动物组织中氯丙嗪残留的检测-HPLC法

动物组织中氯丙嗪残留的检测-HPLC法（共3篇）

动物组织中氯丙嗪残留的检测-HPLC法 篇1

动物组织中氯丙嗪残留的检测-HPLC法

氯丙嗪是吩噻嗪类代表药物,为中枢多巴胺受体的阻断剂,作用于中枢神经系统,常被用作催眠、镇静剂,在运输过程中使用可以明显减少动物的死亡率.这种药主要在肝脏代谢,易产生药物残留,对人们的身体健康造成很大影响.

作 者：董小海 胡京枝 赵光华  作者单位：河南省农科院农业质量标准与检测技术研究中心,郑州,450002 刊 名：农业质量标准 英文刊名：AGRICULTURAL QUALITY & STANDARDS 年，卷(期)： “”(1) 分类号：Q95 关键词： 

动物组织中氯丙嗪残留的检测-HPLC法 篇2

1 样品的处理

SAs一般为白色或黄色结晶粉末, 无臭, 基本无味。具有芳伯氨基和磺酰胺基, 呈酸碱两性。样品提取时, 为获得满意的回收率, 水相的pH值调节非常关键。主要采取液液萃取或固相萃取方法对磺胺类药物进行净化。

动物组织样品处理的一般过程:用乙腈提取并冷冻离心以去除蛋白, 乙腈提取液用正己烷液液萃取去除部分脂肪, 提取液旋转蒸发浓缩。残渣用正己烷和三氯甲醇混合液溶解, 溶液用于硅胶固相萃取净化[1], 具体见图1。

样品前处理是兽药残留分析中的关键步骤, 直接影响检测结果。近年来, 出现了一些新的样品前处理技术, 在磺胺类药物残留分析上也有应用, 见表1。这些技术能够有效地减少分析过程中由样品前处理过程带来的误差, 具有前处理快速、简便的优点, 同时可与分析仪器联用, 实现分析的自动化。

2 流动相选择

2.1 分离度

在高效液相色谱分析中, 流动相的正确选择对改善分离效果有重要的辅助效应。当进行色谱分析时, 样品中2个相邻组分 (1, 2) 的分离度 (R) 可按下式计算:undefined。

式中:n2为以第2组分计算的色谱柱的理论塔板数;α2/1为2个相邻组分的调整保留值之比, 称为分离因子;k2′为第2组分的容量因子。

选择洗脱强度适当的溶剂, 可使被分析样品中组分的容量因子 (k′值) 保持在最佳 (1～10) 。对含多组分的样品, k′值可扩展到0.5～20.0之间。在洗脱强度适当、样品组分k′值保持最佳的溶剂当中, 还要进一步选择能将样品中不同组分分离开且能使每2个相邻组分的分离因子α2/1大于1.05, 以获得具有满意分离度的分析结果。

2.2 溶剂的极性参数

在反相键合色谱中, 溶剂的洗脱强度可以参考溶剂的极性参数 (P′) , P′又被称作极性指数, 它是由Snyder使用Rohrschneider的溶解度数据推导出来的, 它表示每种溶剂与乙醇 (e) 、对二氧六环 (d) 和硝基甲烷 (n) 这3种极性物质的量度, 并将Rohrschneider提供的极性分配系数 (Kg″) 以对数形式表示而导出, P′=lg (Kg″) e+lg (Kg″) d+lg (Kg″) n。

Snyder规定了每种溶剂的选择性参数为:xe=lg (Kg″) /P′;xd=lg (Kg″) /P′;xn=lg (Kg″) /P′。xe反映了溶剂作为质子接受体的能力;xd反映了溶剂作为质子给予体的能力;xn反映了溶剂作为强偶极子之间相互作用的能力。对于多元混合溶剂极性参数P′mix值可以按下式计算:undefined。式中:P′mix为多元混合溶液的极性参数, φi和Pi′分别为每种纯溶液的体积分数和极性参数。

对于反相色谱, k′与P′的关系如下:undefined。

当流动相的P′变化2倍时, 溶质的k′值约变化10倍。

2.3 磺胺类药物的分离流动相选择性

有文献报道, 磺胺类药物常用的流动相为水-乙腈 (75∶25) , 流动相的极性参数P′为9.1, 与水-甲醇 (70∶30) 、水-四氢呋喃 (83∶17) 都具有相同的极性参数。在使用二元混合溶剂时, 为改善分离选择性可在保持极性参数不变的情况下, 换用不同的极性溶剂。如不存在特殊的分子间相互作用, 对于同一种溶质, 用上述3种二元混合溶剂流动相洗脱, 可获得相同的保留时间。在反相色谱中, 溶质k′值的对数与流动相中所含的有机相的体积分数 (φ) 之间有一个近似的线性关系, 即Snyder公式:lgk′=lgk′w-Sφ。

式中:k′为容量因子, φ为流动相中有机相体积分数, S为经验常数 (通常为3～5) , k′w是φ为零时的k′值。当流动相中改性剂 (乙腈、甲醇、四氢呋喃) 部分改变10%, 则溶质的k′值变化2倍, 溶质保留时间 (tR) 将变化3倍。

项智锋等[10]研究了10%、15%、20%、25%、30%乙腈等不同的有机相比例对磺胺类药物的分离效果, 结果见表3。如使用甲醇作为有机相时, 必须添加到40%～50%的比例方可达到和25%乙腈相似的滞留时间。

可以用溶剂选择三角形法选择多元溶剂。用3种二元混合溶剂流动相组成溶剂作为选择三角形ΔABC的3个顶点 (A、B、C) , 见图2。

①为AB边的中点, 其溶剂组成为乙腈-甲醇-水 (12.5∶15∶72.5) ;②为三角形的中心, 其溶剂组成为乙腈-甲醇-四氢呋喃-水 (8.3∶9.9∶5.6∶76.2) 。在溶剂三角形ΔABC上的任何一点, 都对应一种具有确定组成的混合溶剂流动相, 而每种流动相都可对一个确定的分析任务提供一个特定的分离选择性, 即 α2/1。

2.4 磺胺类药物的离子抑制法

磺胺类药物N1上的氢有一定的酸性, 因此常向流动相中加入1%的甲酸 (或乙酸、磷酸、磷酸二氢钾) 抑制磺胺的离子化, 获得对称色谱峰。项智锋等[10]比较了pH值为3.0, 4.0, 5.0, 6.0, 7.0时的流动相的吸收强度及滞留时间。结果显示, 不同pH值样品的吸收强度差异不大, 而滞留时间之间的差异皆在0.01 s内。在磺胺类药物分析中, 大多文献都采用pH值=5.0作为流动相的酸碱度。

2.5 磺胺类药物梯度洗脱

样品含有多组分时, 其k′值的分布范围很宽, 可以进行梯度洗脱。在梯度洗脱中, 用undefined代替等度洗脱中的k′值。在梯度洗脱中, undefined值与梯度系统条件的关系如下:undefined。

式中:tG为梯度洗脱时间 (min) ;F为流动相流速 (mL/min) ;Vm为色谱柱死体积 (mL) ;△φ为梯度洗脱过程流动相有机溶剂体积百分数变化量;S为等度洗脱Snyder公式中的斜率。若undefined值在1～10范围内, tG的最佳梯度洗脱时间是28.75 min。方炳虎等[11]用流动相乙腈 (A) -0.02 mol/L磷酸 (B) 梯度洗脱0～28 min, A从12% (φ) 等度增至28% (φ) , 保留5 min, 成功分离了12种磺胺类药物。

2.6 磺胺类药物超高效液相色谱分析

超高效液相色谱 (UPLC) 的分析速度是HPLC的5～9倍, 检测灵敏度是HPLC的3倍 (分离度相同) , 分离度是1.7倍。郭萌萌等人采用超高效液相色谱—二极管阵列检测器 (PDA) , 建立了水产品中17种磺胺类抗生素残留的快速同时检测技术。17种磺胺在8 min内实现同时分离测定, 该方法快速、灵敏、高效, 适用于水产品中多种磺胺类抗生素的同时测定。

2.7 质谱检测器流动相的选择

将现有的HPLC方法应用于电喷雾离子化 (ESI) 接口时, 需要用挥发性缓冲剂代替非挥发性缓冲剂。离子强度是重要参数。用挥发性酸碱等代替不挥发性酸碱, 通常保持pH值不变。大多数反向色谱流动相与色谱/电喷雾质谱 (LC/ESIMS) 相匹配。

3 常用的检测器

紫外检测器是高效液相色谱仪中使用最广泛的一种检测器, 它分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测器3种类型。可变波长检测器的灵敏度高于二级管阵列检测器。二级管阵列检测器可以提供全紫外图谱, 有一定的鉴别意义, 可以判断是否存在干扰。磺胺类药物有微弱的荧光, 可以通过柱前或柱后衍生化, 使用荧光检测可提高选择性和敏感性, 但增加了操作的复杂性。

与高效液相色谱相连用于兽药残留检测的质谱检查器主要是单级四级杆质谱仪 (QMS) 或三重串联四级杆质谱仪 (TQMS) 。前者没有MS/MS功能, 但用源内碰撞诱导的解离 (CID) 技术也具有离子诱导裂解的“准MS/MS”功能。TQMS具有MS/MS功能, 可以使用反应监测 (SRM) , 以提高选择性及定量分析检测限。

4 小结

4.1 在线的样品处理技术

新的样品处理可以摒弃使用大量有机溶剂, 减少环境污染。简化操作流程, 直接进样, 提高工作效率。样品处理仪器与高效液相色谱直接相连, 实现样品的在线处理[4]。

4.2 超高效液相色谱

超高效液相色谱的使用进一步缩短了分析时间, 可同时检测更多磺胺类药物。

4.3 质谱检测器

质谱检测器的应用极大地提高了磺胺类药物的定性及定量检测限。液相色谱质谱 (LC-MS/MS) 已经成为磺胺类药物的确证技术。

磺胺类药物残留的检测发展方向将是样品的在线处理仪、超高效液相色谱和质谱检测仪三者的联用。

参考文献

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动物组织中氯丙嗪残留的检测-HPLC法 篇3

关键词：氯霉素 高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS） 养殖用水 内标法

中图分类号：S948 文献标识码：A 文章编号：1672-5336（2015）06-0000-00

氯霉素（chloramphenicol，CAP）是一种有效的广谱抗菌素，曾广泛的应用于畜牧、水产养殖。但是氯霉素能抑制人体骨髓造血功能，引起人类的再生障碍性贫血，白血病、过敏性变态反应等严重疾病，低浓度的药物残留还会诱发致病菌的耐药性[1-3]。因此，氯霉素在许多国家被禁止在食品性动物中使用。我国在农业行业标准《无公害食品 渔用药物使用准则》（NY5071-2002）和《无公害食品 畜禽饲养兽药使用准则》（NY 5030-2006）[4-5]中也已将氯霉素列为禁用药物。但是由于氯霉素具有价廉、高效、用量少的特点，氯霉素仍然存在非法使用和误用的可能。因此有必要建立养殖生产过程中氯霉素的有效检测方法，严控违禁药物的使用，确保养殖生产过程的无害化。

目前氯霉素的检测方法主要集中在动物源性食品的检测[6-8]，因为水体和养殖产品的样品性质、制备以及取样量存在较大差异，所需检测方法也有所不同。本研究建立了养殖用水中氯霉素的高效液相色谱-电喷雾串联质谱检测方法，该方法具有快速高效、灵敏度高的优点，可应用于养殖用水中的氯霉素残留监测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

高效液相色谱（美国Agilent公司，1200系列），三重四极杆质谱仪（美国Agilent公司，6410系列），漩涡振荡器（德国IKA公司，MS2系列），旋转蒸发仪（德国IKA公司，RV 10 Basic V系列），纯水机（美国Millipore公司，Milli-Q系列）。甲醇（HPLC级）、乙腈（HPLC级），购于Honeywell公司；氯化钠、乙酸铵均为AR级，购于广州化学试剂厂。标准品氯霉素（CAP）、氘代氯霉素（CAP-d5），购自美国Sigma-Aldrich公司。

1.2 标准工作曲线配制

准确称取0.0500 g氯霉素标准品，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成1 g/L的标准贮备液。于-20 ℃下保存。实验时，根据需要配成适当浓度的标准工作液，于4 ℃下保存，当天使用。准确称取0.0500 g氘代氯霉素标准品，用甲醇溶解并定容至50 mL，配成1 g/L的标准贮备液。于-20 ℃下保存。用甲醇稀释至10 mg/L，作为标准内标工作液使用。

1.3 仪器工作参数

（1）色谱条件；Agilent Eclipse C18液相色谱柱（4.6× 50mm，3.5 μm）。流动相：5 mmol/L 乙酸铵：甲醇（4+6）。流速：0.5 mL/min。进样量：10 μL。（2）质谱条件；电喷雾负电离源（ESI-）；离子雾化源温度350℃；气流速10L/min；雾化器压力40 psi；喷雾电压4000V；扫描模式：多重反应监测（Multiple Reaction Monitor，MRM）。优化后的检测条件见表1。

1.4 测定步骤

（1）样品保存与处理；水样经砂芯漏斗过滤除去固体悬浮物，于冰箱4℃下贮存备用。（2）提取；量取100.0mL水样，置于250 mL分液漏斗中，加入50μL标准内标工作液。加入5g氯化钠，振摇；再加入30mL乙酸乙酯，振摇1 min，静置分层，取上层乙酸乙酯于100 mL梨形瓶中。再加入20 mL乙酸乙酯重复提取一次，合并乙酸乙酯提取液，于旋转蒸发仪50℃水浴下减压浓缩至近干，加入1.0 mL5%甲醇水溶液，涡旋30s，过0.2μm滤膜后，供液相色谱-串联质谱测定。

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

根据氯霉素的分子结构和理化性质，选择ESI为离子源。因为氯霉素具有较强的电负性，适合使用ESI负离子模式监测。使用流动注射进样方式对氯霉素及其同位素内标物CAP-d5的母离子进行扫描，得到其准分子离子峰为321.1和326.2，以适当的碰撞能量对准分子离子峰扫描，选择响应最强的子离子作为定量离子，选择响应相对较强的子离子作为定性离子。选择MRM扫描模式对母离子与子离子进行裂解电压和碰撞能量的优化，优化后的参数见表1。

2.2 色谱条件的优化

比较了乙腈和甲醇作为有机相，结果发现使用甲醇比使用乙腈的基线稳定。因为氯霉素在负离子模式下检测，因此LC-MS/MS常用的甲酸并不适合添加，而实验中加入适量的乙酸铵可以促进电离和改善峰形。最终实验选择甲醇和5 mmol/L乙酸铵混合溶液作为流动相。氯霉素与氯霉素-d5在多重反应监测下的特征离子图质量色谱图见图1。

图1 5.0 μg/L氯霉素与氯霉素-d5在多重反应监测下的特征离子图质量色谱图

2.3 方法的线性关系与检出限

养殖水中溶解的有机质可能导致LC-MS/MS信号的增强或者减弱，从而影响结果的准确性和可靠性。因此，选择在水样中添加氯霉素的同位素化合物CAP-d5作为内标物，有效的避免了不同水体中的基质效应，提高检测结果的准确性。配制0.5 、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0 μg/L的氯霉素标准溶液，并加入氯霉素-d5内标工作液，使每毫升标准工作溶液中含有混合氘代同位素内标5.0 ng。按上述条件进行HPLC-MS/MS分析，得到氯霉素的线性方程为y=1135.96x+307.47，相关系数R2为09994。氯霉素在0.5～20.0 μg/L浓度范围具有良好线性关系，见图2所示。在空白水样中添加氯霉素标准溶液，以3倍和10倍信噪比（S/N）对应的加标浓度算得方法检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为0.002 μg/L和0.005 μg/L。

图2 氯霉素标准曲线

2.4 回收率与精密度

在不含氯霉素的水样中，分别添加0.02、0.05和0.20 μg/L浓度水平的氯霉素标准溶液，按上述实验方法，每一添加水平平行测定5次，测得0.02～0.20 μg/L添加水平范围的加标回收率结果见表2。

3 结语

本研究建立了养殖用水中氯霉素的LC-MS/MS同位素内标法检测方法，该方法具有快速简单、检出限低、重现性好等特点，适合于养殖用水中氯霉素残留量的快速准确分析。

参考文献

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收稿日期：2015-03-09

基金项目：广东省科技厅省级科技计划项目（2013B040400002）

作者简介：许均图（1989—），男，广东茂名，本科，毕业于中山大学，研究方向：农产品中兽药残留检测方法研究。E-mail：582625732@qq.com