复制、症状表达及病毒在植物体内的移动的机制。Rodriguez-Cerezo E等[18]对TVMV早期侵染阶段CP和C1亚细胞定位, 发现C1存在于胞间连丝附近, C1在风轮状结构中大量聚集部分进入细胞壁与内含体连接。从而证明风轮状内含体结构对病毒复制和其在细胞间转运起到重要作用。李云琴等[19]利用烟草曲茎病毒 (Tb CSV) AC4蛋白的抗血清免疫金定位试验表明, AC4蛋白介导AV1-TBCSV复合物移动到细胞质甚至胞间连丝, 有力于病毒的侵染。李红叶等[20]利用免疫电镜技术对葡萄扇叶病毒 (Grapevine fanleaf virus, GFLV) 移动蛋白P38进行标记, 结果显示胶体金能定位在细胞质、细胞壁和胞间连丝上, 在灌装结构中也能有少量标记, 从而说明GFLV是通过管状结构实现细胞间移动的。秦艳红等[21]对甘蔗花叶病毒 (CMV) C1蛋白进行标记, 结果在感病植株维管束的筛管细胞壁上有大量的金颗粒, 说明C1蛋白可能参与了病毒的细胞间移动。

3 小结与展望

由于免疫电镜技术的操作简便, 具有很好的直观性、灵敏性和特效性, 使得其在科学研究和对疾病组织内特殊物质表达位置及表达量的判断等方面具有广阔的应用前景, 特别是在判定和评价光镜免疫细胞化学假阴性及假阳性结果时起着关键作用。但免疫电镜技术也存在一些缺点, 例如免疫电镜技术因多种原因造成的重复性差或技术的不稳定性;目前电镜包埋所采用的是环氧树脂类, 都需高温聚合, 这样会使多种抗原活性减低或丧失。随着新技术如新型标记物的发现, 低温包埋剂、紫外低温聚合、化学聚合和冷冻切片等的运用, 免疫电镜技术将更加成熟, 也将更广泛应用于各个研究领域。

免疫电镜技术 篇2

作为生物体内重要的第二信使Ca2+,参与调节细胞的多种生理生化过程,如肌肉收缩,神经递质释放,激素分泌等[1]。 IP3R是存在于内质网,肌浆网及核膜上的一种配体门控Ca2+释放通道蛋白,1,4,5三磷酸肌醇(IP3)配体与其结合后,自身内部Ca2+通道开放,导致众多钙库释放Ca2+,诱导及调控Ca2+信号传导。前人的研究证实[2],在胰岛β细胞的分泌颗粒膜上存在IP3受体,但由于相关研究甚少,仍有人质疑其是否确实存在。因此,本研究应用胶体金免疫电镜的技术对大鼠胰岛β细胞胰岛素分泌颗粒的IP3R-Ⅲ型进行定位分析,进一步明确分泌颗粒上IP3R-Ⅲ型的存在,为进一步实验研究IP3R与胰岛素分泌的关系作出铺垫。

1材料与方法

1.1实验材料

成年雄性SD大鼠8只,体质量(250—300) g(第四军医大学实验动物中心),胶原酶Ⅴ(Sigma公司),Histopaque—1077(Sigma公司),RPMI-1640(Gibco公司),固定剂(4%多聚甲醛,0.1%戊二醛),TBS(pH7.4),TBS(pH8.2,含1%BSA),1%BSA,Hank’s液,双硫腙(Sigma公司)兔抗大鼠IP3R-Ⅲ型抗体(Abcam公司),5 nm胶体金标记的山羊抗兔IgG(Abcam公司),倒置显微镜(日本OLYMPUS公司),JEM—2000EX透射电镜(日本电子光学有限公司)。

1.2分离纯化大鼠胰岛细胞

采用本科室的方法[3]并有所改进,用100 mg/L戊巴比妥钠按40 mg/kg腹腔注射麻醉大鼠,固定四肢成仰卧位,胸腹部常规用乙醇消毒,腹部“个”字切口,分层进入腹腔,充分暴露胰腺,分离胆总管,破心放血处死,经胆总管内插管逆行注入预冷的0.5 mg/mLⅤ型胶原酶液10 mL,使胰腺膨胀,迅速摘取整个胰腺,37 ℃水浴静止消化28 min,振荡20 s使其呈细沙状,加入4 ℃Hank’s液40 mL终止消化。用50 mL离心管800 r/min离心3次,3 min/次,弃去上清, 于沉淀物中加入Histopaque—1077约 5 mL充分混匀,移入15 mL离心管中, 沿管壁缓慢加入5 mL Hanks’液,1 800 r/min离心18 min.以特制吸管吸取Hank’s液与Histopaque—1077形成的界面上的细胞团。4 ℃离心1 200 r/min 5 min,弃去上清,除去脂肪,加入Hank’s液洗一遍,离心1 000 r/min 5 min,加入6.67 mg/L双硫腙溶液鉴定染色,镜检可看到猩红色的胰岛细胞团,弃去上清,加入1%BSA,离心1 000 r/min 5 min,后将得到的沉淀放入配制好的固定剂中,4 ℃固定4 h。

1.3电镜制样

将标本从固定剂中取出,用PBS漂洗标本2次,10 min/次,充分洗涤后用不同浓度的酒精脱水,100%丙酮漂洗20 min。后将标本浸入丙酮+混合包埋液(1∶1)30 min,混合包埋液中12 h ,而后放入60 ℃恒温箱聚合24 h。超薄切片70 nm,覆于300目镍网上。

1.4免疫染色

在自制的染色湿盒中的培养皿中贴一层封口膜,将3%H2O2液滴加在封口膜上,使之形成水珠。将有切片的镍网朝下于水珠上蚀刻10 min。双蒸水洗3次,每次2 min,TBS(pH7.4)漂洗3次,每次2 min,1%BSA 37 ℃ 孵育20 min。加一抗兔抗大鼠IP3R-Ⅲ型抗体(1∶100)作用,室温3 h,后放4 ℃冰箱结合过夜。结合12 h后将培养皿从冰箱取出,室温放置1 h,TBS(pH7.4)漂洗5×3 min,TBS(pH8.2,含1%BSA)漂洗3次,每次2 min,加5nm胶体金标记的羊抗兔IgG(1∶100)作用,室温放置3 h后,TBS(pH7.4)漂洗4×3 min,双蒸水洗3次,每次5 min。醋酸铀,枸橼酸铅轻度复染15 min,蒸馏水漂洗5次,每次5 min。自然干燥后透射电子显微镜下观察,拍照,加速电压80 kV。对照组的镍网用PBS代替一抗孵育,其他步骤相同。

2结果

2.1用双硫腙染过色的胰岛细胞团

2.2胰岛素分泌颗粒上金颗粒标记的结果

在胰岛β细胞中,金颗粒大量定位于胰岛素分泌颗粒的内部及颗粒膜上。在分泌颗粒表面的切线部位,也有金颗粒的聚集(图2中的B)。对照组的一抗为PBS,二抗为5 nm胶体金标记的羊抗兔IgG(1∶100),照片中胰岛素分泌颗粒上无金颗粒标记(图2中的A)。

3讨论

在胰岛β细胞中,胰岛素分泌的绝对或相对不足是糖尿病发生的主要原因。研究证实[4],胰岛β细胞内胰岛素分泌颗粒胞裂外排分泌胰岛素是由胞内Ca2+浓度的升高而直接触发的。胞内Ca2+的升高主要来源于细胞膜上钙通道的Ca2+内流和胞内钙库Ca2+释放。胰岛β细胞中存在多种钙库[5],如IP3敏感钙库,尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NAADP)敏感钙库,兰诺定(ryanodine)敏感钙库及线粒体钙库等。IP3敏感钙库最早是在小鼠胰腺细胞上发现的,后来研究证实,在多种细胞中都存在。当激素或生长因子作用于质膜上的特异受体时,激活磷脂酶C(PLC)信号系统,活化PLC-β,水解质膜上的磷脂酰肌醇二磷酸(PIP2),产生胞内信号分子1,4,5-三磷酸肌醇(IP3)和二酰基甘油(DG)。IP3能够快速扩散到细胞内部,与IP3R结合,并通过改变IP3R构象使受体通道打开,而诱发IP3敏感钙库中Ca2+释放。尽管IP3R的激动剂是IP3本身,但受体也被胞浆内Ca2+浓度调控,并且Ca2+对IP3R具有双向调节作用[6]。目前研究发现五种IP3R,它们是同源四聚体,但各亚型在不同组织细胞的分布和多少不尽相同[5]。其中Ⅰ～Ⅲ型在β细胞上都有表达,Ⅲ型最为丰富,对IP3和Ca2+最不敏感,调节单相的钙瞬变。Ⅱ型受体对IP3和Ca2+最敏感,主要调节规律的钙振荡[6]。值得一提的是,同时敲除IP3R-Ⅱ型和IP3R-Ⅲ型基因的小鼠外分泌组织腺泡细胞的激素分泌减少,这与细胞内Ca2+信号传导通路严重受阻有关,此种小鼠由于消化困难可导致消瘦和低血糖症[7]。

A—对照组。(TEM×40 000) 1为A中放大的胰岛素分泌颗粒上未见金颗粒。(TEM×120 000),B—实验组。(TEM×40 000) 2为放大的B,可见胰岛素分泌颗粒膜上和颗粒内部都有金颗粒。(TEM×120 000), 3为B放大后的分泌颗粒和核糖体。(TEM×145 000) a为金颗粒,直径5 nm;b为核糖体,直径10 nm。

已有研究表明[8],分泌颗粒在β细胞中大约占10%的体积,其中有约40 mmol/LCa2+,是β细胞中含钙量最高的钙库[9]。在1981年,Hellman[10]等人发现,胰岛素分泌颗粒中存在很多可移动的钙库,葡萄糖刺激胰岛β细胞可导致胰岛素分泌颗粒内Ca2+的外排,提示胰岛β细胞胰岛素分泌颗粒参与了调节细胞内Ca2+的浓度变化。当胞外葡萄糖浓度升高时,β细胞通过膜上的葡萄糖转运体摄入葡萄糖,胞内葡萄糖代谢使ATP/ADP的比值增大,ATP敏感性钾通道(KATP)关闭,K+外流减少,细胞去极化,结果导致电压依赖性Ca2+通道开放,Ca2+内流,胞内Ca2+浓度升高,进而触发胰岛素分泌颗粒移动到近细胞膜处,与胞膜融合,胞吐,将颗粒内的胰岛素释放出来[11]。后来,Olivier[12]在实验中观察到,胰岛β细胞分泌囊泡中含有大量的Ca2+,其含量占总胰岛细胞Ca2+的25%—40%。既往研究发现在胰岛细胞和胰腺的总细胞膜上,前者的IP3R-Ⅲ型的数量远远比后者多。表明IP3R-Ⅲ型主要表达于胰岛细胞,约占胰腺体积的5%。此实验结果还发现当胞外葡萄糖浓度升高时,胞内IP3与颗粒内的IP3R-Ⅲ型结合,释放的Ca2+触发颗粒内钙库的开放,进而大量的Ca2+增加了细胞质中的Ca2+浓度,促进了颗粒的快速胞吐,分泌大量的胰岛素。而后颗粒释放的Ca2+可到达质膜,直接激活膜上的Ca2+结合蛋白,使Ca2+浓度下降,使Ca2+水平保持在合适水平,调节胞外分泌。1999年,Lee等研究发现用葡萄糖刺激离体大鼠胰岛,可明显增加胰岛IP3R-Ⅲ型的基因表达和蛋白分泌。IP3R-Ⅲ型的表达介导了β细胞中Ca2+的调控和胰岛素的分泌[13]。

本实验运用分离纯化大鼠胰岛,得到高纯度的胰岛细胞,通过免疫电镜技术,用胶体金标记IP3R-Ⅲ型,结果发现发现大量的IP3R-Ⅲ型分布于分泌颗粒膜和颗粒内部。而揭示IP3R-Ⅲ型具体是如何调节Ca2+释放的机理,有待于实验的进一步研究,了解IP3R-Ⅲ型促进胰岛素分泌的途径,有助于我们加深对糖尿病发病机制的认识,为糖尿病的治疗奠定理论基础。

植物透射电镜样品制备技术的改进 篇3

1 实验材料与仪器

在实验过程中,选择双子叶植物、单子叶植物的嫩茎、叶作为实验材料,并且在叶的质地上分别选择表面具毛的纸质叶和表面无毛的革质叶进行实验(表1);取样时间是2006年4月;取样植物中双子叶植物是:刺毛杜鹃Rhododendron championae Hook,华丽杜鹃[1]Rh.farrerae Tate et Sweet,满山红Rh.mariesii Hemsl.et Wils,马银花Rh.ovatum(Lindl.)Planch.ex Maxim.,滇白珠Gaultheria leucocarpa Bl.var.crenulata(Kurz)T.Z.Hsu,构树Broussonetia papyrifera(L.)Vent.;单子叶植物是广东石豆兰茎Bulbophyllum kwangtungensis Schltr.。实验所使用的透射电镜是日立H—600型,工作电压为75kv。

2 制备技术研究

2.1 取样与固定

取当年生叶片(展叶后7~20天),无病虫危害,无其他污染。及时剪成长1cm、宽0.5cm,迅速放在2.5%的戊二醛固定液中固定。戊二醛必须在0℃~4℃条件下保存,温度过高会使戊二醛分解失效。一般固定12~48 h,如果需要保存较长时间,必须每隔5天更换1次戊二醛液,但保存最长时间最好不要超过20天。

2.2 预处理

首先,从戊二醛固定液中取出植物物料,用磷酸缓冲液洗涤4次,每次15min,目的是把剩余的戊二醛冲洗干净。磷酸缓冲液的配制方法[2]是:①甲液:取Na2HPO4·2H2O 35.61 g,加蒸馏水1 000mL,配制成0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液为甲液;②乙液:取Na2HPO4·2H2O 27.6 g,加蒸馏水1 000m L,配制成0.2mol/L的磷酸氢二钠溶液为乙液。然后按表2将甲、乙两种溶液混合即得到所需要的p H的缓冲液,本次实验取p H值6.6。

接着,用1%的四氧化锇(OsO4)作后固定液,固定12 h,固定温度为-4℃,然后用蒸馏水冲洗2次,每次15min[3],在常温下进行。

最后,进行逐步、渐进的乙醇或丙酮脱水。分别进行50%→70%→90%的乙醇脱水,每次15min。接着用90%乙醇和90%丙酮的等体积比例混合液脱水15min。再用90%丙酮脱水15min。最后用100%的丙酮脱水2次,每次15min。脱水温度均为0℃~4℃,即每次换好脱水剂之后立即放进符合温度要求的冰箱。

2.3 包埋

首先是渗透,即分别用丙酮:包埋剂(国产环氧树脂618)=3∶1、1∶1、和1∶3的渗透剂进行渗透,每种比例渗透24 h,共计渗透72 h,处理温度均为32℃~35℃。(先将样品放在青霉素瓶中,然后再加渗透剂进行渗透)。最后,加纯包埋剂(环氧丙烷包埋剂618)渗透24 h。

接着是聚合,这一步的具体做法是:把包埋剂注入包埋块板孔中,从青霉素瓶中取出样品(这是样品有些粘稠,动作要迅速),摆放在包埋板孔中(注意不要遮挡编号)。接着又用60℃聚合48 h(放在恒温箱)。最后取出进行修块、光镜定位。

2.4 切片

用于电镜观察的样品切片必须是超薄切片,可用LKB—5型机切片,厚度约为50~70nm。捞出后用构椽酸铅、2%醋酸铀双染色[4](分别用铀和铅染色),在日立H—600型电镜下观察、拍摄。

3 结果与讨论

从图版可以看出,不同类群的各种细胞器如质膜、叶绿体、前质体、油滴、液泡等都得到较好的保存,连很微细的内质网、微管也完整地保留下来了,而且比较清晰,说明这种方法适应于种子植物不同类群的电镜样品制备。此外,这次实验所使用的电镜是日本1980年代的产品,性能具有较大的局限性,如放大倍数仅25 000倍以下等,但观察拍摄的图片却比较清晰、完整,说明这次电镜样品制备技术的改进方法可以在实践中应用,并且能够获得较好的效果。

与常规的植物电镜样品制备技术相比,这次实验主要进行了2个环节的改进:①在渗胶过程中,不添加DMP(2,4,6三、二甲氨甲基苯酚)来控制组织块的硬度,而是利用植物组织中细胞壁富含果胶质、纤维素等物质自我调节组织块的硬度。②通过对所拍摄的照片进行分析,认为根据取样器官的幼嫩程度,调整渗胶的时间可获得较好的清晰度和完整的细胞器图象,即如果植物器官在发育时间为40~60天的阶段,则渗胶时间为60~64 h;如果植物器官在发育时间为40天以下,则渗胶时间为65~75 h。

图版说明:

1.马银花茎Rhododendron ovatum,×12000:A示内质网;B示高尔基体;C示胞质类核仁。

2.满山红茎Rh.mariesii,×12000:A示内质网;B示核膜孔[5];C示核膜;D示线粒体;E示叶绿体基粒;F示叶绿体的核糖体。

3.刺毛杜鹃茎Rh.championae,×5000:A示前质体;B示液泡。

4.华丽杜鹃叶Rh.farrerae,×17000:A示叶绿体基粒;B示淀粉粒。5.滇白珠Gaultheria leucocarpa Bl.var.crenulata,×3500:A示芳香油细胞;B示胞间连丝。

6.构树茎Broussonetia papyrifera,×8000:A示微官;B示核膜孔;C示叶绿体;D示淀粉粒。

7.构树茎(纵切)B.papyrifera,×4000:A示淀粉粒;B示筛板;C示液泡。

8.广东石豆兰茎Bulbophyllum kwangtungensis Schltr.,×8000:A示肼胝质壁;B示内质网;C示结晶细胞;D示线粒体。

摘要：应用植物透射电镜样品制备技术的改进方法对双子叶植物、单子叶植物营养器官进行电子显微镜超薄切片制备效果的实验研究,目的是找到一种比常规制备方法更简便、更经济、效果更好的制备技术。实验结果表明:通过对常规制备技术两个方面的改良,可以保存较多的微细结构而不被破坏,清晰度较高,并能保持其原有的形态;制备方法也简便、经济。

关键词：植物,电镜超薄切片,技术改进

参考文献

[1]Chamberlain D.F.&Rae S.J.A Revison of Rhododendron.Ⅳ Subgenus Tsutsusi.Edingburgh Journal ofBotany1990,47(2):144-146.

[2]李素文.细胞生物学实验[M].北京:高等教育出版社,2001.

[3]魏群.生物工程技术实验[M].北京:高等教育出版社,2002.

[4]蓝盛银,徐珍秀.植物花粉剥离观察扫描电镜图解[M].北京:科学出版社,1996.

免疫电镜技术 篇4

近年来, 随着教育体制改革的不断深入, 对高等院校的理论教学、实验教学及实践环节等提出了更高的要求[2]。然而, 多年来高校实验教学从属于理论教学, 实验教学仅仅是理论教学的一种辅助手段, 并不是一个独立的教学体系。传统的实验教学模式往往以班级为教学单位, 教师严格按照教学计划中的实验学时在课堂预先布置实验题目, 讲解实验目的、实验要求及实验原理, 学生在实验课上按照实验要求完成实验内容, 课后书写统一格式的实验报告, 导致学生形成了对教师的依赖心理。这种教学模式不能根据学生现有的能力因材施教, 多以演示性和示范性教学内容为主, 教学方法陈旧, 学生被动学习, 忽视了学生认知主体的地位, 过分注重教师的讲授, 常导致理论与实践脱节, 未能有意识地引导学生用理论指导实践或从实践问题中寻求解决的理论方法。所以, 传统的实验教学不能充分发挥学生的学习自主性, 严重影响了学生的学习兴趣, 禁锢了学生创新思维与创造性发展;学生个性发展受到严重忽视, 不利于激发学生的创新意识和创新能力, 培养出来的学生动手能力差[3]。

为培养适应社会发展需要的高素质医学人才, 合理利用教育资源, 充分发挥学生学习的主动性, 提高学生的学习兴趣, 满足学生掌握实践技能的要求, 结合医学电镜实验室条件及医学电镜技术实验的特点, 2011年, 我院超微病理室面向选修医用电镜技术课程的硕士研究生开设了电镜样品制备技术的开放式实验, 取得了较好的效果。与传统实验教学方法相比, 我们在以下方面做了一些尝试与探索。

1 灵活安排开放式实验课时间, 合理运用指导方式

开放式实验意味着学生进入实验室的时间完全自由。为保证开放式实验的正常开展并获得良好的教学效果, 在采用预约实验时间常规方法的同时, 注意尊重学生意见, 充分发挥学生的主观能动性、积极性和创造性。因为选修的学生涉及医学的各个专业, 有些专业的学生因为较早进入临床实习, 参加实验课的时间受限制, 所以我们安排了更加灵活的实验时间, 指导教师预先做好实验准备与个案, 让学生自由选择时间及个案参加, 对每个实验没有结束时间的规定, 而且允许失败后重新开始, 直至实验成功。虽然教师在整个开放式实验教学过程中比以往付出更多的时间、精力和耐心, 但学生能够更好地掌握所学实验技术, 取得了较好的教学效果。

2 案例教学法

密切结合临床超微病理诊断实践及科研服务工作, 精心设计实验内容, 充分调动学生的积极性。

根据临床检测标本的要求, 预先安排学生学习相关知识, 使学生在实验准备阶段主动学习新知识, 充分调动其学习的积极性。举例:临床怀疑某患者朗格罕氏组织细胞增生, 送检皮肤组织标本, 要求超微病理诊断确诊。在电镜样品的制备过程中, 要求切到皮肤的全层, 在半薄定位的实验过程中定位到表皮下的大体积细胞, 在电镜观察阶段认出是否有朗格罕氏细胞增生。首先, 要求学生在实验准备阶段学习和复习该病的特点, 掌握朗格罕氏组织细胞的超微结构特征;其次, 在实验的组织包埋阶段, 学生要注意组织包埋的方向, 保证能够满足切片的要求;最后, 要能够准确半薄定位, 满足诊断需求。通过以上结合案例开展的开放式实验教学, 学生在样品制备的实验过程中, 不仅掌握了实验技术, 而且还主动学习了相应的理论知识, 学习过程生动有趣, 学习效果较好。

3 合理分组, 利用现有条件充分保障实验器材的合理使用

随着高校研究生招生规模的扩大, 在校硕士研究生人数明显增加, 学生实验教学的场地、实验设备捉襟见肘, 所以很多实验课实际上是教师的示教课、学生的观摩课, 学生缺少动手的机会。这种情况使学生很难真正掌握所学的实验技术。由于在实验过程中缺乏热情, 很多学生在实验课程后期产生消极情绪, 以应付的态度对待实验课。这样的恶性循环使得学生不能将所学理论与实验技术应用在后期的科研设计当中, 或是学生虽然在科研设计中运用了该项技术, 但在课题实施的操作阶段不知从何下手, 还需教师重新讲解, 有些学生甚至需要教师为其准备材料和实验操作。为解决这些问题, 我们根据科室每周2～3次的样品制备时间, 将学生合理分组, 严格限制每组学生人数, 保证学生都有动手的机会, 实验器材能合理使用, 确保参加实验课程学习的学生, 都能够学有所得, 有所收获。而且通过这样的安排, 教师可以讲解的更加详细、具体, 细心指导每位学生的操作。学生在动手操作的过程中会不断发现问题、解决问题, 师生之间交流增多, 同学之间有更多的讨论与协作。最终当学生完成实验时, 不但掌握了该项技术, 还接受了早期科研培训, 为其今后科研工作的开展奠定了基础。

总而言之, 开放式实验教学可以充分利用现有的教学条件, 把更多的学生吸引到实验室, 提高学生对医学电镜技术和方法的学习兴趣;同时, 开放式实验教学也实现了理论与实践教学的有机结合, 极大地提高了学习效率[4]。我们发现一旦学生摆脱枯燥的学习方式, 就能从实践中体会到乐趣, 爆发出无穷的能量。而且, 开放式实验教学对教师也提出了更高的要求, 促使教师不断提高教学水平。在这种良性循环中, 教与学得到相互促进, 相得益彰。学生逐渐养成主动学习、勤于思考、善于总结的良好习惯, 培养了创新精神和实践能力, 从而提高了教学质量[5]。医学电镜技术开放式实验教学的现实意义更加重要。运用医学电镜技术观察研究生物细胞超微结构已有半个世纪的历史, 而将医学电镜技术用于临床研究和疾病诊断也近40年。它作为一种先进手段, 在医学科学的研究和临床疾病诊断方面做出了重大贡献, 不断完善和丰富了病理学内容, 为临床疑难疾病的诊断和鉴别诊断提供了更可靠的科学依据。通过开展开放式实验教学, 可以使医学硕士研究生更好地认识和掌握医学电镜技术, 为理解超微结构与超微病理学知识及其应用打下坚实的基础;同时掌握该技术可为今后的临床及科研工作提供思路和方法, 从而达到活学活用、学以致用的目的。

参考文献

[1]蒋吉英, 姜红心, 李磊, 等.医学研究生培养模式的探讨[J].山西医科大学学报:基础医学教育版, 2006, 8 (1) :34-36.

[2]苏博, 陈胜秋, 马飞, 等.实施新的人才培养方案造就21世纪高素质人才[J].中国高等医学教育, 2000 (1) :13-16.

[3]杨金奎.医学研究生教育中创新能力的培养[J].医学研究通讯, 2005, 34 (2) :76-77.

[4]刘其涛, 井西学, 赵仁宏, 等.提高实验室开放教学效果的方法研究[J].实验室科学, 2009 (4) :124-126.