优化提取（共12篇）
优化提取 篇1
苦荞 (tartary buckwheat) 又名鞑靼荞麦, 一年生草本植物, 是一种药食两用的珍品, 广泛种植于我国西南及山西、陕西等地[1]。苦荞营养丰富, 不仅富含淀粉、蛋白质、维生素和矿物质等, 而且富含大量的富有生物活性的黄酮类化合物, 其含量是甜荞的10~100倍[2,3];苦荞黄酮类化合物具有极高的医疗和保健价值, 不仅具有降血糖、降血脂、抗癌、抗氧化、抗过敏、抗老化、杀菌、抑菌等作用, 也可用于防晒、祛斑等[4,5,6,7,8,9]。
目前, 苦荞黄酮不同部位化合物分离提纯的研究较多, 主要有对苦荞麸皮黄酮的乙醇浸提法[10]和微波提取法[11], 对苦荞植株茎叶黄酮的超声提取法[12]和酶提取法[13];但对苦荞食用部位麦粒黄酮提取的方法主要有传统的水煎煮法[14]和超临界流体萃取法[15]。索氏提取法具有选择性好、能耗低、设备简单、操作简便等优点, 适于实验室应用;黄酮易溶于甲醇、乙醇、丙酮等有机溶剂, 但甲醇和丙酮均具有一定的毒性, 乙醇无毒且沸点低, 适于索氏提取法进行苦荞麦粒中黄酮的提取, 且使用乙醇为提取剂时回收利用方便, 有利于降低生产成本。以苦荞麦粒为研究对象, 探究索氏提取法提取苦荞麦粒黄酮的最佳工艺条件, 为苦荞麦粒黄酮的开发利用提供借鉴。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
苦荞、无水乙醇、硝酸铝、氢氧化钠、芦丁等均购自国药集团化学试剂有限公司。
1.2 仪器与设备
DH6-91435-Ⅲ型电热鼓风干燥箱, 上海新苗医疗器械制造有限公司;UV721紫外/可见分光光度计, 上海精密科学仪器有限公司;电子天平, BT224S, 赛多利斯科学仪器有限公司;恒温水浴锅, HH-2, 北京科伟永兴仪器有限公司;高速粉碎机, CS-700, 武义海纳电器有限公司。
1.3 试验方法
1.3.1 黄酮标准曲线的绘制。
称取干燥芦丁0.014 6 g, 用30% (体积分数) 乙醇溶液溶解后定容至50 m L, 得到0.292 mg/L的芦丁对照品溶液, 配制步骤参考文献[15]。分别量取芦丁对照品0、2.5、5.0、7.5、10.0、12.5 m L于25 m L容量瓶中, 加0.75m L 5%亚硝酸钠溶液, 摇匀后再加0.75 m L 10%硝酸铝, 摇匀后放置6 min, 加入10 m L 4%氢氧化钠溶液, 用30%乙醇定容, 摇匀, 室温放置10 min, 分光光度计510 nm处比色得吸光度A, 得芦丁浓度与吸光度之间的回归方程。
以芦丁浓度C为横坐标, 吸光度A为纵坐标绘制标准曲线, 标准曲线回归方程为:A=0.810 5C+0.000 62, 相关系数r=0.995 5, 线性关系良好, 说明该方法可靠。
1.3.2 单因素试验。
采用乙醇为提取液, 利用索氏提取法提取苦荞中总黄酮。准确称取一定量的苦荞麦粒, 用高速粉碎机粉碎后过筛至60~80目, 在一定条件下研究乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间对苦荞麦粒黄酮提取效果的影响;在预试验的基础上, 设定以下试验。
(1) 在料液比1∶20, 为提取温度和提取时间分别为80℃和5 h的条件下, 考察不同乙醇浓度对苦荞得率的影响, 乙醇浓度选择50%、60%、70%、80%和90%。
(2) 在乙醇浓度为70%, 提取温度和提取时间分别为80℃和5 h的条件下, 考察料液比对黄酮得率的影响, 料液比选择1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50。
(3) 在料液比1∶30, 提取温度80℃, 乙醇浓度70%的条件下, 考察提取时间对苦荞黄酮得率的影响, 提取时间选择1、2、3、4、5 h。
(4) 在料液比1∶30, 乙醇浓度70%, 提取时间为5 h的条件下, 考察提取温度对黄酮得率的影响, 提取温度选择50、60、70、80、90℃。
黄酮得率计算公式:
式中, C—样液浓度;A—吸光值;N—稀释倍数;V—提取液体积;m—苦荞的质量。
1.3.3 正交试验。
由于苦荞黄酮提取率同时受提取剂 (乙醇) 浓度、料液比、提取温度、提取时间4因素的影响, 因此本试验在单因素试验的基础上, 设计了4因素3水平L9 (34) 正交试验, 以考察苦荞黄酮提取的最佳提取条件, 试验设计见表1。
1.4 统计分析
所有试验均做3次重复, 并采用Excel和DPS软件对数据进行分析。
2 结果与分析
2.1 单因素试验对苦荞黄酮提取工艺参数的优化
2.1.1 乙醇浓度对黄酮率的影响。
在提取温度为80℃, 料液比1∶20, 提取时间为5 h的条件下, 考察乙醇浓度对苦荞得率的影响。由图1a可知, 随着乙醇浓度从50%增加到80%, 总黄酮得率持续升高, 当乙醇浓度为80%时总黄酮提取率达到最大值, 但当乙醇浓度继续提高后, 苦荞黄酮提取率则呈下降的趋势。可能是由于乙醇浓度过高, 苦荞中醇溶性物质大量析出, 从而影响了黄酮在乙醇中的溶解, 导致黄酮提取率降低。同时, 试验结果表明, 当乙醇浓度为80%时不但总黄酮提取率最高, 而且没有大量水溶性杂质溶出, 由此可以得出苦荞黄酮在80%左右乙醇浓度中的溶解性较好。
2.1.2 料液比对黄酮率的影响。
由图1b可知, 当料液比较大时, 由于溶液体积较小, 苦荞中的黄酮难以全部转移到提取液中, 从而得出的黄酮得率比较小。当料液比逐渐减小时, 苦荞黄酮的提取率逐渐增加, 当料液比由1∶10减小为1∶30时, 总黄酮提取率明显提高。而料液比继续减小, 总黄酮提取率趋于稳定。料液比不仅影响黄酮的溶解同时也会对升温速率造成影响, 从而影响总黄酮提取率。提取过程中若料液比过小, 即溶解量过大, 不仅会造成溶剂的浪费, 同时对后续浓度带来不便。综合考虑各因素, 料液比为1∶30左右时为最佳料液比。
2.1.3 提取时间对黄酮率的影响。
由图1c可知, 当提取时间较短时, 总黄酮提取率较低, 随着提取时间的延长, 总黄酮提取率明显提高, 当提取时间高于4 h以后, 总黄酮提取率趋于稳定。在苦荞黄酮提取过程中, 需要一定的时间才可达到传质平衡, 提取时间过短, 反应未达到传质平衡, 苦荞中的黄酮未充分溶出, 从而导致总黄酮收率较低。随着提出时间的延长, 传质达到平衡, 苦荞中黄酮充分溶出, 因此当提取时间达到一定值后, 继续延长提取时间, 总黄酮提取率趋于稳定。试验结果表明, 乙醇回流提取苦荞黄酮过程中, 在提取时间为4 h时即可达到传质平衡。因此, 最佳提取时间为4 h。说明该提取过程在4 h已经接近平衡, 因此选择最佳提取时间为4 h左右。
2.1.4 提取温度对黄酮提取率的影响。
在乙醇浓度70%, 料液比1∶30, 提取时间5 h的条件下, 考察提取温度对黄酮得率的影响。提取温度的升高, 有利于传质过程的进行, 使分子的扩散作用更加激烈, 从而加快了溶质扩散和溶剂渗透, 有利于苦荞黄酮的溶出。由图1d可知, 当提取温度由50℃升高60℃时苦荞黄酮提取率增加缓慢, 提取温度由60℃升高至70℃时苦荞黄酮提取率显著增加, 且在70℃时达到最大值。当提取温度继续提高时, 由于超过了乙醇溶液的沸点, 乙醇挥发, 造成了溶剂的大量损失, 从而导致总黄酮提取率降低。因此70℃左右为较佳的提取温度。
2.2 正交试验结果分析
由表2可知, R值大小依次为RD>RC>RA>RB, 因此4种因素对黄酮得率效果影响的大小依次为:乙醇浓度>提取时间>提取温度>料液比, 再综合各因素水平k值大小及黄考虑各方面因素和黄酮得率可得出最佳提取工艺为A3B3C2D1, 即乙醇浓度75%, 提取温度75℃, 料液比1∶35, 提取时间4 h。
3 结论
苦荞是山西省农村广泛栽培的小杂粮之一, 其麦粒除了食用外, 苦荞茶还是人们夏天最青睐的饮品之一, 荞麦中黄酮含量丰富, 对人体有较大的益处, 因此从荞麦中提取黄酮具有很大的实际意义。本文以乙醇为提取剂, 采用索氏提取法通过单因素试验探索了乙醇浓度、料液比、提取温度和提取时间对苦荞麦粒黄酮提取率的影响, 并用正交试验对苦荞黄酮提取工艺进行优化, 得出的最佳提取工艺为:乙醇浓度75%、料液比1∶35、提取温度75℃、提取时间4 h, 在此最优条件下苦荞麦粒黄酮得率为1.462%;并得到影响黄酮提取因素的关系为:乙醇浓度>提取时间>提取温度>料液比, 本试验得出的苦荞黄酮最佳提取条件对苦荞黄酮的工业生产有一定的参考价值。
优化提取 篇2
白鲫鱼C-反应蛋白提取条件的优化
摘要：探讨了白鲫(Carassius auratus cuvieri)C反应蛋白(CRP)亲和层析法提取过程中,不同的硫酸铵饱和浓度、缓冲液pH值、缓冲液离子强度和配基浓度下对白鲫CRP的.提取效率的影响.结果发现,在硫酸铵饱和浓度80%,缓冲液pH值8.5,缓冲液离子强度为0.05 mol/LTris以及配基浓度为8 μmol/mL介质的条件下,白鲫CRP的提取效率最高.作 者：毛月霞 余群 赵冠军 MAO Yue-xia YU Qun ZHAO Guan-jun 作者单位：厦门大学,近海海洋环境科学国家重点实验室,环境科学研究中心,福建,厦门,361005期 刊：厦门大学学报(自然科学版) ISTICPKU Journal：JOURNAL OF XIAMEN UNIVERSITY(NATURAL SCIENCE)年，卷(期)：,46(z1)分类号：X503关键词：白鲫 CRP 提取条件 优化
内部沸腾法提取松针多糖工艺优化 篇3
摘要：为提高松针多糖提取率，采用内部沸腾法提取松针多糖。方法：用适量的乙醇润湿物料使多糖溶出，然后加入一定温度的水让物料内部的乙醇在低温下沸腾，快速把多糖提取出来。结果：在料液比130（克/毫升）、提取温度90℃、提取时间5分钟以及乙醇体积分数40%时，多糖得率达到7.13%。结论：与超声波辅助提取法和传统法相比，新的提取方法多糖提取率提高显著，内部沸腾法用于提取松针多糖具有很大优势。
关键词：内部沸腾法;提取;松针;多糖
中图分类号： TQ351.0 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2014.24.0021
黑松为北方广大地区最主要的造林树种之一，松针为松科松属植物的叶片，松针是采伐后所残留的无用副产物之一，是可持续利用的天然再生资源。松针多糖是一种具有多种生理功能和开发价值的活性多糖，具有对机体毒副作用小、无残留、不产生耐药性等优点，应用前景广阔。在多糖提取研究中，提取方法多为水溶液提取法、微波辅助、超声波辅助等，这些方法还存在着提取时间长和多糖得率低等问题。内部沸腾法能以实现渗入物料内部溶剂产生汽化的方式，改变传统提取过程的普通分子扩散方式，实现低温、快速提取，从而大大降低了提取时多糖浸出的问题。
1 材料与方法
1.1 仪器
HH数显恒温水浴锅：金坛市金城国胜实验仪器厂;UV-5900型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司;多功能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司;SHZ-C型循环水式多用真空泵：河南巩义市英峪予华仪器厂;DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥机：上海精宏实验设备有限公司;超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。
1.2 材料与试剂
黑松松针，采摘于沈阳师范大学校园，30℃烘干后粉碎至60～80目;葡萄糖（AR）;乙醇（AR）;苯酚（AR）;硫酸（AR）等。
1.3 试验方法
1.3.1 内部沸腾法提取松针多糖的单因素试验 称取1克松针粉末，用适量一定体积分数乙醇均匀润湿30分钟，使乙醇充分渗透物料，然后以一定温度的热水提取一段时间后，取滤液适当稀释后用苯酚—硫酸法测多糖含量。
单因素试验法，用内部沸腾法提取松针多糖，分别在热水温度90℃、提取5分钟、适量无水乙醇润湿条件下测定水用量对多糖提取率的影响;在提取5分钟、适量无水乙醇润湿、30倍水用量条件下测定提取温度对多糖提取率的影响;在热水温度90℃、适量无水乙醇润湿、30倍水用量条件下测定提取时间对多糖提取率的影响;在热水温度90℃、30倍水用量、提取5分钟条件下测定乙醇体积分数对多糖提取率的影响。
1.3.2 超声波辅助提取松针多糖的试验 取1克松针粉末置于烧杯中加蒸馏水进行超声提取30分钟，过滤取滤液适当稀释，用苯酚—硫酸法测定多糖含量。
1.3.3 传统煎煮法提取松针多糖的试验 取1克松针粉末置于圆底烧瓶内加入25毫升水，加热回流2小时，过滤，取少量的滤液并适当稀释，然后用苯酚—硫酸法测定含量。
1.4 多糖含量测定
1.4.1 标准曲线的绘制 称取葡萄糖（105℃烘干至衡重）20毫克，用蒸馏水溶解并定容至500毫升，摇匀。分别取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2毫升，加水补充至2.0毫升，再加入1.0毫升6%苯酚溶液，快速加入浓硫酸5.0毫升，静置5分钟，置沸水浴中加热15分钟，立即转入冷水浴中冷却10分钟至室温，在490纳米处测吸光度。取2毫升蒸馏水做空白对照。以葡萄糖浓度为自变量，吸光度值为因变量，得到多糖浓度C和吸光度值的线性回归曲线，其方程为Y=0.0095X+0.1424，R2=0.9905 （图1）。
1.4.2 松针多糖含量测定 取稀释后的多糖溶液2.0毫升，加入1.0毫升 6%苯酚溶液，快速加入浓硫酸5.0毫升，静置5分钟，置沸水浴中加热15分钟，立即转入冷水浴中冷却10分钟室温，在490纳米处测吸光度。取2.0毫升蒸馏水做空白对照。由下列公式计算出松针多糖得率：
多糖得率=（V×C÷1000000÷W）×100%
式中，C为标准曲线上查得的葡萄糖溶液浓度（微克/毫升），V为松针多糖溶液的总体积（毫升），W为松针粉末的质量（克）。
2 结论
本实验采用内部沸腾法提取松针多糖，确定最佳工艺条件乙醇体积分数40%、料液比为1∶30（克/毫升）、提取时间35分钟、提取温度90℃，在此条件下，松针多糖的提取率为7.13%。实验数据显示，内部沸腾法提取松针多糖是高效获得多糖的方法。
参考文献
[1] Kwak CS， Moon SC， Lee MS . Antioxidant ， antimutagenic，and antitumor effects of pine needles（Pinus densiflora） [J].Nutrition and cancer，2006，56（2）：162-171.
[2] 官员，张大伟，刘伟，等.松属植物天然多糖研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（25）：12357-12359，1237.
[3] 许丽丽，李杰.正交设计优化马尾松松针多糖的微波提取工艺[J].食品工业， 2013，34（2）：44-46.
[4] 杜晓平，郑明珠，刘景圣.超声波破壁提取松花粉多糖的工艺研究[J].食品科学，2007，28（9）：308-311.
[5] 陈晓光，韦藤幼，彭梦微，等.内部沸腾法提取香菇多糖的工艺优化[J].食品科学，2011，32（10）：31-34.
[6] 江岩，李斌，郭晓军，新疆黑桑格多糖的提取和测定田.食品科学，2005，29（8）：224-226.
[7] 翁艳英，韦藤幼，童张法.内部沸腾法提取三七多糖的研究[J].时珍国医国药，2011，22（6）：1435-1436.
作者简介：张松书，沈阳师范大学粮食学院，本科在读，研究方向：食品质量与安全。
摘要：为提高松针多糖提取率，采用内部沸腾法提取松针多糖。方法：用适量的乙醇润湿物料使多糖溶出，然后加入一定温度的水让物料内部的乙醇在低温下沸腾，快速把多糖提取出来。结果：在料液比130（克/毫升）、提取温度90℃、提取时间5分钟以及乙醇体积分数40%时，多糖得率达到7.13%。结论：与超声波辅助提取法和传统法相比，新的提取方法多糖提取率提高显著，内部沸腾法用于提取松针多糖具有很大优势。
关键词：内部沸腾法;提取;松针;多糖
中图分类号： TQ351.0 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2014.24.0021
黑松为北方广大地区最主要的造林树种之一，松针为松科松属植物的叶片，松针是采伐后所残留的无用副产物之一，是可持续利用的天然再生资源。松针多糖是一种具有多种生理功能和开发价值的活性多糖，具有对机体毒副作用小、无残留、不产生耐药性等优点，应用前景广阔。在多糖提取研究中，提取方法多为水溶液提取法、微波辅助、超声波辅助等，这些方法还存在着提取时间长和多糖得率低等问题。内部沸腾法能以实现渗入物料内部溶剂产生汽化的方式，改变传统提取过程的普通分子扩散方式，实现低温、快速提取，从而大大降低了提取时多糖浸出的问题。
1 材料与方法
1.1 仪器
HH数显恒温水浴锅：金坛市金城国胜实验仪器厂;UV-5900型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司;多功能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司;SHZ-C型循环水式多用真空泵：河南巩义市英峪予华仪器厂;DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥机：上海精宏实验设备有限公司;超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。
1.2 材料与试剂
黑松松针，采摘于沈阳师范大学校园，30℃烘干后粉碎至60～80目;葡萄糖（AR）;乙醇（AR）;苯酚（AR）;硫酸（AR）等。
1.3 试验方法
1.3.1 内部沸腾法提取松针多糖的单因素试验 称取1克松针粉末，用适量一定体积分数乙醇均匀润湿30分钟，使乙醇充分渗透物料，然后以一定温度的热水提取一段时间后，取滤液适当稀释后用苯酚—硫酸法测多糖含量。
单因素试验法，用内部沸腾法提取松针多糖，分别在热水温度90℃、提取5分钟、适量无水乙醇润湿条件下测定水用量对多糖提取率的影响;在提取5分钟、适量无水乙醇润湿、30倍水用量条件下测定提取温度对多糖提取率的影响;在热水温度90℃、适量无水乙醇润湿、30倍水用量条件下测定提取时间对多糖提取率的影响;在热水温度90℃、30倍水用量、提取5分钟条件下测定乙醇体积分数对多糖提取率的影响。
1.3.2 超声波辅助提取松针多糖的试验 取1克松针粉末置于烧杯中加蒸馏水进行超声提取30分钟，过滤取滤液适当稀释，用苯酚—硫酸法测定多糖含量。
1.3.3 传统煎煮法提取松针多糖的试验 取1克松针粉末置于圆底烧瓶内加入25毫升水，加热回流2小时，过滤，取少量的滤液并适当稀释，然后用苯酚—硫酸法测定含量。
1.4 多糖含量测定
1.4.1 标准曲线的绘制 称取葡萄糖（105℃烘干至衡重）20毫克，用蒸馏水溶解并定容至500毫升，摇匀。分别取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2毫升，加水补充至2.0毫升，再加入1.0毫升6%苯酚溶液，快速加入浓硫酸5.0毫升，静置5分钟，置沸水浴中加热15分钟，立即转入冷水浴中冷却10分钟至室温，在490纳米处测吸光度。取2毫升蒸馏水做空白对照。以葡萄糖浓度为自变量，吸光度值为因变量，得到多糖浓度C和吸光度值的线性回归曲线，其方程为Y=0.0095X+0.1424，R2=0.9905 （图1）。
1.4.2 松针多糖含量测定 取稀释后的多糖溶液2.0毫升，加入1.0毫升 6%苯酚溶液，快速加入浓硫酸5.0毫升，静置5分钟，置沸水浴中加热15分钟，立即转入冷水浴中冷却10分钟室温，在490纳米处测吸光度。取2.0毫升蒸馏水做空白对照。由下列公式计算出松针多糖得率：
多糖得率=（V×C÷1000000÷W）×100%
式中，C为标准曲线上查得的葡萄糖溶液浓度（微克/毫升），V为松针多糖溶液的总体积（毫升），W为松针粉末的质量（克）。
2 结论
本实验采用内部沸腾法提取松针多糖，确定最佳工艺条件乙醇体积分数40%、料液比为1∶30（克/毫升）、提取时间35分钟、提取温度90℃，在此条件下，松针多糖的提取率为7.13%。实验数据显示，内部沸腾法提取松针多糖是高效获得多糖的方法。
参考文献
[1] Kwak CS， Moon SC， Lee MS . Antioxidant ， antimutagenic，and antitumor effects of pine needles（Pinus densiflora） [J].Nutrition and cancer，2006，56（2）：162-171.
[2] 官员，张大伟，刘伟，等.松属植物天然多糖研究进展[J].安徽农业科学，2012，40（25）：12357-12359，1237.
[3] 许丽丽，李杰.正交设计优化马尾松松针多糖的微波提取工艺[J].食品工业， 2013，34（2）：44-46.
[4] 杜晓平，郑明珠，刘景圣.超声波破壁提取松花粉多糖的工艺研究[J].食品科学，2007，28（9）：308-311.
[5] 陈晓光，韦藤幼，彭梦微，等.内部沸腾法提取香菇多糖的工艺优化[J].食品科学，2011，32（10）：31-34.
[6] 江岩，李斌，郭晓军，新疆黑桑格多糖的提取和测定田.食品科学，2005，29（8）：224-226.
[7] 翁艳英，韦藤幼，童张法.内部沸腾法提取三七多糖的研究[J].时珍国医国药，2011，22（6）：1435-1436.
作者简介：张松书，沈阳师范大学粮食学院，本科在读，研究方向：食品质量与安全。
摘要：为提高松针多糖提取率，采用内部沸腾法提取松针多糖。方法：用适量的乙醇润湿物料使多糖溶出，然后加入一定温度的水让物料内部的乙醇在低温下沸腾，快速把多糖提取出来。结果：在料液比130（克/毫升）、提取温度90℃、提取时间5分钟以及乙醇体积分数40%时，多糖得率达到7.13%。结论：与超声波辅助提取法和传统法相比，新的提取方法多糖提取率提高显著，内部沸腾法用于提取松针多糖具有很大优势。
关键词：内部沸腾法;提取;松针;多糖
中图分类号： TQ351.0 文献标识码： A DOI编号： 10.14025/j.cnki.jlny.2014.24.0021
黑松为北方广大地区最主要的造林树种之一，松针为松科松属植物的叶片，松针是采伐后所残留的无用副产物之一，是可持续利用的天然再生资源。松针多糖是一种具有多种生理功能和开发价值的活性多糖，具有对机体毒副作用小、无残留、不产生耐药性等优点，应用前景广阔。在多糖提取研究中，提取方法多为水溶液提取法、微波辅助、超声波辅助等，这些方法还存在着提取时间长和多糖得率低等问题。内部沸腾法能以实现渗入物料内部溶剂产生汽化的方式，改变传统提取过程的普通分子扩散方式，实现低温、快速提取，从而大大降低了提取时多糖浸出的问题。
1 材料与方法
1.1 仪器
HH数显恒温水浴锅：金坛市金城国胜实验仪器厂;UV-5900型紫外可见分光光度计：上海元析仪器有限公司;多功能粉碎机：天津市泰斯特仪器有限公司;SHZ-C型循环水式多用真空泵：河南巩义市英峪予华仪器厂;DHG-9146A型电热恒温鼓风干燥机：上海精宏实验设备有限公司;超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司。
1.2 材料与试剂
黑松松针，采摘于沈阳师范大学校园，30℃烘干后粉碎至60～80目;葡萄糖（AR）;乙醇（AR）;苯酚（AR）;硫酸（AR）等。
1.3 试验方法
1.3.1 内部沸腾法提取松针多糖的单因素试验 称取1克松针粉末，用适量一定体积分数乙醇均匀润湿30分钟，使乙醇充分渗透物料，然后以一定温度的热水提取一段时间后，取滤液适当稀释后用苯酚—硫酸法测多糖含量。
单因素试验法，用内部沸腾法提取松针多糖，分别在热水温度90℃、提取5分钟、适量无水乙醇润湿条件下测定水用量对多糖提取率的影响;在提取5分钟、适量无水乙醇润湿、30倍水用量条件下测定提取温度对多糖提取率的影响;在热水温度90℃、适量无水乙醇润湿、30倍水用量条件下测定提取时间对多糖提取率的影响;在热水温度90℃、30倍水用量、提取5分钟条件下测定乙醇体积分数对多糖提取率的影响。
1.3.2 超声波辅助提取松针多糖的试验 取1克松针粉末置于烧杯中加蒸馏水进行超声提取30分钟，过滤取滤液适当稀释，用苯酚—硫酸法测定多糖含量。
1.3.3 传统煎煮法提取松针多糖的试验 取1克松针粉末置于圆底烧瓶内加入25毫升水，加热回流2小时，过滤，取少量的滤液并适当稀释，然后用苯酚—硫酸法测定含量。
1.4 多糖含量测定
1.4.1 标准曲线的绘制 称取葡萄糖（105℃烘干至衡重）20毫克，用蒸馏水溶解并定容至500毫升，摇匀。分别取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2毫升，加水补充至2.0毫升，再加入1.0毫升6%苯酚溶液，快速加入浓硫酸5.0毫升，静置5分钟，置沸水浴中加热15分钟，立即转入冷水浴中冷却10分钟至室温，在490纳米处测吸光度。取2毫升蒸馏水做空白对照。以葡萄糖浓度为自变量，吸光度值为因变量，得到多糖浓度C和吸光度值的线性回归曲线，其方程为Y=0.0095X+0.1424，R2=0.9905 （图1）。
1.4.2 松针多糖含量测定 取稀释后的多糖溶液2.0毫升，加入1.0毫升 6%苯酚溶液，快速加入浓硫酸5.0毫升，静置5分钟，置沸水浴中加热15分钟，立即转入冷水浴中冷却10分钟室温，在490纳米处测吸光度。取2.0毫升蒸馏水做空白对照。由下列公式计算出松针多糖得率：
多糖得率=（V×C÷1000000÷W）×100%
式中，C为标准曲线上查得的葡萄糖溶液浓度（微克/毫升），V为松针多糖溶液的总体积（毫升），W为松针粉末的质量（克）。
2 结论
本实验采用内部沸腾法提取松针多糖，确定最佳工艺条件乙醇体积分数40%、料液比为1∶30（克/毫升）、提取时间35分钟、提取温度90℃，在此条件下，松针多糖的提取率为7.13%。实验数据显示，内部沸腾法提取松针多糖是高效获得多糖的方法。
参考文献
[1] Kwak CS， Moon SC， Lee MS . Antioxidant ， antimutagenic，and antitumor effects of pine needles（Pinus densiflora） [J].Nutrition and cancer，2006，56（2）：162-171.
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玉竹植物甾醇提取工艺优化 篇4
1 试验材料与方法
1.1 材料与仪器
玉竹由湖南双峰邓氏玉竹有限公司提供;β-谷甾醇标准品 (HPLC98%左右) 购于成都曼斯特生物科技有限公司;其它试剂均为分析纯, 市售;TH2-312台式恒温振动器购自上海精宏仪器有限公司;SP-745紫外可见光光度计购自上海光谱仪器有限公司。
1.2 试验方法
a.工艺流程 玉竹根茎→洗净烘干→粉碎→过80目筛→称取→加入萃取溶剂→恒温摇床浸提→离心取上清液→定容→加入显色剂→比色测定。
b.测定方法[6] 用β-谷甾醇为标样作标准曲线, 以乙酸乙酯为溶剂, 将1mg/mLβ-谷甾醇溶液稀释为0.04、0.06、0.08、0.1、0.12mg/mL浓度梯度, 各取5mL, 分别加入1mL浓硫酸, 50℃水浴加热4min, 在416nm波长下, 以乙酸乙酯与浓硫酸混合液为空白测定吸光值。
c.单因素试验 称取玉竹粉样品5份, 每份均为2.0g, 考察浸提时间分别为30、60、90、120、150min, 浸提温度分别为30、40、50、60、70℃, 浸提料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50时, 摇床150r/min, 离心10min, 4000r/min, 取上清液定容, 考察对植物甾醇提取量的影响。
2 试验结果与分析
2.1 最佳提取时间的确定
随着提取时间的延长, 植物甾醇提取量会提高, 但在90min后会降低, 由图1可知, 再增加提取时间, 对提取量的提高没有明显效果。
2.2 最佳提取温度的确定
据图2所示, 随着温度的提高, 植物甾醇提取量随着增加, 当温度到达50℃时达到最大, 随后减少。这可能是因为温度过高会使其杂质的溶解度也提高, 从而影响植物甾醇的提取量。
2.3 最佳料液比的确定
由图3得出, 当料液比为1∶20 (mg/mL) 时植物甾醇提取量最高, 之后随料液比增加, 提取效果趋于平缓。
3 小结
玉竹中存在一定量的植物甾醇, 试验表明以乙酸乙酯为提取剂, 浸提时间分别为30、60、90、120、150min, 浸提温度分别为30、40、50、60、70℃, 浸提料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50时, 摇床150r/min, 离心10min, 4000r/min时, 玉竹中植物甾醇最佳提取条件为提取温度50℃, 料液比1∶20 (mg/mL) , 提取时间90min, 植物甾醇提取量最高, 达2.9246mg/g。
随着提取技术的发展, 对植物甾醇的提取方法也逐渐增多, 如溶剂结晶法、络合法、分子蒸馏法、干式皂化法、超临界CO2法、吸附法等方法的应用, 大大提高了提取量, 检测方法除了比色法外, 目前较为前沿的薄层色谱法、高速逆流色谱法也可用于植物甾醇的检测分析。随着研究的深入, 植物甾醇的应用也进一步加强, 在国外许多国家已将它列为一种新资源食品使用。对植物甾醇及其衍生物的精深加工, 如乳化、粉末微胶囊化、纳米脂质体等的研究, 也将成为植物甾醇研究新的热点。
摘要：以新鲜玉竹为原料, 经干燥磨粉后, 将乙酸乙酯作为提取剂, 采用恒温摇床浸提, 探讨提取时间、提取温度、料液比三因素对玉竹植物甾醇提取的影响。结果表明:当提取温度50℃, 料液比1∶20 (mg/mL) , 提取时间90min时, 玉竹植物甾醇的提取量达2.9246mg/g。
关键词：玉竹,植物甾醇,浸提
参考文献
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[3]王业秋, 陈巧云, 祁永华, 等.中药玉竹抗衰老作用研究进展[J].中国民族民间医药, 2010 (14) :12-13.
[4]蒋智林, 拜如霞, 桂富荣, 等.玉竹药理功效及其开发利用研究进展[J].特产研究, 2012 (3) :73-76.
[5]杨慧洁, 杨世海, 张海弢, 等.玉竹化学成分、药理作用研究进展及开发利用现状[J].人参研究, 2012 (3) :40-43.
优化提取 篇5
用改良的CTAB法提取菜心基因组DNA,并利用紫外分光光度法测定其纯度和含量,用琼脂糖凝胶电泳法检测DNA的降解状况和纯度.结果表明:此法提取的DNA具有典型的天然DNA分子的标准紫外吸收光谱特点,且适于进行RAPD分析.RAPD分析的.优化反应体系为:25μL的反应液中含有0.8 U的Taq酶,0.28 μmol/Lprimer,30 ng的DNA,2.0 mmol/L Mg2+,0.20 mmol/L dNTPs.PCR扩增循环为94℃、5 min;94℃、1 min;36℃、1 min; 72℃、2 min,37个循环;72℃延伸10 min.
作 者：王丽 乔爱民 孙一铭 孙敏 WANG Li QIAO Ai-min SUN Yi-ming SUN Min 作者单位：王丽,WANG Li(西南大学,生命科学学院,重庆,400715;仲恺农业技术学院,园艺系,广州,510225)
乔爱民,QIAO Ai-min(仲恺农业技术学院,园艺系,广州,510225)
孙一铭,孙敏,SUN Yi-ming,SUN Min(西南大学,生命科学学院,重庆,400715)
水浴法提取茶籽油的条件优化 篇6
关键词：茶籽油 水浴法 提取率
中图分类号：TS224 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2014）10-0004-02
油茶籽油俗称茶油，又名山茶油或山茶籽油，是从山茶科山茶属植物的普通油茶（Camellia oleifera Abel）成熟种子中提取的一种健康的纯天然的高级食用油[1]。茶油中主要成分为多不饱和脂肪酸，这类脂肪酸在人体内是不能够自身合成的，必须要通过一些食物来获取，是人类必需脂肪酸[2]。茶籽油具有抗肿瘤[3]、降血脂、延缓动脉粥样硬化[4]等功效。我国对于茶油的规模化研究和开发也是近期才慢慢开始的，对于茶油的提取工艺的优化实验具有了实际的科学价值和意义。
1 材料与方法
1.1 试验仪器材料
1.1.1 试剂及材料
油茶籽：去壳，磨粉；石油醚：沸程为60-90℃（分析纯；广东光华化学厂有限公司）。
1.1.2 仪器
电子天平（CP214）：奥豪斯仪器（上海）有限公司；循环水真空泵（SHZ-DM）：巩义市予华仪器有限责任公司；旋转蒸发器（RE-52AA）：上海亚荣生化仪器厂；恒温烘箱（DHG9123）：上海精密科学仪器有限公司；电热恒温循环水槽（DK-8AB）：上海一恒科学仪器有限公司。
1.2 提取工艺流程图（见图1）
1.3 茶籽油提取率的计算
茶籽油提取率表示为：茶籽油提取率=m1/m0*100%
式中m1—提取的茶籽油的质量，m0—茶籽中茶籽油的总含量（g）。
1.4 茶籽油总含量的测定
在温度为70℃、浸提液为100ml，浸提时间为2h，按照图1的提取工艺连续提取五次，
同时做3个平行样，测得茶籽油的总含量为33.43%。
1.5 单因素试验
分别选择时间（t）1h、2h、3h、4h、5h，温度50℃、60℃、70℃、80℃、85℃，料液比1：4、1：6、1：8、1：10、1：12，按照图1提取工艺，以茶籽油提取率为指标，研究提取时间、温度、料液比对水浴法提取茶籽油的工艺的影响。
2 结果与讨论
2.1 单因素实验
2.1.1 提取时间对茶籽油提取的影响
由图2可以看出，提取时间在2h前，提取率随着提取时间的延长而热呈现增加趋势，在提取时间为2h时提取率达到了最高。提取时间为3、4、5h时，随着提取时间的增加，由于溶剂挥发越来越多，提取则率逐渐下降，如果从能耗和耗时的角度来考虑，提取时间选用2h为宜。
2.1.2 提取温度对茶籽油提取的影响
由图3可以看出，随着温度的增加，茶籽油提取率虽然是呈现上升的趋势，但不难发现，温度达到60℃时，提取率达到最大，到70、80℃时提取率开始下降，有可能是因为提取的温度过高，导致石油醚挥发过快，从而致使溶剂减少，最终影响了提取率，因此应将提取温度定在60℃为宜。
2.1.3 料液比对茶籽油提取的影响
随着溶剂用量的增加，提取率在增大，在1∶10和1∶12之间提取率已变化不大。因此，选择1∶10为料液比较佳。
2.2 正交试验
正交试验结果见下表2。
由表2可以得出结论：C因素对茶籽油提取率的影响最大，其次为A和B。因此推出最佳的提取茶油的工艺组合为：A3B2C3。即提取条件为，提取温度为70℃，料液比为1：10，提取时间为3h。
3 结语
温度、料液比、提取时间这三个因素相互影响，在单因素试验结果的基础上，采用正交及验证试验，优化茶籽油的提取工艺后得到最佳提取工艺条件为：料液比为油茶籽粉末：石油醚1：10，提取温度为70℃，提取时间为3h。
参考文献
[1]朱文鑫，等.油茶籽制油及综合利用[J].粮油加工与食品科技，2004（11）：42-43.
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[3]陆顺忠，等.茶油精致工艺[J].广西林业大学，2003.132（4）：181-183.
超声法提取枸杞多糖工艺优化 篇7
关键词：枸杞,多糖,超声
枸杞为茄科植物枸杞(Lycium Barbrum L.)的果实,具有多种药理作用和生物功能。近年的医学研究表明,枸杞含有多种营养成分和微量元素[1],其有效成分枸杞多糖具有增强免疫力、抗癌、抗氧化、防衰老、增加造血功能、防止遗传损伤等作用[2,3],已成为保健食品中一种重要的功能性添加剂。
超声技术具有简单、快速、高效的特点,在食品加工中的应用越来越引起人们的注意。其原理是超声波可在液体中产生空化作用,产生的冲击波和射流可破坏植物细胞和细胞膜结构,从而增加细胞内容物通过细胞膜的穿透能力。本实验优化了超声法提取枸杞多糖的工艺条件,为更充分地开发利用枸杞资源提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
材料:新鲜枸杞(产自宁夏吴忠市)。
试剂:浓硫酸,苯酚,葡萄糖。
1.2 试验方法
1.2.1 多糖的测定
采用苯酚-硫酸法测定枸杞多糖含量。
1.2.2 标准曲线的制作
取7只10 mL试管,分别加入100 μg/mL的标准葡萄糖溶液0 mL,0.1 mL,0.2 mL,0.4 mL,0.6 mL,0.8 mL,1.0 mL,并补水至1.0 mL,再加入0.5 mL 5%苯酚,置于冷水中,再迅速加入2.5 mL浓硫酸,摇匀后于冷水中放置5 min,然后置于沸水浴中加入15 min,再置冷水中放置5 min,利用分光光度计在487 nm处测吸光值。以葡萄糖浓度为横坐标,吸光值为纵坐标,制得葡萄糖标准曲线。线性回归得方程y=8.732x+0.096 4,其中R2=0.999 1,y为吸光值,x为葡萄糖浓度(mg/mL)。
1.2.3 多糖的提取方法
将枸杞放入烘箱中烘干至恒重,粉碎,称取2.0 g枸杞粉,加入一定量去离子水,超声处理,恒温水浴浸提,离心得到上清液,加入无水乙醇沉淀多糖,离心,烘干,得到粗多糖。用蒸馏水溶解粗多糖,定容至5 mL,检测多糖含量。
1.2.4 单因素试验
分别检测料液比、超声功率、超声时间和提取温度对枸杞多糖提取率的影响。
按照料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60分别提取枸杞多糖,超声功率50 W,超声时间10 min,60 ℃浸提2 h,测多糖提取率,确定料液比对提取率的影响。
按照料液比1∶40提取枸杞多糖,分别在30 W、40 W、50 W、60 W、70 W、80 W条件下超声10 min,在60 ℃下浸提2 h,测多糖提取率,确定超声功率对提取率的影响。
按照料液比1∶40提取枸杞多糖,在超声功率60 W条件下分别处理5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min,在60 ℃下浸提2 h,测多糖提取率,确定超声时间对提取率的影响。
按照料液比1∶40提取枸杞多糖,在超声功率60 W条件下处理20 min,分别在40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃下浸提2 h,测多糖提取率,确定超声时间对提取率的影响。
1.2.5 正交试验
根据单因素试验结果,设计L9(34)正交实验,进行直观分析和方差分析。
2 结果与讨论
2.1 单因素试验
2.1.1 料液比对枸杞多糖提取率的影响
由图1可以看出,枸杞多糖的提取率随着料液比的增加而逐渐增加,当料液比大于1∶40时,多糖的提取率增加量减少。从节约成本的因素考虑,选择料液比为1∶40。
2.1.2 超声功率对枸杞多糖提取率的影响
由图2可以看出,随着超声功率的增加,多糖的提取率也增加,在功率为60 W时,多糖的提取率达到最大值。继续提高超声功率,提取率开始下降。可能是由于超声功率过高导致容器内局部温度瞬时升高,溶液颜色变深,最后得到的多糖产率略有下降。
2.1.3 超声时间对枸杞多糖提取率的影响
由图3可以看出,超声时间延长,多糖的提取率也随之增加,处理时间为20 min时的多糖提取率最大,继续增加超声时间多糖提取率显著下降。因此,最佳超声时间应为20 min。
2.1.4 提取温度对枸杞多糖提取率的影响
由图4可以看出,提取温度升高多糖的提取率也随之增加,提取温度为80 ℃时的多糖提取率最大,继续增加温度多糖提取率有所下降。因此,最佳提取温度应为80 ℃。
2.2 正交试验
根据单因素试验结果设计L9(34)正交实验。正交试验各因素的水平见表1,直观分析结果见表2,方差分析结果见表3。
根据正交试验中四个因素的极差值,各因素对枸杞多糖提取影响大小排列依次为:超声功率>提取温度>超声时间>料液比。正交试验的直观分析得到最佳提取工艺条件为A3B2C1D3,即料液比1∶50、超声功率60 W、超声时间15 min、提取温度90 ℃。
误差=0.01
根据方差分析可知,超声功率和提取温度各水平对枸杞多糖提取率的影响有显著性差异。
参考文献
[1]杨继祥.药用植物栽培学.北京:中国农业出版社,2001
[2]张静丽,王宏勋,张雯.灵芝、枸杞多糖复合抗氧化作用.食品与机械,2004;20(6):11—13
紫草素提取工艺优化的研究 篇8
1 仪器与试药
10L-50L大型旋转蒸发仪 (北京赛美思仪器设备有限公司) ;MOLPW医药生物行业用超纯水系统 (上海摩勒科学仪器有限公司) ;HD120-RT进口低温循环水浴 (上海凌初环保仪器有限公司) ;10L-50L大型旋转蒸发仪 (北京赛美思仪器设备有限公司) ;科捷仪器LC600A液相色谱仪 (南京科捷分析仪器有限公司) ;2升基本型超声波清洗器 (天津市瑞普电子仪器公司) ;SP-1920双光束紫外-可见分光光度计 (上海光谱仪器有限公司) ;FA1004万分之一分析天平 (上海书培实验设备有限公司) ;数字酸度计PHS-3C (上海佑科仪器仪表有限公司) 。乙腈 (成都市恒昌化工有限责任公司) 、甲醇 (成都市恒昌化工有限责任公司) 、磷酸 (济南汇丰达化工有限责任公司) 、三乙胺 (浙江省海宁市上峰化工有限公司) 、磷酸氢二钾 (哈尔滨市德阳化工有限公司) 、四氢呋喃 (东营柯林维尔化工有限公司) 、乙醇 (济南汇丰达化工有限责任公司) 。
2 方法与结果
2.1 水提。
按处方称取药材, 粉碎为粗粉, 至于圆底烧瓶内, 提取两次, 第一次加8倍水, 煎煮2小时, 第二次加6倍水煎煮1小时, 过滤, 合并滤液, 减压浓缩至相对密度为1.22 (65摄氏度测) 。采用高效液相测定浓缩膏中辣椒素含量并计算收率。
2.2 醇提。
按处方称取药材, 粉碎为粗粉, 至于回流提取器内, 回流提取两次, 第一次8倍80%乙醇, 回流提取2小时, 第二次6倍80%乙醇回流提取1小时, 过滤, 合并滤液, 减压浓缩至相对密度为1.22 (65摄氏度测) 。采用高效液相测定浓缩膏中辣椒素含量并计算收率。
2.3 渗滤。
按处方称取药材, 粉碎为粗粉, 至于渗滤罐内, 采用20倍80%乙醇进行渗漉, 渗漉速度为每分钟1升, 合并渗漉液, 减压浓缩至相对密度为1.22 (65摄氏度测) 。采用高效液相测定浓缩膏中辣椒素含量并计算收率。
2.4 浸泡。
按处方称取药材, 粉碎为粗粉, 至于浸泡罐内, 浸泡两次, 第一次加10倍80%乙醇, 浸泡8小时, 第二次加8倍80%乙醇, 浸泡6小时, 合并浸泡液, 减压浓缩至相对密度为1.22 (65摄氏度测) 。采用高效液相测定浓缩膏中辣椒素含量并计算收率。
2.5 正交试验设计。
实验结果表明, 90%乙醇回流提取左旋紫草素收率最高。选择乙醇体积分数、加醇量、提取时间作为考察因素, 采用正交试验法对影响提取效率的其它工艺条件进行优选。采用3个考察水平, 用L9 (34) 正交表进行试验, 因素水平表见表1。
3 含量测定
3.1 色谱条件色谱柱为Waters Sun Fire C18液相色谱柱 (规格250×4.6mm, 5um) ;甲醇-水-磷酸 (76:24:0.2) 为流动相;检测波长为516nm;流速1.0m L·min-1。
3.2 供试品溶液的制备取紫草浓缩膏, 精密称定, 置具塞锥形瓶中, 精密加入流动相50毫升, 密塞, 精密称定重量, 超声三十分钟, 放冷, 精密称定, 用流动相补足重量, 摇匀, 用微孔滤膜 (0.45μm) 滤过, 取续滤液, 即得。
3.3 对照品溶液的制备精密称取左旋紫草素对照品, 用流动相溶解稀释, 配制成每1m L溶液中含左旋紫草素20μg的对照品溶液。
3.4 标准曲线的制备将浓度为5μg/ml, 10μg/ml, 20μg/ml, 30μg/ml, 40μg/ml, 50μg/ml, 60μg/ml的对照品溶液分别吸取20μL注入HPLC, 以进样量 (μg) 为横坐标, 峰面积积分值A为纵坐标, 绘制标准曲线。试验表明, 左旋紫草素对照品在5~60μg/ml范围内线性关系良好。
3.5 回收率试验取已知含量的同一批供试品各6份, 分别精密添加一定量的左旋紫草素对照品, 测定含量, 计算回收率。平均回收率为99.23%, RSD为0.56%。
4 讨论
分别考察甲醇-水-磷酸 (76:24:0.2) , 乙腈-水-磷酸 (70:30:0.1) , 乙腈-甲醇-四氢呋喃-水 (10:20:30∶40) , 0.05mol.L-1磷酸二氢钾溶液 (用磷酸调p H到3.0) -乙腈 (20∶80) , 乙腈-甲醇-水-三乙胺 (20:30:50∶0.01) , 不同比例的流动相, 结果以甲醇-水-磷酸 (76:24:0.2) 为流动相, 供试品各峰分离效果最好, 故选用甲醇-水-磷酸 (76:24:0.2) 为流动相。按照L9 (34) 正交设计表条件进行试验, 得到最佳的提取工艺为最佳的提取工艺为提取二次, 第一次8倍90%乙醇提取1.5小时, 第二次6倍90%乙醇提取1小时, 过滤, 合并滤液, 减压浓缩。本方法可靠、简单, 可用于生产。
参考文献
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优化提取 篇9
酶法提取米糠蛋白反应条件温和, 蛋白质提取得率较高, 且能更多保留蛋白质营养价值, 同时也避免传统碱法提取米糠蛋白所带来的负面效应, 因此酶法提取米糠蛋白为米糠利用提供了便利[7]。本研究探讨了采用碱式蛋白酶水解米糠, 通过优化提取工艺提高米糠的附加值, 为米糠产业的发展提供技术支撑和实践参考。
1 材料
脱脂米糠, 四川省岳池县黄龙贡米经加工处理后得到。
碱性蛋白酶 (最佳温度为30~50℃, 最佳p H值为9~13, 5 000 U/g) 、中性蛋白酶 (最佳温度为30~50℃, 最佳p H值为6~8, 3 000 U/g) , 购自北京奥博星生物技术有限责任公司;甘氨酸、茚三酮、D-果糖、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、蔗糖、柠檬酸、浓硫酸、硫酸铜、硫酸钾、标准盐酸、硼酸, 购自成都市科龙化工试剂厂。
电子天平JA2003, 上海仪电科学仪器股份有限公司产品;UV-2600型紫外可见分光光度计, 尤尼柯 (上海) 仪器有限公司产品;粉碎机, 上海市浦恒信息科技有限公司产品;恒温振荡器, 金坛市富华仪器有限公司产品;数显恒温水浴锅, 金坛市医疗仪器厂产品;KDN-04消化炉、KDN-04B定氮仪, 上海华睿仪器有限公司产品。
2 方法
2.1 米糠蛋白的提取工艺
参照李喜红等[8]的方法, 本试验选择的提取工艺为:脱脂米糠→粉碎→过筛 (80目) →加水→调p H值→加碱性蛋白酶→提取→灭活→调p H值→加中性蛋白酶→提取→灭活→离心分离→取上清液测定蛋白质的含量及水解度。
2.2 检测项目
1) 蛋白质含量:采用凯氏定氮法[9]测定。
2) 蛋白质提取率:按公式“蛋白质提取率=水解提取出蛋白的量/原料中总蛋白的含量×100”[10]计算。
3) 水解度:采用茚三酮比色法[11]测定。
2.3 米糠蛋白提取条件的优化
脱脂米糠经粉碎后, 于不同加酶比例、加酶总量、水解时间、液料比、p H值、温度下水解, 测定水解物中蛋白含量, 计算提取率。选取影响较大的3个因素进行响应面分析, 以期获得最优工艺条件。三因素不同水平分别为:碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比1∶1、2∶1、3∶1, 加酶总量0.70%、0.75%、0.80%, 碱性蛋白酶水解时间2.5 h、3.0 h、3.5 h。响应面分析试验因素水平见表1。
3 结果与讨论
3.1 原料中总蛋白含量的测定
采用凯氏定氮法两次测得脱脂米糠原料中平均蛋白含量约为16.34%。
3.2 水解时间对提取率的影响
3.2.1 碱性蛋白酶水解时间对提取率的影响
当液料比为10∶1、加酶总量为0.1%、碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量之比为2∶1时, 碱性蛋白酶在p H值为10、温度为40℃的条件下经过不同时间水解, 再用中性蛋白酶在p H值为7、温度为40℃条件下水解1 h, 探讨碱性蛋白酶水解时间对提取率的影响, 结果见图1。
由图1可知:水解时间为1~3 h, 米糠蛋白提取率随着时间的增加而显著增加, 米糠蛋白提取率从10.11%增加到27.67%, 随后趋于稳定。
3.2.2 中性蛋白酶水解时间对提取率的影响
当液料比为10∶1、加酶总量为0.1%、碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量之比为2∶1时, 碱性蛋白酶在p H值为10、温度为40℃的条件下水解3 h, 再用中性蛋白酶在p H值为7、温度为40℃条件下水解不同时间, 探讨中性蛋白酶水解时间对提取率影响, 结果见表2。
%
由表2可知:中性蛋白酶水解时间对提取率的影响不大。当水解时间为2.5 h, 有最大提取率, 但与水解1 h相差不大。
3.3 液料比对提取率的影响
当加酶总量为0.1%、碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量之比为2∶1时, 碱性蛋白酶在p H值为10、温度为40℃的条件下水解3 h, 再用中性蛋白酶在p H值为7、温度为40℃条件下水解1 h, 探讨料液比对提取率的影响, 结果见图2。
由图2可知:当液料比为4∶1时, 有最大提取率 (27.87%) ;当液料比超过4∶1时, 提取率呈缓慢下降趋势, 且料液比对提取率的影响不大。
3.4 p H值对提取率的影响
3.4.1 碱性蛋白酶p H值对提取率的影响
液料比为4∶1、加酶总量为0.1%、碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量之比为2∶1时, 碱性蛋白酶在不同p H值、温度为40℃的条件下水解3 h, 再用中性蛋白酶在p H值为7、温度为40℃条件下水解1 h, 探讨碱性蛋白酶p H值对提取率影响, 结果见图3。
由图3可知:在p H值为9~12时, 米糠蛋白提取率随着时间的增加而增加;当碱性蛋白酶p H值超过12后, 米糠蛋白提取率随着时间的增加而下降。碱性蛋白酶p H值为10~12时, 对米糠蛋白提取率的影响不大。当p H值为12时有最大提取率, 为36.45%。
3.4.2 中性蛋白酶p H值对提取率的影响
液料比为4∶1、加酶总量为0.1%、碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量之比为2∶1时, 碱性蛋白酶p H值为12、温度为40℃的条件下水解3 h, 再用中性蛋白酶在温度为40℃、不同p H值条件下水解1 h, 探讨中性蛋白酶p H值对提取率的影响, 结果见表3。
%
由表3可知, 中性蛋白酶p H值在适宜温度范围内 (6~8) 对提取率的影响作用不明显。
3.5 温度对提取率的影响
液料比为4∶1、加酶总量为0.1%、碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量之比为2∶1时, 碱性蛋白酶在p H值为12、不同温度下水解3 h, 再用中性蛋白酶在p H值为7、相同温度条件下水解1 h, 探讨温度对提取率的影响, 结果见图4。
由图4可知:温度对米糠蛋白提取率的影响不大。当碱性蛋白酶温度为55℃时提取率最小, 为26.48%;当碱性蛋白酶温度为45℃时提取率最大, 为32.28%。
3.6 加酶总量对提取率的影响
液料比为4∶1、不同加酶总量、碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量之比为2∶1时, 碱性蛋白酶在p H值为12、温度为45℃的条件下水解3 h, 再用中性蛋白酶在p H值为7、温度为45℃条件下水解1 h, 探讨加酶总量对提取率以及水解度的影响, 结果见图5、图6。
由图5可知:加酶总量对米糠蛋白提取率的影响较大, 米糠蛋白提取率随着加酶总量的增加而显著增加。当加酶总量为0.10%时提取率最小, 仅为32.24%;当加酶总量为0.90%时提取率最大, 可达79.62%。酶量越多蛋白质提取率越高, 但水解度也相应增加。水解度的增加会影响产品质量 (一般是产品的风味及口感) , 一般要求水解度不超过5%[8,9]。因此, 选择最佳加酶总量为0.70%, 此时提取率为73.40%, 水解度为4.50%, 见图6。
3.7 加酶比例对提取率的影响
液料比为4∶1、加酶总量为0.70%、不同碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比, 碱性蛋白酶在p H值为12、温度为45℃的条件下水解3 h, 再用中性蛋白酶在p H值为7、温度为45℃的条件下水解1 h, 探讨碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比对提取率以及水解度的影响, 结果见表4。
%
由表4可知:碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比对提取率的影响较大。随着碱性蛋白酶用量的增加, 提取率明显增加。当碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比为1∶3时, 提取率最小, 为56.90%;当碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比为2∶1时, 提取率最大, 为77.50%。
3.8 提取工艺的优化
3.8.1 主要影响因素的选择
在单因素试验基础上, 选择对米糠蛋白提取率影响较大的3个因素进行响应面分析, 以期获得最佳工艺条件。故选择碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比、蛋白酶加酶总量、碱性蛋白酶水解时间3个主要因素进行响应面分析, 从而得到最佳工艺条件。
3.8.2 Box-Behnken试验设计和响应面法优化米糠蛋白提取工艺
Box-Behnken试验设计结果见表5。
3.8.3 模型的建立及显著性检验
利用DesignExpert软件对表5中试验数据进行二次线性回归拟合, 得到回归方程如下:提取率=84.58-0.16A+0.11B-1.03C+0.15AB+1.07AC+0.73BC-10.07A2-6.27B2-5.19C2。回归统计分析结果见表6。
由表6可以看出:所建立的模型极显著 (P<0.000 1) , 米糠蛋白提取率与所考察自变量中, 碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比、加酶总量、碱性蛋白酶水解时间之间的线性关系显著 (R2=0.998 4) , 模型调整确定系数R2adj=0.996 4, 说明该模型拟合度较好, 失拟不显著 (P>0.05) , 本试验二次回归方程所得预测值与实测值高度相关, 因此可以很好地运用响应值进行预测。二次项A2、B2、C2表现为极显著, 说明碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比的平方、加酶总量的平方、碱性蛋白酶水解时间的平方对响应值影响极大。
3.8.4 提取工艺条件响应面分析及优化
通过Design-Expert软件分析, 利用得到的回归方程, 可通过MATLAB绘出响应面及等高线图, 见图7~9。
因响应面图表示第三个因素处于最佳水平时, 其他两个因素间的相互作用, 因此可直观反映各因素交互作用对响应值的影响, 其中等高线的形状可反映出交互效益的强弱, 椭圆表示两因素交互作用显著。由图7~9可以看出:碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比、加酶总量、碱性蛋白酶水解时间对米糠蛋白提取率的影响存在一定的相关性, 其中加酶总量对提取率的影响最大。当加酶总量在0.7%~0.8%的范围内时, 随着加酶总量的增加蛋白提取率显著增加;当加酶总量确定时, 碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比、碱性蛋白酶水解时间对米糠蛋白提取率的影响不大。
3.8.5 寻求最优值及验证试验
通过所建立的回归方程, 得到最佳提取条件为:碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比1.99∶1、加酶总量0.75%、碱性蛋白酶水解时间2.95 h, 此时米糠蛋白提取率最大, 为84.63%。考虑到实际操作性, 设定最佳工艺条件为碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比2∶1、加酶总量0.75%、水解时间3 h。采取最优条件, 分别重复5组验证试验, 米糠蛋白提取率平均值为83.71%, 相差0.91%, 说明验证试验所得结果与预测值相符, 因而确定最佳工艺条件为:碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比2∶1, 加酶量0.75%, 水解时间3 h。
4 结论
在诸多单因素基础上, 选出对米糠蛋白提取率影响最大的因子:碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比、加酶总量、碱性蛋白酶水解时间。再以这些因子为基础进行Design-Expert试验设计及响应面分析, 从而得到最佳工艺条件。最后确定出米糠蛋白最佳提取条件为:当碱性蛋白酶与中性蛋白酶用量比2∶1、加酶总量0.75%时, 经碱性蛋白酶在p H值为10、温度为45℃的条件下水解3 h, 再用中性蛋白酶在p H值为6.5、温度为45℃条件下水解1 h, 米糠蛋白的提取率最高可达84.63%。
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正交试验法优化桑叶多糖提取工艺 篇10
关键词：桑叶,多糖,提取,工艺
桑叶为桑科桑属植物(Morus alba L.)的叶子,该属植物全世界约有16种,我国有11种,分布于全国大部分地区,以浙江、江苏等南方养蚕地区产量较大。桑叶是我国传统中药,具有疏散风热、清肺润燥、清肝明目功效[1]。化学成分研究表明,桑叶中除含有黄酮、生物碱等次生代谢活性物质外,还具有丰富的多糖、蛋白质、脂肪酸、纤维素、维生素、矿物质等[2]。多糖作为桑叶的有效成分之一,具有显著地降血糖、抗氧化和抗凝血作用[3,4,5]。
目前关于桑叶多糖提取的报道较多,有热水提取、酶法提取、超声波辅助提取、超高压提取等[6,7,8,9,10],但其研究都是直接以干燥桑叶为原料进行提取。为了综合利用桑叶资源,本试验在前期研究基础上[11],以脱除黄酮的桑叶为原料,采用热水法提取桑叶多糖,可为工业化生产桑叶多糖提供参考。
1 材料与方法
1.1 材料和仪器
桑叶:湖桑,采自浙江大学华家池校区,2009年12月采摘;葡萄糖、浓硫酸、苯酚等试剂均为分析纯。
752 紫外-可见光分光光度计,上海光谱仪器有限公司;BS 124S分析天平,赛多利斯公司;HH-4数显恒温水浴锅,金坛市江南仪器厂;DZF-6050型真空干燥箱,上海一恒科学仪器有限公司;SHB-III循环水式多用真空泵,河南太康教材仪器厂。
1.2 试验方法
1.2.1 按文献[11]所述工艺条件提取桑叶黄酮后,过滤,将滤渣在真空条件下35℃烘干。
1.2.2 标准曲线的绘制
精密称取50℃真空干燥至恒重的葡萄糖110 mg于100 mL容量瓶中,加水至刻度,摇匀得到葡萄糖贮备液。精密吸取2 mL贮备液于50 mL容量瓶中,加水至刻度,即得0.044 g·L-1的葡萄糖对照品溶液。再分别吸取葡萄糖对照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL置于10 mL试管中,加水补足至2.0 mL,另以2.0 mL 蒸馏水作空白对照,分别加入新配制5%苯酚溶液1.0 mL,置冷水中迅速流入浓硫酸5.0 mL,冷水放置5 min后,摇匀,置沸水浴中加热15 min,再用自来水冷却,放置5 min,于490 nm比色测定吸光度。以吸光度值为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标,绘制标准曲线,得到回归方程。
1.2.3 桑叶多糖得率的测定
吸取桑叶多糖提取溶液1.0 mL置于试管中,加水补足至2.0 mL,另以2.0 mL蒸馏水作空白对照,采用上述1.2.2方法测定吸光度。根据葡萄糖标准曲线的方程计算桑叶多糖含量,再通过下式计算桑叶多糖得率:
桑叶多糖得率undefined
1.2.4 桑叶多糖提取最优工艺条件的确定
试验首先观察不同条件对桑叶多糖得率的影响,包括提取时间、提取温度、提取液pH、料液比(桑叶质量:提取液, g/mL)和提取次数,再选取四个因素进行L9(3)4正交试验,以确定最佳桑叶多糖的提取工艺条件。
2 结果与讨论
2.1 葡萄糖标准曲线及其回归方程
按照线性关系考察方法操作一次,得到葡萄糖标准曲线图1,以吸光度值(X)对葡萄糖浓度(Y)作回归计算,回归方程如下:
Y=57.728X-0.0199
该方程线性关系良好(r2 = 0.9991),表明葡萄糖在1.0～11.0 mg·L-1范围内与吸光度呈良好线性关系,可应用此方程计算待测溶液中多糖含量。
2.2 桑叶多糖提取工艺单因素
2.2.1 提取时间对桑叶多糖提取工艺的影响
称取原料5.0 g,按料液比1:20加入去离子水,在65 ℃、pH 7的条件下提取1次,提取时间分别设定为1、2、3、4、5 h,考察提取时间对桑叶多糖提取工艺的影响,实验结果见图2。
由图2可知,随着桑叶多糖提取时间的增加,粗多糖得率呈现缓慢上升趋势,当提取时间达到4 h时,多糖得率达到最大值,5 h时反而有轻微下降。因此取4 h为桑叶多糖的最佳提取时间。
2.2.2 提取温度对桑叶多糖提取工艺的影响
取桑叶5 g,按料液比1:20加入去离子水,在提取时间为3 h、pH 7的条件下提取1次,提取温度分别为35、50、65、80、95 ℃时,考察提取温度对桑叶多糖提取得率的影响,实验结果见图3:
由图3可以看出,当提取温度上升时,桑叶粗多糖的得率也随之呈上升趋势,当温度达到95 ℃时,多糖得率达到最高值,且比65 ℃时的多糖得率提高了整整1个百分点,因此取95 ℃作为桑叶多糖的最佳提取温度。
2.2.3 提取pH对桑叶多糖提取工艺的影响
取桑叶5 g,按料液比分别为1:20加入去离子水,在提取时间为3 h,温度65℃的条件下提取1次,提取pH分别为3、5、7、9、11时,考察提取pH对桑叶多糖提取工艺的影响,实验结果见图4:
由图4可知,当提取pH上升时,桑叶粗多糖得率也随之波动,当pH达到3、7、11时,多糖得率达到较高值,考虑到提取工艺的简化及多糖在酸性和碱性条件下容易发生水解,取pH7较为合适。
2.2.4 料液比对桑叶多糖提取工艺的影响
取桑叶5 g,分别按料液比1:20、1:30、1:40、1:50加入去离子水,在提取时间为3 h,温度65℃,pH7的条件下提取1次,考察提取料液比对桑叶多糖提取工艺的影响,实验结果见图5:
由图5可知,随着料液比的增加,粗多糖得率呈现上升趋势,当料液比达到1:40时,多糖得率提高的幅度趋缓,综合考虑经济因素和后续工艺的简化,取料液比1:40为桑叶多糖提取工艺的最佳料液比。
2.2.5 提取次数对桑叶多糖提取工艺的影响
取桑叶5 g,按料液比1:20加入去离子水,在提取时间为3 h,温度65℃,pH7的条件下分别提取1、2、3、4次,考察提取次数对桑叶多糖提取工艺的影响,实验结果见图6:
由图6可知,随着提取的增加,粗多糖得率呈现上升趋势,当提取次数达到2次时,多糖得率提高的幅度趋缓,综合考虑经济因素和后续工艺的简化,取提取次数2次为桑叶多糖提取的最佳工艺。
2.3 正交试验
通过单因素试验的研究,设定提取次数为2,取影响桑叶多糖提取主要因素提取时间(A)、料液比(B)、提取温度(C)和样液pH(D)进行正交优化试验。每个因素设定3个水平,在平行操作下,按L9(34)正交设计(见表1),以多糖得率为评价指标对提取工艺条件进行优化。
2.4 正交优化实验结果与讨论
水提取桑叶粗多糖正交实验结果见表2,方差分析结果见表3。
由表2和表3可知,以多糖得率为考察指标,提取温度对多糖得率有显著影响,料液比无显著影响。正交试验结果分析表明,影响桑叶多糖得率因素顺序为:提取温度>提取时间>pH>料液比,即在试验设定的条件下,多糖得率随提取温度升高和提取时间延长而增加,而随pH提高而先增大后减小,随料液比增大而呈现轻微增加。
F0.1(2,2)=9, F0.05(2,2)=19, F0.01(2,2)=99; *有一定影响, **显著
通过上述试验结果分析,可得到以下结论:提取温度对多糖得率有显著影响,提取时间对多糖得率有一定影响;桑叶多糖的最佳工艺条件为:A2B2C3D2、即提取温度100 ℃、提取时间4 h、pH7、料液比1:30、提取2次。
在该优化条件下进行验证试验,得到桑叶多糖的平均得率为2.74 %,RSD=1.4 % (n=5),试验重复性较好。
3 结论
本试验以脱除黄酮后的桑叶为原料,利用热水法提取多糖,确定了各种提取因素对桑叶多糖得率的影响,通过单因素和正交优化实验确定了桑叶多糖最佳提取工艺条件为:提取温度100 ℃、提取时间4 h、pH7.0、料液比1:30、提取次数为2,多糖得率达2.74%。验证研究表明,该工艺稳定,重复性较好,易于工业化生产。
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优化提取 篇11
关键词：发菜；总RNA；提取；方法优化
中图分类号：Q781文献标志码：A文章编号：1002-1302（2015）09-0058-03
收稿日期：2014-08-22
基金项目：国家自然科学基金（编号：31360054）。
简介作者：杨佳（1988—），女，山东菏泽人，硕士研究生，主要从事资源植物学方面的研究。E-mail：yangjia713@126.com。
通信作者：梁文裕，博士，教授，主要从事植物资源及植物分子生物学的研究。E-mail：liangwy2009@163.com。生物体性状和对外界环境的响应归根到底是由基因调控的，基因调控主要涉及到核酸、蛋白质等生物分子，高质量RNA是进行基因表达分析的基础。细胞内RNA分子多样性和易被降解的特性决定了RNA提取过程的复杂性[1]，RNA酶高稳定性是造成RNA分离困难的主要原因。RNA提取过程中出现的RNA酶有2种来源：外源性RNA酶和内源性RNA酶。外源RNA来自RNA制备过程中用到的玻璃和塑料制品、研究人员本身以及分离过程中用到的试剂或溶液，但这些外源性RNA酶可以通过RNA酶抑制剂处理或使用RNA研究的专用试剂等措施来解决[2-4]。而内源性RNA酶存在于材料本身，如材料的不新鲜会降低RNA的产量，破碎细胞内含物常与RNA形成难溶的物质（多糖类等）导致RNA分离困难[5-6]，因此，诸多因素会直接影响RNA的提取效果，增加RNA的提取难度。
发菜（Nostoc flagelliforme）是一种陆生固氮蓝藻，生长在干旱-半干旱荒漠草原地区，具有独特的抗干旱、高温、高光照度、紫外线等非生物胁迫的特性[7]。RNA提取是探索发菜抗逆差异基因表达或转录组研究的重要基础，但由于发菜藻体被较厚的胶质鞘包被，对发菜藻体和细胞的破碎存在一定难度，同时发菜藻体富含的多糖、色素、蛋白质等会以不同方式干扰RNA的提取，从而加大了发菜藻体RNA提取的难度。目前，国内尚无发菜高质量RNA提取的相关报道，找到适合提取发菜总RNA的方法具有重要意义。本研究对3种发菜藻体RNA的提取方法进行比较和优化，筛选出最适合发菜RNA的提取方法，为从抗逆差异基因表达或转录组角度研究发菜耐干旱、抗紫外辐射等机理奠定重要基础。
1材料与方法
1.1材料
野生新鲜发菜采自宁夏贺兰山发菜自然生长地。
1.2发菜藻体总RNA的提取及优化
1.2.1Omega试剂盒法提取发菜藻体总RNA将研磨充分的发菜藻体粉末转入Buffer RCL中（含β-巯基乙醇），迅速涡旋振荡，使材料充分裂解，按Omega公司E.Z.N.A.TM Plant RNA Kit试剂盒说明书中的E.Z.N.A.TM Plant RNA Protocol Ⅱ进行试验。
1.2.2Trizol法提取发菜藻体总RNA按照TRIzol Reagent说明书进行发菜藻体RNA的提取。
1.2.3天根试剂盒法提取发菜RNA将充分研磨至粉末的发菜藻体迅速转移至裂解液SL（含β-巯基乙醇）中，立即涡旋剧烈振荡混匀，按天根公司RNAprep Pure Plant Kit试剂盒步骤提取发菜藻体总RNA。
1.3发菜藻体总RNA提取方法的优化
1.3.1Omega试剂盒方法的优化参照Omega试剂盒法稍作修改。使用700 μL Buffer RCL进行材料的裂解。试验步骤中增加DNase I，即当RNA全部吸附到HiBindTM RNA Mini柱子上后，加300 μL RWC Wash Buffer到柱子上，10 000 g离心1 min，把配好的DNase Ⅰ mix准确地加入柱子中心，室温静置15 min；将HiBindTM RNA Mini柱子放入1个新的收集管中，加400 μL RWC Wash Buffer，静置5 min，10 000 g离心 1 min；最后加入在70 ℃水中孵育的DEPC水进行RNA的提取。
1.3.2改良Trizol法提取发菜RNA对TRIzol Reagent RNA的提取方法稍作修改。向研磨好的发菜细胞中加入1 mL Trizol 后，用涡旋混合器充分混匀，并在冰上放置15 min；55～60 ℃水孵育10～15 min后，4 ℃放置1 h再转移至-80 ℃冰箱备用。
1.3.3天根试剂盒方法的优化参照天根试剂盒法稍作修改。将研磨好的材料加入裂解液SL充分涡旋振荡混匀后，12 000 g 离心3 min；2次加入去蛋白液RW1后，放置1 min再进行离心1 min；用漂洗液RW漂洗3次再空转离心2 min；加入RNase-Free水后于室温放置5 min后离心收集RNA。
1.4RNA质量和完整性检测
1.4.1琼脂糖凝胶电泳检测分别取RNA样品进行1.0%的琼脂糖凝胶，电泳条件为0.5×TAE缓冲液、160 V恒压、15 min，紫外灯下观察RNA条带并照相记录结果。
1.4.2RNA产量和纯度检测RNA产量和纯度通过核酸浓度测定仪进行检测。通常D260 nm/D280 nm比值在1.8～2.2之间，D260 nm/D230 nm比值在2.0左右，说明RNA纯度较高，D260 nm/D280 nm比值为2.0时质量最高[8]。用RNase free ddH2O作为空白对照，取1 μL RNA样品，用核酸浓度测定仪检测D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm以及RNA的浓度（ng/μL）值。
2结果与分析
2.13种方法提取发菜总RNA质量比较
Omega试剂盒法提取的发菜总RNA样品电泳显示无典型的RNA条带（图1）；Trizol法所提RNA无23S、16S条带，只有1条条带，表明RNA完全降解（图2）；天根试剂盒法提取的发菜总RNA电泳结果表明，23S、16S条带明显，但条带拖尾现象严重（图3）。
用核酸浓度测定仪分别检测3种方法所提发菜藻体RNA的产量和纯度，检测结果表明，Omega试剂盒所测值均超出了正常值的范围；Trizol法所提RNA相关数据远远低于正常值范围，RNA浓度值较高，说明所提RNA不纯，蛋白质、多糖等杂质污染严重；天根试剂盒法所得数值均正常，且D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm比值接近2.0，说明RNA纯度较高，可进行优化后用于后续的分子试验（表1）。
2.23种方法优化后所提发菜藻体RNA的琼脂糖凝胶电泳检测
优化后Omega试剂盒法所提发菜总RNA（图4）与优化表1不同方法所提发菜藻体RNA的质量及产量检测
方法D260 nm/D280 nmD260 nm/D230 nmRNA浓度
（ng/μL）峰值波长
（nm）Omega试剂盒法2.122.47737.7260Trizol法1.720.53328.3220天根试剂盒法2.071.9397.1260
前（图1）无明显差异，用DNase处理后，仍有杂带，无明显改变，在最下1条亮带以上，能清晰看到4条条带，这与正常RNA电泳条带相异，推测Omega试剂盒不适合发菜藻体RNA的提取；改良后的Trizol法23S、16S 2条带已有大部分降解，5S条带比较明亮，并伴有拖尾现象，表明该方法所提RNA降解快，不适合进行后续试验（图5）；优化后的天根试剂盒法所提发菜总RNA质量有明显提高，23S、16S条带清晰，无明显弥散、拖尾现象（图6）。
与没有优化前的3种RNA提取方法相比，优化的Omega试剂盒法和改良Trizol法所提RNA并没有提高其质量和纯度，优化的Omega试剂盒法比值依然较高；改良Trizol法所得比值均低，说明改良后Trizol法所提RNA仍伴有蛋白质、多糖等杂质的污染；天根试剂盒经过优化，所提取的RNA质量和浓度都有所增加，D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm、浓度分别达2.06、2.08、154.3 ng/μL（表2），260 nm处峰值显著（图7）。
表2不同方法优化后所提发菜藻体RNA的质量及产量检测
方法D260 nm/
D280 nmD260 nm/
D230 nmC
（ng/μL）峰值波长
（nm）优化Omega试剂盒法2.122.24663.1260改良Trizol法1.770.5845.5220优化天根试剂盒法2.062.08154.3260
3讨论
RNA提取一般采用研磨等方法使细胞破碎，通过去除材料中的多糖、蛋白质、DNA的污染，进一步进行洗涤和沉淀，最终得到纯度较高的RNA。有效细胞裂解是提取高质量及高产量RNA的关键环节[8-9]，由于发菜藻体富含胶质、色素和多糖等，并且极易大量吸水和细胞壁坚硬的特性造成了RNA提取困难，对发菜藻体和细胞破碎以及缓冲液的选择无疑成为提取其RNA的关键步骤。笔者进行了几种破碎方法的比较，发现采用反复多次液氮研磨是破碎发菜藻体和细胞的理想方法。然而研磨过程中还应确保研磨用力恰当、液氮充足，避免材料溶解，而且研磨时间不宜过长（小于8 min）。
根据不同试验目的和材料，RNA提取可采用不同的方法[10-11]。李亚军等研究表明，Trizol法能更简单有效获得莱茵衣藻中高质量的RNA，而最适合提取微芒藻中高质量RNA的方法是SDS-LiCl沉淀法[12]。本研究结果表明，Omega试剂盒法所提取的RNA伴随杂质较多；Trizol法和改良Trizol法均不适用于发菜藻体RNA的提取，D260 nm/D280 nm、D260 nm/D230 nm 都与标准数值相差甚远；天根试剂盒法是发菜总RNA提取的理想选择，所得发菜RNA基本可以满足RT-PCR要求，但仍达不到转录组测序的要求。通常情况下，试剂盒法所提取的RNA质量并不高，原因是不同材料组织结构以及其中所含物质的种类不同，导致试剂盒在提取过程中并不理想，因此，试剂盒使用应根据试验目的及试验材料的特性进行适当改进。王友华等用改进的热酚提取法获得了高质量的棉花根总RNA[13]；王春晖等通过对2种试剂盒法和改良的异硫氰酸胍法的比较，得出改良的异硫氰酸胍法所提出的棉花幼根总RNA能够满足转录组测序要求[14]；杨晓燕等针对3种常用RNA提取试剂盒对红地球葡萄叶样品RNA的提取效果进行评估和优化，结果显示最适于提取葡萄叶片总RNA的为RNeasy Plant Mini Kit试剂盒，同样需要延长提取试剂与样品的接触时间从而提高RNA的提取质量[8]。笔者对Omega RNA提取试剂盒、Trizol RNA提取法、天根试剂盒等3种方法进行优化，结果表明，天根试剂盒法所提发菜RNA质量最高，达到转录组测序要求。
参考文献：
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优化提取 篇12
如果能够在保证识别效果的基础上有效降低存储和计算量,使这一技术推广到常见的便携移动设备上,如利用智能手机进行银行转帐时,使用SIM+人脸鉴定的双重保险,将会给人们带来更加安全便捷的数字化服务。为与人脸识别过程相结合,在分析了遗传算法的基本过程和要素后,给出遗传算法在应用于人脸识别时的一种适应度评价方式和三个重要算子,通过实验分析,证实此方法效果明显。
1 基于遗传算法(GA)的人脸特征提取
遗传算法是Holland教授[6]于1975年提出的一种模拟生物体进化的抽象算法,具有“生成+检测”的特性。它利用编码空间代替问题参数空间,以适应函数作为评价依据,以编码群体为进化基础,并对群体中的个体进行遗传操作来实现选择和遗传机制,形成循环迭代,由群体中个体的不断进化逐渐接近问题的最优解。遗传算法的整个进化过程操作是随机的,但它所显现的特性并非完全随机,它在搜索过程中它能有效利用历史信息推测下一代,得到期望性能有所提高的寻优点集。
一般的遗传算法包含五大要素[7]:
1)参数编码(二进制编码、序列编码、树编码、自适应编码、大字符集等);
2)初始群体的敲定;
3)适应度函数的设计;
4)遗传操作的设计(遗传算子:选择、交叉、变异);
5)控制参数的设定。
其中遗传算子的作用就是模拟生物系统中“适者生存”,淘汰不能适应的染色体,把更有益的信息遗传到子代。
在生物模拟系统中,DNA由遗传的染色体构成,染色体在遗传算法中表示为比特序列。其中每个染色体用n位来表示。在执行遗传算法的第一步就是对各类中的每个个体进行编码,即编排单个个体的比特序列。在这里,对染色体的编码是通过获取个体的十进制值后转化为二进制编码来实现的,它是由0和1组成的序列。例如,对于已知的单个个体由8位(n=8)来表示时,则它的染色体为:X=x8,x7,x6,x5,x4,x3,x2,x1。
对群体中个体的染色体进行操作的三个算子:选择、交叉、变异。
选择算子,作用就是选择适应值较好的个体以生成交配池。这里采用轮盘赌(roulette whell)的方法来实现,以保证每个父代都有同等的概率Ps被选择。
交叉算子,在GA中模仿了自然界有性繁殖的基因重组过程,目的是将原有的优良基因遗传给子代。交叉操作一般分为三步:
从交配池中随机抽取出一对要交配的个体。
根据位串长度L,对要交配的一对个体进行长度[1,L-1]的位置交叉;
根据设定的交叉概率Pc(0
设在交配池中随机抽取一对个体:S1=a1,a2,a3,...,aL,S2=b1,b2,b3,...,bL,随机抽取交叉位x∈{1,2,...,L-1},此处以L=5,X=3为例对两个个体右侧部分染色体位串进行交换,得到两个新个体S1’=a1,a2,b3,b4,b5,S2’=b1,b2,a3,a4,a5。
变异算子,模拟的是自然界生物体进化中染色体某位基因发生突变的现象。在GA中,通过设定变异概率Pm随机反转某位的二进制字符值来实现。即,产生一个随机数P,若P
GA(后面提及的GA都是限定遗传算法在人脸识别中的应用)工作流程如下:
2 应用示例
设有L类样本,定义:
训练集X={X1,X2,X3,...XL}
第i个类的子集Xi={x1(i),x2(i),...,xNi(i)}
其中x1(i),x2(i)为i类的第1和第2个训练样本个体(图像),Ni为第i类样本的训练样本总数。所有图像训练样本的总数量N=N1+N2+...NL
1)对所有图像转换为列矢量,即,把每个位置的染色体变为向量。每个向量代表一个个体,位数取决于染色体所代表图像的灰度级,即图像像素的编码。假设一个灰度级为256的图像,其染色体应为8位(28=256),如图1,为一个m×n像素的图像。
2)每个类的初始种群从Ni中产生。因为交叉操作需成对进行,所以当Ni为奇数时,需要取一个测试图像进行配对交叉(仅对属于同一类的所有个体设置进行交叉操作,产生的新个体仍属于此类中)。
3)对每个类中的所有个体设置一个适应度函数,这里采用欧氏距离来衡量。设测试用例为q,与xij(第i类中的第j个个体)的适应度函数为:
4)新生成的类中的每个个体Ni都将符合最低适应度函数。
5)迭代递增+1。
6)如果算法执行超过最大迭代数T,或者群体产生的个体已达到最高适应度值,则认为此测试用例属于该类。否则,转到步骤3。
为说明交叉操作,设有某类中一对将要配对的个体a和b,在第4比特位进行切割交叉,将产生两个新个体c和d,如图2:
3 实验分析
实验使用了剑桥ORL库(共有40人,每人10幅,每幅92×112像素的256灰度级图片),实验机器平台为清华同方X46H型号,使用[8]的方法与遗传算法进行比较,先后进行了10次实验,取平均值得到结果如表1和表2:
从实验结果看,两种方法的识别率比较接近。首先,对比所用时间,两种方法在训练和识别同一组人脸时,在L=40,T<10,Pm<0.01,Pc=0.6的情况下,使用PCA方法的总耗时是GA的十倍。其次,对比存储空间,PCA方法在前期的预处理过程中,占用资源要比GA方法大很多。例如一幅92×112的图像,产生的协方差矩阵大小为10304×10304,如果协方差矩阵所表示的基本像素单元为8字节,那么6幅图像需要占用存储量6×10304^2×8b,相当于4.7GB的存储空间,要比普通的电脑全部内存还大;而GA即使在256灰度级图片上进行编码,存储6幅图像所占用空间为:92×112×6×8×2约966Kb,远远小于PCA。
4 总结
利用遗传算法良好的“生成+检测”特性来寻找优化问题的最优解,并在人脸识别中进行一次有效尝试,实验结果表明在不降低识别率的情况下,无论是计算时间还是所占在存储容量GA都要明显少于PCA。但本方法只适合在非固定用户群使用,这里使用单一的PCA降维方式进行实验对比只是为了更明显分析遗传算法的特点,并非反映PCA方法低效,相反,在固定用户群体的情况下,PCA只需进行一次前期训练即可完成以后的快速识别,这是GA所不能及的。相信在其他优化问题求解上,遗传算法会有更好的拓展空间。
参考文献
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