荧光PCR检测

荧光PCR检测（精选10篇）

荧光PCR检测 篇1

小鹅瘟是由鹅细小病毒(GooseParvovirus,GPV)引起的雏鹅急性或急性败血性传染病,主要引起雏鹅和雏番鸭的急性或亚急性、败血性传染病[1]。该病主要侵害4～20日龄的鹅雏,也感染鸭雏,传播速度快,发病率和死亡率较高[2,3,4]。特别是近年来一些地区的流行,给养鹅业造成严重危害,带来重大的经济损失,因此,该病的预防控制,特别是快速而准确的诊断方法的建立受到国内外的广泛关注[5,6,7]。

荧光PCR是近几年来发展很快的一种检测方法,扩增和产物分析的全过程均在单管封闭条件下进行,实现了扩增产物检测和结果自动分析,避免了对扩增产物的后续处理,可以有效地避免实验室交叉污染,同时可在较短的时间内得到检测结果[8]。本研究采用Taqman探针法,以GPV NS基因序列为靶基因,建立了一种特异性的荧光PCR检测方法,用于对GPV的检测。通过重复性、敏感性、特异性试验,证明该方法快速、敏感、准确,从而为GPV感染的早期快速诊断提供了有力的工具。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 GPV病毒

小鹅瘟病毒病料分离株均由本实验室保存。

1.1.2 试剂

pMD18-T Simple Vector、胶回收试剂盒均购自大连宝生物公司;DH5α感受态细胞购自北京全实金有限公司;DNA提取试剂、质粒提取试剂盒、高纯质粒提取试剂盒均购自天根生化科技(北京)有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计

根据GenBank中的小鹅瘟病毒(GPV)的NS区基因序列,用Oligo6.0和Primer5.0软件设计合成一对特异性引物。P1(上游引物):5′-TCTGCTCTCAGAGAGAACG-3′,P2(下游引物):5′-ATTACCCACTCCATCGGC-3′,P3(上游引物):5′-AGTGATTTGGCTGCCCCTTTA-3′,P4(下游引物):5′-TCTTTGCCGCTCTGTTGGA-3′,探针:fam-ATCCTCAAGCATCAACTGTGGCACC,引物送大连宝生物工程公司合成。

1.2.2 病毒增殖和病毒DNA的提取

将两组GPV毒株分别接种5枚9～11日龄SPF鸭胚,每胚尿囊腔接种0.2 ml后,置孵化器内孵化,连续观察7 d,弃去48 h内死亡鸭胚。收集48～168 h死亡鸭胚,取出放置4℃冰箱内冷却收缩血管。用无菌方法抽取鸭胚尿囊液,同时观察胚体病变,尿囊液作无菌检验后冻结保存备用。对照组,鸭胚尿囊腔接种无菌生理盐水0.2 ml/胚。病毒DNA提取按照DNA提取试剂盒使用说明操作。

1.2.3 PCR反应的建立

以小鹅瘟病毒DNA为模板,建立PCR反应。采用P1、P2建立50μl的PCR反应,反应体系为:10×buffer 5μl;dNTP 4μl;P1、P2各1μl;DNA 1μl;Ex Taq0.5μl;ddH2O 37.5μl。反应条件为:95℃5 min,94℃1 min,56℃1 min,72℃2 min,30个循环,72℃10 min。取10μl PCR产物用于1.0%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.2.4 PCR结果与测序分析

PCR扩增后,取10μl PCR产物用于琼脂糖凝胶电泳鉴定,出现一条约为2 590 bp的扩增条带并将阳性目的片段切胶回收与PMD18-T Simple Vector连接,转化DH5а,接种于含有AMP的LB平板,37℃过夜,挑取单菌落接种含AMP的LB培养液,37℃振荡过夜。碱裂解法小量提取质粒,采用质粒PCR的方法来鉴定是否有插入片段。将阳性菌液交由天根生化科技(北京)有限公司进行测序。测序结果在NCBI上进行比对,结果同源性达到100%。1.2.5荧光PCR扩增采用P3、P4及探针建立25μl荧光PCR反应,反应体系为:10×buffer1μl;dNTP 1μl;P3、P4各1μl;DNA 0.5μl;rTaq 0.25μl;探针1μl;ddH2O 18.25μl。反应条件为:95℃3 min,95℃10 s,57℃50 s,72℃15 s,40个循环,72℃10 min。在每一循环退火温度结束时采集荧光信号进行荧光检测。每次试验均做阴、阳性对照。

1.2.6 标准阳性DNA模板的制备

将1.2.4中测序100%正确的质粒作为阳性质粒,转化培养,大提质粒后测定浓度,算出质粒的拷贝数,用阳性质粒DNA作为标准质粒NDA模板制备标准曲线。

1.2.7 动力学曲线的扩增和标准曲线的制备

将计算好拷贝数的标准DNA模板以10倍系列稀释,取9个稀释浓度(1.0×100～1.0×10-8),同一稀释梯度做重复孔对照,进行荧光PCR扩增,该方法能检测到的最低拷贝浓度为10拷贝数/PCR反应。

2 结果与分析

2.1 PCR扩增的电泳结果

PCR扩增产物经琼脂糖凝胶电泳,可见大约2 594 bp的特异性条带(见图1),与预期片大小一致。

2.2 p MD18-T-GPV NS的质粒

PCR鉴定:PCR产物切胶回收,纯化目的片段,并进行基因克隆,将构建的重组质粒pMD18-T-GOV NS做质粒PCR,1%琼脂糖凝胶电泳(见图2),从图2中可见预期大小的目的片段。

2.3 采取Taqman探针法进行荧光PCR同一性和稳定性检测

同一NDA进行8管的重复试验结果CT值相同(见图3)。

2.4 阳性质粒做8个稀释倍数的灵敏度试验及做标准曲线

有8个稀释浓度的标准NDA模板的扩增曲线呈良好的重复性,在稀释的线性浓度范围内,随着模板量的减少,其对应的Ct值相应增大,两者之间线性相关系数达0.998(见图4和图5)。

2.5 特异性分析

利用所建立的荧光PCR检测方法,分别对已知的小鹅瘟病毒(GPV)、鹅副黏病毒(GPMV)、小鹅流行性感冒病毒、鹅副伤寒病原、曲霉菌等进行了检测。结果显示,只有小鹅瘟病毒毒株呈阳性反应,其他病原均呈阴性(见图6)。

注:从左至右模板拷贝数分别为(1.0×100～1.0×10-8)。

注:从左到右扩增曲线分别一次加对应模板拷贝数分别为(1.0×100～1.0×10-8)不同稀释梯度所对应的标准曲线。

3 讨论

荧光PCR是一种新型的核酸技术,既有普通PCR灵敏、快速的特点,又具有准确性高、效率高、污染少等特点,是病毒检测技术发展的一个新方向。Taqman探针法是利用荧光标记探针,可以提高检测的特异性,效率较高[9]。

本试验以GPV NS基因为靶基因序列设计了检测GPV的特异性引物,利用Taqman探针法,建立了用于GPV快速检测的荧光PCR方法。该方法的检测灵敏度达到最低检测达到1.0×10-8。在特异性检测中分别检测了小鹅瘟病毒(GPV)、鹅副粘病毒(GPMV)小鹅流行性感冒、鹅副伤寒、曲霉菌病,结果显示,只有小鹅瘟病毒毒株呈阳性反应,其他毒株均呈阴性,证明本方法具有很高的特异性。所以,利用此方法,可以对小鹅瘟进行快速检测和流行病学的调查,具有重要的临床使用意义。

摘要：依据GenBank小鹅瘟病毒(GPV)的NS基因保守区设计一对特异性引物,利用PCR扩增NS区片段,克隆、测序,采取Taqman探针法,构建小鹅瘟病毒的荧光PCR检测方法。结果表明,该方法检测GPV具有很高的特异性和敏感性,可以用于小鹅瘟病毒的检测。

关键词：小鹅瘟病毒,Taqman探针法,荧光PCR

参考文献

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[8]潘玉民,董玉平,石全瑞,等.小鹅瘟免疫荧光诊断方法的研究[J].中国兽医科技,1990,10:6-10.

[9]韩俊英,曾瑞萍.荧光定定PCR技术及其应用[J].国外医学遗传学分册,2000,23(3):117-120.

荧光PCR检测 篇2

根据GenBank中瘦蛋白(leptin)基因序列设计合成了引物和探针,对荧光定量PCR的方法进行了方法学的评估,建立了TaqmanMGB荧光定量RT-PCR检测方法.结果表明,由pMD-18T瘦蛋白所构建的.标准曲线线性关系良好,建立的瘦蛋白基因荧光定量PCR检测方法灵敏度高、特异性强(可检测出低于10个拷贝/μL的样品),准确可靠.

作 者：张才 牛淑玲 夏成 刘国文 王哲 ZHANG Cai NIU Shu-ling XIA Cheng LIU Guo-wen WANG Zhe  作者单位：张才,牛淑玲,刘国文,王哲,ZHANG Cai,NIU Shu-ling,LIU Guo-wen,WANG Zhe(吉林大学,畜牧兽医学院,吉林,长春,130062)

夏成,XIA Cheng(黑龙江八一农垦大学,动物科技学院,黑龙江,大庆,163319)

荧光PCR检测 篇3

关键词：南美白对虾；肝胰腺；SOD；PO；荧光定量PCR

中图分类号： S945.4+9文献标志码： A文章编号：1002-1302（2015）09-0290-02

南美白对虾属甲壳类动物，其免疫主要为非特异性免疫。包括体液免疫中的一些非特异性的酶或因子来进行的[1-2]。抗氧化酶是无脊椎动物机体非特异性免疫的一个重要方面，其中SOD是一种能够催化超氧化物通过歧化反应转化为O2和H2O2的酶。超氧化物歧化酶（SOD）是抗氧化系统中起关键作用的酶，不仅具有清除体内自由基的作用，而且在机体免疫调节中具有重要的作用[3-4]。酚氧化酶（PO）是一种含铜的氧化还原酶，能够催化单酚羟化成二酚，再把二酚氧化成醌，醌在非酶促条件下形成反应终产物黑色素。其反应链的短暂中间产物拥有很高的生物毒性，能够抑制病原体胞外蛋白酶以及几丁质酶的活性，属于一种酶级联反应系统，在南美白对虾抵抗病原菌侵袭过程中具有重要作用[5-9]。

目前检测南美白对虾免疫活性因子通常是通过采集血清，采用生化反应方法检测免疫相关酶。由于采集过程及检测过程，酶活性极易受外界环境的影响，常导致检测结果波动性很大，检测的可靠性受影响。酶的产生是通过基因的转录、翻译及后加工形成的，其转录水平也可反映机体的免疫状态。虾肝胰腺是其血细胞产生的主要场所，肝胰腺组织免疫因子的转录表达也可作为评价机体免疫能力的指标之一。荧光定量PCR检测技术已经成为国际上检测基因表达通用的方法，能对低丰度mRNA水平进行定量分析[10]。设计特异性强的引物以及合适的反应条件是利用荧光定量PCR检测南美白对虾免疫相关因子的关键。本发明设计的引物及反应条件可同时用于检测南美白对虾肝胰腺SOD和PO的转录相对定量表达检测，为今后准确分析其南美白对虾免疫状态提供新的方法。

1材料与方法

1.1材料

南美白对虾来自浙江省绍兴县某养殖场，SYBGreen反应预混液购自Bio-Rad公司，M-MLV酶、dNTP、RNase抑制剂购自TaKaRa（大连）公司，Trizol购自Invotrigen公司。

1.2肝胰腺总 RNA的提取

取南美白对虾完整肝胰腺组织，加入500 μL Trizol裂解液，用研磨棒研磨，等彻底匀浆后，取50 μL匀浆液加入1 mL Trizol 继续裂解5 min。其余匀浆液置-80 ℃保存备用，或将完整肝胰腺在液氮中速冻后置于于-80 ℃下保存。使用时将组织全部碾磨后，取100 mg加入1 mL Trizol裂解，其余组织粉末置-80 ℃保存备用。

取出的50 μL匀浆液或100 mg组织粉末继续裂解5 min后，12 000 r/min条件下离心2 min，吸取上清至新的离心管。加入200 μL三氯甲烷，涡旋混匀，12 000 r/min条件下离心15 min，吸取上清。加入等体积异丙醇，颠倒混匀数次，静置10 min，12 000 r/min 条件下离心10 min，弃上清。用500 μL DEPC水配制的70%乙醇洗涤沉淀，12 000 r/min 条件下离心 5 min，弃去上清。100 μL DEPC水溶解RNA。 测定RNA浓度和纯度后，-80 ℃保存备用。

1.3引物设计与合成

引物是根据GenBank公布的南美白对虾SOD（登录号：AY486424.1）、PO（登录号：JN393011.1）及β-actin内参基因序列（登录号：JF288784.1），由软件Primer Premier 5.0设计和手工修改后获得（表1），均由苏州金维智生物科技有限公司合成。

1.4cDNA合成

取1 μg 总RNA为模板，加入1 μL 10 mmol/L dNTP、1 μL 50 mmol/L Oligo（dT）15，加DEPC水至总体积6.25 μL，65 ℃变性5 min，冰上骤冷2 min。上述反应液加入2 μL 5× M-MLV buffer、0.25 μL RNA酶抑制剂、0.5 μL MMLV逆转录酶、1 μL 10 mmol/L二硫苏糖醇，使最终反应总体积达 10 μL。42 ℃反应1 h后，65 ℃孵育10 min，cDNA合成完毕。表1荧光定量PCR所用引物

检测基因名称引物序列（5′→3′）扩增长度（bp）SOD SOD-F：CGCCCTTGAACCTCACATCT；SOD-R：ATTGCGCTTACGTCATTGGC135POPO-F：AATGACCGCGTTGAGGAGTT；PO-R：AGTGGGATCTTCAGCTTGCC134β-actin（内参）β-actin-F：CGAGCGAGAAATCGTTCGTG；β-actin-R：GAATGAGGGCTGGAACAGGG187

合成的cDNA加入90 μL无菌双蒸水，用于后续荧光定量PCR扩增。1.5荧光定量的反应体系及条件

取5 μL上述合成的cDNA稀释液作为扩增模板，加入2×Sybgreen反应预混液12.5 μL，分别加入5 μmol/L相应特异性上、下游引物各0.5 μL，加6.5 μL无菌双蒸水，使反应总体系达25 μL，置于荧光定量PCR仪上进行PCR反应。PCR反应条件为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40个循环；60～90 ℃熔解曲线。

2结果与分析

2.1荧光定量PCR扩增效果

从扩增曲线可以看出，SOD、PO及内参基因β-actin的扩增曲线均较好，曲线拐点清楚，基线平，无上扬现象；SOD的CT值为23.85，PO的CT值为28.33，能较好地反映各基因的表达差异（图1）。通过CT值计算该样品中SOD和PO表达量相对于β-actin的表达量分别为0.140 63、0.006 30倍。

2.2荧光定量PCR扩增产物的熔解曲线

从扩增产物的熔解曲线看，SOD、PO及内参基因β-actin均为单峰，且峰值较高（图2），表明各扩增产物的特异性较好，且扩增效率较高。

2.3荧光定量PCR扩增产物的琼脂糖电泳检测

将荧光定量PCR的扩增产物进行琼脂糖电泳检测，结果显示SOD、PO及内参基因β-actin的各扩增产物的条带单一，亮度较好，并能一定程度上看出各基因的表达差异（图3）。进一步证实了其较好的扩增效率和较高的扩增特异性。

3结论与讨论

非特异性免疫因子的测定是评估南美白对虾免疫状态的主要指标，建立可靠的检测方法对于南美白对虾的免疫学研究、抗病育种研究等都具有重要意义。传统的体液免疫指标的测定常采用酶法检测，但易受多种因素干扰，测定值偏差较大。近几年，随着分子生物学迅猛发展，荧光定量PCR方法开始被广泛应用于多种免疫因子定量检测[11-12]。荧光定量PCR检测方法的可靠性与所设计引物的特异性和扩增有效性密切相关。本方法针对SOD和PO等2个重要的非特异免疫指标设计了特异性较好、扩增效率较高的引物，建立了利用荧光定量PCR方法对南美白对虾肝胰腺SOD、PO的检测方法。该方法特异性强，敏感性高，克服了酶法测定易波动的问题，适合南美白对虾免疫活力的评估。

与酶法检测技术比较，本方法所提供的南美白对虾肝胰腺SOD、PO的荧光定量PCR检测方法具有以下优点：（1）所采用的肝胰腺组织较对虾血液采集更容易。（2）所采集的组织直接用Trizol处理或通过速冻方式保存，可有效减少RNA降解；较血清采集过程可能发生的溶血或其他导致酶失活的因素更易于控制，保证结果的可靠性。（3）设计的引物特异性好，扩增效率高，提高了检测的准确性。（4）采用相对定量方式，通过与内参基因表达量的对比，可同时测定多个免疫相关因子。

参考文献：

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荧光PCR检测 篇4

该病的主要临床症状是精神沉郁,食欲废绝;行为上无方向感的游泳,甚至停止游泳;皮肤上出现苍白的块斑和水泡;鳍、鳞片、口腔、腹部出血或充血;患病鱼出现症状后1~2 d内死亡。

该病毒适合培养温度为21℃,只对锦鲤鳍细胞系敏感,产生细胞病变。目前国内有效的监测和诊断方法不多,主要用聚合酶链式反应(PCR)方法。PCR方法和细胞培养技术是OIE推荐的KHV诊断方法。目前,很多流行病的诊断都采用一种新技术——荧光定量PCR方法,该方法以其敏感性、特异性高,污染少,可定量等优点逐渐成为实验室和临床诊断中的主要方法。本研究利用锦鲤疱疹病毒VR52标准株建立荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)方法,利用一对特异性引物和探针建立一种特异的实时定量PCR方法,以期为KHV感染提供快速、特异的诊断方法。

1 材料和方法

1.1 毒株

KHV标准毒株VR52购自ATCC R公司。鲤春病毒血症病毒(SVCV),传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(IHNV)阳性质粒由深圳出入境检验检疫局馈赠。

1.2 试剂和仪器

组织基因组DNA提取试剂盒(DV811A),Taq DNA聚合酶,PCR反应试剂盒,质粒提取试剂盒,PMD-18T Vector,Takara Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0,Takara Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0,DNA分子量Marker,DNAgreen,焦磷酸二乙酯(DEPC)均购自宝生物工程(大连)有限公司,其他试剂均为国产或进口分装。核酸蛋白分析仪Gene.specv为Hitachi Naka Instruments Co.Ltd公司产品。荧光PCR仪ABI7000 Sequence Detection Systems为ABI公司、普通PCR仪PTC-200 Peltien Thermal Cycler为MJ Research公司产品。凝胶成像仪Gel Doc TMXR为BIO-RED公司产品,高速冷冻离心机3K30为德国SIGMA公司。

1.3 FQ-PCR标准品的制备

1.3.1 引物的设计与合成

根据Gen Bank上公布的AB375391 KHV胸苷激酶(TK)基因的保守序列,利用Premier5.0引物设计软件设计两条引物,送上海生工合成。引物序列如下:

上游引物TK1为:5′-GGGTTACCTGTACGAG-3′下游引物TK2为:5′-CACCCAGTAGATTATGC-3′

1.3.2 TK基因的扩增

将KHV标准毒VR52接种KF细胞,待出现细胞病变收获细胞毒。用组织基因组DNA提取试剂盒提取细胞毒的核酸,做为扩增的模板。提取过程按照说明书进行操作。PCR扩增体系如下:25 L的体系,DNA模板3 L,10×Ex Taq buffer 2.5 L,d NTP(2.5 m M)2.5 L,引物TK11 L(10 p M),引物TK21 L(10 p M),Taq酶(5U/L)0.2 L,DEPC处理水补到25 L。反应条件为94℃5 min;95℃1 min,52℃1 min,72℃1 min,40个循环;72℃10 min;4℃保温。扩增片段大小为409 bp,以1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果。

1.3.3 TK基因的克隆与鉴定

利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒将TK基因PCR扩增产物回收(具体操作见试剂盒说明书),将回收的产物与PMD-18T Vector连接16 h。连接体系:PMD-18T Vector 1 L,PCR产物1 L,DEPC处理水3 L,连接液5 L。将连接产物转化到DH5感受态细胞,加入IPTG和X-Gal,涂在Amp+琼脂平板上,次日挑取4个白色单个菌落,分别进行PCR鉴定。将阳性克隆菌落接种到Amp+LB液体培养基中,37℃摇床过夜,利用质粒小量提取试剂盒提取质粒,以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。

1.3.4 质粒标准品浓度的计算

将上述质粒用核酸蛋白分析仪测定260 nm与280 nm波长下的OD值,判断其纯度(OD260nm/OD280nm>1.8者为纯品),然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数:每微升质粒拷贝数=(质量/分子量)×(6.02×1023)=[质粒浓度(ng/L)×1 L]×10-9/[(载体分子量+插入片段分子量)×660]×(6.02×1023个/mol),其中:6.02×1023是阿佛加德罗常数;660是每个碱基的平均分子量;重组质粒的总长度为3101bp。标准品作10倍梯度稀释,–20℃保存备用。

1.4 实时荧光定量PCR检测方法的建立

1.4.1 引物和Taq Man探针的设计与合成

以1.3中PCR扩增的片段为模板,利用Beacon Designer 5.0软件设计了1对特异引物和Taq Man探针,引物和探针均由大连宝生物有限公司合成,探针的5′端用荧光基团FAM标记,3′端用淬灭基团TAMRA标记。引物及其Taq Man探针序列见表1。扩增长度为116bp。

1.4.2 荧光定量PCR反应体系及条件

反应体系:25 L的总体系,DNA模板5 L,10×Ex Taq buffer 2.5 L,d NTP(2.5 m M)2.5 L,上游引物1 L(10 p M),下游引物1 L(10 p M),探针0.8 L(10 p M),Taq酶(5 U/L)1 L,DEPC处理水补到25 L。置荧光定量PCR仪中,反应条件为94℃3 min;94℃15 s,60℃30 s,72℃1 min,5个循环;94℃10 s,60℃40 s,40个循环,收集荧光信号。用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用量。

1.4.3 标准曲线的制备

将KHV标准品质粒做10倍系列稀释,采用优化好的条件进行实时荧光定量PCR。根据质粒拷贝数和对应的Ct值,利用SDS1.2分析软件得到标准曲线。

1.4.4 FQ-PCR特异性试验

用建立的荧光定量PCR反应体系同时检测鲤春病毒血症病毒(SVCV),传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(IHNV)阳性质粒,检测KHV引物和探针的特异性。

1.4.5 FQ-PCR重复性试验

对FQ-PCR模板进行10倍系列稀释,并做2组平行样,检测其重复性。

2 结果

2.1 KHV TK基因特异性片段的扩增

目的片段大小为409 bp,经1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。

2.2 KHV标准阳性质粒的构建与鉴定

将目的片段与PMD-18T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5,经过Amp+的琼脂平板的培养,挑取阳性克隆菌,提取质粒,并测序。经0.8%琼脂糖凝胶电泳,质粒大小为3 101 bp,结果如图2所示。测序结果显示,质粒中含有目的片段。以质粒为模板,进行常规PCR鉴定,扩增出409 bp的目的片段,如图3所示,说明质粒构建成功,取2号管对应的质粒做标准品,用于荧光定量PCR方法的建立。

2.3 重组质粒浓度的测定

提取的质粒经核酸蛋白分析仪测定,其质量浓度为32.85 g/m L,OD260nm/OD280nm比值为1.825,符合纯度要求。根据每个阳性质粒含3101bp,所提质粒DNA溶液浓度可换算为1.6×1010个拷贝/L。

2.4 引物和探针最佳使用浓度的确定

以相同浓度的阳性核酸为模板,选用不同浓度范围的引物和探针,采用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用浓度。在模板量相同的情况下,以循环阈值(Ct值)最小,荧光强度增加值(Rn)最大,若两者不一致,优先以Ct值为准,矩阵法优选后,引物和探针的最佳浓度分别为0.4 p M和0.32 p M。

2.5 FQ-PCR标准曲线的建立和回归方程的确定

对标准阳性质粒10倍系列稀释,以优化的条件进行Taq Man FQ-PCR扩增。利用SDS1.2分析软件,以Ct值为纵坐标,质粒DNA拷贝数的对数为横坐标,获得一条标准曲线,如图4所示。可见,在1.6×10~1.6×105拷贝之间,测得的数值基本在一条直线上,与Ct值有良好的相关性,相关系数R2=0.992,说明各个浓度组相关性非常好,可以对病毒进行可靠的定量检测,此阳性质粒可作为FQ-PCR的标准品。质粒在稀释到10-9仍能检测到荧光信号,对应16个拷贝数,该方法检测的灵敏度为16个病毒拷贝数,灵敏度较高。图中,标准曲线的斜率为-3.09,截距为20.96,可以得出拷贝数N与Ct值之间的线性关系表达式即回归方程:Ct=-3.09Ig N+20.96。待测样品的Ct值可直接从仪器中读取,通过回归方程,可确定样品中核酸的含量。

2.6 FQ-PCR重复性试验

将KHV核酸做梯度稀释,做两组重复样,结果如图5所示,重复样Ct值之间相差0.1左右,重复性较好。

2.7 FQ-PCR特异性实验

分别对IHNV、SVCV、IHNV、KHV阳性质粒,用建立好的KHV FQ-PCR的反应体系,进行扩增。如图6所示,只有KHV有扩增曲线,呈现出良好的特异性。

3 讨论

目前对锦鲤疱疹病毒病的诊断方法主要有Soliman等[3]、Gunimaladevi等[4]报道采用LAMP法能高度灵敏、快速、省力的检测出KHV病毒;乌日琴等[5]、刘荭等[6]也初步建立了快速、灵敏和操作简便的KHV病毒的PCR检测方法。这些方法只能作为定性分析的手段。而本文建立的FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性,而且由于荧光探针的使用,可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果,所以还具有DNA杂交的高特异性、光谱技术的高精确性和实时监测的特点;FQ-PCR克服了常规PCR的许多缺点,如普通PCR需要琼脂糖凝胶电泳来观察结果,费时费力,并且紫外线和溴化乙锭对人体又有害,这些复杂的过程增加了假阳性的机会,FQ-PCR具有扩增与自动分析一体化,缩短了检测时间。本文建立的FQ-PCR检测方法,具有高灵敏性、高特异性、操作时间短,可做为KHV检测首选的方法。

本文FQ-PCR标准品的构建是荧光定量PCR方法建立的基础,本文选用6个稀释度的标准阳性质粒模板,建立的标准曲线,相关系数为0.992,表明拷贝数与Ct值相关性良好,本试验最低可检出16个病毒拷贝,说明灵敏度较高。因此本研究构建的检测KHV的标准品可用于FQ-PCR检测。

由于FQ-PCR可定量检测病毒数量的特点,可做为判断病毒在体内定植规律、复制水平和用药后病毒是否被清除、新药的药效学等方面研究提供有力的参考,有很好的应用前景和研究价值。

参考文献

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[5]乌日琴,刘中勇,黄宝春.PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因[J].检验检疫科学,2005,15(2):6~8.

实时荧光定量PCR技术综述 篇5

实时荧光定量PCR技术综述

实时荧光定量PCR技术是在PCR技术基础上发展起来的.一种高度灵敏的核酸定量技术.与传统PCR相比,实时定量PCR能够更加快速、灵敏,并有效地对核酸进行定量检测.

作 者：邓文星 张映 Deng Wenxing Zhang Ying 作者单位：山西农业大学动物科技学院,太谷,030801刊 名：生物技术通报 PKU英文刊名：BIOTECHNOLOGY BULLETIN年，卷(期)：“”(5)分类号：Q5关键词：实时荧光定量PCR 标准曲线

荧光PCR检测 篇6

目前PCV-2常用的检测方法主要有病毒分离与鉴定、间接免疫荧光试验(IFA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学法(IHC)、原位核酸分子杂交技术等,但在操作程序、检测时间、特异性检测等方面尚不理想,因此生产实践中需要一种快速、特异、敏感的PCV-2检测技术来准确检测圆环病毒病,并为该病的防治提供事实和理论依据。本试验旨在对比新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心实验室建立的常规PCR和荧光定量PCR检测方法的优缺点,为实验室或者临床中PCV-2的准确、快速检测提供帮助。

1 材料与方法

1.1 主要仪器与试剂

荧光定量PCR仪,购自Bio-Rad公司;普通PCR仪,购自Eppendorf公司;琼脂糖,购自Invitrogen公司;PCR试剂盒、DL-2 000 Marker等,购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.2 标准阳性模板

包含PCV-2-ORF2全基因的重组质粒p MD-PCV-2-ORF2,新疆天康畜牧生物技术股份有限公司技术中心实验室构建保存。

1.3 标准阳性模板的制备

培养含p MD-PCV-2-ORF2的工程菌,提取质粒,用核酸蛋白分析仪测定其浓度,并计算标准品的拷贝数。将重组质粒稀释至1.0×1010拷贝数/μL后再倍比稀释成含质粒数量分别为109,108,107,106,105,104,103,102,101,100拷贝数的标准阳性模板,-80℃保存,备用。

1.4 引物设计与合成

1.4.1 荧光定量PCR引物和探针的设计

根据Gen Bank发表的PCV-2-ORF2基因序列中的保守片段设计1对特异引物和Taq-Man探针,由宝生物工程(大连)有限公司合成,探针的5'端用FAM标记,3'端用TAMRA标记,扩增目的片段长度为106 bp。具体序列如下。

引物F(上游):5'-CCCTATGTAAACTACTCCT C-3';引物R(下游):5'-GGAAGTAATCAATAGTG-GAAT C-3'。

探针序列:5'-(FAM)ACCATAACCCAGCCCT-TCTCC(TAMRA)-3'。

1.4.2 普通PCR引物和探针的设计

根据GenBank发表的PCV-2-ORF2基因序列中的保守片段设计1对特异引物,扩增目的片段长度为494 bp,由宝生物工程(大连)有限公司合成。具体序列如下。

引物P1(上游):5'-CACGGATATTGTAGTCCT-GGT-3';引物P2(下游):5'-CGCACCTTCG-GATATACTGTC-3'。

1.5 反应条件

1.5.1 荧光定量PCR反应条件

经过反复试验确定出最佳反应条件:PCR反应体系为25μL,其中Premix Ex Taq 12.5μL,上、下游引物(终浓度为10μmol/L)各0.5μL,探针(终浓度为10μmol/L)0.25μL,模板DNA 2μL,去离子水9.25μL。荧光定量PCR反应条件:95℃预变性30 s,95℃变性5 s,57.4℃退火延伸30 s,40个循环。

1.5.2 普通PCR反应条件

经过反复试验选出最佳反应条件:PCR反应体系为25μL,其中上游引物P1 1μL,下游引物P2 1μL,10×PCR Buffer(Mg Cl2Plus)2.5μL,d NTP Mixture(2.5 mmol/L)4μL,La Taq(2.5 U/μL)0.25μL,模板DNA 5μL,去离子水11.25μL。反应条件:95℃预变性5 min;95℃变性1 min,54℃退火40 s,72℃延伸1 min,30个循环;72℃延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳,置紫外灯下观察。

1.6 临床样品检测

临床送检的158份病料用常规PCR和荧光定量PCR方法进行检测。

2 结果

2.1 重组质粒浓度的测定

提取的p MD-PCV-2-ORF2质粒,经核酸蛋白分析仪测定其质量浓度为449.9 ng/μL,并计算其拷贝数为9.84×1010拷贝数/μL,OD260/OD280值为1.80,符合纯度要求。

2.2 荧光定量PCR标准曲线的建立

根据重组质粒浓度测定结果,选择106,105,104,103,102,101拷贝数/μL 6个梯度浓度的质粒为模板,制作标准曲线(见图1)。标准曲线斜率为-3.354,轴截距为35.337,线性方程为Y=-3.354X+35.337,相关系数r为0.999,表明线性关系很好。

2.3 荧光定量PCR敏感性试验

以10倍系列稀释的p MD-PCV-2-ORF2标准质粒(1.0×106~1.0×101拷贝数/μL)为模板进行扩增,1.0×101拷贝数/μL仍有荧光曲线,表明该方法检测灵敏度为1.0×101拷贝数/μL。荧光曲线见图2。

2.4 普通PCR特异性与敏感性试验

选用101~1010拷贝数/μL 10个梯度浓度的质粒为模板进行扩增,凝胶电泳结果显示:当模板浓度≤1.0×104拷贝数/μL时,无法扩增出特异性目的条带。凝胶电泳检测结果见图3。

2.5 临床样品检测

对临床送检的158份病料用常规PCR法和荧光定量PCR法进行检测,结果见表1。荧光定量PCR法比常规PCR法的检出率高出8.86个百分点,表明荧光定量PCR法更加敏感。

-.PCR阴性对照;M.DL-2 000 Marker;1~10.101~1010拷贝数/μL。

3 讨论

断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)是1997年首次在加拿大的SPF猪群中被发现,随后在世界范围内广泛流行,自2001年起,我国的一些猪场也发现了PMWS[3]。PMWS主要侵害6~12周龄仔猪,引起淋巴系统疾病、渐进性消瘦、呼吸道症状及黄疸,造成病猪免疫机能下降、生产性能降低。现已证明PCV-2是导致PMWS的主要病原,特别是在有猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和伪狂犬病毒(PRV)存在的情况下,该病的阳性率更高[4],是当前严重危害我国养猪业的重要疫病之一。

圆环病毒病的确诊需要进行病毒分离,PCV-2在细胞上不产生细胞病变,且需将PCV-2盲传多代后才能使病毒有效增值,有时连续传代会导致病毒抗原性的改变,因此病毒的分离费力耗时,不适合快速诊断。国内外已有多种诊断试剂盒,如ELISA、IFA等,但其非特异性较高,且价格昂贵。常规PCR方法可以快速、敏感、特异地定性检测PCV-2,具有简单、易操作、设备价格较低、人员素质要求不高的优点,但也存在非特异性扩增造成的假阳性结果需要PCR后处理的缺点。荧光定量PCR可以对样品中的病毒含量进行准确的定量检测,具有结果直观、灵敏度高、特异性强的优点[5],同时也存在设备及试剂价格较高、对人员的素质要求较高、在基层推广性低的缺点。

参考文献

[1]ALLAN G M,mc NEILLY F,KENNEDY S,et al.Isolation of porcine circovirus 2 like viruses frompigs with a wasting disease in the USA and Europe[J].J Vet Diagn Invest,1998,10(1):3-10.

[2]李海超,王娟,黄秀梅,等.猪圆环病毒2型免疫应答机制研究进展[J].动物医学进展,2014,35(2):105-109.

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[4]张治涛,李玉峰,姜平,等.猪圆环病毒2型感染的检测与流行病学调查[J].中国兽医学报,2008,28(3):227-231.

荧光PCR检测 篇7

1 材料与方法

1.1 样本来源

所检测的200份咽拭子样本均采自佳木斯市中心医院门诊部患者, 主要是具有发热症状的呼吸道传染性疾病病例。

1.2 主要试剂

病毒RNA提取试剂盒 (KIT 74104) 及RT-PCR反应体系试剂盒 (KIT 210212) 均为德国QIAGEN公司产品;FQ-PCR试剂盒为北京金豪公司生产, RT-PCR引物购自大连宝生物公司, RNA酶抑制剂 (promega) 由上海生物工程公司提供。

1.3 主要仪器设备

Z233MK-2台式高速小型离心机购自德国Eppdendorf公司, 7300基因扩增仪购自美国ABI公司, Gene Genius凝胶成像分析系统BIO-RAD购自美国伯乐公司, FS-91自动DNA扩增仪购自上海复生生物公司。

1.4 方法

病毒RNA提取、FQ-PCR、RT-PVR、扩增产物电泳分析方法均按试剂盒及仪器操作说明书进行。

2 结果

2.1 2种方法检测的阳性率结果

在200份来自临床的咽拭子检测标本中, 用FQ-PCR检测后甲型流感病毒检测阳性的为96份, Ct值最小为12.95, 最大为24.63, 阳性率为48.0%;用RT-PCR检测后结果甲型流感病毒检测阳性的为69份, 凝胶条带在235bp处出现, 阳性率为34.5%。2种方法检测的阳性率差异具有统计学意义 (P<0.05) 。见表1。

2.2 2种方法全程检测所需时间

FQ-PCR:RNA病毒提取需1 h, 配制反应体系及实时荧光RT-PCR反应需2.0～2.5 h, 整个过程大约共需要3.0～3.5 h。

普通RT-PCR:RNA病毒提取需1 h, 实验设计及PCR反应体系配制约需1 h, RT-PCR反应约需4 h, RT-PCR产物检测约需2 h, 整个过程大约共需要8 h。

3 讨论

FQ-PCR是通过对PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测, 从而实现对起始模板定量及定性的分析。在FQ-PCR反应中, 随着PCR反应的进行, PCR反应产物不断累计, 荧光信号强度也等比例增加[1]。通过对荧光的实时动态检测可对PCR产物进行定性及定量, 它具有灵敏度高、特异性强、所需时间短的优点, 并且实现了PCR检测的密闭操作, 克服了普通RT-PCR易污染以及强致癌物溴化乙啶对操作人员的危害的缺点, FQ-PCR则更体现了其应用的价值[2]。

摘要：目的 比较实时荧光PCR检测 (FQ-PCR) 与RT-PCR在鉴定甲型流感病毒中的优劣, 建立能快速简便、特异地从临床标本中检测并鉴定流感病毒的新方法。方法 对200份临床采集的咽拭子样本进行FQ-PCR与RT-PCR检测, 综合比较2种监测方法之间的差异。结果 FQ-PCR检测200份临床咽拭标本, 96份甲型阳性, 阳性率为48.0%;从RNA提取到检测结果仅需3～3.5 h。RT-PCR检测200份临床咽拭标本, 69份阳性, 阳性率为34.5%;从RNA提取到检测结果约需8 h。结论 FQ-PCR方法快速、特异、灵敏, 在甲型流感病毒检测中具有较大的应用价值。

关键词：实时荧光PCR,RT-PCR,甲型流感病毒

参考文献

[1]程晓雯, 周丽, 赵锦, 等.荧光定量RT-PCR在流感病毒检测上的应用.中华实验和临床病毒学杂志, 2004, 18 (3) :289-290.

荧光PCR检测 篇8

在真菌感染性疾病中,曲霉菌所引起的感染是仅次于念珠菌的重要致病真菌之一。据统计,侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis,IA)在白血病和造血干细胞移植患者中病死率达70%~90%[2],有研究表明肺部感染IA的病死率为40%,泛发性IA的病死率为90%,特别是中枢神经系统的泛发性IA病死率可达100%[3]。其中烟曲霉是引起患者严重深部曲霉感染的最常见病原菌,其次还有黄曲霉、黑曲霉、土曲霉等[5]。由于真菌感染的诊断方法相对落后,真菌感染实验室诊断长期所沿用的血培养和组织活检这一金标准,因其培养时间长、阳性率低导致很多患者得不到正确及时的诊断而丧失了治疗机会[4]。因此,发展新技术对真菌病能够快速准确的诊断,并能有效地对病原真菌进行鉴定具有临床治疗和流行病学研究的双重意义。

分子生物学技术的发展为真菌病的快速诊断及感染菌种的确立提供了可能。目前许多病原真菌的全基因组序列已完成测序。可以根据这些已知序列选择合适的区域设计具有种、属特异性的引物建立PCR方法用于医学真菌的检测。本文基于烟曲霉的Mto1基因序列,建立了特异、快速检测烟曲霉的Real-time PCR方法,并对该方法的敏感性及特异性进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试菌株

供试菌株主要购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)及中国工业微生物菌种保藏中心(CICC)。部分菌株为本实验室从临床送检样品中分离保藏菌株,其中黑曲霉(Aspergillus niger)ATCC16404、ATCC16888购自上海汉尼公司。

1.1.2 试剂

DNA提取试剂盒(AxyPrepTM Multisource Genomic DNA Miniprep Kit,AXYGEN公司),引物及Taqman探针合成于宝生物工程(大连)有限公司。Real-time PCR扩增试剂盒(JumpStartTM Taq Ready MixTM For Quantitative PCR,Sigma公司)

1.1.3 仪器设备

高速冷冻离心机(SIGMA 3K30,德国西格马公司);ABI Prism 7000 Sequence Detection System(美国ABI公司);微量移液器(0.1~1 000 μl BIOHIT芬兰);霉菌培养箱(MJ-180BS-Ⅱ型,上海新苗医疗器械制造有限公司);核酸蛋白分析仪(Gene SpecV, Hitachi NaKa instruments Co.Ltd.日本日立公司)。

1.1.4 培养基

马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:购于北京路桥技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

所有试验菌株均在PDA培养基上28℃培养72h,用于DNA提取。在无菌条件下用接种环刮取少量菌丝体于预先加入提取液的1.5ml离心管中,用试剂盒附带的研磨杵将菌丝体捣散,然后按试剂盒说明进行DNA提取。

1.2.2 引物及Taqman探针

应用Primer express 2.0软件根据烟曲霉Mto1基因特异位点设计实时荧光PCR特异引物及探针。上游引物序列:Mto1-F:ttt ctc cac cca gga acg tt,下游引物序列:Mto1-R:cga atc cgg aga ggt gat acc,Taqman探针序列:FAM-cag ttg tga tga cga cac gcc cag t-TAMRA,配制成100μmol/L储藏液备用。

1.2.3 实时荧光 PCR反应体系

实时荧光PCR反应体系:2×JumpStart Taq Ready Mix(20mmol/L Tris-HCl,pH 8.3, 100mmol/L KCl, 3mmol/L MgCl2, 0.002% gelatin, 0.4mmol/L of each dNTP, stabilizers, 0.06 unit/μl Taq DNA Polymerase, JumpStart Taq antibody)10μl,引物Mto1-F (10μmol/L)1μl,引物Mto1-R(10μmol/L)1μl,探针(10μmol/L)1μl, 模板DNA 2μl,ddH2O补足体积到20μl。实时荧光PCR采用二步法,反应条件:94℃ 2min;95 ℃ 10s,60℃ 1min,40个循环。在ABI Prism 7000 Seqence Detection System仪器上进行扩增反应。反应结束后,仪器自动给出荧光信号增长曲线,可以根据荧光信号是否成指数增长及其Ct值来判断扩增结果。

1.2.4 实时荧光PCR的敏感性分析

为了确定Real-time PCR检测烟曲霉的敏感性,对烟曲霉基因组DNA进行一系列10倍比稀释,分别做模板DNA进行扩增,判断其检测Mto1基因的敏感性。

1.2.5 实时荧光PCR的特异性分析

为了验证引物及探针的特异性,选择了26株曲霉属及6株致病性真菌的DNA作模板(见表1),进行特异性验证。

注:表中+表示阳性结果,-表示阴性结果。

2 结果与分析

2.1 引物及Taqman探针的设计

以烟曲霉Af293的线粒体翻译优化蛋白基因(mitochondrial translation optimization protein,Mto1)为参考基本序列(GenBank accession No.XM-742541)通过与其他主要病原曲霉黑曲霉(Aspergillus.niger)、杂色曲霉(Aspergillus.versicolor)、构巢曲霉(Aspergillus.nidulans)、土曲霉(Aspergillus.terrus)及黄曲霉(Aspergillus. flavus)Mto1基因序列应用lasergene7.1软件对其进行比对分析,选择特异位点来进行引物及Taqman探针。序列比对结果如图1所示。

从图1可见,烟曲霉与黑曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、土曲霉及黄曲霉在Mto1基因这部分序列差异较大,适合设计特异引物及探针,我们据此设计了针对烟曲霉的特异引物及探针。

2.2 实时荧光PCR的敏感性分析

通过对烟曲霉标准菌株提取出的基因组DNA用核酸蛋白分析仪测量DNA含量后(含量107.40μg/ml),进行10倍比稀释后进行Real-time PCR扩增,分析结果显示,最低1.08×10-6μg/ml DNA能够被扩增,如图2中扩增曲线4所示,而其他更低的稀释度没有信号增长(图中未显示)。

2.3 实时荧光PCR的特异性分析

实验对曲霉属及其他一些属的菌株做了特异性验证,结果如表1所示,可见该引物和探针只对烟曲霉产生扩增,而其他致病性曲霉如黑曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉、土曲霉及黄曲霉等均未有扩增,白色念珠菌、近平滑念珠菌、克柔念珠菌、茄病镰刀菌、裴氏着色菌及甄氏外瓶霉等病原真菌也见交叉反应。此外,本实验还对毛霉属、假丝酵母属、青霉属的一些真菌也做了特异性验证实验,均未发现交叉反应(数据未列出)。

3 讨论

由于曲霉感染发病隐匿,早期诊断十分困难,传统的真菌培养和组织病理方法因培养所需时间长、阳性率低及活检有创性,已不能满足临床早期诊断的要求。因此能够在发病早期、快速和特异地对病原曲霉进行检测显得十分必要,目前新发展的方法主要基于血清学方法和分子生物学方法。目前研究较多的曲霉血清抗原检测是检测曲霉的半乳甘露聚糖(GM)和(1→3)-β-葡聚糖(BG)。GM和BG均为是曲霉菌细胞壁的成分,可以采用ELISA方法检测GM抗原及BG抗原[6,7],由于抗原血症是短暂的,抗原的浓度受机体清除和抗真菌治疗的影响较大,此外假阳性也是GM检测的主要障碍之一。

PCR技术因具有高特异性,强敏感性及快速、便捷的特点,是目前最常用的分子生物学手段检测病原菌。目前已有应用PCR技术检测曲霉菌的报道[8,9],应用实时PCR技术用于临床病原真菌的诊断研究[10,11]。

以上应用分子生物学方法用于真菌的鉴定主要通过对18S、28S rDNA、ITS区、细胞色素b等目的序列进行分析,人们分别设计出白念珠菌、烟曲霉、孢子丝菌、皮炎外瓶霉、茄病镰刀菌的ITS区种特异性引物用于诊断。我们选择Mto1基因作为靶序列,通过序列分析表明该序列在不同病原曲霉的种间具有较大的变异性,以此设计的特异引物及探针建立了实时荧光PCR,采用两步法(退火与延伸在同一温度下进行)进行扩增,大大缩短了检验时间,特异性实验也证明了该方法能够区分烟曲霉与其他常见的病原曲霉如黄曲霉、黑曲霉、土曲霉、杂色曲霉等,此外该引物探针还能区别念珠菌属、镰刀菌属、假丝酵母属、着色真菌属、外瓶霉属、毛霉属及青霉属的病原真菌。我们建立的real-time PCR可以检测到1.08×10-6μg/ml的烟曲霉DNA,非常适合于烟曲霉感染的早期诊断,从而为真菌感染的早发现早治疗提供了有效手段。应用实时荧光PCR可以定量检测病原菌数量,即能够监测患者真菌负荷量(fungal load)的变化,及时检查治疗效果, 是否具有抗药性以利于临床用药指导。为临床早期诊断治疗侵袭性曲霉感染建立一种有效方法。

摘要：目的:根据烟曲霉Mto1基因特异位点设计并合成探针及引物,建立应用实时荧光PCR检测烟曲霉的方法。方法:通过对多种病原曲霉Mto1基因序列的比对分析,在烟曲霉特异位点设计引物及探针,并对其进行特异性及敏感性进行验证。结果:通过对曲霉属26株不同曲霉菌及其他属的6株不同病原真菌的特异性验证未发现有交叉反应,敏感性实验显示应用该方法可检出1.08×10-6μg/ml的模板DNA。结论:实验建立了应用实时荧光PCR技术检测烟曲霉的方法,该方法具有特异、灵敏、快速等特点并能有效避免普通PCR中的样品间交叉污染问题。

关键词：烟曲霉,实时荧光PCR,检测

参考文献

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荧光PCR检测 篇9

关键词：乙型肝炎病毒DNA,荧光定量PCR,试剂

乙型肝炎仍然是严重威胁我国公众健康的公共卫生疾病。采用荧光定量PCR(FQ-PCR)方法定量检测HBV-DNA对慢性乙型肝炎的诊断、治疗和预后判断具有重要意义[1,2]。目前已有多家国内公司生产HBV DNA定量试剂盒,其中临床应用最广的是深圳匹基生物技术公司、上海科华生物技术公司和广州达安公司生产的试剂。由于扩增目的片段的不同及其技术平台不同,不同试剂的敏感性、特异性、准确率等存在一定差异[3]。本文选用3种最常用的HBV DNA荧光定量PCR试剂盒,对我院随机抽取的一批待测患者血清进行HBV DNA定量检测,以横向比较3种试剂检测结果之间是否存在差异。

1 材料与方法

1.1 研究对象

随机抽取门诊及病房采集的血标本共70例。抽取清晨空腹静脉血3~5 m L于无菌真空管中,离心10 min后分离血清,将血清转入1.5 m L无菌离心管中备用。

1.2 仪器与试剂

本试验所用HBV DNA荧光定量PCR试剂分别购自国内3家公司的试剂A、B、C,批号分别为2009007、20090601和20090401,检测下限分别为1×103拷贝/m L、5.0×102拷贝/m L和5.0×102拷贝/m L。PCR采用美国Applied Biosystem公司生产的ABI 7300基因扩增仪。

1.3 方法

HBV-DNA定量检测:同一份标本采用3种试剂进行平行检测,具体操作和结果判定参照试剂盒说明书进行(3种试剂检测结果不相符者,用原方法重复检测1次,并参考患者乙肝3对定量结果)。

1.4 统计学分析

所有数据用SPSS 13.0统计软件进行分析,采用方差分析。数据采用均数±标准数表示。P<0.05为差异有显著性。

2 结果

2.1 整体扩增效率分析

79例样本经3种试剂扩增后,3种扩增曲线均基线平坦,拐点明显,平台期峰值较一致,曲线间平行度良好,标准曲线r值均大于0.99,符合试剂说明书结果判定要求,结果见图1~3。

2.2 3种试剂HBV DNA定量结果比较

采用3种试剂对79例标本进行检测,检测结果(log10 copies/m L)分别是A(7.34±1.64)、B(7.27±1.67)、C(6.09±1.48)。采用方差分析对3者检测结果进行总体比较,结果F=4.106,P<0.05;组间比较试剂A与C、试剂B与C相比,P<0.05;试剂A与B相比,P>0.05。在102~103之间试剂A无法检测(低于检测下限),而试剂B、C分别能检出4例和2例样本有乙肝病毒复制;在103~108之间试剂A与B检测结果无显著差别,见表1。

注:试剂A、B与试剂C相比,有显著性差异(P<0.05);试剂A与B相比,差异无统计学意义(P>0.05)

2.3 3种试剂阳性率、灵敏度、特异性、符合率结果

试剂A阳性率41.77%(33/79);试剂B阳性率45.57%(36/79);试剂C阳性率41.77%(33/79)。3种试剂结果一致者66例,总符合率83.54%;不相符者13例,其中试剂A阴性者8例,阳性者5例;试剂B阴性者3例,阳性者10例;试剂C阴性者8例,阳性者5例。13例标本乙肝3对定量结果HBs Ag结果均为阳性。试剂A、C的灵敏度均为77.78%,低于试剂B;而特异性高于试剂B,见表2。

3 讨论

乙型肝炎作为我国最为常见的感染性疾病之一,抗病毒治疗是其常用的治疗方法。HBV-DNA定量检测现已广泛应用于临床,可直接反映HBV复制状况,对临床判断患者的传染性及指导用药具有重要参考价值[4]。

实时定量PCR是一种准确度高、重复性好、灵敏度高而且快速检测临床标本HBV-DNA的方法,在所有商业化检测方法中检测范围最宽[5,6,7,8,9,10]。国际上以COBAS Amplicor系统作为检测HBV-DNA的金标准,但试剂昂贵,难以在我国推广使用。目前国内生产的HBV-DNA定量PCR试剂有很多种,但这些试剂在检测灵敏度、检测范围和低拷贝样本的检测精密度等方面参差不齐,且检测方法的敏感度和特异性将决定检测病毒反弹的时间和准确性[5]。为保证检验结果准确可靠,选择一种灵敏度高,检测范围宽、精密度高以及费用低廉的试剂至关重要。

本研究结果显示,试剂A、B、C检测阳性率分别为41.77%(33例)、45.57%(36例)和41.77%(33例)。3种试剂检测结果共有13例样本不符,其原因可能为:(1)厂家引物保守序列设计不同或者是试剂引物设计序列与HBV某些基因型不相匹配所致。(2)乙型肝炎病毒发生变异与某一试剂所设计的引物不匹配。(3)由于试剂质量或操作误差引起。

结果显示,试剂A、B对79例样本的检测结果比较没有显著性差异,但分别与试剂C相比均有显著性差异,表明试剂A、B总体性能优于试剂C。试剂A的灵敏度、特异性及符合率分别为77.78%、88.37%、83.54%,在本院已应用于临床HBV-DNA定量检测数年,临床反映良好,在卫生部临检中心室间质评及宁夏临检中心室间质评活动中均取得满意成绩,且出厂前经国际标准品校正,是一种复合临床要求、适用于临床应用的试剂。试剂B、C在102~103之间分别能检出4例和2例样本有乙肝病毒复制,而试剂A无法检测(低于检测下限),表明在低拷贝样本中存在一定的漏检率,即存在假阴性现象。PCR的假阴性问题涉及了与PCR实验的几乎所有人员和技术环节,十分复杂,但本研究用3种试剂进行复核可大大降低HBV-DNA的假阴性。

综上所述,试剂A、B具有较好的灵敏度和稳定性、较低廉的价格和简便的操作,总体性能优于试剂C,适于临床使用,试剂C有待校准或改进。对低拷贝标本应结合血清标志物检测和其他检查结果以及临床症状综合判断以排除假阴性的可能。由于试剂盒的质量是影响临床PCR测定的决定性因素之一,因此,为保证检验质量,临床基因扩增实验室必须选择质量好且符合自己实验室要求、与本实验室仪器相匹配的试剂盒应用于临床检测。

参考文献

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荧光PCR检测 篇10

关键词：实时荧光定量PCR,乙肝DNA,影响因素

乙肝病毒是最为常见的感染性疾病病毒, 是肝硬化、慢性肝炎和原发性肝细胞癌等疾病的主要病毒, 其中乙型病毒性肝炎是一种以肝脏炎性病变为主的多器官损伤综合疾病, 是当前我国传播范围最广, 危害最大的一种传染病[1]。当前, 实时荧光定量PCR检测技术是进行乙肝DNA检测最为有效的方法之一, 应用逐渐加强。本文选取笔者所在医院收治的300例乙肝病毒感染患者进行研究, 对实时荧光定量PCR检测的效果和影响因素进行了分析, 现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2010年1月-2012年1月笔者所在医院收治的300例乙型肝炎病毒感染患者, 其中男157例, 女143例, 年龄10~65岁, 平均32.5岁。

1.2 检测方法

对本组300例患者进行血标本制作, 在空腹时抽取静脉血, 注入干燥消毒的试管内, 且试管内含有EDTA-K2抗凝管;使用离心机离心5 min;使用实时荧光定量PCR进行乙肝DNA的检测;首先在94℃下进行2 min的预变性, 随后进行40个55℃~95℃循环, 模板DNA经加热至95℃左右一定时间后, 使模板DNA双链DNA解离成为单链后, 温度降至55℃左右, 引物与模板DNA单链配对结合;反应结束后, 制作标本曲线, 计算标本中的DNA模板量;依据试剂盒内的阳性质控标准进行标本的定量阳性质控;进行核酸扩增。本组研究中所采用的药剂和器械均统一, 试剂盒为厦门安普利生物工程有限公司生产, 仪器为9800型PCR扩增仪。以综合临床诊断结果为标准, 对实时荧光定量PCR对乙肝DNA的检测结果准确率进行对比, 并对导致两者差异的因素进行分析总结。

1.3 统计学方法

所得数据采用SPSS 13.0统计学软件进行处理, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验, 计数资料采用x2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本组300例乙肝病毒感染患者, 采用实时荧光定量PCR进行乙肝DNA检测, 与临床综合诊断结果进行对比, 确诊276例 (92.0%) , 漏诊误诊24例 (8.0%) , 实时荧光定量PCR检测与临床诊断比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。对影响检测结果的因素进行分析, 主要包括实验室条件、血标本操作和核酸提取操作等影响因素, 详见表1。

3 讨论

3.1 实验室条件影响因素

PCR技术操作对实验室的条件要求较高, 轻微的污染都会导致其产生假阳性的检测结果。实验室硬件要求为:试剂储藏的准备区、标本制备区、扩增反应混合物配置区和扩增分析区;软件要求为:人员专业培训、技术验收和规范化管理等[2,3,4,5]。本组研究中, 有3例漏诊误诊病例是由于实验室条件因素影响所致, 占12.5%, 需要进一步加强实验室硬件建设和软件管理。

3.2 标本因素影响

标本因素影响, 包括标本抗凝血因素、存储因素、溶血和血脂因素等[6,7]。标本抗凝血因素:使用肝素抗凝素时, 会导致标本血液的裂解失效, 使得实时荧光定量PCR不能分别对血浆和血清进行有效检测;标本存储因素:静止时间过长, 超过3 h, 或存储温度高于25℃等, 均会导致标本变性, 对检测结果产生影响;溶血及血脂因素:溶血和血脂会导致标本内血红蛋白变形, 部分酶失去活性从而导致荧光信息强度变化, 对检测结果产生影响[8,9,10]。

3.3 核酸提取方法因素

不同的核酸提取方法会对实时荧光定量PCR检测的结果产生不同的影响, 其中磁珠核酸提取法的准确度较高, 煮沸裂解核酸提取法的准确度较低, 本次试验全部采用磁珠提取法, 但操作差异导致检验结果异常[11,12]。