生物分离与纯化技术（共9篇）
生物分离与纯化技术 篇1
摘要：任课教师根据药物分离与纯化技术课程的地位和特点, 深入企业调研与行业专家共同开发课程, 将教学内容设计为四个学习情境、五个项目任务、十一个知识模块、二十二个子模块、六个案例分析。教学中采用项目教学法为主, 案例教学法、讲授法、任务驱动教学法、讨论法等为辅的多种教学方法, 充分调动学生的自主学习的积极性, 提高了学生的团队合作意识, 取得良好的教学效果。
关键词：药物分离与纯化,项目教学法,课程改革
药物的分离与纯化是化学合成法生产药物、从天然药物提取药物、微生物法生产药物等多种方法获得药物收率、纯度及进一步测定其结构、研究其药理作用和毒性的首要条件, 也是对药物进行化学结构改造、化学合成、研究化学结构与疗效关系的前提[1], 其分离与纯化技术的效率、安全性、环保、节能等又直接影响到药品生产的经济成本和企业的可持续发展, 是制药的关键环节之一, 因此该课程是化学制药专业学习领域的核心技能课程之一, 在我院化学制药专业人才培养方案中课时为60课时, 主要内容为药物分离与纯化技术的基本概念、原理、设备的操作及维护等知识和技能。
1 改革依据
2006年至2012年, 我国医药行业工业总产值的年复合增长率达到24.01%, “十二五”期间我国政府医药卫生体制改革投入力度和强度要高于2009年至2011年的改革投入, 随着人民健康意识的增强, 国内药品的需求量持续上升, 经济合作与发展组织预测到2020年我国药品市场规模将会达到全球第二, 仅次于美国[2]。未来的制药企业将需要大批的高素质、高技能型药品生产技术的专门人才。为适应社会对制药专业人才的需求, 高职院校在不断地进行专业教学改革、课程改革。对往届毕业生跟踪调查表明制药专业的学生多在中药企业、化学制药企业、生物制药企业就业。目前国内高职院校开设的药物分离与纯化课程多偏向于生物分离与纯化技术、天然药物化学的分离, 课程内容不能拓展学生多方面的就业能力。基于此, 笔者与教学团队对江、浙、沪的制药企业的药物分离与纯化岗位调查, 其调查结果图1是改革教学内容的重要依据。
2 合理选取教学内容, 建设动态化教学资源
课题组成员与企业一线工程技术人员一起以职业岗位所需素养、知识和技能为出发点, 将传统课程的教学内容进行整合, 编制了与制药企业职业岗位对接的“情境”、“知识模块”、“项目任务”、“案例分析”的理实一体化教材, 将教学内容设计成四个学习情境、五个项目任务、十一个知识模块、二十二个子模块、六个案例分析。为突出对高职学生的职业岗位技能的培养, 提高学生的就业竞争力, 根据药物分离、纯化岗位的要求, 体现教学内容与企业实际需求的对接, 知识模块及子模块遵循“知识够用, 强化技能”的原则, 重点学习典型仪器和设备的操作、维护、工艺参数的影响、常见问题的分析、判断和排除, 例如“色谱技术”模块重点介绍工业用制备色谱、“干燥技术”模块重点介绍冷冻干燥机等。药物分离与纯化技术是微生物学、化学工程学、药物化学、物理化学等多学科交叉渗透[3]的前沿性边缘学科与综合技术, 技术发展迅速、知识更新快, 一本教材难以涵盖所有的知识, 为适应教师教学与学生自主学习的需要, 教学团队利用信息化技术建设多形式、动态、共享的药物分离与纯化技术精品资源共享课程, 其内容主要一、药物分离与纯化的前沿技术和国内外学者研究的热点问题;二、新型药物分离与纯化设备;三、药品标准及其变化;四、药物制剂工、高级药物制剂工、药物检验工等职业考核信息、资格考试题库等。教学资源形式有名师讲课视频、授课教师课件、学术报告讲座、期刊文献、硕博论文、科技作品等。通过增加补充性、更新性和延伸性教辅资料, 使课程资源更加完善, 完成专业课程内容与职业标准对接, 学历证书与职业资格证书对接。 (表1)
3 采用多种教学方法强化学生技能、提高教学效果
药物分离与纯化技术课程还涉及大量的实验技能和操作, 传统的教学方法是把该课程分为理论课和实践课两个独立的教学环节, 容易造成理论和实践的脱节, 学生知识的连贯性和教学效果不佳。在课程改革后, 配备“双师”教师, 使用工业化生产设备、小型实验仪器和设备、精品资源共享课程等教学资源, 实施“计划、任务、方案、实施、检查、评估”的工作过程的项目教学法为主, 以案例教学法、讲授法、任务驱动教学法[4]、参观教学法、讨论法等为辅的多种教学方法。以“槐米中芸香苷的提取、分离与鉴定”为例, 具体实施步骤见表2, 在项目实施过程中将学生分组, 每组2~3人[5], 将项目任务书下发给学生团队, 学生在规定的时间内制定方案、完成项目、教师点评、学生互评、学生实际操作及技能提高, 完成整个项目任务 (表2) 。
以工作过程为导向, 工作任务为驱动力, 进行教学的项目教学法, 实行课堂翻转和角色转变, 改变了以往教师讲实验内容, 然后学生动手操作的被动学习过程, 体现了“教师为主导, 学生为主体”的教学原则, 完成教学过程与生产过程对接的教学过程, 充分发挥学生在学习过程中的主观能动性。
4 改革成效
药物分离与纯化技术课程经过三年的建设与改革, 取得了令人满意的成绩, 教学效果显著提高, 受到学生们的普遍欢迎, 校内督导、学生、同行、领导对本课题组成员主讲教师的教学综合评价得分均在良好以上。我院化学制药专业的毕业生受到扬农股份、扬农集团、扬州联博药业、南京红太阳等制药公司工作企业领导的好评、用人单位的高度认可。
参考文献
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[2]中国国内医药行业发展状况分析.中商情报网 (http://www.askci.com/) .
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[5]郭双华, 秦建华.试析工作过程系统化课程体系中的项目开发, 2009 (10) 129-130.
生物分离与纯化技术 篇2
1.1课程设计理念
结合学生情况、教学资源等实际，课程设计上力求达到可操作性、科学性和规范性。以职业岗位需要的知识技能为课程设计的依据，按照企业实际药物分离纯化生产过程进行教学，依次讲授基本原理、萃取技术、蒸馏技术、色谱分离技术、膜分离技术、固液分离技术、固相析出技术、干燥技术和电泳技术。合理的教学内容是实现教学目标的保证，药物分离与纯化技术课程涉及一些工程计算等工程性比较强的内容，学生可以把这些知识作为兴趣课后学习，而在课堂上要精选分离纯化基础原理、技术等教学内容，以“必需、够用”为原则，并且适当引入新技术，拓宽学生的视野。减少知识的抽象性，多采用实物、模型、多媒体等直观教学的形式，探索现场教学模式，提高教学效果。要为学生学习和掌握技能奠定必要、足够的理论基础，同时注意理论知识的把握程度，不一味强调理论知识的重要性和完整性，在淡化理论的同时根据实际工作需求培养学生的实践技能。
1.2积极引导启发鼓励
学生认识不到课程的重要性主要是因为没有明确的职业规划，对未来职业的具体工作过程不了解，意识不到课程内容在以后工作中的作用。适当给学生介绍药品生产工作岗位的具体任务流程，同时建立生产工艺技术与质量控制的概念，让学生认识到药物分离与纯化技术在整个制药过程中的关键性地位。在传授知识的同时还要注重培养学生良好的学习习惯，利用课后时间与学生接触，多去理解学生的感受，给予他们积极的鼓励和建议。
1.3合理导入适当拓展
上好课的前提是备好课，不仅要选用合适的教材，还要提前了解学生相关知识基础和理解接受能力，在课堂教学中要随时观察学生反应，以合理的速度引导学习，顺利完成教学任务。绪论作为教学的开始，是该课程的第一堂课，其教学效果不仅直接影响到教师后续的教学，也影响到学生对该课程的学习。绪论中对整个课程的导入很关键，以后讲授每个章节时对章节的导入也很重要，良好的导入能激发学生的兴趣，改善教学效果。与飞速发展的科学技术相比，教材的内容总是滞后的，教学内容不能局限于教材。教师要关注最近研究进展，把学科发展前沿的技术介绍给学生。还可以自己的科研经验作为教学素材，让学生了解科学的研究方法和过程。例如薄层色谱是实验室广泛应用的分离纯化方法，其原理、操作在课本中都会有详细的介绍，但在实际科研过程中会遇到很多问题，而这些问题的解决方法是在课本里面学不到的，教师可以把这些经验归纳出来，传授给学生。另外还要补充一些GMP的相关知识，从整体上介绍药物从研发到制成成品的过程，让学生有一个整体的认识。
1.4方法多样合理搭配
本课程理论深奥抽象，与日常生活关系不大，在教学中如果仅用语言和板书进行讲述，缺乏形象直观的展示，学生会对很多知识点理解困难，对学习失去兴趣。多媒体课件可以展示各种图片、动画、影像资料，比传统教学方式更为直观。它能使复杂、抽象的理论简单化、形象化，还能解决实验条件不足的问题，开阔学生眼界、拓宽知识面。由于教学资源的限制，实验室条件很难跟上先进仪器设备的发展，也不可能具备所有的制药机械，借助多媒体可以将新技术、新设备直观的展示给学生，展示完整的工艺流程，加深印象。但多媒体包含知识量大，授课速度快，学生注意力容易分散，所以多媒体不能代替传统教学方法。教师在用多媒体授课的同时用板书将知识点进行归纳，适当提问，有利于教师和学生之间的互动交流，控制授课节奏，给学生留出消化和吸收知识的时间。教学方式有很多种，要合理搭配，取长补短。
1.5适当举例激发兴趣
教材编写通常采用的是学术用语，如果整节课都进行原理性知识的讲解，很多学生会感到迷茫，课堂气氛会陷入枯燥、沉闷的状态。应该适当调整方式，联系日常生活、生产和科研，增强课堂学习的趣味性、实用性及先进性。这样不仅能够加深学生对相关知识的理解，为课堂教学增加活跃的气氛，也让学生认识到课程的重要性，激发学习积极性。在讲授每章节的内容时，为减少学生对新知识的陌生感，激发其求知欲，可以将教学内容与实际生活中的一些情景结合起来，将抽象的知识点变成学生感兴趣的内容。例如在讲授膜分离时，让学生看到实验室最常见也最简单的滤纸过滤；在环境保护方面，让学生了解如何用液膜法处理废水；为学生介绍在进行海水淡化时用到的电渗析技术；也给学生介绍海带（生物膜）富集碘的原因。
1.6重视实验校企结合药物分离与纯化技术是一门实践性很强的学科，学生要在实训实践中学习并掌握相关的知识与技能。但目前受实训学时和条件的限制，实验内容的安排多为验证性实验。学生只要按照教师给出的步骤按部就班的操作，无需思考就能得到结果，这种实训模式不利于学生培养解决实际问题的职业能力。在开展实训之前要鼓励学生自己查阅文献资料，设计实验过程，验证理论知识，提高学生实际动手能力和分析问题、解决问题及独立工作的能力。近年来新技术、新设备不断涌现，迅速渗透到生产中的各个领域。除了在课堂上给学生介绍企业岗位职责要求和最新的分离纯化技术信息之外，教师还应与企业技术人员密切合作，组织学生参观药品生产企业，让学生参与药品生产中遇到的实际问题，了解书本和实际生产上的差距，弥补书本知识的局限性，开拓学生眼界。
1.7过程考核发挥导向作用
传统的考核结果往往只考虑期末卷面成绩，这样不利于调动学生的积极性，很容易忽略学生在平时课堂中的表现和创新能力的培养。本课程的考核方式为：学生期末总成绩（百分制）=期末考试卷面成绩（50%）+课堂出勤及回答问题表现（20%）+小论文撰写（10%）+实训操作（20%）。考核方式从四个方面进行综合测评，不仅重视结果，更重视过程。小论文的撰写要求学生选择自己感兴趣的一种分离纯化技术，查阅文献资料，设计一个具体的方案，将这种技术应用到实际的生产中。另外要求学生对课程有所反馈，提出自己的意见和建议。
2.小结
生物分离与纯化技术 篇3
关键词：大孔吸附树脂,真菌,发酵法,番茄红素,分离纯化
番茄红素(lycopene)是一种具有11个共轭双键的脂溶性不饱和碳氢化合物,是类胡萝卜素的一种。在所有的类胡萝卜素中,番茄红素具有最强的消除单线氧功能,其对单线氧的消除能力是β-胡萝卜素的两倍,抗氧化作用也明显优于β-胡萝卜素,同时还具有清除自由基、诱导细胞分化、减少DNA损伤等作用[1,2],在消除氧自由基、降低癌症发病率、增强人体免疫功能以及防治心脑血管疾病方面具有良好的应用前景[3]。
目前国内应用的番茄红素主要源自从番茄中提取,然而即使是含番茄红素较高的品种,其番茄红素含量也仅有140~200 mg·kg-1,纯化工艺较为复杂。使用微生物法发酵生产具有生产周期短、产生菌更易于基因改造而大幅度提高产量等优势。前文中我们报道了筛选到番茄红素产生菌,并通过添加环化酶抑制剂可提高番茄红素的累积量[4],该菌株经过诱变选育,产量可达500 mg·L-1以上。本文拟对微生物发酵产物中番茄红素的吸附法分离纯化进行初步探索,为发酵法生产番茄红素奠定基础。
1 材料
1.1 菌株
三孢布拉霉(Blakeslea trispora):本实验室筛选保存[4]。
1.2 培养基
斜面培养基为PDA 培养基[5]。
种子培养基各成分质量分数:葡萄糖1.0%,黄豆粉3.0%,玉米浆6.0%,KH2PO4 0.05%,MgSO4 0.025%,VB1 0.005%,pH6.5~7.0。
发酵培养基各成分质量分数:可溶性淀粉4.5%,葡萄糖1.5%,黄豆饼粉2%,玉米浆4%,KH2PO4 0.4%,MgSO40.02%,VB1 0.001%,pH6.5~7.0,装液量40ml/250ml。
1.3 仪器及试剂
高效液相色谱仪为Agilent1100(安捷伦科技有限公司);分离柱为Lichrospher-5-C18,5 μm,250 mm×4.6 mm(江苏汉邦科技公司);番茄红素对照品(纯度≥95%):上海融禾医药科技发展有限公司;X-5大孔吸附树脂(比表面积500~600 m2/g;粒度0.315~1.25 mm≥95%;平均孔径300 nm):安徽三星树脂科技有限公司;干燥烟草:福建龙岩卷烟厂;甲醇、异丙醇和正己烷为色谱纯,其它试剂均为国产分析纯。
2 方法
2.1 烟草水提物的制备
取干燥烟草2 g,加入水40 mL,超声提取15 min,过滤后取滤液,121℃灭菌15 min。
2.2 菌株的培养及发酵
将(+)、(-)菌接入种子培养基,在25℃、150 r·min-1条件下分别培养24 h。培养完毕后,(+)、(-)菌以1:10混合得种子液。然后将种子液以接种量10%接入发酵培养基,于28℃,220 r·min-1培养5 d;在发酵培养48 h时,在发酵培养基中加入75 ml·L-1的烟草水提取物[6]。
2.3 番茄红素的制备
2.3.1 番茄红素的抽提
三孢布拉霉发酵液菌丝体抽滤后避光60℃减压烘干,用石油醚反复提取至提取液无色,合并提取液,经真空浓缩蒸干后用少量氯仿溶解,制备成浓缩液,-20℃保存备用。
2.3.2 X-5树脂吸附
准确称取处理后的干树脂0.25 g于50 mL磨口具塞三角瓶中,将番茄红素浓缩液配制成适当浓度的氯仿溶液,取10 mL加入三角瓶中于水浴振荡器中在4℃或25℃、100 r·min-1、避光条件下振荡吸附。隔时取样测定吸附量及吸附率,计算公式如下:
吸附量undefined
吸附率undefined
将番茄红素浓缩液配制成不同浓度的氯仿溶液,取10 mL分别加入各含有0.25 g树脂的三角瓶中进行振荡吸附,达到吸附平衡后分别计算吸附量及吸附率,绘制吸附等温线。根据吸附等温线确定吸附条件。
2.3.3 树脂的解吸
将达到吸附平衡的树脂抽滤后于室温下避光真空干燥至恒重,精密称取6份等质量的树脂于磨口三角瓶中,各加入10 mL丙酮、正己烷、石油醚、无水乙醇、乙酸乙酯及二氯甲烷,于水浴振荡器中25℃、100 r·min-1条件下避光解吸。达到解吸平衡后根据吸附量分别计算在各解吸剂中的解吸率,从而确定合适的解吸溶剂。解吸率计算公式如下:
解吸率undefined
2.3.4 番茄红素的纯化及结晶
将经过真空干燥过的粗提取物用适量氯仿溶解,上吸附柱(柱床高度10.0 cm,内径1.1 cm);然后分别用2BV左右无水乙醇以最大流速快速通过柱子洗涤树脂,再用乙酸乙酯:无水乙醇=3:7和乙酸乙酯:无水乙醇=5:5的混合溶剂以1ml/min的流速阶段洗脱,分部收集橙红色的洗脱液,合并后置于-20℃低温结晶,于10000 r·min-1下离心收集晶体,用少量乙醇洗涤,离心,真空干燥至恒重。
2.4 含量测定
色谱流动相为甲醇:正己烷:异丙醇=75:15:10;波长472 nm(番茄红素检测)和230 nm(脂类检测),柱温35℃,流速l.0ml/min,进样量10 μL。样品经适当稀释后进样。在此条件下,番茄红素对照品在10 min左右出峰。
3 实验结果
3.1 番茄红素稳定性考察
由于番茄红素中含多个不饱和双键,在提取、浓缩及储存过程中极易发生异构化和降解,为考察纯化过程番茄红素随时间的降解破坏情况,我们将番茄红素对照品溶于氯仿配制成每毫升50 μg的溶液,分别在4℃和25℃避光静置,隔时取样测定番茄红素的含量,以初始浓度为百分百,对时间作图,结果如图1。
图1表明番茄红素在溶液中稳定性较差,且随着温度上升稳定性下降,在25℃下,14 h后残留量不到原来含量的50%,因此在纯化过程中要快速,以尽量减少番茄红素的损失。
3.2 X-5树脂吸附动力学曲线
实验考察了4℃和25℃下X-5树脂对菌丝提取液中番茄红素的吸附动力学曲线,结果如图2所示。
图2结果表明,25℃度时在0~3 h番茄红素快速被树脂吸附,随后吸附趋于缓和,吸附量上升缓慢;而在4℃时树脂对番茄红素的吸附速度较慢,在4 h后才逐渐加快。考虑到工艺的可操作性,确定吸附温度为25℃(室温)。同时由于番茄红素极易降解,吸附时间以3~5 h为宜。
将番茄红素浓缩液用氯仿稀释成不同浓度,考察X-5树脂的吸附能力,结果见图3。
由图3可得,在实验范围测得的吸附等温线近似为一条直线,在实验考察的条件下,最大吸附量及最大吸附率分别为11.5 mg·g-1干树脂及45.1%。
3.3 番茄红素的解吸附
实验比较了乙酸乙酯、丙酮、二氯甲烷、正己烷、石油醚和无水乙醇这6种溶剂对X-5树脂吸附的番茄红素的解吸能力,结果如图4。
从解析率来看,丙酮和二氯甲烷对番茄红素的解吸附效率最高,其次为乙酸乙酯、正己烷和石油醚次之,乙醇对番茄红素的解吸能力最低。据报道[7],番茄红素晶体在有机溶剂中的溶解度顺序为:二氯甲烷>乙酸乙酯>丙酮>正己烷>石油醚>无水乙醇,由此可见,番茄红素从吸附树脂上的解吸率与它在溶剂中的溶解度有一定关联。考虑到溶剂毒性及工业上回收难易,可选取乙酸乙酯为解吸溶剂。以乙酸乙酯为解吸剂,考察了静态解吸条件下番茄红素从树脂上解吸附的动力学曲线,如图5。
从图5可得,乙酸乙酯能快速将X-5树脂上的番茄红素解析下来,在45 min就可以达到解吸平衡。
3.4 菌丝提取液中的脂类物质
三孢布拉霉是一种产油脂丝状真菌,其干菌体中油脂最高含量可达37%。实验测定了菌丝初提液中在230 nm的色谱图(图6),表明在粗提物中含有大量油脂。由于油脂类物质在后续工艺中会影响番茄红素的结晶,因此去除油脂对番茄红素纯化工艺有重要影响。
3.5 不同解吸溶剂解吸效果考察
将吸附番茄红素后的树脂用不同溶剂洗脱,测定洗脱前后番茄红素峰及杂质色素峰的变化情况(472 nm)。将保留时间小于番茄红素的色素杂质定义为A(以杂质峰面积总和计算其百分含量),保留大于番茄红素的色素杂质峰总和定义为B,计算其含量,如表1所示。
从表1可得,尽管乙酸乙酯等溶剂对番茄红素有较高的解吸率,但是对杂质色素A也有较高的解吸率,经纯化后番茄红素含量没有太大提高。无水乙醇对番茄红素解吸作用较弱,但对杂质A含量却有明显的洗脱效果,且乙醇对杂质色素B的洗脱较少。为此,可使用吸附柱动态洗脱的方法,先用无水乙醇洗涤去除色素杂质A,再用乙醇和乙酸乙酯混合溶剂洗脱,减少色素杂质B的洗脱。由于油脂类物质溶于乙醇,通过乙醇洗涤可去除树脂上吸附的脂类杂质,提高番茄红素的纯度。
3.6 纯化及鉴定
如2.3.4所述将经过真空干燥过的316.3 mg粗提取物用适量氯仿溶解后配制成番茄红素质量分数为5.2%的溶液,上X-5树脂柱吸附,然后分别用无水乙醇洗涤、乙酸乙酯:无水乙醇=3:7和乙酸乙酯∶无水乙醇=5:5混合溶剂洗脱,合并洗脱液于-20℃低温结晶,真空干燥至恒重,共得到15.0 mg晶体,测定纯度为70.9%,收率64.6%。所得番茄红素晶体经乙酸乙酯溶解后于无水乙醇中重结晶,所得晶体经APCI源质谱测得分子量为536.7,其红外光谱(IR)如图7、核磁氢谱如图8所示,结果表明制备的为天然型番茄红素。
4 讨论
微生物发酵法生产番茄红素与传统的番茄提取法相比具有占用土地资源少、生产受季节和环境影响小等优点,通过选育高产菌株还可大幅度降低生产成本,是一种具有良好工业应用前景的生产方法。但是由于目前报道的番茄红素产生菌多为真菌,最常见的为三孢布拉霉。与番茄不同,三孢布拉霉菌体中油脂含量较大,且在真菌中,脂肪酸、类固醇及类胡萝卜素的生物合成具有共同的初始阶段,一些脂类物质及代谢中间产物在结构上与番茄红素分子类似,对番茄红素的分离纯化有较大的干扰,因此微生物源的番茄红素在纯化方法上与植物来源的有很大的不同,无法照搬常用的番茄红素提取工艺。对于发酵产生的番茄红素的纯化方法国内报道很少,番茄红素极易被氧化或异构化的性质也使得它的分离纯化较为困难,成为制约发酵法生产工业化应用的一个重要因素。本实验较系统地研究了大孔吸附树脂吸附纯化发酵产物中番茄红素的方法,通过考察不同解吸溶剂对番茄红素以及杂质的解吸附情况,设计了乙醇和乙酸乙酯混合溶剂动态解吸附的纯化方法,可快速有效地去除洗脱产物中的脂类杂质,简化了后续的结晶工艺,适合于工业化推广应用。
参考文献
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抗体分离纯化技术的研究进展 篇4
抗体分离纯化技术的研究进展
制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础,抗体质量的高低,将直接影响试验的成败.抗体的制备有两个途径:一是一般通用的方法,以纯化的抗原免疫动物,获得多克隆抗体;二是应用杂交瘤技术制备单克隆抗体.但不论用何种技术制备的.抗体都需要进行纯化.重要的是根据抗体的性质和来源选择一个合适的分离纯化方法.对当前的纯化方法进行了一个简要的综述.
作 者：侯越 罗奋华 吴应积 Hou Yue Luo Fenhua Wu Yingji 作者单位：内蒙古大学哺乳动物生殖生物学与生物技术教育部重点实验室,呼和浩特,010021刊 名：生物技术通报 PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY BULLETIN年，卷(期)：2008“”(3)分类号：Q95关键词：抗体 分离 纯化
生物分离与纯化技术 篇5
本实验利用体外筛选模型[9]从土壤中筛选到一株产α-葡萄糖苷酶抑制剂的菌株UN-8[10],其代谢产物对α-葡萄糖苷酶有较强的抑制作用,经分离鉴定,活性物质的分子量在1 000 Da以上。目前未见有相关文献报道,为课题后续研究提供了拓展空间。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料:
菌株UN-8由作者实验室保藏。
1.1.2 试剂:
4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷,美国Sigma公司;α-葡萄糖苷酶,美国Sigma公司。
1.1.3 仪器:
J2-21高速冷冻离心机,美国Beckman公司;UV-1601紫外分光光度计,日本SHIMADIU公司;RE-52A型旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂;中空纤维超滤系统,Pharmacia公司;Sephadex G25凝胶自装柱与Superdex Peptide 10/300GL预装柱,Bio-Rad公司;LC-10AVP型高效液相色谱仪,日本岛津公司。
1.1.4 培养基
①初始发酵培养基(g/L):
可溶性淀粉 20,酵母膏 10,K2HPO4 1,KNO3 0.5,NaCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.01,蒸馏水1 000mL,pH值7.2～7.4;
②优化后发酵培养基(g/L):
木薯淀粉 20,黄豆粕粉 10,K2HPO4 1,KNO3 0.5,NaCl 0.5,MgSO4·7H2O 0.5,FeSO4·7H2O 0.01,蒸馏水1 000mL,pH值8.0。
1.2 方法
1.2.1 种子培养方法
无菌条件下,刮取一环斜面孢子于50 mL种子培养基(250 mL锥形瓶)中,28 ℃、160 r/min培养24 h,得种子液。
1.2.2 发酵培养方法
无菌条件下,用移液枪移取2 mL种子液于装50 mL发酵培养基(250 mL锥形瓶)中,置于摇床中,28℃、160 r/min发酵培养3 d,得发酵液。
1.2.3 α-葡萄糖苷酶抑制剂活性测定
采用PNPG-紫外分光光度计法[11],即取100 μL待测样品(用去离子水稀释10倍)于玻璃试管中,依次加入400 μL磷酸缓冲液(pH 6.8),100 μL α-葡萄糖苷酶,混匀,置于37℃恒温水浴锅保温15 min,加入400 μL 5 mmol/L底物PNPG,混匀,于37℃恒温水浴锅中反应15 min,加入2 mL 0.5 mol/L Na2CO3溶液终止反应,对照组以蒸馏水代替样品,最后采用紫外分光光度计在405 nm波长处测定各管溶液的吸光值。
1.2.4 发酵液预处理
将发酵液置于4℃高速冷冻离心机,除去菌体及发酵液中其他大颗粒物质,收集上清液。上清液浓缩5倍,加入2倍体积冰乙醇,密封,于4℃冰箱中静置1～2 h,离心,收集上清液,除乙醇,经活性炭脱色,过滤,于4℃冰箱保藏,备用。
1.2.5 采用透析袋判断活性抑制剂的分子量范围
分别选取截留分子量为3 500 Da和1 000 Da两种透析袋对发酵液进行透析试验。将大约1/2透析袋体积的发酵液装入袋内,置于装有去离子水的烧杯中,于磁力搅拌器上边搅拌边透析,每隔4 h换一次水,透析完毕,将透析内液与透析外液浓缩至原体积,分别测定各溶液对α-葡萄糖苷酶的的抑制率。
1.2.6 中空纤维超滤
采用0.45 μm有机滤膜对脱色后发酵液进行过滤,去除颗粒性杂质,澄清液经截留量为3 000 Da的中空纤维超滤系统超滤,收集分子量小于3 000 Da的流出液,置于4℃冰箱中保存,备用。
1.2.7 采用Sephadex G25凝胶柱层析分离纯化活性抑制剂[12]
量取步骤1.2.6中滤液3 mL,上柱,超纯水洗脱,洗脱流速控制在0.5 mL/min,每管收集1.5 mL,共收集75管。分别测定各管溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制活力。
1.2.8 采用Superdex Peptide 10/300GL进一步分离纯化活性抑制剂
将步骤1.2.7中抑制活力最高的一管样品浓缩,经0.2 μm微孔过滤膜过滤除去样品中气泡,采用Superdex Peptide 10/300GL凝胶柱进一步分离纯化。
1.2.9 紫外分光-可见光度分析
将活性抑制剂用超纯水稀释一定的倍数,以超纯水作对照,采用酶标仪在波长190～1 000 nm范围内进行紫外扫描,确定活性抑制剂的吸收峰。
1.2.10 高效液相色谱检验样品纯度
检验活性抑制剂的高效液相色谱条件为:所用分析柱为C18柱(规格4.6 mm×250 mm,5 μm),检测器为紫外检测器,检测波长为200 nm,以甲醇:水(V/V)=3:7的混合溶液作为流动相,进样量10 μL,控制流速为0.5 mL/min。
1.2.11 傅里叶变换红外光谱仪定性分析[13]
将样品溶液置于真空旋转蒸发仪浓缩干燥,得到固体样品,然后将样品与KBr压制成透明薄片(直径约13 mm,厚度约1 mm),在波数400～4 000 cm-1 范围内,扫描样品信号,经傅里叶变换干涉信号即得到样品的红外光谱图。
1.2.12 质谱检测
取样品0.5 μL,采用AB 4800 MALDI-TOF-TOF 质谱仪测定其分子量。
1.2.13 硅胶薄层色谱分析活性抑制剂
本实验所用展开剂系统为:乙酸乙酯:吡啶:无水乙醇:水(V/V/V/V) =8∶1∶2∶2,显色剂系统为:苯胺-二苯胺-磷酸显色剂系统,配方比例为:苯胺(2%,m/v):二苯胺(2%,V/V ):磷酸 (85%,V/V )=5∶5∶1。
2 结果与分析
2.1 分离纯化
2.1.1 发酵液预处理所得α-葡萄糖苷酶抑制率
2.1.2 Sephadex G25凝胶柱层析分离纯化结果
取经脱色处理的样品3 mL,沿柱壁缓缓加入已装好凝胶柱中,用超纯水洗脱,流速控制在0.5 mL/min,每管收集1.5 mL,共收集75管。测定每支管中的液体对α-葡萄糖苷酶的抑制能力,实验结果如图1所示。
由图1可知,经过Sephadex G-25凝胶柱分纯后,活性抑制剂主要分布在第40～61管之间,而活力最高管为第47号和48号管,因此将这两管样品合并浓缩,为后续实验做准备。
2.1.3 Superdex Peptide 10/300GL分离纯化结果
经过Superdex Peptide 10/300GL柱子分离后,共收集40管,图谱如图2所示。
测定每管溶液对α-葡萄糖苷酶的抑制率,活性抑制剂主要集中在第A4～A9管之间,而活力最高的为第A8管,因此将第A8管用于结构的初步分析。
2.2 初步鉴定
2.2.1 紫外可见光谱分析结果
由图3可知,样品溶液在200 nm处有最大紫外吸收峰,因此,选择200 nm作为样品的紫外检测波长。
2.2.2 高效液相色谱检测样品纯度结果
由图4 显示,样品经 HPLC分析呈现单一对称峰,可见其α-葡萄糖苷酶抑制剂活性物质是一种均一成分。
2.2.3 傅里叶变换红外光图谱
由图5可知,样品在4 000 cm-1到400 cm-1之间的主要特征吸收峰有3 394.61 cm-1、2 946.15 cm-1、1 651.93 cm-1、1 402.71 cm-1、1 149.60 cm-1、1 035.82 cm-1、526.44 cm-1,其中3 600 cm-1～3 200 cm-1和1 665 cm-1～1 635 cm-1之间的两组峰,表明该活性抑制剂可能是糖类物质。在3 394.61 cm-1处有宽的强吸收峰, 证明是分子间氢键O-H的伸缩振动峰,2 946.15 cm-1处为C-H的伸缩振动峰,1 651.93 cm-1处为C=C、N-H或者C=O的伸缩振动峰,1 402.71 cm-1处为C-N伸缩或者C-H弯曲振动,1 149.60 cm-1和1 035.82 cm-1处为醚的伸缩振动峰。
2.2.4 质谱检测结果
由图6可知,质谱图中呈现一个明显的离子峰,[M+H+]=1 229.8,因此该活性抑制剂的分子量为1 228.8。
2.2.5 硅胶薄层层析结果
由图7可知,通过苯胺-二苯胺-磷酸显色后,活性抑制剂得到了一定程度的纯化,并且显示了糖的特性,因此,活性抑制剂应属于糖类物质,在硅胶板上具有与糖相同的性质。
3 讨论
目前有很多学者采用化学合成法来制备α-葡萄糖苷酶抑制剂[14],但步骤繁杂,副产物多。也有学者从中草药植物中筛选α-葡萄糖苷酶抑制剂[15],但由于原料有限,活性物质纯度低,至今未工业化生产。倪孟祥等人从海洋微生物的代谢产物中分离得到α-葡萄糖苷酶抑制剂[16],但没有给出明确的成份鉴定。
由于活性物质分子量为1 228.8,而每个葡萄糖分子量为180,若假设活性抑制剂是由若干个葡萄糖或(和)其他单糖连接而成的,则推测该物质应是一种由7～8个单糖组成的天然寡聚糖。寡聚糖具有很多独特功能,比如低聚异麦芽糖、低聚果糖、低聚半乳糖等,不仅能能显著增加人体肠道益生菌(比如双歧杆菌、乳酸杆菌)数量,还能抑制腐生菌生长,从而改善肠道微生态,有益于人体健康。此外,此类寡聚糖还具有抗龋齿、进食后不会出现血糖升高、不引起肥胖等优势。而阿卡波糖是一种假性四糖,虽然在结构上与寡糖非常相似,但不具备低聚寡糖的这些独特优势,而且在降血糖过程中患者还会出现腹胀、腹泻、腹部不适等不良症状。因此,该活性抑制剂具有很大的研究意义及探索价值。
4 结论
作者从土壤中筛选到产α-葡萄糖苷酶抑制剂菌株,首先通过层析等方法对发酵液中抑制剂进行分离提纯,然后通过质谱鉴定显示活性物质分子量为1228.8,最后结合紫外-可见光光谱扫描、傅里叶红外光谱扫描以及硅胶薄层层析对物质结构做了初步分析,结果表明活性物质应属于寡糖,其精确结构还有待进一步研究。
摘要：目的:分离纯化发酵液中的α-葡萄糖苷酶抑制剂,并对其结构进行初步鉴定。方法:通过预处理发酵液、活性炭脱色、中空纤维超滤、Sephadex G25葡聚糖凝胶层析以及Superdex Peptide 10/300GL预装柱层析等方法对发酵液中的活性抑制剂进行了分离纯化,通过质谱鉴定确定其分子量,结合紫外-可见光光谱扫描、傅里叶红外光谱扫描以及硅胶薄层层析对该物质的结构进行初步分析。结果:经分离纯化,该物质的高效液相色谱图呈单一对称峰,通过质谱确定其分子量为1 228.8,经初步鉴定该抑制剂应属于寡糖类物质。结论:提取了发酵液中的α-葡萄糖苷酶抑制剂,其分子量为1 228.8,目前未见有文献报道,为糖尿病新药研发奠定了基础。
生物分离与纯化技术 篇6
1.1 膜分离技术的特点
膜分离过程以选择透过性膜作为分离介质,通过在膜两侧施加某种推动力,使得原料侧组分有选择性地透过膜,从而达到分离、提纯和浓缩的目的。
传统氨基酸生产工艺:蛋白质水解液液→过滤或离心或大孔树脂吸附、萃取→浓缩→脱色→干燥→产品。
采用膜分离技术工艺可简化为:蛋白质水解液→超滤→纳滤→脱色→干燥→产品。
相对于传统工艺,膜分离技术具有设备简单、常温操作,无相变及化学变化,选择性高及能耗低,分离效率高,产品的收率和质量高等优点。
1.2 超滤膜和纳滤膜分离的原理
超滤膜属于非对称多孔膜,孔径在2~50nm,对蛋白质水解液各组分的分离依据筛分原理,根据膜的截留分子量不同进行分离。
纳滤膜具有纳米级孔径,截留分子量在100~1000Da之间,主要特征是表面带有电荷,蛋白质水解液中的氨基酸分子在不同的PH带有不同的电荷,纳滤膜通过空间位阻和电荷效应的共同作用就可对溶液中氨基酸进行分离。
2 膜分离技术在氨基酸分离纯化中应用
2.1 氨基酸的性质和传统方法分离纯化
氨基酸是一种既含有氨基又含有羧基两性官能团的物质,氨基和羧基的电离取决于溶液的p H值和氨基酸的等电点p I:在p H低于等电点p I时,氨基酸带正电荷;在p H值高于等电点p I时氨基酸带负电荷;在等电点时,氨基酸的溶解度最小,最易从溶液中析出。氨基酸的分离纯化就是利用其在不同PH值时所带电荷不同的特性。传统的氨基酸分离纯化方法有:离心法、沉淀法、离子交换法、萃取法、吸附法、和色谱法。由于目前,工业上氨基酸主要采用酶生化反应器对蛋白质进行水解制取。蛋白质水解液成分相当复杂,其中很多氨基酸分子分子量相近、性质相似,有的仅是净电荷数的不同。用这些传统的方法分离纯化氨基酸存在工艺复杂、耗时长、原料需求量大、能耗高、收率低、污染严重等问题,且产品在长时间提取过程中易变性失活。
2.2 膜分离技术在分离纯化中应用
酶水解蛋白质是一个与水解程度有关的很复杂的过程,水解产物中可以是不同链长的多肽和氨基酸等,运用膜分离技术对各组分进行分离纯化,主要依据膜和溶液的界面处存在以下机理:由于亲水性等原因所引起的选择性透过效应;与分子尺寸有关的筛分效应;膜与氨基酸的电荷效应。在对蛋白水解液中多肽和氨基酸进行分离纯化时,首先可以用筛分原理的超滤将蛋白水解液中酶、多肽和大分子量的氨基酸截留并回收利用,透过液中氨基酸分子分子量相近、性质相似,有的仅是净电荷数的不同,此时再将透过液经纳滤[6]浓缩后,再通过等电点结晶获得高纯的氨基酸。运用这样的集成联用的膜分离技术,不仅提高了氨基酸的质量和收率,而且可降低酶的成本和分离的能耗。有文献报道过,将超滤、反渗透和等电点结晶技术结合从发酵液中回收谷氨酸。同时运用膜分离技术对蛋白水解液中废水进行处理,可以降低对环境的污染。
3 急需解决的问题和应用前景
3.1 面临的问题[7]
在运用超滤和纳滤膜分离过程,超滤和纳滤都是以压力差为推动力进行分离的,料液在压力的驱动下下透过膜,溶质被截留,造成膜界面区域浓度增高,易造成浓差极化还有就是分离过程也易造成膜污染问题。在膜分离纯化过程将面临膜材质的选择,膜的抗污力,膜的使用寿命和操作费用等问题。
3.2 需解决的问题
针对膜分离纯化中面对的问题,需开发耐有机溶剂、耐药品、高通量、高分离的选择性膜;优化膜分离的机理及操作过程;增强膜的抗污能力;采用不同的膜技术的优化组合。
3.3 应用前景
分离纯化技术是一项耗时长、消耗大、能耗高、产品回收率低的很复杂的操作过程,尤其是对一些生物药品的的分离纯化,成本较高。在这个必须需要一些生物产品的社会中,需将膜技术与传统工艺集成联用发展出了一些全新的膜分离过程,这些新的分离过程在不同程度上吸取了膜分离和传统分离方法的优点,而避免了两者原有的一些局限性,这将是膜分离技术发展的主要方向.将这些新技术应用在低分子量生物产品氨基酸类的分离纯化,并逐渐实现工业化,取代传统分离纯化这些单元操作,降低成本,减少环境的污染和提高产品质量和收率。
4 结论
将膜分离技术应用在氨基酸分离纯化中,不仅提高氨基酸的质量和收率,还能减少其废水的排放量,从而减轻对环境的污染,符合清洁工艺的要求。
参考文献
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[2]王湛.膜分离技术基础[M].北京:化学工业出版社,2000
[3]严希康.生化分离工程[M].北京:化学工业出版社,2001.
[4]姚红娟,王晓琳.膜分离技术在低分子量生物产品分离纯化中的应用[J].化工进展,2003,(2):146-152.
[5]王欣欣,任虹,曹学丽.膜分离技术在氨基酸发酵生产中的应用[J].中国调味品,2001,36(5).
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[7]何毅,李光明,苏鹤祥,等.纳滤膜分离技术的研究进展[J].过滤与分离,2003,13(3):5.
生物分离与纯化技术 篇7
大孔吸附树脂是一类有机高聚物吸附剂,具有选择性好、吸附量大、吸附速率快、机械强度高、易再生等优点,已被广泛运用于天然产物黄酮类化合物的分离纯化[10,11,12]。目前关于两种及多种树脂混用在天然产物分离纯化上的运用研究已有相关报道[13,14,15],而关于大孔树脂在竹叶黄酮类化合物的分离纯化的研究多为单一树脂的研究,未见多种树脂的混用技术的研究报道。
本研究采用大孔树脂混用技术,在8 种大孔吸附树脂中选取两种进行混合,对竹叶黄酮进行分离特性的研究,分离纯化效果好,样品中黄酮纯度得以大大提高,为竹叶黄酮的纯化提供了新方法,具有较好的应用价值,对竹叶资源的利用具有重要意义。
1 实验
1. 1 材料、试剂与仪器
竹叶采于2013 年贵州赤水,并通过自然风干,备用。
芦丁标准品( 中国食品药品检定研究院; 批号: 100080 -201409) ; 氢氧化钠、亚硝酸钠、硝酸铝、石油醚、乙醇、甲醇、盐酸均为国产分析纯; 大孔吸附树脂( D101 - 1、D101、AB - 8、DM130、DM301、ADS - 17、S - 8) 来自安徽三星树脂有限公司、NKA - 9 来自沧州宝恩树脂有限公司。
恒温水浴锅、旋转蒸发器,上海亚荣生化仪器厂; SHB -IV循环水式多用真空泵,郑州长城科工贸有限公司; HH - 4数显恒温水浴锅,常州澳华仪器有限公司; 恒温循环器,北京博医康实验仪器有限公司; JC - 100 恒温培养振荡器,上海精旭实业有限公司; 酒精计,河北省武强县同辉仪表厂; JF1204电子分析天平,余姚市金诺天平仪器有限公司; 101 - 1AB电热鼓风干燥箱,天津市泰斯特仪器有限公司; UV - 6100S紫外/ 可见分光光度计,上海美谱达仪器有限公司; 雷磁PHS -25p H计,上海仪电科学仪器股份有限公司; 玻璃层析柱。
1. 2 实验方法
1. 2. 1 竹叶黄酮提取方法
取干燥未粉碎的竹叶,先按料液比1∶20( g/m L) 加入50%乙醇提取一次分离固液后,再以料液比1∶15( g/m L) 进行二次提取. 合并两次提取液,醇沉过夜以除去糖类、蛋白质等,浓缩至一定浓度,备用。
1. 2. 2 树脂处理方法
先用体积分数95% 乙醇溶液充分浸泡过夜,然后用无水乙醇洗至洗出液加适量水后无白色浑浊,再用去离子水洗至洗出液无醇味,转入酸碱处理,用4 BV的5% HCL溶液以5 BV/h流经层析柱后浸泡3 h,然后用去离子水洗至p H值为中性,用4 BV的5% Na OH溶液以5 BV / h流经层析柱后浸泡3 h,然后用去离子水洗至p H值为中性,浸泡于95% 乙醇中备用,使用前用水洗至无醇味。
1. 2. 3 竹叶黄酮的测定方法
1. 2. 3. 1 标准曲线的绘制
由于芦丁和黄酮类化合物都是以2 - 苯基色原酮为母核,具有相同的吸光度测试性质,故用芦丁为标准品,采用Na NO2- Al ( NO3)3- Na OH比色法测定总黄酮含量[16]。精确称量0. 0150 g芦丁标准品,置于100 m L容量瓶中,用甲醇定容至刻度,摇匀得浓度为0. 15 mg/m L的标准溶液。准确吸取芦丁标准溶液0 m L、1. 0 m L、2. 0 m L、3. 0 m L、4. 0 m L、5. 0 m L、6. 0 m L、7. 0 m L于25 m L具塞比色管中,用30% 乙醇补齐至10 m L,加0. 7 m L 5% Na NO2溶液摇匀放置5 min后,加入0. 7 m L 10% Al( NO3)3溶液摇匀6 min后,再加入5 m L 1 mol/L Na OH溶液,摇匀,用30% 乙醇定容至刻度。静止15 min后置于分光光度计于510 nm处测吸光度A,记录数值。以吸光度为纵坐标,芦丁质量浓度为横坐标,绘制标准曲线,所得线性标准回归方程为y = 11. 66071x + 0. 00186,相关系数R2=0. 99972。
1. 2. 3. 2 样品含量及纯度的测定
取一定量待测试样溶液,按绘制标准曲线的步骤,于510 nm处测定吸光度,根据标准曲线方程计算样品黄酮浓度。
竹叶黄酮精制后于50 ℃ 条件放置烘箱干燥至恒重,取精制产品100 mg,用30% 乙醇溶解并定容至100 m L,摇匀待测其黄酮浓度。
1. 2. 4 单一大孔吸附树脂的筛选
1. 2. 4. 1 静态吸附与解吸实验
准确称取1 g已处理好的8 种吸附树脂( 用滤纸吸干后称重)装入100 m L锥形瓶中,精密加入30 m L质量浓度0. 8 mg/m L竹叶黄酮样品溶液,于25 ℃ 下置恒温培养振荡器中振荡吸附24 h,过滤,测定剩余黄酮的质量浓度,按式( 1) 、( 2) 计算吸附量和吸附率; 吸附后的树脂用滤纸吸干后加入30 m L的95%乙醇,在25 ℃ 下置恒温培养振荡器中振荡解吸24 h,过滤测定洗脱液中黄酮质量浓度,按式( 3) 、( 4) 计算其解吸率。
1. 2. 4. 2 静态吸附与解吸动力学实验
根据1. 2. 4. 1 结果所示,选择其中2 种较理想的树脂进行静态吸附与解吸动力学实验。按1. 2. 4. 1 的方法,每隔1 h取样检测,测定其中吸附液剩余黄酮浓度,以树脂对黄酮的吸附量与时间作图,绘制大孔树脂静态吸附动力学吸附曲线及静态动力学解吸曲线。
1. 2. 5 混合大孔吸附树脂比例的筛选
将上述两种效果较好的树脂以一定质量比混合,按1. 2. 4. 1 的方法,于25 ℃ 下置恒温培养振荡器中振荡吸附5 h,解吸4 h,按公式( 1) ~ ( 4) 计算吸附量、吸附率和解吸率。筛选出最优树脂混合比例。
1. 2. 6 混合大孔吸附树脂静态吸附、解吸实验
1. 2. 6. 1 上样液质量浓度对吸附效果的影响
各取30 m L上样液质量浓度分别为0. 4 mg/m L、0. 8 mg/m L、1. 2 mg / m L、1. 6 mg / m L、2. 0 mg / m L的竹叶总黄酮提取液。加入1 g树脂( AB - 8∶D101 - 1 = 1∶2) ,于25 ℃ 下恒温振荡吸附5 h,取一定量上层清液按绘制标准曲线的方法测定其总黄酮浓度,计算其吸附率和吸附量。
1. 2. 6. 2 洗脱液体积分数对解吸率的影响
将吸附饱和的1 g树脂( AB - 8∶D101 - 1 = 1∶2) 用滤纸吸干后,分别加入体积分数为40% 、50% 、60% 、70% 、80% 、90% 乙醇各30 m L。下同1. 2. 6. 1,计算其解吸率。
2 结果与讨论
2. 1 单一大孔吸附树脂的筛选
2. 1. 1 静态吸附与解吸实验
竹叶黄酮具有一定的酚羟基且有一定的极性,而大孔吸附树脂是种表面吸附剂,吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质,即树脂的极性( 功能基) 和空间结构( 孔径、比表面积、孔容等) ,由于不同树脂结构性质的不同,从而对竹叶黄酮树脂的吸附解吸难易程度不同。由表1 可知,如D101 - 1 型树脂吸附效果较好,吸附率达到71. 04% ; S - 8 型树脂虽然吸附效果最好,但是其解吸效果较低; 而解吸率最高的是AB - 8 型树脂达95. 07% 。综合考虑黄酮的吸附率、解吸率,本实验拟采用D101 - 1 和AB - 8 两种树脂按一定比例混合,筛选出对竹叶黄酮分离纯化效果更好的树脂混合比例。
2. 1. 2 静态吸附与解吸动力学实验
分别考察其静态吸附解吸动力学特性,结果如图1、图2所示,D101 - 1 与AB - 8 两种大孔树脂能够达到快速吸附与解吸平衡,在5 h时,D101 - 1 与AB - 8 的吸附量分别是15. 37mg / g和15. 09 mg / g,基本达到吸附平衡; 在4 h时,D101 - 1 与AB - 8 的洗脱液浓度分别是0. 490 mg / m L和0. 487 mg / m L,基本达到解吸平衡。
2. 2 混合大孔吸附树脂比例的筛选
大孔树脂对竹叶黄酮的吸附作用与其空间结构和功能团息息相关,考虑到不同树脂的协同作用和空间结构参数的不同,通过不同比例树脂的混合,混合树脂的空间结构和功能团有所差异。由表2 可知,当两种树脂以一定比例混合时,其不同的吸附率和解吸率作为判断对竹叶黄酮分离纯化效果的标准,当AB - 8∶D101 - 1 = 1 ∶2 时,吸附率与解吸率均较高所以选择以此比例混合后对竹叶黄酮进行分离纯化。
2. 3 不同条件下混合大孔吸附树脂对竹叶黄酮纯化工艺的实验
2. 3. 1 上样液质量浓度对吸附效果的影响
大孔树脂对竹叶黄酮溶液吸附过程是一种液固吸附过程,而液固之间的吸附不仅存在吸附剂与溶质之间的作用,还存在溶质- 溶质、溶质- 溶剂、溶剂- 吸附之间的作用[17]。由图3可知,随着上样液浓度的增加,吸附率逐渐降低,吸附量逐渐增大。综合考虑黄酮的吸附率与树脂的吸附量,选择最适上样液浓度为1. 2 mg/m L。
2. 3. 2 洗脱剂体积分数对解吸率的影响
常用的洗脱剂多为甲醇、乙醇、丙酮等,由于乙醇安全、无毒、易回收等优点,本实验选择乙醇作为洗脱剂,通过静态吸附解吸实验,吸附5 h后,考察不同乙醇体积分数对竹叶黄酮分离纯化的影响,如图4 所示。从图4 中可以看出,随着乙醇体积分数的增加,解吸率先增加后减少,在70% 时解吸率达到最大值90. 81% 。当体积分数大于70% 时解吸率降低,这是由于当乙醇浓度过高时,醇溶性杂质增加,降低洗脱液中黄酮纯度。
2. 3. 3 最佳上样体积的确定
取1. 2 mg/m L竹叶黄酮提取液,以2 BV/h流经层析柱。每0. 5BV为一收集段收集流出液,测定其黄酮质量浓度,绘制其泄漏曲线如图5 所示。流出液黄酮浓度随着上样量的增加而增加,则吸附率逐渐降低; 而上样量过少时,树脂的吸附量减小,树脂利用率降低。综合考虑树脂的吸附率与树脂的吸附量,选择3. 5 BV为最佳上样量体积。
2. 3. 4 最佳上样流速的确定
上样液通过树脂床的流速对树脂的吸附效率及生产效率均有着一定的影响。本实验通过控制不同流速考察对吸附效果的影响,将树脂( AB - 8∶D101 - 1 = 1∶2) 装柱,竹叶黄酮上样量浓度1. 2 mg/m L,上样量3. 5 BV,分别以1 BV/h、2 BV/h、3 BV / h、4 BV / h、5 BV / h的流速流经层析柱,测定吸附过程中流出液的黄酮质量浓度,计算黄酮吸附总量。结果如图6所示。随着上样流速的增加,吸附量降低,反之,流速降低,有利于总黄酮的吸附,但会影响生产效率,增加吸附时间,生产周期和成本增加。综合考虑树脂的处理量和黄酮的利用率,选择2 BV/h为最佳上样流速。
2. 3. 5 最佳洗脱体积的确定
按确定的最佳吸附条件上柱,用1 BV水洗去水溶性杂质,再用70% 乙醇作为洗脱剂以2 BV/h的流速洗脱,每0. 5 BV作为一收集段收集洗脱液,检测其中总黄酮质量浓度,绘制洗脱曲线如图7 所示。当洗脱体积达到4 BV时,洗脱液中黄酮浓度接近于0,考虑到洗脱效率与洗脱剂用量,选择4 BV为最佳洗脱体积。
2. 3. 6 最佳洗脱流速的确定
按确定的吸附条件上柱,先用1 BV水洗去水溶性杂质,用4 BV的70% 乙醇分别以1 BV/h、2 BV/h、3 BV/h、4 BV/h、5 BV / h的速度进行洗脱。测定洗脱液总黄酮质量浓度计算解吸率,如图8 所示。不同的流速对其解吸效果影响不大,考虑洗脱时间不至于过长,选用2 BV/h为最佳洗脱流速。
2. 4 混合树脂纯化工艺验证实验
上样条件: 上样质量浓度1. 2 mg/m L,上样量体积3. 5 BV,上样流速2 BV/h; 洗脱条件: 洗脱剂体积分数70% ,4 BV洗脱剂体积,洗脱流速2 BV/h。以此条件对竹叶黄酮进行精制,收集洗脱液经旋转蒸发器浓缩后烘干。测得其黄酮纯度为28. 16% ,与纯化前黄酮纯度8. 46% 相比,纯度为原来的3. 3倍。纯化效果显著。
3 结论
在8 种大孔吸附树脂中选取两种( D101 -1 与AB -8) ,采用混用技术进行分离纯化竹叶黄酮工艺条件考察,结论如下: D101- 1 与AB - 8 以2∶1 比例混合,上样液质量浓度1. 2 mg / m L、上样量为3. 5 BV、上样流速2 BV/h条件下上柱吸附、洗脱剂体积分数70% 、洗脱体积4 BV、洗脱流速2 BV/h的条件下进行洗脱。比较纯化前后黄酮纯度,较纯化前8. 46% ,纯化后黄酮纯度为28. 16%,纯度为原来的3. 3 倍。大孔树脂混用技术为竹叶黄酮的纯化提供了新方法,具有较好的应用价值。
摘要：采用大孔树脂混合使用技术,用于分离纯化竹叶黄酮的工艺研究。通过研究8种大孔树脂对竹叶黄酮的静态吸附与解吸实验,筛选出两种较好的树脂D101-1和AB-8,采用混用技术进行实验,结果表明:D101-1与AB-8的最优混合比例为2:1;上样液质量浓度1.2 mg/m L、上样量为3.5 BV、上样流速2 BV/h为最佳上样条件,洗脱剂体积分数70%、洗脱体积4BV、洗脱流速2 BV/h的条件下进行洗脱。在此条件下进行纯化实验,分离纯化效果最好,样品中黄酮纯度由原来的8.46%上升至28.16%。
生物分离与纯化技术 篇8
关键词：迷迭香,迷迭香酸,提取,纯化
迷迭香(Rosmarinus Officinalis L.),别名艾菊,系唇形科迷迭香属植物,原产地中海沿岸一带,其含的迷迭香酸(Rosmarinic acid,Ros.A.)是一种天然的具有多种生理活性的水溶性酚类化合物[1],在食品、化妆品、医药等方面[2]国内外已有着广阔的应用,目前德国己作为解热、镇痛、抗炎药物投放市场,随着大众对迷迭香抗氧化剂的需求,迷迭香的应用领域也正在不断扩大,可见其在国内外有着广阔的应用前景。
1 实验
1.1 材料与仪器
迷迭香叶。
X-5大孔吸附树脂,天津市光复精细化工研究所;UV-2450紫外可见分光光度计,日本岛津公司;LC-20A高效液相色谱仪,岛津国际贸易(上海有限公司)。
1.2 实验方法
1.2.1 溶剂提取法提取迷迭香酸
本文考察了在常温下迷迭香干叶不同的粉碎度、乙醇浓度、浸提时间、料液比及提取次数对迷迭香酸提取率的影响,称取100 g原料置于3000 m L容器中,加入不同浓度的乙醇,在常温下搅拌一定时间提取并过滤,提取2次,将提取的滤液合并后加入0.01 g Vc静止6 h浓缩回收乙醇,用蒸馏水定容至100 m L,以1∶1盐酸调节p H值至3.0再进行过滤。按Fe SO4比色法测定吸光度值,来计算迷迭香酸的提取率[3]。
1.2.2 迷迭香酸的分离与富集纯化[4]
迷迭香酸的提取液经过滤布粗滤后,再用无机膜对浸提液进行处理,滤液经过X-5、D201、NKA-Ⅲ、聚酰胺四种不同的的大孔树脂吸附柱,用洗脱剂进行洗脱,在进行萃取,测定萃取液吸光度,计算迷迭香酸产品的解吸率。最后把液体浓缩为饱和液体,低温放置,析出颗粒状,过滤,真空干燥得产品。
1.2.3 迷迭香酸的含量测定[5]
采用高效液相色谱(HPLC)法对迷迭香酸产品进行定量分析,色谱条件Waters C18(150 mm×4.6 mm,5μm);流动相为乙腈-0.5%磷酸水(35∶65);流速为1.0 m L/min;检测器为紫外检测器,检测波长为332 nm;灵敏度为0.16AFUS;柱温为室温(25℃);溶解介质为无水乙醇。标准样品溶液的制备:称取4.95 mg迷迭香酸标准品用无水乙醇定容到10 m L,浓度为0.495 mg/m L。
2 结果与讨论
2.1 迷迭香酸提取工艺条件优化
由表1可知,迷迭香粉碎度在20目以下时,迷迭香酸提取率随粒度增加而迅速提高,以20目为最佳粒度。随浸提次数增多,其提取率的不断增长,而前2次迷迭香酸的提取率总和已达94.35%,故选取提取次数为2次。随着液料比提高而升高,当液料比达到15∶1时提取率比较高,与液料20∶1相比几乎一致,因此选择15∶1为最佳料液比。随着提取时间增长,提取率升高,至6 h后提取率几乎不再变化,故选择6 h为最佳浸取时间。当乙醇浓度在50%以下时,提取率呈增长趋势,而随乙醇浓度提高开始缓慢降低,故选择乙醇的浓度为50%。
2.2 迷迭香酸分离纯化工艺
2.2.1 微滤膜对浸提液的预处理
由表2可知,采用微滤可除去悬浮颗粒及大部分的果胶、蛋白,微滤后的透过液澄清透明,颜色比较浅,放置时间长,3和4次过滤基本是透明澄清的液体,从降低生产成本和节能角度考虑,所以实验选取过滤次数为3次。
2.2.2 大孔树脂吸附法富集与分离[6]
2.2.2. 1 树脂类型的选择
由表3可知,X-5对迷迭香酸的吸附率比较高,而它的解吸率是最高的,和D201相比其吸附率很大但却很难解吸,故选择X-5树脂进行富集与分离迷迭香酸。
2.2.2. 2 洗脱溶剂的选择
从表4可知,蒸馏水对迷迭香酸的洗脱能力最差,乙醇对迷迭香酸具有良好的洗脱能力,在天然产物的提取纯化过程中一般选择对环境没有污染的有机溶剂,所以本文采用乙醇溶液作洗脱溶剂。
2.2.2. 3 洗脱乙醇浓度的选择
由图1可知,不同乙醇浓度对迷迭香酸的解吸有一定的影响,在一定范围内,随着乙醇浓度的增加其解吸率也提高。当乙醇浓度达到75%时,解吸率也增加到了89%,当乙醇浓度继续增加时,变化不是很明显,而且乙醇浓度过高时其挥发性也增大,故选用75%左右的乙醇作为洗脱剂。
2.3 迷迭香酸产品的萃取[7]
2.3.1 萃取剂的选择
由表4可知,正丁醇对迷迭香酸的萃取率最高,石油醚的萃取率则最低。故实验先选用正丁醇萃取2次,再用乙酸乙酯萃取3次来获取纯度比较高的迷迭香产品。
2.3.2 正丁醇用量影响
由图2可知,萃取率随萃取溶剂的增加而增加,当料液比为1∶1.5之后,增加缓慢。故选择正丁醇的用量为浓缩液体积的1.5倍。
2.3.3 料液p H值对萃取效果的影响
由图3可知,料液p H值为3.0时,迷迭香酸的萃取率最高,最终选择料液的p H值为3.0。
2.3.4 萃取时间的选择
由图4可知,萃取率随着混合时间的增大而增大,在超过20 min后萃取率增长缓慢,故最终选择萃取时间为20 min。
2.4 迷迭香酸的定量分析-HPLC法
(1)迷迭香酸标准样品的HPLC分析
(2)迷迭香酸产品的HPLC分析
将迷迭香酸产品溶于10 m L无水乙醇,进行HPLC分析。
由图5和图6可知,迷迭香酸标准品和产品的高效液相色谱图见所得到的产品保留时间基本一致,以峰面积计算样品中迷迭香酸的含量,分离纯化后得到产品中迷迭香酸的纯度最高为66.67%,产率为0.36%。
3 结论
本文得出常温下溶剂提取法提取迷迭香酸最佳条件为:物料破碎至20目,用50%乙醇作为提取剂,在15∶1液料比下,提取2次,每次为6 h,得到迷迭香酸的提取率为94.35%。此迷迭香酸提取工艺在很大程度降低了能耗且设备简单可行,为工业提取迷迭香酸提供了新的途径。迷迭香中迷迭香酸的分离纯化工艺:用定性滤纸过滤3次浸提液,回收溶液中的乙醇再用1∶1盐酸调提取溶液的p H值至3,以1.5倍正丁醇为萃取剂、时间为20 min、萃取2次、回收正丁醇。将回收正丁醇的的产品用水溶解,用1∶1盐酸调值p H值至2.0~2.5,以10∶6(V/V)萃取料液溶剂比,用乙酸乙酯萃取3次,萃取时间为20 min,合并萃取液,减压回收溶剂,浓缩至适当体积。用75%乙醇洗脱浓缩的产品,再通过X-5大孔树脂收集洗脱液,放置低温下结晶,过滤,干燥得到迷迭香酸产品,纯度可以达到66.67%,产率为0.36%。
参考文献
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生物分离与纯化技术 篇9
刺参(Apostichopus japonicus)属于棘皮动物门海参纲(Holothuroidea)木盾手目(Aspidochirota)刺参科(Stichopodidae)仿刺参属(Apostichopus),为温带种。刺参无适应性免疫,依靠体壁、体腔细胞和体液中的免疫因子来抵御外来侵犯。凝集素作为一种它的免疫因子,在体内起着重要的作用[3]。
我国从20世纪80年代开始进行刺参养殖以来相继出现一系列病害问题。其中"烂皮病"因其高传染性、高死亡率而成为刺参养殖病害研究的重点[4]。作者采用了实验室已成功分离的2株"烂皮病"致病菌对健康刺参进行致病感染,分离纯化其体内凝集素,并进行凝集活性检测和性质研究,与健康个体的凝集素的性质相比较,以期探索刺参免疫机制并为其药用价值提供科学的依据和参考。迄今为止,有关患病刺参凝集素的研究鲜见报道。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 实验材料
实验用健康刺参购于青岛某刺参养殖厂;实验兔购于青岛大学医学院实验动物中心。
1.1.2 试剂
DEAE-Sepharose FF、Sephadex G-100等购自Pharmacia LKB Biotechnology。牛甲状腺球蛋白、鼠李糖、蔗糖均为分析纯,Sigma公司;其它为国产分析纯或生化试剂。
1.1.3 仪器
ALPHAPHOT-2型光学显微镜:Nikon;血球计数板:江苏丹阳市光学仪器厂;立式压力蒸汽灭菌锅YXQ-LS-50SⅡ:上海博迅实业有限公司医疗设备厂;台式离心机TGL-16G:上海安亭科学仪器厂;高速冷冻离心机GL-20G-Ⅱ:上海安亭科学仪器厂;HZQ-X100振荡培养箱:哈尔滨市东联电子技术开发有限公司;DS-1型高速组织捣碎机:上海标本模型厂;YC-1型层析实验冷柜:北京博医康实验仪器有限公司;SBS-100型数字记滴自动部分收集器、HD-1型核酸蛋白检测仪、TH-300梯度混合器:上海沪西分析仪器厂;DHL-B型电脑定时恒流泵:上海康华仪器制造厂;Amicon Ultra-4离心超滤管:Millipore;DYCZ-26电泳槽:北京六一仪器厂;TS-1型脱色摇床:江苏海门市麒麟医用仪器厂;96孔V形底板:杭州维特洁生化技术有限公司。
1.1.4 培养基
2216E培养基(1L):酵母膏1.0g;蛋白胨5.0g;磷酸高铁0.1g;琼脂20.532g;陈海水1000mL;pH 7.6。
1.2 方法
1.2.1 致病菌感染刺参个体
制备菌悬液:将Tenacibaculum属的一种菌(代号C6) 和Vibrionales属的一种菌(代号TB)分别划平板,28℃下培养48h,用过滤灭菌海水冲洗菌落制成菌悬液,每株菌菌液为3ml。分别取1ml,梯度稀释后用血球计数板计数。
准备感染场所:将4 000ml塑料盆用酒精消毒并用过滤灭菌海水冲洗3遍。向每个盆中分别注入2 000ml过滤灭菌海水,用充气阀通气。
刺参的前处理:将购回的刺参先在实验室环境中用过滤灭菌海水驯养3d,去除死亡或孱弱个体。挑选大小相近、健康的个体,用灭菌海水冲洗2次。然后用经火焰加热过的手术刀片在刺参背部和腹部分别划2道长度0.5cm的划痕,放于盆中饲养。每个盆中5～6头。
加入菌悬液:分别向盆中注入不同菌株的菌液,最终浓度均为108CFU/ml。空白对照组中加入与最大菌悬液注入量同剂量的过滤灭菌海水。
得到患病个体:每天观察各个盆中刺参的状况,记录并拍照。
1.2.2 刺参凝集素(AJL)的分离纯化
1.2.2.1 AJL粗提液的制备:
将患病个体捞出洗净,在冰块上解剖,用高速组织捣碎机捣碎,加2倍重量的0.15mol/L NaCl的PBS缓冲液[0.015mol/L Na2HPO4-NaH2PO4, (1:20), pH 7.2],4℃、16h,离心(4℃、4 500r/min、60min),取上清,即为粗提液。
1.2.2.2 硫酸铵分级:
冰水浴下,向粗提液中加入研磨好的的固体硫酸铵至20%饱和度,4℃过夜,离心(4℃、4 500r/min、60min),弃沉淀取上清液。向上清液中加硫酸铵至75%饱和度,搅拌过夜(4℃),离心(条件同上),弃上清,收集沉淀于适量蒸馏水中溶解,用浓缩离心管脱盐至无SO42-(10%的BaCl2检验)。
1.2.2.3 DEAE-离子交换层析:
将上步所得的浓缩液上DEAE-纤维素柱(2.0cm×16cm),0～1 mol/L NaCl连续盐度梯度洗脱,缓冲液为0.05 mol/L的磷酸盐缓冲液,流速为30ml/h,3ml/tube,自动收集器收集,考马斯亮蓝法TU-1800型分光光度计测A595,洗脱至A595<0.01。检测每管的凝集活性,收集合并活力峰。
1.2.2.4 Sephadex G-100分子筛凝胶层析:
层析柱为2.0cm×75cm,洗脱液为生理盐水,流速20ml/h,3ml/tube,样品为经过浓缩并脱盐的离子交换层析得到的活力峰。检测每管的凝集活性,A595测定蛋白含量。
1.2.3 刺参凝集素性质
1.2.3.1 蛋白含量的测定:
以A595表示,以牛血清清蛋白作对照。
1.2.3.2 亚基分子量的测定:
采用SDS-PAGE方法,从标准蛋白质和刺参凝集素的迁移率来求得相对分子量[5]。
1.2.3.3 血凝活性的测定:
制备2%的红细胞悬液[6]。在96孔V型板上,40μL凝集素溶液与等量生理盐水系列倍比稀释,加入红细胞悬液40μL,振匀,室温下静置1.5～2h,肉眼观察。无凝集现象时红细胞沉积在V型孔底部呈一小圆点,有凝集现象时血球不下沉相互集聚成一片网络。血凝活性以产生凝集现象时的最小凝集素的量或凝集素最大稀释倍数表示[7]。比较3组凝集素(健康组、C6组和TB组)的活性。
1.2.3.4 热稳定性试验:
健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为24.2g/L、23.5g/L、24.0 g/L,将3组凝集素分成若干份,每份0.5ml,分别在25～90℃的不同条件下温育,于10min、30min不同时间取样,冷却后测定血凝活性[6]。比较3组凝集素的热稳定性。
1.2.3.5 pH对血凝活性的影响:
参照李丹彤[6]方法配制pH 4.0～10.14的系列缓冲液。健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为24.2g/L、23.5g/L、24.0g/L。pH 4.0～6.0采用0.015mol/L的柠檬酸-Na2HPO4缓冲液;pH 6.50～7.50采用0.015mol/L的磷酸盐缓冲液;pH 8.0～9.0采用0.015mol/L的Tris-HCl缓冲液;pH 9.5～10.14采用0.015mol/L的Na2CO3-NaHCO3缓冲液。比较3组凝集素在不同pH条件下的血凝活性。
1.2.3.6 EDTA及二价金属离子对血凝活性的影响:
40μL EDTA、CaCl2、MgCl2溶液分别用生理盐水倍比稀释,加入40μL能凝集兔红细胞的最小浓度2倍的凝集素(健康组、C6组、TB组浓度分别为3.03mol/L、2.94mol/L、3.0mol/L),室温下静置15min,再加入40μL兔红细胞悬液,振匀,静置1.5～2h,比较3组凝集素的活性。
1.2.3.7 糖抑制实验:
糖或糖蛋白溶液40μL用生理盐水倍比稀释,加入40μL能凝集兔红细胞的最小浓度2倍的凝集素(健康组、C6组、TB组浓度分别为3.03g/L、2.94g/L、3.0g/L),室温下静置15min,再加入40μL兔红细胞悬液振匀,静置1.5～2h,比较3组凝集素的凝集结果。
2 结果
2.1 致病菌感染刺参个体
C6组、TB组刺参均在6～11d内出现预期病症,如体刺回收、腹部体色变浅,口部肿大,触手不能闭合,活动能力变差;接着口部、体表、体刺处出现大面积蓝白色溃烂斑。
2.2 刺参凝集素的分离纯化
组织捣碎后用PBS浸泡,离心得墨绿色粗提液;20%～75%硫酸铵分级沉淀得到黄绿色硫酸铵分级液;经DEAE-离子交换层析,初步得到活性物质,收集合并活力峰,浓缩脱盐;经Sephadex G-100分子筛凝胶层析,得到进一步纯化的活性物质,收集合并活力峰,浓缩脱盐,冷冻干燥的白色样品。纯化结果有关数据见表1、图1-6。
2.3 亚基分子量
在SDS-PAGE上显示一条带,与标准蛋白质比较,可计算出刺参凝集素亚基分子量为31 000Da(图7)。
1.标准蛋白; 2.健康组凝集素; 3.C6组凝集素; 4.TB组凝集素。
2.4 3组凝集素的血凝活性
健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为1.39g/L、1.34g/L、1.40g/L,用兔红细胞悬液进行血凝活性试验(表2)。
结果表明C6组刺参不仅凝集素含量高,而且活性较健康组和TB组强。
2.5 热稳定性
健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为1.39g/L、1.34g/L、1.40g/L,结果图7表明:在90℃、30min热处理后,均对兔红细胞显示出凝集活性,但活性下降50%。在25～70℃温育30min,活性均未见改变(表3)。
2.6 pH对3组凝集素血凝活性的影响
健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为1.39g/L、1.34g/L、1.40g/L,结果表明:当4.0≤pH≤7.5时,活性均无变化;当pH≥8.0时,活性均下降了50%(表4)。
2.7 EDTA及金属离子对3组凝集素血凝活性的抑制作用
健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为0.18g/L、0.17g/L、0.18g/L,结果表明3组凝集素对兔红细胞的凝集活性保持不变,未出现凝集抑制现象。
2.8 糖抑制试验
健康组、C6组、TB组凝集素浓度分别为0.18g/L、0.17g/L、0.18g/L,兔红细胞进行检测,结果表明3组凝集素不被所测试的单糖、二糖、三糖、聚糖所抑制,仅被牛甲状腺球蛋白抑制,最小抑制浓度分别为1.55mg/ml、1.45mg/ml、1.55mg/ml(表5)。
注:-表示无抑制作用。
3 讨论
用20%～75%饱和度的硫酸铵分级沉淀3组粗提液,得到的分级液纯化倍数均为粗提液的3倍,总活力回收率均超过95%,与李丹彤的结果一致[6]。分析其原因可能是粗提液中含有抑制剂,像多聚糖,它可以抑制凝集素的活性或阻碍凝集素与血红细胞的结合,抢占红细胞膜上凝集素的结合位点等[8,9]。因硫酸铵分级沉淀纯化倍数不高,所以有研究认为动物凝集素的纯化可不经硫酸铵分级沉淀[10],直接采用离子层析和分子筛凝胶过滤等方法。
用DEAE-Sepharose F.F.和Sephadex G-100凝胶层析进行纯化后,所得蛋白收获率(平均值为0.39%)及活性收获率(平均值为7.7%)都较小,一次处理样品量小。活力峰均在蛋白峰之前,说明凝集素在刺参体内蛋白质中属于离子强度偏小、分子量偏小的生物大分子。
凝集素亚基分子量测定用SDS-PAGE方法,测得结果为31 000Da,根据李丹彤结果[6],推断刺参凝集素含有两个相同亚基单位。
从血凝活性的结果看,表明C6组刺参不仅凝集素含量高,而且活性较健康组和TB组强。
3组凝集素在25～70℃活力保持不变,在80～90℃温育30min后均保留50%的血凝活性,表现出强的热稳定性。
当4.0≤pH≤7.5时,3组凝集素活性均无变化,当pH≥8.0时,活性均下降了50%,具有广泛的pH作用范围。
EDTA及二价金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+对3组刺参凝集素的血凝活性均无影响。因此可推断刺参凝集素在进行凝集活动时,不需要二价离子的参与[6]。
糖抑制实验表明,3组凝集素均不被所测试的糖类所抑制,而仅被牛甲状腺球蛋白抑制,其中C6组凝集素活性更易受到牛甲状腺球蛋白的影响,与李丹彤的结果一致[6]。
推断菌株C6(Tenacibaculum属的一种菌)可诱导刺参体内产生大量的凝集素,但产生的大量凝集素更易受到牛甲状腺球蛋白的抑制,此结论有待进一步证实。
摘要：目的:研究刺参免疫机制,探寻其发病机理。方法:刺参(Apostichopus japonicus)经磷酸盐缓冲溶液抽提、2075%硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose F.F.和Sephadex G-100柱层析,得到刺参凝集素(AJL)。结果:经SDS-PAGE显示单一条带,亚基相对其分子量为31000。分别提取感染Tenacibaculum属和Vibrionales属两种刺参烂皮病病原菌的刺参凝集素,感染Tenacibaculum属病菌刺参的凝集素产量较大,但凝集兔红细胞的作用均不被所测试的单糖和寡糖所抑制,而仅被牛甲状腺球蛋白所抑制。凝集兔红细胞的作用均不被二价金属离子Ca2+、Mg2+、Mn2+、Zn2+及EDTA所抑制。在pH4.010.14系列缓冲液中均有活性,其中在pH4.07.5时活性最大。该凝集活性在90℃加热30min后凝集活性仅损失50%。结论:推断菌株Tenacibaculum可诱导刺参体内产生大量的凝集素。
关键词：刺参,病原菌,凝集素,纯化,性质
参考文献
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