PCR法检测

PCR法检测（共10篇）

PCR法检测 篇1

人乳头瘤病毒, 简称HPV, 是一组病毒的总称。目前, HPV感染的主要途径是性接触, 根据感染的部位可以分为皮肤型HPV和生殖道上皮HPV, 感染的早期患者的局部皮肤、黏膜通常都会形成疣状增生, 像生殖器部位的尖锐湿疣, 甚至可能引起宫颈癌的发生。从高危型HPV的持续感染到一般的宫颈癌前病变最终发展为宫颈癌大约需要5~10年[1]。在早期通过检测手段发现亚临床及潜伏性HPV感染。本次采用PCR-反向点杂交法对我院就诊HPV感染患者进行HPV分型检测, 现总结报道如下。

1 资料与方法

1.1 标本来源:回顾性分析建阳区我院检测的1624例HPV感染患者的临床资料, 男5例, 女1619例, 年龄18~56岁, 平均年龄 (36.2±4.23) 岁, 病程为0.5~9个月, 平均病程 (3.1±0.67) 个月, 所有患者均有性生活史, 均有不同程度的瘙痒, 其中男性常见于冠状沟、包皮内板、龟头、系带及肛门周围, 女性常见于大小阴唇、阴道口、阴道内及会阴处。

1 . 2 仪器与试剂: 高速离心机 ( Thermo - 2 ) , 基因扩增仪 (Hema9600) , 恒温杂交仪 (YN-H16) , 各种小型器材, 人乳头瘤病毒基因分型 (23型) 检测试剂盒, 包括高危型和低危型, 购自亚能生物技术有限公司。

1.3 HPV DNA提取与检测

1.3.1 标本采集:本次实验的标本为采集患者泌尿道分泌物, 外阴赘生物、溃疡处分泌物和组织液等。男性患者用咽拭子采集尿道分泌物, 女性患者以专用宫颈脱落细胞采集器 (宫颈刷) 进行采集, 将宫颈刷置于宫颈口, 单方向旋转4~5周以获得足量的上皮细胞样本, 然后将宫颈刷头部放入提取缓冲液管中, 沿刷柄折痕处将宫颈刷柄折断, 旋紧管盖, 并保持提取缓冲液管直立送检。

1.3.2 实验过程:将送检的标本充分洗脱后取1 m L液体转移到离心管中于13000 r/min离心10 min后弃去上清液, 加入裂解液悬浮沉淀, 沸水浴加热再离心, 上清液作提取样本DNA。再进行PCR扩增、杂交、洗膜、显色, 并观察结果。每次实验设置一个阴性质控和一个阳性质控, 作为质量控制[2]。

1.3.3 结果判读:根据膜条上蓝色斑点显现的位置, 读取相应位。仅一个基因型位点出现蓝色班点, 则为相应基因型单一感染;多个基因型位点出现蓝色斑点, 则为相应基因型的混合感染;检测位点无显色信号, 则为阴性或低于检测限[3]。

2 结果

本次检测HPV阳性患者504例 (31.0%) 。各型均有检测出感染, 单型感染患者346例 (68.7%) ;混合型感染158例 (31.3%) ;其中高危型381例, 占75.6%, 高危型感染以16、52、53、58型感染较多;低危型123例, 占24.4%, 低危型感染以42、43、81型感染较多。

病理诊断显示, 12例阴道内损害, 呈乳头状, 5例小阴唇损害, 呈丝状。年龄段情况比较, 感染高峰人群为30~39岁, 其次20~29岁, 达到40岁以后感染率骤然减少, 见表1。

3 讨论

随着社会经济的不断发展, 性传播类的疾病发病率越来越高, 通过生殖道传播、感染的HPV的概率也不断增多, 目前, 流行病学和分子生物学的研究结果说明, 人乳头状瘤病毒和宫颈癌、癌前病变都存有密切的联系[4]。人乳头状瘤病毒也是引发宫颈癌的主要病毒, 虽然感染HPV的患者在临床上没有明显的症状, 或处于一种亚临床感染, 但是会导致严重的后果发生, 病死率较高, 严重影响了患者的生活质量。PCR-反向点杂交法通过PCR体外的扩增及DNA反向点杂交技术相结合, 分子杂交的特异性较高, 属于HPV检测的新方法, 提高了检测的敏感性[5]。

本院采用PCR-反向点杂交法可对患者分泌物进行基因分型, 了解各型感染情况, 总检出率达31.0%。本研究表明HPV感染高峰人群为30~39岁, 这可能与此阶段年龄妇女性生活频繁、忽略性行为卫生及个人卫生习惯、生活工作压力大等原因有关, 而达到40岁以后感染率又骤然减少。在所有检测HPV型别中, 以高危型HPV感染为主。已有研究表明, 高危型HPV感染且年轻化是影响宫颈癌发生的发生的重要因素[6]。

PCR-反向点杂交法检测HPV结合临床表现及病理细胞学检查, 诊断率高, 特异性强, 对HPV感染病变的早期发现, 判断预后及治疗有重要价值, 对降低宫颈癌的发病率有重要的指导意义。

摘要：目的 探讨闽北建阳区PCR-反向点杂交法在检查患者HPV感染病变中的临床意义及分析。方法 回顾性分析我院检测的1624例HPV感染患者的临床资料, 采用PCR-反向点杂交法对病变标本进行HPV分型检测。结果 共进行1624次HPV分型检测, 检出感染患者504例, 检出率为31.0%, 感染较多的是16、52、58、81型, 并以高危型感染为主。单种分型感染共346例, 两种及以上感染158例。结论 PCR-反向点杂交法在HPV感染的诊断率较高, 特异性较强, 对闽北地区HPV感染病变的早期发现, 判断预后及指导治疗有重要价值。

关键词：反向点杂交法,人乳头瘤病毒 (HPV) ,临床价值

参考文献

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PCR法检测 篇2

关键词：PCR 原理与技术 食品检验 应用

中图分类号：TS207 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）02-0038-01

1 引言

上世纪80年代中期，分子生物学领域诞生了一项新技术，称作DNA体外扩增法，简称为PCR技术。其基本原理是在生物体的体外，对指定DNA双链片断进行扩增。第一步：挑选出指定DNA双链片断，人工合成指定DNA双链片断端头邻近序列互补的寡核苷酸片断，将该互补片段称作引物（Primer），引物也是双链结构，分作左端引物和右端引物。第二步：加热指定DNA双链片断，使之发生变性，分裂成单链，把左右引物与之分别配对进行互补结合。第三步：在DNA聚合酶和4种dNTPs底物的共同作用下，引物沿模板DNA链按5/→3/方向延伸，合成DNA双链，这个步骤被称为DNA多聚酶链反应。第四步：以新合成的DNA双链作为扩增模板，重复DNA多聚酶链反应步骤。历经25～35次循环，可将DNA序列扩增到近百万倍。该技术具有特异性强、灵敏度高、扩增快速准确等优点，自诞生之日起，其实用性在医学、农学、环境科学、食品检验等领域得到了很好的印证。

2 PCR技术在食品检测方面的应用

2.1 PCR技术的检测原理

PCR技术最根本的鉴定依据是生物的DNA结构具有唯一性。在食品检测中，起到鉴定标准模板作用的是引物，从理论上说，①如果引物来自DNA保守区，则在扩增之后，所有被检测对象都含有DNA保守区的片段；②如果引物来自DNA特异区，则在扩增之后，所有被检测对象都含有DNA特异区的片段。以上两种理论依据就是PCR技术的检测原理。

在实际应用中，人工有选择地截取DNA片段，使用DNA多聚酶链反应，可以在2～3小时之内达到常规检测需要数天才能达到的培养效果，另外还省去了繁琐的种属鉴定等工作，简化了检测流程。

2.2 PCR技术的操作程序

（1）待检样品的浓集（增菌）。食品中待检的微生物群落浓度一般都是比较低的，达不到检测要求。这就需要进行待检微生物的浓集。

（2）核酸的提取。为了实现PCR扩增，必须提取待检样品的核酸。常用的处理方法包括：加热、反复冻融、化学裂解。

（3）PCR扩增。在扩增过程中，最关键的莫过于引物，它直接关系到PCR检测的成败。扩增需要20—40个反应循环，每个循环都由高温变性、低温退火、适温延伸组成。高温时，氢键打开，双链变为单链，生成扩增模板；低温时，左引物和右引物分别与模板DNA的2条单链做互补结合，完成配对；适温时，在聚合酶作用下，4种三磷酸脱氧核苷（A、T、G、C）按碱基互补配对原则不断进行配对添加，按5/→3/方向自动合成新的DNA双链片段。

变性温度一般需保持在94℃左右，如果待扩增区域DNA的G+C含量太高，则可考虑适当提高变性温度。

退火温度与引物的G+C含量有关，根据公式：Ta=4×（G+C）+2×（A+T）-5。

延伸温度一般需保持在72℃左右，此时DNA聚合酶的聚合速度约1000（碱基）/min。

（4）扩增产物的检测。常用的检测方法为琼脂糖凝胶电泳法，琼脂糖质量分数在0.8%～2%之间。待分离DNA片断的分子量越小，所需琼脂糖质量分数则越大，反之亦然。

3 PCR技术用于食品检测的优缺点

3.1 PCR技术的优点

传统检测方法多采用平板培养法，通过菌落计数来判断菌体浓度。传统方法的优点是操作简单，其最大的缺点是消耗的时间太长，检测周期一般在3——10天。

PCR技术的最大优点就是检测速度快，使用特异区扩增检测，只要在几个小时内成功扩增，即可检验并判断出待检测样品的种类，非常迅捷、灵敏。

3.2 PCR技术的缺点

任何事物都不是完美的，PCR技术一样存在缺点，正是这些缺点的存在，导致其不能完全取代传统检测法。其主要缺点包括：（1）假阳性问题。核酸受到污染而造成假阳性的问题，是PCR技术的最大缺点。这个缺点来自扩增本身，在扩增的过程中，即使只有一个污染源，结果也会出现成十万成百万倍的污染现象，造成检测结果出现阳性，称之为假阳性。

防止假阳性问题，目前只有做好隔离这一种办法。（2）假阴性问题。假阳性问题来自PCR技术本身，假阴性问题则来自待测样品。食品成分复杂，其中多种成分发生了复杂的化学反应，不能排除模板液中带有某种或某些抑制PCR反应的成分。防止假阴性问题的办法是设置阳性对照环节。（3）定量检测困难。由于影响PCR产率的原因比较多，在定量检测方面不能提供较为精准的数据，导致PCR技术无法胜任定量检测。直至目前，尚没有实质性的突破与进展，限制了PCR技术在检测方面的应用范围。

4 结论

PCR检测有一定的局限性，但是，其高灵敏度的检测反应、明显的特异性辨别、快速简便的检测流程，是其它检测方法所不能替代的。相信随着生物技术的快速进步，PCR检测技术的应用范围會越来越广泛。

参考文献

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[2]张泽民，李曼.PGR技术在转基因食品检测中的应用与发展趋势[J].农牧产品工程，2011（7）.

PCR法检测 篇3

据联合国粮食和农业组织FAO (1995) 报告报道, 含谷蛋白的谷物、树坚果、鱼、大豆、甲壳类、鸡蛋、花生和牛奶会经常引起过敏反应, 占所有食物过敏原的90%以上[2]。含谷蛋白的谷物具体是指小麦、大麦、黑麦和燕麦。经研究证实, 小麦醇溶谷蛋白、黑麦碱、大麦醇溶谷蛋白和燕麦蛋白是致敏蛋白[3]。敏感个体会对这些蛋白产生不适当免疫反应而患乳糜泻, 一种小肠慢性炎症性疾病。目前, 乳糜泻没有有效的治疗方法, 患者只能通过终身无谷蛋白食疗[4], 若持续摄入含谷蛋白的食物, 则可能导致严重并发症如男女不孕, 肝功能异常和恶性肿瘤等[5]。总之, 乳麋泻是一种具有高患病率和死亡率且易被误诊和漏诊的疾病。

为了尽量避免因消费者误食而导致的过敏事件的发生, 急需建立可靠和灵敏的致敏原检测方法, 为食品标签标注的准确性提供坚实后盾。

目前已有的谷物致敏原测定方法是ELISA, 但此法有不如人意之处。ELISA的检测对象是蛋白质, 蛋白质的三维结构在热加工过程中会发生巨大变化, 这就可能改变醇溶谷蛋白的抗原决定簇, 使其再也无法识别抗体的活性结合位点, 继而降低特异性和产生不确定性。另一个原因是抗体对不同品种谷物 (小麦、大麦、黑麦和燕麦) 的醇溶谷蛋白的亲和力会有较大差异, 因此就可能因标准品的不同, 而出现不同厂家的ELISA试剂盒的测定结果有所不同的情况[6]。因此仍需建立一种快速和灵敏的方法来检测市场上的各种产品。

鉴于上述原因, 可采用PCR来检测食品中的谷物致敏原。PCR的试验对象DNA比蛋白质稳定, 热变性条件下仍可被有效提取, 而且受地理条件和季节变化的影响较小。因此可作为对已建立的酶联免疫吸附法的一种补充。

1 试验材料与方法

1.1 材料与仪器

材料:大麦、黑麦、小麦、燕麦、荞麦、薏仁米、小黄米、大米、玉米、黄豆、红豆和高粱米, 均购自当地超市。

仪器:SW22振荡水浴槽, 北京优莱博技术有限公司;Centrifuge 5415R离心机、AG22331 Hamburg核酸蛋白分析仪, 德国Eppendorf公司;Eastwin Vortex-2Genie震荡混匀器, 美国Scientific Industries公司;580 BR PCR扩增仪, 美国ABI公司;Power Pac Basic电泳仪、Universal HoodⅡ凝胶电泳成像仪:美国BIO-RAD公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DNA的提取

采用改良CTAB裂解液 (Tris-HCl p H值8.0, 100mmol;EDTA p H值8.0, 20mmol;Na Cl 1.4mol;2%CTAB (w/v) ;5%PVP40 (w/v) ) 提取大麦、黑麦、小麦、燕麦、荞麦、薏仁米、小黄米、大米、玉米、黄豆、红豆、高粱米以及桂格燕麦粥、西麦麦片 (含30%燕麦) 、燕麦年轮蛋糕、谷粒酸奶 (含大麦、燕麦仁) 、混合谷物薄饼 (含大麦面粉、全燕麦面粉) 5种实样的DNA。

将样品放入灭菌的研钵中适量研磨, 取100mg加入2m L离心管中, 加入500μL改良CTAB裂解液和10μL蛋白酶K (20mg/m L) 于65℃裂解一整夜, 然后加入600μL酚-氯仿-异戊醇 (体积比为25∶24∶1) 混匀, 13 200r/min离心10min, 取上清液加入等体积氯仿-异戊醇 (24∶1) 混匀, 13 200r/min离心10min, 取上清液加入0.8倍体积的异丙醇于-20℃放置1.5h左右沉淀DNA, 13 200r/min离心10min后晾干, 最后用100μL TE缓冲液溶解沉淀[7]。

1.2.2 用植物通用引物t RNALeu验证所提取样品DNA的扩增性

PCR反应体系为20μL, 其中Mg Cl2终浓度2.0mmol;d NTP终浓度各200μmol;引物终浓度0.5μmol;模板1μL。反应条件为94℃预变性4min, 然后94℃、30s, 54℃、30s, 72℃、40s, 35个循环, 最后72℃延伸5min, 4℃保温。扩增产物用1.8%的琼脂糖凝胶电泳检测 (TBE缓冲液) , 其中含终浓度为0.5μg/m L的溴化乙锭, 取8μL PCR产物加入上样孔, 110V, 电泳45min, 用凝胶成像系统检测。

1.2.3 引物设计

根据Gen Bank中公布的H.vulgare Hor3 gene, 利用引物设计软件Primer 3.0自行设计, 并将设计的引物通过Blast比对, 考查其特异性。引物由上海生物工程合成, 序列见表2。

1.2.4 PCR反应体系及反应条件

反应条件为94℃, 4min;33个循环 (94℃, 30s;57℃, 30s;72℃, 40s) ;72℃, 5min;4℃保温。扩增产物用1.8%的琼脂糖凝胶电泳检测 (TBE缓冲液) , 其中含终浓度为0.5μg/m L的溴化乙锭, 取8μL PCR产物加入上样孔, 110V, 电泳45min, 用凝胶成像系统检测。

2 结果与分析

2.1 通用引物t RNA验证所提样品DNA的扩增性

L1:Marker (100~600bp) ;L2:小麦;L3:大麦;L4:燕麦;L5:黑麦;L6:荞麦;L7:薏仁米;L8:小黄米;L9:大米;L10:玉米;L11:黄豆;L12:红豆;L13:高粱米;L14:阴性对照

由图1可知:每种样品处均出现了明亮的目标条带, 说明所提取的样品DNA具有很好的扩增性。

2.2 特异性试验

L1:Marker (100~600bp) ;L2:大麦;L3:黑麦;L4:小麦;L5:燕麦;L6:荞麦;L7:薏仁米;L8:小黄米;L9:大米;L10:玉米;L11:红豆;L12:高粱米;L13:阴性对照

L1:Marker (100~600bp) ;L2:大麦;L3:黑麦;L4:黄瓜;L5:土豆;L6:大蒜;L7:生姜;L8:芝麻;L9:葱;L10:猪;L11:牛;L12:羊;L13:鸭;L14:阴性对照

试验在所确定的PCR条件下进行, 分别选取了燕麦、大麦、小麦、黑麦、荞麦、薏仁米、小黄米、大米、玉米、黄豆、红豆、高粱米、黄瓜、土豆、大蒜、生姜、芝麻、葱、猪、牛、羊和鸭共22种相关的样品对燕麦引物进行了特异性试验, 结果如图2和图3所示。

由图2和图3可知:引物Barley108bp只在大麦和黑麦处出现明亮目标条带, 在其他对照样品处均不出现条带, 说明引物具有很好特异性。虽在样品鸭处出现一条600bp左右的条带, 但大小与目标条带相差很多, 故并不干扰检测结果的判定。

2.3 检出限

2.3.1 理论检出限

按照试验方法中确立的参数, 我们通过使用不同浓度的大麦DNA模板和黑麦DNA模板对PCR体系的理论检出限进行了研究, 结果如图4和图5所示。

L1:Marker (100~600bp) ;L2:大麦100ng/μL;L3:大麦10ng/μL;L4:大麦1.0ng/μL;L5:大麦0.1ng/μL;L6:阴性对照

L1:Marker (100~600bp) ;L2:黑麦100ng/μL;L3:黑麦10ng/μL;L4:黑麦1.0ng/μL;L5:黑麦0.1 ng/μL;L6:阴性对照

由图4和图5可知:引物BR108bp对大麦和黑麦的理论检出限均为1.0ng/μL。

2.3.2 实际检出限

按照试验方法中确立的参数, 我们通过使用将米粉与大麦、米粉与黑麦按照一定的比例进行混合制备成的谷物含量梯度分别为100%、10%、1.0%、0.1%和0.01% (w/w) 的样品DNA模板对PCR体系的实际检出限进行了研究[9], 结果如图6所示。

L1:Marker (100~600bp) ;L2:大麦100%;L3:大麦10%;L4:大麦1.0%;L5:大麦0.1%;L6:大麦0.01%;L7:黑麦100%;L8:黑麦10%;L9:黑麦1.0%;L10:黑麦0.1%;L11:黑麦0.01%;L12:阴性对照

由图6可知:引物BR108bp对大麦和黑麦的实际检出限均为1.0%。

2.4 实样检测

为了验证本PCR检测方法的实用性, 试验选取了7种市售样品进行了检测, 其结果如图7所示。

L1:Marker (100~600bp) ;L2:大麦早餐营养麦片;L3:大麦面包;L4:谷粒酸奶 (含大麦、燕麦仁) ;L5:混合谷物薄饼 (含大麦面粉、全燕麦面粉) ;L6:黑麦片;L7:黑麦面包;L8:黑麦薄脆饼干;L9:阴性对照

由图7可知:各样品均在108bp处出现了目标条带, 检测结果与产品的标注相符。谷粒酸奶处的条带相对较暗, 可能是因为大麦含量相对较低。

2.5 PCR产物测序

尽管研究结果显示, 在试验条件下各引物均在相应的位置出现了目标条带, 但为了保证试验结果的准确性, 还需对PCR产物进行测序, 并利用DNASTAR的Meg Align将测序结果和目标序列进行比对[10]。通过这样的方式来验证PCR的扩增结果。

经测序和比对, 发现以大麦和黑麦为模板的BR108bp扩增产物与模板序列的匹配度分别达到了100%和97.1% (单向测序) 。

测序结果中引物序列包括紧跟在引物后面的一部分序列是测不到的, 为了获得整个序列, 故采取双向测序, 采用DNAMAN软件进行拼接。先将下游引物测得的序列转化为反向逆转序列, 再与上游引物测得的序列进行拼接。将拼接得到的序列与目标序列进行比对, 考查匹配度。

采用DNAMAN软件将上游引物测得的序列与下游引物测得的序列进行拼接后发现大麦和黑麦的测序结果一致, 与目标序列只相差一个碱基 (用方框标记的碱基) , 归纳见表4。可见以大麦DNA为模板和以黑麦DNA为模板获得的扩增产物是一致的, 而且都是目标产物。

3 结论

用改良CTAB裂解液提取样品DNA, 使用PCR方法检测市售产品是否污染了致敏原大麦和黑麦。针对大麦和黑麦的理论检出限均为1.0ng/μL, 实际检出限均为1.0%。满足检测产品中是否含大麦和黑麦致敏原的要求。所建立的PCR方法价格低廉, 操作简单, 结果准确可靠, 可作为产品是否含大麦和黑麦致敏原的鉴定方法。

摘要：乳糜泻是患者对小麦、大麦、黑麦和燕麦中的谷蛋白产生的一种不适当免疫反应。患者只能通过终身无谷蛋白食疗来避免严重并发症。本文建立了一种常规PCR方法来同时检测食品中大麦和黑麦致敏原。引物BR108bp是针对大麦醇溶谷蛋白3编码序列设计的, 在GenBank上经Blast, 发现理论上特异性很好。然而通过试验发现, 该引物除了在大麦处出现相应扩增外在黑麦处也扩增出大小约为108bp的条带。经测序和比对, 发现以大麦和黑麦为模板的扩增产物测序结果一致, 并且只与模板序列相差一个碱基, 这说明黑麦也含有这段序列, 只是在核酸数据库中没公布, 因此可以说是发现了黑麦的部分基因序列。通过多次试验, 结果表明:该引物只在大麦和黑麦处出现相应扩增, 具有良好特异性, 针对大麦和黑麦的理论检出限均为1.0ng/μL, 实际检出限均为1.0%。而且能检测热加工食品中的大麦和黑麦DNA, 故可用于日常检测。

关键词：大麦,黑麦,谷蛋白,PCR,检测

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PCR法检测 篇4

关键词：猪链球菌；菌种；致病血清型；多重PCR；检测方法

中图分类号：S852.61 文献标志码：A

文章编号：1002-1302（2014）08-0212-02

猪链球菌（Streptococcus suis，SS）是一种危害公共安全和现代养猪业的人兽共患病原体，有致从业人员感染的危险，猪链球菌病几乎危及所有规模化养猪国家^[1]。猪链球菌血清型众多，其中猪链球菌2型（SS2）对猪的致病性最强，流行亦最广；此外，猪链球菌 7型（SS7）和猪链球菌9型（SS9）等也是引起猪感染发病的重要血清型。谷氨酸脱氢酶（GDH）是细菌的一种十分重要的功能蛋白，其基因保守性高，点突变率极低，是病原体种属鉴定的重要诊断性抗原。Okwumabua等根据gdh基因设计猪链球菌种特异性引物，通过对306株链球菌的检测发现，目前发现的35个猪链球菌血清型中均检测出了gdh基因，而化脓链球菌、乳房链球菌、牛链球菌、链球菌兽疫亚种、马链球菌均未检测出gdh基因，因此，gdh通常作为猪链球菌的一种重要检测抗原^[2]。荚膜多糖（CPS）是区分猪链球菌血清型的重要依据之一^[3]。SS2 cps2J基因仅可以与2型和1/2血清型产生杂交，显示cps2J基因为SS2的特异性基因可以作为鉴定SS2 的依据。根据SS7型、SS9型基因与其他血清型的同源性比对，选择同源性低的阅读框基因作为检测基因。本试验以我国及山东等地SS血清型流行病学调查为参考，借鉴已发表的SS gdh基因作为种特异性引物，筛选2、7、9型cps特异性基因作为检测引物，在建立单项PCR的基础上优化反应体系和反应条件，建立特异性的多重PCR检测方法，可在诊断猪链球菌的同时进行主要致病血清型的分型。并利用本研究建立的多重PCR检测方法系统地对鲁西区域SS的流行状况进行了调查与分型研究。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株及来源 标准菌株HA9801（SS2）、8074（SS7）、2083（SS9）基因组DNA由南京农业大学陆承平教授惠赠。49株分离株来源于鲁西各大养猪场^[4]，马链球菌兽医亚种、副猪嗜血杆菌、金黄色葡萄球菌、多杀性巴氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌由聊城市畜禽疫病检测重点实验室、聊城市畜禽疫病诊疗工程技术研究中心保存。

1.1.2 主要试剂 Ex-Taq Mix、DNA marker和蛋白酶K等主要试剂均购自宝生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 根据国内外资料的报道^[5-8]，确定gdh基因保守区域为SS 种特异性靶基因，以cps基因为型特异性靶基因，设计血清2型、7型和9型检测引物（表1），由上海Sangon生物工程公司合成。

3 讨论

Arends 等对143个屠宰猪扁桃体开展了SS2 的检测研究，结果表明，荷兰SS2的带菌率在30 %以上^[9]。Breton 等对413 份屠宰猪扁桃体开展SS的分离，结果在加拿大猪场共分离到 180 株SS（分离率为43.6 %），SS2有29 株（占SS的16.1%）^[10]。Han 等对 406 个屠宰猪扁桃体进行SS的检测研究，结果从韩国猪场共分离出猪链球菌 55 株，临床9 型最多（16.4%）^[11]。可见，SS 在各国大猪场存在隐性感染的情况比较普遍。本研究结果显示，从各采样猪场不同生长阶段临床表观症状健康猪群中均检测出SS，表明鲁西地区临床表观症状健康的猪群中存在SS隐性带菌和潜在感染的威胁。

本研究结果对猪链球菌的表观症状健康猪群及患病猪群从分离率及血清型两方面反映出鲁西地区猪链球菌的流行状况。对鲁西地区分离到的49株SS PCR检测为阳性的样品进行了血清型的分型研究，鑒定出SS2、SS7和SS9 菌株的数量分别为 17株、2株和3株。SS2菌株的阳性率占SS总分离菌株的比例为34.7%，提示SS2在该地区猪群中的带菌比例相当高。鲁西地区分离到的49株SS，其相同血清型不同菌株间的毒力因子情况及不同血清型的致病性等都有待于进一步研究。

本研究建立了猪链球菌种及3种主要致病血清型2、7、9型的四重PCR方法，通过特异性检测和临床应用验证，表明该多重PCR方法的敏感性高、特异性强，可作为养殖一线开展猪链球菌快速诊断和流行病学调查的重要手段。

参考文献：

[1]Staats J J，Feder I，Okwumabua O，et al. Streptococcus suis：past and present[J]. Veterinary Research Communications，1997，21（6）：381-407.

[2]Okwumabua O，Persaud J S，Reddy P G. Cloning and characterization of the gene encoding the glutamate dehydrogenase of Streptococcus suis serotype 2[J]. Clinical and Diagnostic Laboratory Immunology，2001，8（2）：251-257.

[3]Charland N，Kobisch M，Martineau-Doizé B，et al. Role of capsular sialic acid in virulence and resistance to phagocytosis of Streptococcus suis capsular type 2[J]. FEMS Immunology and Medical Microbiology，1996，14（4）：195-203.

[4]王海麗，赵德明，葛长城，等. 猪链球菌的分离鉴定及病原特性研究[J]. 中国兽医杂志，2012，48（7）：36-39.

[5]Wisselink H J，Joosten J J，Smith H E. Multiplex PCR assays for simultaneous detection of six major serotypes and two virulence-associated phenotypes of Streptococcus suis in tonsillar specimens from pigs[J]. Journal of Clinical Microbiology，2002，40（8）：2922-2929.

[6]Smith H E，Veenbergen V，van der Velde J，et al. The cps genes of Streptococcus suis serotypes 1，2，and 9：development of rapid serotype-specific PCR assays[J]. Journal of Clinical Microbiology，1999，37（10）：3146-3152.

[7]Smith H E，van Bruijnsvoort L，Buijs H，et al. Rapid PCR test for Streptococcus suis serotype 7[J]. FEMS Microbiology Letters，1999，178（2）：265-270.

[8]Okwumabua O，OConnor M，Shull E. A polymerase chain reaction（PCR） assay specific for Streptococcus suis based on the gene encoding the glutamate dehydrogenase[J]. FEMS Microbiology Letters，2003，218（1）：79-84.

[9]Arends J P，Hartwig N，Rudolphy M，et al. Carrier rate of Streptococcus suis capsular type 2 in palatine tonsils of slaughtered pigs[J]. Journal of Clinical Microbiology，1984，20（5）：945-947.

[10]Breton J，Mitchell W R，Rosendal S. Streptococcus suis in slaughter pigs and abattoir workers[J]. Canadian Journal of Veterinary Research，1986，50（3）：338-341.

PCR法检测 篇5

1 资料与方法

1.1 一般资料

2008年3月至2010年5月选择在我院因咳嗽、咳痰、胸痛、发热、胸片或CT异常住院接受检查的患者102例, 其中男67例, 女35例。最小年龄27岁, 最大年龄76岁, 平均年龄 (45.6±8.5) 岁, 全部病例无严重的细菌或真菌感染。所有患者均自愿参加临床研究, 且签署知情同意书。

1.2 诊断方法

(1) 标本处理: (1) 取痰液2m L加液化剂 (1X液化剂Liguidyzing Peagent) 使之充分液化至清亮。 (2) 取1m L液化痰, 1400γ/min离心5min, 小心倾去上清部分。 (3) 向沉渣中加入无菌双蒸水, 振荡混匀, 并颠倒管数次, 1200γ/min离心3min, 倾去上清液。 (4) 重复步骤 (3) 离心后尽量倾去全部上清液。 (5) 向沉渣中加入40μL裂解液, 充分振荡混匀, 100℃加热15min, 1400γ/min离心5min, 取2μL上清液做PCR反应模板。 (2) 结核分枝杆菌核酸扩增 (PCR) 荧光定量检测:取单管单人份PCR反应管, 直接加入处理后样品或各梯度标准品5m L, 6000r/min离心数秒。上机扩增, 扩增参数:93℃120s 1个循环, 93℃45s~55℃60s, 10个循环, 93℃30s~55℃60s 30个循环。反应结束后该电脑根据阳性定量标准模板的扩增情况自动绘制标准曲线。根据阳性定量模板和体测样品的扩增情况, 算出反应体系中体测样品中DNA的拷贝数。 (3) 抗酸染色:各标本涂片进行抗酸染色, 在油镜下观察300个视野, 3个菌以上为阳性。

1.3 统计学处理

使用SPSS 13.0对各项资料进行统计、分析, 采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

肺结核患者按2001年全国肺结核诊断标准确诊 (根据临床表现、胸部X线或CT、痰涂片或/和培养及抗结核治疗有效为标准) , 非肺结核病患者根据临床表现、胸部X线或CT、病理及其他辅助检查以及治疗效果而确诊。经上述诊断方法进行诊断发现:102例受检查的病例中有45例为肺结核患者, 占44.12% (45/102) , 非肺结核病患者组57例, 其中肺癌15例, 肺炎24例, 支气管哮喘5例, 肺脓肿11例, 支气管扩张伴感染2例。102例受检者经过FQ-PCR和抗酸染色检查发现, FQ-PCR检查出42例阳性, 占41.17% (42/102) , 低于2001年全国肺结核诊断标准确诊病例数, 但是差异无统计学意义 (P>0.05) ;抗酸染色共检查出27例阳性, 占26.47% (27/102) , FQ-PCR的阳性检查结果明显优于抗酸染色的检测结果, 且差异具有统计学意义 (P<0.05) , 具体结果可见表1。

3 讨论

随着分子生物学技术的发展, PCR技术曾经广泛用于临床检测, 但不久人们发现传统PCR因在开放状态下分析, 对实验室的污染是不可避免的, 因为污染而导致的假阳性结果, 使PCR无法满足临床应用。而FQ-PCR是在全封闭状态下, 实现PCR扩增和产物分析。改正了传统PCR的缺陷, 并由于其扩增与自动化分析一体化, 使检测更加简便和快速。FQ-PCR技术主要是在PCR反应体系中加入一条荧光标记的基因探针, 只要标本中结核分枝杆菌数达到10~103/m L时, FQ-PCR技术便可给予准确定量。本文的研究结果显示102例受检者经过FQ-PCR和抗酸染色检查发现, FQ-PCR检查出42例阳性, 占41.17% (42/102) , 低于2001年全国肺结核诊断标准确诊病例数, 但是差异无统计学意义 (P>0.05) ;抗酸染色共检查出27例阳性, 占26.47% (27/102) , FQ-PCR的阳性检查结果明显优于抗酸染色的检测结果, 且差异具有统计学意义 (P<0.05) 。这表明FQ-PCR可以有效地检测出肺结核患者体内的结核分枝杆菌且这种检测方法明显优于传统的抗酸染色法。

PCR法检测 篇6

关键词：建兰花叶病毒,荧光RT-PCR,快速检测,蜘蛛兰

建兰花叶病毒(Cymbidium mosaic virus,简称CymMV)和齿兰环斑病毒(OdontogLossum ringspot virus,简称ORSV)是发生最为普遍的兰花病毒,广泛分布于全世界栽培兰花的地区[1,2,3,4,5,6],这2种病毒传染性强,其中CymMV相对ORSV更易传染,在市场上蝴蝶兰、文心兰和卡特兰CymMV的感染率高达66%以上[7],病毒侵染导致植株生长不良甚至死亡,有时病毒感染后还会在植株的营养生长期出现较长时间的隐症现象,但带毒植株开花小而少,花期缩短,发病兰株观赏价值和经济价值大为下降,还会导致种质退化,对兰花产业造成严重危害。

多年来,国内学者不断深入地对CymMV的检测技术开展研究工作:1997年,潘俊松等[8]从石桷兰中分离出CymMV用于制备抗血清;郑平等[9]用组织涂抹酶联免疫吸附技术检测CymMV和ORSV;周国辉等[10]用RT-PCR方法对病毒分子进行鉴定;2007年施农农等[11]对用电镜法对CyMV和ORSV进行超微结构观察;2008年高焕利等[12]用IC-RT-PCR检测CymMV,提出了该方法可检测到CymMV分离物的最低病毒量为2.72×10-7μg/mL(428个拷贝)。2006—2008年期间,笔者在根据文献资料的多种方法对147个样品进行CymMV检测,并相应的隔离栽培,但不时发现有部分初检为阴性的样品,经过一段时间养护后复检为阳性,对苗圃中兰花种苗的检测也经常发现这种情况。这就涉及检出限的问题,说明有部分样品中只含有微量CymMV,用前述的方法不能被检出。

为解决检测工作中由于隐症、病毒浓度低、干扰物质存在而影响检测结果的问题,笔者摸索建立了利用实时荧光PCR仪快速检测微量建兰花叶病毒的方法,使建兰花叶病毒的检测水平从灵敏度、准确性、稳定性上有所提高。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试材料。

供试材料为蝴蝶兰(PhaLaenopsis sp.)(1#)、卡特兰(CattLeya sp.)(2#)、文心兰(Oncidium sp.)(3#)、蜘蛛兰(Arachnis sp.)(4#)、皇后兰(GrammatophyLLmn sp.)(5#)、蕙兰(C.Faberi)(6#),所有样品之前经ELISA筛检,并由笔者所在实验室分类保存,其中本试验所用的卡特兰、文心兰和蜘蛛兰为加保护液冻存的叶片组织,其他为从植株上采的新鲜叶片。

1.1.2 供试试剂。

供试试剂为:UNIQ-10柱式总RNA抽提试剂盒(上海Sangon),MMLV一步法RT-PCR扩增试剂盒(上海Sangon)、One Step SYBR PrimeScriptTMRT-PCR试剂盒(大连Takara公司)。

1.1.3 供试仪器。

供试仪器为:Bio-Rad Opticon 2荧光定量PCR仪(美国),Thermo Labsystem MuLtiskan Mk 3酶标仪(上海雷勃),TC-96/H/G基因扩增仪(大和热磁),VARIAN CAR Y50紫外-可见分光光度计(美国)。

1.2 引物设计与合成

查询NCBI基因库(GeneBank),根据CymMV保守序列,设计并合成3对特异性引物(表1)。

1.3 RNA提取

样品用液氮研磨成粉状,称取粉状未解冻试样(约为100 mg),提取步骤参照RNA抽提试剂盒推荐方法稍加调整,因试样较粘稠,每100 mg试样加0.8 mL裂解液提取,洗脱体积为50μL。取20μL RNA提取物用无菌水稀释100倍在分光光度计上以波长260 nm检测总RNA含量,以A260/280比值和200～400 nm扫描图检测RNA纯度,纯化提取物直到A260/280比值>1.9。将提取物10μL/管分装在RNAase free的PCR管中,-80℃保存备用。

1.4 普通RT-PCR-琼脂糖电泳定性检测熔解曲线分析

将1.3提取的兰花RNA用MMLV一步法RT-PCR扩增试剂盒,反应条件参照文献[7]。反应结束后,取C1、C4、C7产物分别为4.0、5.0、6.0μL,各加0.5μL上样缓冲液,于1.2%琼脂糖凝胶上(含EB 0.2μL/mL)进行电泳。

1.5 荧光RT-PCR定性检测和熔解曲线分析

将1.3提取的兰花RNA用One Step SYBR PrimeScript TM RT-PCR试剂盒进行荧光PCR定性检测,具体操作步骤:每孔加RT-PCR Buffer(内含dNTP Mixture,Mg2+,SYBR誖Green I)25μL,反转录酶和Taq酶混合物2.0μL;10μmoL/L上游、下游引物(C7)各1.0μL;水20μL;最后加1.0μL标准品或试样,制成总体积为50μL反应液体系,以无菌水代替试样作空白对照,加盖密封,1 000 r/min离心1 min,在荧光PCR仪上逆转录和扩增反应,经优化后的一步法RT-PCR反应条件为:(1)43℃,30 min;(2)94℃,15 s;(3)94℃,5 s;(4)55℃,30 s;(5)72℃,20 s;(6)读板;(7)将(3)～(6)步PCR反应循环30次;(8)72℃,5 min。将扩增产物进一步做熔解曲线分析:55～94℃;每0.5℃读板1次,每点持续5 s。

1.6 荧光RT-PCR定量检测

由于普通RT-PCR与荧光PCR定性检测存在差异,对有差异结果通过与一定浓度的重组质粒同时扩增进行定量分析。

1.6.1 标准品的制备。

将得到的经纯化的扩增产物,与质粒(p UCm-T载体)连接并克隆,提取相应的重组质粒,制成100 ng/mL的溶液,以此作为标准品储备液。

1.6.2 一点法粗略定量检测。

将C4重组质粒储备液以无菌去离子水逐级稀释成2.8×102质粒/μL标准使用液。4#样品和标准品在相同条件下进行反应:RT-PCR Buffer 12.5μL,反转录酶和Taq酶混合物1.0μL;10μmoL/L上游、下游引物(C4)各0.5μL;水10μmoL;最后加0.5μL标准品或试样,制成总体积为25μL反应液体系,反应条件为:(1)43℃,30 min;(2)94℃,2 min;(3)94℃,30 s;(4)、55℃,30 s;(5)72℃,25 s;(6)读板;(7)将(3)～(6)步PCR反应循环35次;(8)72℃,10 min。

1.6.3 绝对定量法检测。

将C7重组质粒储备液以无菌去离子水逐级稀释成2.6×107、2.6×105、2.6×102质粒/μL的标准使用液。将1#、4#和5#样品和标准品在相同条件下进行反应,引物为C1,其他反应试剂同1.62,反应条件参照文献[13]。对线性范围内未知样品用绝对定量法计算其原始拷贝数,对线性范围以下的样品进行半定量分析其浓度范围。

1.7 测序验证

收集1.4和1.6的扩增产物,经纯化、克隆,委托上海Sangon测序。

2 结果与分析

2.1 CymMV的普通RT-PCR-琼脂糖电泳定性检测结果

用所设计3对的CymMV PCR引物进行RT-PCR反应,能够成功地在部分兰花病样总RNA抽提物中扩增到与预期大小相符的单一明亮的DNA电泳条带(图1)。由图1可见4#样在电泳图上未检出CymMV,但该植株再经过3个月的隔离栽培后出现症状,并用ELISA和PCR方法均检出CymMV,随后逐渐枯死。

注:图中1为DNA Marker,2～8、9～16、16～22孔依次为1#～6#样品C1、C4、C6和相应的空白对照的产物。

2.2 荧光RT-PC定性检测结果

由图2可知,4#样的总RNA提取物经荧光RT-PC定性检测发现该蜘蛛兰已被CymMV感染,但其含量极低,对产物进一步进行熔解曲线分析,结果4#样与其他样品的产物Tm都是78.0℃,并由图3可知,其熔解曲线均为单一产物形态,表明4#样与其他样品的具有相同的单一产物。

2.3 荧光RT-PCR半定量检测结果

由图4可知,4#样的CymMV C4模板浓度<2.8×102质粒/μL的C4重组质粒模板浓度,因重组质粒中的模板为双链DNA,0.5μL重组质粒模板数为2.8×102×2×0.5=2.8×102拷贝,即4#样的CymMV C4模板<2.8×102拷贝。由图5可知,4#样的CymMV C1模板<2.6×102拷贝,同时可以看出,2.6×102拷贝和2.6×100拷贝扩增曲线并无明显的区别,因此当模板数<2.6×102拷贝,只能进行定性分析。

2.4 测序结果

测序结果表明,所有扩增产物的实际长度与预期完全相符。应用NCBI基因库的BLAST对产物进行同源性分析,C1产物与基因库中CymMV相应序列的同源性≥96%;C4产物同源性89%～99%。C7产物的测序结果同源性比较见图6,由图6可知,1#样蝴蝶兰同源性≥96%;5#样皇后兰同源性≥97%,与AM055640.2所报道的序列完全相同,与1#样有5个碱基的差异(同源性97%);4#样蜘蛛兰与基因库序列的同源性94%～96%;与基因库中EU672821.1序列最接近,存在7个碱基的差异(同源性96%);4#样与1#样有12个碱基的差异(同源性94%),4#样被其他样品污染的可能性极小。因此,认为该植株在引进时已经携带微量的CymMV。

3 结论与讨论

3.1 建立了微量CymMV的快速检测方法

传统的PCR-电泳方法无法对起始模板准确定量,只能对终产物进行分析,必须在扩增后用电泳方法分析,费时费力,而且电泳分辨率限制了该方法的检测灵敏度。

荧光RT-PCR法在检测时可进行实时观察扩增状态,因此在很大程度上加快检测速度;该方法因所有试验在封闭系统内完成,可变因素大大减少,比普通PCR方法灵敏度提高了102倍;因为不需要进行后期处理,可防止强致癌物溴乙锭对操作人员的危害。本研究建立的CymMV实时荧光RT-PCR检测方法具有灵敏度高、操作快速、结果直观准确的特点,可应用于种苗中微量CymMV的早期检测,并对深入开展CymMV生物学特性研究打下基础。

3.2 检测灵敏度可达基因拷贝数仅在个位数

荧光RT-PCR检测方法不但可以定性分析,也可进行定量分析,导入基因拷贝数解析,在本文中主要针对病毒含量在定量限(2.6×102拷贝)以下的样品进行分析,因此只能通过半定量方法推算其基因拷贝数仅在个位数。

3.3 荧光RT-PCR定性和绝对定量检测对引物要求高

荧光PCR法的荧光扩增曲线,不能分辨扩增产物有几个,因此必须是单一产物的扩增。扩增结束时,可用熔解曲线法对扩增的特异性进行验证。因此,要求引物具有高度的特异性和目标基因的保守性。

荧光RT-PCR定量检测方法分为绝对定量和相对定量法,相对定量法检测成本高,本研究主要针对生产应用,因此,采用了绝对定量法,该种方法对于引物的特异性、保守性和产物的稳定性要求较高,所应用的引物应经过反复验证。

PCR法检测 篇7

1 材料与方法

1.1 菌株来源

84株金葡菌均为我科2008年1月~2009年1月从临床标本中分离的菌株,分别来源于痰液、脓液、血液、分泌物、腹腔引流物、肾囊肿穿刺液、胸腔积液、脓疱液、疱液、导管下段及导管尖端,经美国DADE-BERING公司Walk Away-40全自动微生物分析仪鉴定核实为金葡菌。

1.2 细菌鉴定质控菌株

金葡菌ATCC25923,购于卫生部临床检验中心。

1.3 仪器与试剂

Walk Away-40全自动微生物分析仪(美国DADE-BERING公司产品),PCR仪(美国Eppendorf公司产品),测序仪(美国ABI公司),凝胶成像仪(美国FOTODYNE),电泳仪(瑞典Phermacia公司)。PCR试剂购于上海生工生物工程有限公司。

1.4 引物设计

根据Gen Bank中已发布的基因序列,利用Primer Premier 5.0软件及参考文献[2]设计mec A基因、TSST-1基因、PVL基因引物,扩增产物预期长度分别为892 bp、578 bp和578 bp,由上海生工生物工程有限公司合成。

mec A:P1 5'-GCC GTA GTT GTC GGG TTT GG-3',P25'-GGC GGA TGT GCG ATT GTA TTG C-3'。

PVL:P1 5'-GTG ATG GCG CTG AGG TAG TC-3',P25',-GCT GGG GGT AAT TCA TTG TCT G-3'。

TSST-1:P1 5'-GCT ATC GTA AGC CCT TTG TTG C-3',P2 5'-GCT GGA TCC GTC ATT CAT TGT T-3'。

1.5 细菌DNA的提取

将冰冻保存的84株实验菌株用胰酶大豆肉汤复苏、转种哥伦比亚羊血琼脂培养基。用接种环挑取24 h培养的单个菌落,置于100μl裂解液(1 mol/L Na OH+20 g/L SDS)中,100℃水浴30 min,冷却后用等量的1 mol/L盐酸中和,离心10 min(13 000 r/min)去沉淀,再用乙醇沉淀DNA(加入400μ无水乙醇),混匀后-20℃冰冻30 min,13 000 r/min离心15 min,弃上清。加入70%乙醇200μl,静置5 min,13 000 r/min离心5 min,吸干上清液,完全晾干沉淀后,用30μl双蒸水溶解DNA,作为PCR扩增模板。

1.6 多重PCR扩增体系及反应条件

把3对引物放入同一反应体系建立多重PCR。PCR体系:采用20μl反应体系,模板1μl,起始引物和终末引物各1μl,d NTP 1.5μl,Taq酶0.2μl,10×Buffer 2μl,Mg2+2μl,双蒸水11.3μl。PCR反应条件:94℃预变性4 min,然后进入循环,94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸150 s,共进行35个循环,最后72℃延伸15 min,PCR产物在20 g/L的琼脂糖凝胶中进行电泳,然后在溴化乙锭溶液中染色20 min,清水冲洗后用凝胶成像系统观察结果。

1.7 序列测定

将PCR产物送上海生工生物工程有限公司进行测序,结果与Gen Bank中的核苷酸序列进行同源性比较。

2 结果

2.1 多重PCR扩增产物的电泳分析

84株金葡菌中检出mec A基因阳性49株,检出率为58.3%;检出PVL基因20株,占临床分离株的23.8%,其中,MRSA为13株(13/49,26.5%),MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因阳性菌株。部分菌株的PVL基因PCR扩增结果见图1。

(1~6、9~11泳道为PVL基因阴性菌株;7、8泳道为PVL基因阳性菌株;M:PCR marker)

2.2 PVL基因阳性金葡菌的分布特点

PVL基因阳性的分离株中,有7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离自血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液。

2.3 测序结果的分析

将测序结果与Gen Bank中的已有序列进行比较,同源性为100%。

3 讨论

最近,国内学者报道葡萄球菌已是医院感染分离率最高的细菌,其中MRSA占较高的比例[3]。近年来,其临床分离率呈明显上升趋势,因具有多重耐药特征和携带多种毒力因子(如PVL、TSST-1、SEC等)已成为临床治疗的难点。笔者对我院金葡菌感染情况分析发现,我院MRSA感染占58.3%,MSSA占41.7%,明显高于马筱玲等[4]报道的MRSA检出率(42%),说明我院MRSA感染率较高,并且多为院内感染,应引起临床重视。MRSA的甲氧西林耐药决定簇(mec A)位于SCCmec盒上,该结构类似于转座子,可以介导mec A基因游离传播,使敏感的金葡菌获得甲氧西林耐药;同时SCCmec盒还可以整合许多其他耐药基因。因此,MRSA菌株常表现为多重耐药。MRSA的产生还与临床上抗生素的不合理应用有密切关系。

PVL是金葡菌产生的一种外毒素,该毒素特异性地吸附并作用于白细胞,改变白细胞的通透性,造成大量白细胞损伤,丧失吞噬能力。同时,由于白细胞的破坏,处理抗原和呈递抗原信息的能力下降,损害了机体的防御屏障和免疫应答,从而不能建立有效的特异性免疫。近年来由产PVL金葡菌所致感染而导致死亡病例逐渐增多,尤其是携带PVL基因的MRSA[5]。本研究结果显示,84株金葡菌中PVL基因阳性的检出率为23.8%,明显高于闫中强等[6]报道的PVL基因检出率(15.7%)。20株PVL阳性菌株中,7株分离自脓液和创伤分泌物,5株分离直血液,5株分离自痰液,2株分离自腹腔引流物,1株分离自尿液,说明不同临床标本中都可能检出PVL阳性的金葡菌,PVL阳性的金葡菌主要造成化脓性感染、肺部感染、血液感染及尿路感染。PVL基因阳性菌株在MRSA中的分离率高于MSSA,PVL基因阳性的MRSA具有多重耐药性且携带PVL,其毒性强,有一定的致死性,将会给患者带来严重的后果。

TSST-1是金葡菌产生的一种产热毒素,作为超抗原,TSST-1与MHC-Ⅱ类分子结合,作用于T细胞受体,使其大量增殖,并产生白细胞介素-1、白细胞介素-2及干扰素等多种细胞因子,是引起中毒性休克的主要原因[7]。本研究对84株金葡菌进行检测,未检出TSST-1基因,可能与感染类型不同、其金葡菌携带的毒素基因不同有关。

摘要：目的:了解金黄色葡萄球菌(简称金葡菌)耐药基因及所携带致病毒素基因PVL与TSST-1的特点。方法:应用多重PCR法检测mecA基因、TSST-1基因及PVL基因。结果:84株金葡球经多重PCR法对其mecA基因进行检测,检出率为58.3%(49/84)。PVL基因阳性菌株的分离率为23.8%(20/84),PVL阳性的MRSA为13株(13/49,26.5%),PVL阳性的MSSA为7株(7/35,20.0%),差异无统计学意义(P>0.05);未检出TSST-1基因。结论:金葡菌的耐药性呈上升趋势,且金葡菌可产生多种毒素,在分离金葡菌的同时,应加强其耐药基因及毒素基因的检测。

关键词：金黄色葡萄球菌,中毒休克综合征毒素-1基因,杀白细胞毒素基因

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PCR法检测 篇8

关键词：乙肝病毒,荧光定量PCR,ELISA,病毒含量

乙型肝炎是由于乙肝病毒 (HBV) 引起, 是一种在全球流行的传染性疾病, 而我国是其高发地区, 严重威胁着国民的生命健康[1]。乙肝病毒血清标志物 (HBV-M) 的检测是临床对乙肝病情及传染性进行判断的重要依据, 反映了机体对于乙肝病毒的免疫状态[2]。酶联免疫吸附法 (ELISA) 是检测HBV-M的常用方法。分子生物学的快速发展使得HBV-DNA的检测越来越方便, 荧光定量PCR法 (FQ-PCR) 检测HBV-DNA也逐渐在临床上推广应用[3]。本研究采用这两种方法作为检测方法, 探讨了乙肝病毒血清标志物 (HBV-M) 与HBV-DNA之间的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选择2012年1月到2012年6月半年内我院门诊和住院的682例乙型肝炎患者, 其中男415例, 女267例, 年龄4~76岁, 平均年龄 (38.6±11.2) 岁。患者均经临床诊断确诊, 排除甲、丙、丁、戊、庚型肝炎的重叠感染。空腹采血后即刻分离血清, 以备检测。

1.2 检测方法

1.2.1 乙肝病毒血清标志物 (HBV-M) 检测

采用酶联免疫吸附法 (ELISA) 检测患者HBV-M, 严格按照试剂盒说明书进行操作, 应用酶标仪对结果进行测定并记录。检测所用试剂由上海科华生物工程股份有限公司提供, HBV-DNA试剂是由深圳匹基提供。

1.2.2 HBV-DNA检测

HBV-DNA的检测采用荧光定量PCR法 (FQ-PCR) 。操作步骤:取患者血清标本100μl, 向其中加入等量的DNA提取液, 混匀后于13 000rpm离心10min, 弃去上清液, 加入25μl处理液, 100℃热浴10min。再于13 000rpm离心10min, 取2μl上清液加入PCR管。强阳性对照品、弱阳性对照品、阴性对照品、阳性标准品的处理方法与患者血清标本相同。设定循环参数进行PCR反映, 反应结束后应用阳性梯度标准品的Ct值制作标准曲线, 再依据样品的Ct值计算DNA的含量。

1.3 统计学分析

运用SPSS13.0软件, HBsAg与HBeAg同为阳性组与其他组别的比较采用χ2检验, 判定标准以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

682例乙型肝炎患者血清标本共有8种乙肝病毒血清标志物 (HBV-M) 模式, 其中最多的为小三阳, 即HBsAg (+) +HBeAb (+) +HBcAb (+) 模式, 占38.71% (264/682) , 大三阳[HBsAg (+) +HBeAg (+) +HBcAb (+) ]次之, 占25.51% (174/682) 。大三阳与[HBsAg (+) +HBeAg (+) ]模式的HBV-DNA阳性率分别98.85%和98.04%, 两者HBV-DNA检出率明显高于其他HBV-M模式, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;大三阳的HBV-DNA含量为 (5.8×106±2.3×105) , 明显高于其他模式。

3 讨论

酶联免疫吸附法 (ELISA) 检测血清标准中的乙肝病毒标志物 (HBV-M) 方便易行, 可以为判定是否感染HBV以及所处阶段提供重要的依据, 但ELISA法不能够直接反映患者体内HBV的复制情况, 也不能直接判断患者是否具有传染性[4]。荧光定量PCR很好的克服了传统PCR的缺点, 对常规的血清学HBV检测也起到了补充作用, 可以通过体内是否存在完整的病毒颗粒复制来判断患者的感染性[5]。荧光定量PCR还可以对病毒DNA水平做定量分析, 对药物疗效的观察及预后的判断也十分有帮助。

大三阳指的是抗原、核心抗体及e抗原同时阳性, 即HBsAg (+) +HBeAb (+) +HBcAb (+) 模式。本研究结果显示, 大三阳与[HBsAg (+) +HBeAg (+) ]模式的HBV-DNA阳性率分别98.85%和98.04%, 两者HBV-DNA检出率明显高于其他HBV-M模式, 差异具有统计学意义 (P<0.05) ;大三阳的HBV-DNA含量为 (5.8×106±2.3×105) , 明显高于其他模式。这与其他研究报道结果基本一致, 说明了当HBsAg、HBeAg同时阳性时, 患者体内HBV-DNA复制较为活跃, HBV-DNA的活跃复制会导致患者的传染性增加, 因此, 此结果也说明了大三阳病人的传染性强。

682例乙型肝炎患者血清标本共有8种乙肝病毒血清标志物 (HBV-M) 模式, 其中小三阳模式所占比例最多, 为38.71%。小三阳的患者HBV-DNA阳性率为31.82%, 明显低于大三阳患者HBV-DNA阳性率 (P<0.05) 。说明了小三阳患者HBV-DNA复制活跃性明显低于大三阳患者, 虽然HBeAg转阴, 但乙肝病毒并没有停止在机体内的复制, 仍然具有传染性。HBsAg (+) +HBcAb (+) 模式的HBV-DNA阳性率为52.88%, 处于大三阳与小三阳之间, 有研究报道解释这种情况是由于病毒基因的第1896位核苷酸发生突变, 阻止了前C区序列的转录与翻译[6], 使得HBeAg的分泌减少, 但患者体内仍然存在HBV-DNA复制。

HBeAb (+) +HBcAb (+) 模式、HBcAb (+) 模式及HBsAb (+) +HBcAb (+) , 患者HBV-DNA的阳性率为0, HBsAg和HBeAg的转阴及HBsAb的出现说明了机体已经清除了肝炎病毒, HBsAb在清除病毒时有着重要的作用[7]。HBsAb (+) +HBeAb (+) +HBcAb (+) 模式下, 机体产生了保护性的HB-sAb, 或者因为免疫功能低下, 既不表达抗原, 也没有宿主抗体的应答, 因此HBV-DNA的阳性率也较低[8]。此4种模式下, 机体内HBV-DNA基本不复制, 传染性也较低。

综上所述, 不同乙肝病毒标志物模式HBV-DNA的检出率及病毒含量有差异。同时对患者做HBV-DNA检测与乙肝病毒标志物检测, 对乙肝的早期诊断、病情判断及其传染性都有重要意义。

参考文献

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PCR法检测 篇9

关键词：小麦散黑穗病；PCR检测；种传病害；特异性引物

中图分类号：S435.121.4+4文献标志码：A文章编号：1002-1302（2014）01-0036-03

收稿日期：2013-05-01

基金项目：国家公益性行业（农业）科研专项（编号：2013016）；国家科技支撑计划（编号：2012BAD19B04）。

作者简介：朱桂清（1959—），女，高级实验师，主要从事植物病理学研究。E-mail：zhugq1959@126.com。

通讯作者：曹远银，研究员，博士，主要从事植物免疫学与分子植物病理学研究。E-mail：caoyy66@yahoo.com.cn。小麦散黑穗病由小麦散黑粉菌[Ustilago tritici （Pers.） Rostr.]引起，各国小麦产区均有发生[1]。在我国以华中和华东麦区发病最重，而东北麦区则重于西北麦区。该病为典型的种传病害，带菌种子（胚内菌丝体）是唯一的传播途径。小麦单株一经罹病，其产量损失就近100%，换句话说，小麦发病株率可约等于产量损失率。从对整体生产危害情况来看，未见有毁灭性的报道，严重地块可达10%以上，但一般中等发病率田块仅为1%～5%。然而，近20年来，由于疏于药剂拌种处理，病情呈上升趋势。例如，被认为较轻发生的西北天水等地区也变得较普遍，重病田块发病率竟达15%～200%[2]。在国外的发生情况也呈类似上升，如加拿大西部小麦散黑穗病造成硬粒小麦和面包麦的产量损失更严重，已高达27%[3]。

该病的最有效防治手段是种子处理等化学方法，发病后的应急防治意义不大。因此，关于种子处理的各种化学药剂种类研发较多，但鲜有大规模应用于拌种的报道。其原因应与小麦散黑穗病的防治还未引起足够重视、种子处理费时费工、增加成本及污染有关，特别是因缺乏简便快速可靠的技术检测病种率而影响拌种的决策有关。为了改变这种现状，研制其简便可靠的检测方法是十分必要的。常规检验方法非常耗时，完全依赖专业人员的症状观察、筛选培养基进行培养、育苗观察、血清学等鉴定以及广博的分类知识，而且其准确性与灵敏度难以满足要求[4-5]。现代分子生物学方法为种传病害检测提供了新的可靠途径，基于DNA检测的方法[如杂交探针、常规PCR、PCR-RFLP、巢式PCR、多重PCR、反转录PCR、荧光定量PCR、PCR-ELISA、in situ PCR、DNA 印迹、基因芯片以及RAPD（SCAR）、SSR、DNA条纹码等]快速简便实用，还能满足高通量和潜伏期检测的要求[5-8]。国际上已制定了61种种传病害不同的标准检测方法[5-8]，好几种常见黑穗（粉）病已建立了分子检测方法，如常规PCR检测玉米瘤黑粉病[9]、巢式PCR检测茭白黑粉病和甘蔗黑粉病[10-11]、DNA印迹和PCR检测与区分玉米丝黑穗病和瘤黑粉病[12]等种传病害，但对小麦散黑穗病的分子检测方面，尚未见对该病菌的种特异性强、灵敏度高的经济、简便、快速分子检测方法的报道。本文报道了利用普通PCR检测小麦散黑穗病的新方法。

1材料与方法

1.1供试材料

1.1.1主要仪器与设备移液枪（德国，eppendorf）；DYY-10型三恒多用电泳仪（北京六一仪器厂）；PCR基因扩增仪（美国，Bio-Rad）；超纯水制造系统（美国，MILLI-Q）；高速冷冻离心机（日本，日立公司）；凝胶成像分析系统（美国，科达公司）；紫外分光光度计U-3010（日立公司）。

1.1.2主要试剂主要化学与生物试剂购自宝生物工程（大连）有限公司与美国Sigma公司，扩增引物与杂交探针均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3供试菌种供试菌株见表1。小麦条锈菌由中国农业科学院植物保护研究所锈病组提供，其他菌系均由沈阳农业大学提供。

表1供试菌株名称和代号

病原菌1所致病害1菌系代号大麦散黑粉菌（Ustilago nuda）1小麦散黑穗病1XSH丝孢堆黑粉菌（Sporisorium reilianum）1玉米丝黑穗病1YSH小麦白粉菌（Blumeria graminis f.sp. tritici）1小麦白粉病1XBF葫芦科白粉菌（Erysiphe cucurbitacearum）1黄瓜白粉病1HBF条锈病菌（Puccinia striiformis f.sp. tritici）1小麦条锈病1XTX秆锈病菌（P. graminis f.sp. tritici）1小麦秆锈病1XGX细柄锈病（P. triticina）1小麥叶锈病1XYX禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）1小麦赤霉病1XCM小麦纹枯病菌（Rhizoctonia cerealis）1小麦纹枯病1XWK立枯丝核菌（Rh. solani）1玉米纹枯病1YWK

1.2试验方法

1.2.1菌种收集方法（1）小麦散黑穗病菌和玉米丝黑穗病菌的收集。用解剖针从样品或菌瘿中挑取单个冬孢子置于2%琼脂平板上，于20 ℃、12 h光照条件下培养15～20 d，显微镜下观察有无孢子萌发，将萌发孢子转移至PDA平板上，20 ℃培养15 d，收集菌丝，4 ℃保存备用。（2）小麦白粉病菌的收集。在实验室内，将保存的白粉病菌单菌落用抖落法接种到高感品种小麦穗上，培养7～14 d，待菌落长出，分生孢子大量繁殖时，在超净工作台上摇动花盆将其抖落到载玻片上，再用细毛笔将其刷进1.5 mL离心管中（可多次收集，每支管中达到30～50 mg孢子），将收集了孢子的离心管置于装有变色硅胶的干燥器中干燥3～5 d，-20 ℃保存备用。 （3）小麦秆锈病菌、小麦叶锈病菌的收集。将感病品种McNair701播种于花盆内，待幼苗长至2叶1心时剪取第1张叶，平展于铺有双层滤纸的培养皿内（叶背面朝上），培养皿中垫有浸过保鲜液的滤纸。用牙签沾上孢子，轻轻地向叶面涂抹，使叶面均匀地沾有1层孢子。接种后，用5×10-4Tween 20溶液进行喷雾，18 ℃ 黑暗条件下保湿6～18 h。18 ℃、8 000 lx光照 14 h/d，培养15 d左右，收集孢子，干燥，-20 ℃保存备用。（4）其他参考菌株的收集。将在PDA培养基上培养4 d的各菌株接入马铃薯液体培养基中，振荡培养（25 ℃，100 r/min） 4～7 d，用无菌纱布过滤，再用无菌水冲洗2次，用滤纸吸干多余水分，将菌丝体放入65 ℃恒温箱中干燥2～4 h，取出碾碎，装入 1.5 mL 离心管中，置于-20 ℃冰箱中保存备用[13]。

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1.2.2基因组DNA的提取小麦散黑穗菌、玉米丝黑穗菌、小麦赤霉病菌、小麦纹枯病菌、玉米纹枯菌等分离纯化后接种至PD培养基中培养，菌丝体经真空抽滤，采用Pascual等改良后的CTAB法[14]提取病菌DNA。小麦白粉菌、黄瓜白粉菌、小麦条锈菌、叶锈菌和秆锈菌的小种或菌株在温室用各自的高感品种繁殖，分别收取孢子，采用Enjalbert等玻璃珠破碎病菌细胞壁的CTAB法[15]提取DNA，其中几个特别环节分述如下：（1）小麦白粉菌DNA的提取。隔离条件下收集白粉菌至2 mL离心管中，将菌体重量按5 mL ∶1 g比例加入裂解缓冲液，加入3/10总体积的石英砂，盖紧，涡旋振荡5～ 8 min，65 ℃ 水浴10 min，加入600 μL 7.5 mol/L NH4Ac，冰浴 8 min；然后反复抽提，收集沉淀，加入1×TE，于-20 ℃保存。（2）黄瓜白粉病菌提取。参照王娜等的方法[16]，用手指轻弹染病的叶片，使病菌孢子及菌丝落在滴加缓冲液的载玻片上，在解剖镜下用针将孢子和菌丝压碎后转移至离心管，加入 10 μL Tween20，60 ℃水浴3 h后，12 000 r/min离心 5 min，取上清液，-20 ℃保存，待用。（3）小麦条锈病菌、小麦秆锈病菌、小麦叶锈病菌DNA的提取。称取小麦条锈菌、叶锈菌和秆锈菌孢子装于2 mL离心管中，加入玻璃珠及预热的0.8%CTAB提取缓冲液混匀，在涡旋仪上以最大速度振荡 3 min 后，于 65 ℃ 条件下水浴 1.5 h，然后反复抽提，收集沉淀，加入1×TE，于-20 ℃保存。（4）其他菌株DAN的提取。用液氮将病原菌快速研磨后转入事先装有500 μL提取缓冲液A的2 mL离心管中，混匀后加入50 μL 10%SDS，混匀，置于水浴锅 37 ℃ 1 h；再加入 75 mL 5 mol/L NaCl及65 μL 10%CTAB，再次混匀，置于 65 ℃ 水浴锅20 min；然后反复抽提，收集沉淀，加入1×TE，于-20 ℃保存。

1.2.3专化性引物的设计选用扩增ITS1、5.8S、ITS2核糖体基因的通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），专一扩增 rDNA 中的ITS1、5.8S、ITS2区域[17]。对得到的PCR产物，进行测序，用测序结果登录Genebank，与相关菌的ITS序列进行比对，选取小麦散黑穗病菌的特异DNA序列做特异的PCR引物（图1）。

1.2.4PCR扩增PCR反应体系（20 μL）：10×PCR buffer 2.0 μL；25 mmol/L MgCl2 1.5 μL；10 mmol/L dNTP 0.4 μL；引物（15 μmol/L） 各0.8 μL；Taq DNA聚合酶（5 U） 0.2 μL；DNA模板（1ng/ μL） 1.0 μL；ddH2O 14.1 μL。

PCR反应条件：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃延伸10 min。

1.2.5PCR产物电泳与染色观察PCR扩增完毕后，用 1×TBE 配制1%琼脂糖凝胶进行电泳，每孔加样5 μL，100 bp Ladder Marker为对照，电泳液为1×TBE。凝胶在 0.5 μg/mL 溴乙锭溶液染色20 min，凝胶成像分析系统照相。

1.2.6小麦散黑穗病菌PCR引物特异性检测用设计合成的特异性引物对所有供试菌株及小麦叶片的DNA进行PCR扩增，检测设计引物的特异性。

1.2.7小麦散黑穗病菌PCR引物灵敏性检测将提取的小麦散黑穗病菌的DNA稀释成1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg共7个不同浓度，用设计的引物进行PCR扩增，根据凝胶电泳结果测定引物的灵敏度。

2结果与分析

2.1小麦病害病原菌PCR引物设计结果

将小麦散黑穗病菌的ITS区域测序结果与Genebank中登录的相关菌的ITS序列进行比对，设计小麦散黑穗病菌的特异性引物，比对结果及特异性引物如图1所示，即设计出小麦散黑穗病菌的PCR的特异扩增引物对XSHF（5′-AGGAGAAAATCCTCGCGTCT-3′）/XSHR（5′-CAGAAGCACTCCAAACAGCA-3′）。F和R引物的序列长度均为20个碱基，很理想。

2.2小麦散黑穗病菌特异性检测

以设计的小麦散黑穗病菌特异性引物XSHF/R对所有供试菌株的DNA进行PCR扩增，只有小麦散黑穗病菌能扩增出533 bp左右的条带，其他供试非靶标参考菌株未扩增出条带，说明設计的引物对小麦散黑穗病菌具有特异性，结果见图1。

2.3小麦散黑穗病菌检测灵敏度测定

用引物XSHF/R对稀释成1 ng、100 pg、10 pg、1 pg、100 fg、10 fg、1 fg共7个不同浓度的小麦散黑穗病菌DNA进行PCR扩增，结果可以检测到最低含量为1 pg的DNA（图2）。

3结论与讨论

小麦散黑穗病是小麦常见的典型种传病害，带菌种子的病菌来源于生长季小麦扬花时，其他病穗上的冬孢子经风雨传给健康的花柱头，孢子萌发侵入子房，再以休眠菌丝潜伏在胚内。种子萌发时，病菌被激活生长且始终位于植株顶端和穗原基，直到抽穗，显露最易识别的症状：薄膜包裹的冬孢子团（病穗）[18-19]。带菌种子或植株与无菌种子或植株外观均无可诊断的差异，因此，是否需要进行化学药剂拌种等防治处理的决策需要以带菌率检测作为科学依据。快速、简便、准确、可靠的检测方法是实现这一目标的可靠保证。本研究利用真菌通用引物[18]，对小麦散黑穗病菌的ITS区域序列进行PCR扩增、测序、Genbank搜索，用其他9个相近病菌作参照，通过软件分析比对，设计了长度为20个碱基的该病菌的特异性引物XSHF（5′-AGGAGAAA ATCCTCGCGTCT-3′）/ XSHR（5′-CAGAAGCACTCCAAACAGCA-3′），能在Ustilago属内种的水平特异性上检测小麦散黑穗病菌，对小麦散黑穗病菌的检测限为1 pg。该方法快速、准确、灵敏，为实现该病种子带菌率检测提供了关键技术支撑。

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PCR法检测 篇10

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2013年1月-2015年12月在我中心体检的体检者750例作为检测对象, 其中男420例, 女330例;年龄30~52 (38.1±6.23) 岁。

1.2 酶联免疫吸附试验 (ELISA) 检测方法

使用仪器:MK3全自动酶标仪, MK3全自动洗板机, 移液器 (上海热电仪器有限公司生产) , 生物安全柜 (苏州净化设备有限公司生产) 。试剂生产厂家:上海科华生物制药有限公司, 所有试剂均批批检合格且有效期内使用。操作方法:首先在酶标孔内加入100μl样品稀释液, 阳性及阴性对照空不加, 分别在相应的酶标空内加入10μl样品, 设置2空阳性对照孔, 3空阴性对照孔, 每空加入100μl阳性或阴性对照, 加样完成后封板37℃温育60min, 用MK3全自动洗板机洗板5次, 然后每空加入酶结合物100μl, 再次封板37℃温育30min, 然后用MK3全自动洗板机洗板5次, 每空加入底物缓冲液50μl及底物液50μl, 混匀后再次封板37℃温育30min, 每空加入终止液50μl, 选择酶标仪450/630波长测量结果, 按照试剂说明书判断结果。

1.3 荧光定量PCR检测方法

使用仪器:PCR仪器:PTC200GAJF, 提取仪器:西安天隆科技有限公司。试剂厂家:艾康生物技术有限公司。操作方法:首先使用天隆全自动提取仪进行核酸提取, 提取后使用荧光定量PCR仪进行定量检测, 检测参数的设置及结果判断严格按照试剂说明书进行。

1.4 质量控制

ELISA检测方法及荧光定量PCR检测方法均加入阳性及阴性对照进行质量控制。

1.5 统计学方法

应用SPSS 16.0统计软件进行数据处理。计数资料以率 (%) 表示, 组间比较采用χ2检验, P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

本组750例体检者中ELISA法检出阳性21例, 阳性率为2.80%, PCR法检出阳性40例, 阳性率为5.33%, 两种检测方法检测结果比较差异有统计学意义 (χ2=6.170, P<0.05) 。

3 讨论

丙型肝炎主要是因机体受到丙型肝炎病毒入侵而引起的一种血液传播性传染病, 目前在世界范围内广泛流行, 普通人群均易感, 感染年龄也无大小之分, 各个年龄阶段均可感染[4]。近年来丙型肝炎在我国的流行趋势也越来越严重, 其中多数会引发严重肝炎, 如果在感染初期不能得到及时有效的治疗, 多数患者会转变为慢性丙型肝炎患者, 丙型肝炎病毒感染的一个重要特点就是慢性转化率很高, 随着病程的延迟, 患者的肝脏组织会出现不同程度的病变, 并且随着时间的推移而进行性加重, 再严重的患者则会出现原发性肝癌, 给患者造成严重的经济及心理负担[5]。丙型肝炎的传播途径多为血液传播, 其次为母婴及性传播, 以前丙型肝炎多在吸毒等特殊人群中传播, 目前已经有向一般人群流行的趋势, 需引起医学界的重视。因此对丙型肝炎进行早发现、早诊断、早治疗是控制病情恶化的主要措施, 丙型肝炎仅依据临床症状很难作出正确的诊断, 因此必须要结合实验室检测结果综合判断[6]。ELISA用于丙型肝炎抗体的检测, 是当前各家实验室较为常用的检测方法, 该方法具有较高的敏感性和特异性, 基本可作出正确的判断。其操作方法主要为患者血清中的抗-HCV, 血清丙型肝炎抗体通过与酶标孔上已经包被好的抗原相结合, 然后与酶标记物相结合, 最后加入底物显色, 加入终止液后使用酶标仪测量吸光度, 通过吸光度值进行结果判断[7]。荧光定量PCR是一种近年来出现的新型检测方法, 其检测原理主要为选用丙型肝炎病毒保守基因片段设计特异引物及特异Tapman探针, 该探针能与引物扩增区域中间的一段c DNA模板特异性结合。在PCR延伸反应过程中, Taq酶的外切酶活性将5’端荧光基团从探针上切割下来, 从而脱离3’端光淬灭基因的屏蔽, 能接受光而发出可供仪器检测的荧光, 从而在全封闭反应体系中对丙肝病毒核酸的自动化检测。该检测方法具有高度敏感性及特异性[8]。本结果显示, ELISA法检出阳性率低于荧光定量PCR法, 说明使用荧光定量PCR检测丙型肝炎感染情况, 检测结果明显优于传统的ELISA法。在临床检测中, ELISA法检出的结果, 有时需采用确诊实验确定患者的感染情况, 对感染的程度也不能作出明确的判断[9,10]。荧光定量PCR检测技术是表示传染性及复制病毒最可靠指标, 是显示丙肝感染状态及治疗效果的重要指标, 不但可判断患者是否感染丙型肝炎病毒, 同时还可跟踪患者的治疗效果。因此, 荧光定量PCR检测方法用于检测丙型肝炎病毒感染准确可靠, 可在临床检测中推广使用。

摘要：目的 分析酶联免疫吸附试验法和荧光定量PCR检测患者感染丙型肝炎病毒的情况, 以期为丙型肝炎病毒的检测寻找更为合理有效的检测方法。方法 选择2013年1月-2015年12月在该中心体检的体检者750例作为检测对象, 分别采用酶联免疫吸附试验 (ELISA) 和荧光定量PCR进行检测, 统计分析检测结果。结果 ELISA法检出阳性21例, 阳性率为2.80%, PCR法检出阳性40例, 阳性率为5.33%, 两种检测方法检测结果比较差异有统计学意义 (χ2=6.170, P<0.05) 。结论 荧光定量PCR检测方法用于检测丙型肝炎病毒感染准确可靠, 可在临床检测中推广使用。

关键词：丙型肝炎,荧光定量PCR,抗-HCV,结果分析

参考文献

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