荧光PCR定量检测法（精选10篇）
荧光PCR定量检测法 篇1
锦鲤疱疹病毒病是由锦鲤疱疹病毒(Kio Hepesvirus,KHV)引起的一种传染性疾病,目前的研究表明,该病毒仅感染鲤和锦鲤,且各年龄段的锦鲤和鲤鱼均可感染,死亡率高达80%~100%[1]。此病首先在以色列暴发,接着美国、欧洲一些国家,如英国、德国、比利时,亚洲一些国家均有此病的暴发,给锦鲤和鲤鱼养殖业造成重大经济损失[2]。
该病的主要临床症状是精神沉郁,食欲废绝;行为上无方向感的游泳,甚至停止游泳;皮肤上出现苍白的块斑和水泡;鳍、鳞片、口腔、腹部出血或充血;患病鱼出现症状后1~2 d内死亡。
该病毒适合培养温度为21℃,只对锦鲤鳍细胞系敏感,产生细胞病变。目前国内有效的监测和诊断方法不多,主要用聚合酶链式反应(PCR)方法。PCR方法和细胞培养技术是OIE推荐的KHV诊断方法。目前,很多流行病的诊断都采用一种新技术——荧光定量PCR方法,该方法以其敏感性、特异性高,污染少,可定量等优点逐渐成为实验室和临床诊断中的主要方法。本研究利用锦鲤疱疹病毒VR52标准株建立荧光定量PCR(Flurogenic Quantitative Polymerase Chain Reaction,FQ-PCR)方法,利用一对特异性引物和探针建立一种特异的实时定量PCR方法,以期为KHV感染提供快速、特异的诊断方法。
1 材料和方法
1.1 毒株
KHV标准毒株VR52购自ATCC R公司。鲤春病毒血症病毒(SVCV),传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(IHNV)阳性质粒由深圳出入境检验检疫局馈赠。
1.2 试剂和仪器
组织基因组DNA提取试剂盒(DV811A),Taq DNA聚合酶,PCR反应试剂盒,质粒提取试剂盒,PMD-18T Vector,Takara Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0,Takara Mini BEST Plasmid Purification Kit Ver.2.0,DNA分子量Marker,DNAgreen,焦磷酸二乙酯(DEPC)均购自宝生物工程(大连)有限公司,其他试剂均为国产或进口分装。核酸蛋白分析仪Gene.specv为Hitachi Naka Instruments Co.Ltd公司产品。荧光PCR仪ABI7000 Sequence Detection Systems为ABI公司、普通PCR仪PTC-200 Peltien Thermal Cycler为MJ Research公司产品。凝胶成像仪Gel Doc TMXR为BIO-RED公司产品,高速冷冻离心机3K30为德国SIGMA公司。
1.3 FQ-PCR标准品的制备
1.3.1 引物的设计与合成
根据Gen Bank上公布的AB375391 KHV胸苷激酶(TK)基因的保守序列,利用Premier5.0引物设计软件设计两条引物,送上海生工合成。引物序列如下:
上游引物TK1为:5′-GGGTTACCTGTACGAG-3′下游引物TK2为:5′-CACCCAGTAGATTATGC-3′
1.3.2 TK基因的扩增
将KHV标准毒VR52接种KF细胞,待出现细胞病变收获细胞毒。用组织基因组DNA提取试剂盒提取细胞毒的核酸,做为扩增的模板。提取过程按照说明书进行操作。PCR扩增体系如下:25 L的体系,DNA模板3 L,10×Ex Taq buffer 2.5 L,d NTP(2.5 m M)2.5 L,引物TK11 L(10 p M),引物TK21 L(10 p M),Taq酶(5U/L)0.2 L,DEPC处理水补到25 L。反应条件为94℃5 min;95℃1 min,52℃1 min,72℃1 min,40个循环;72℃10 min;4℃保温。扩增片段大小为409 bp,以1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增效果。
1.3.3 TK基因的克隆与鉴定
利用DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒将TK基因PCR扩增产物回收(具体操作见试剂盒说明书),将回收的产物与PMD-18T Vector连接16 h。连接体系:PMD-18T Vector 1 L,PCR产物1 L,DEPC处理水3 L,连接液5 L。将连接产物转化到DH5感受态细胞,加入IPTG和X-Gal,涂在Amp+琼脂平板上,次日挑取4个白色单个菌落,分别进行PCR鉴定。将阳性克隆菌落接种到Amp+LB液体培养基中,37℃摇床过夜,利用质粒小量提取试剂盒提取质粒,以1%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.3.4 质粒标准品浓度的计算
将上述质粒用核酸蛋白分析仪测定260 nm与280 nm波长下的OD值,判断其纯度(OD260nm/OD280nm>1.8者为纯品),然后按照下面的公式转换成质粒的拷贝数:每微升质粒拷贝数=(质量/分子量)×(6.02×1023)=[质粒浓度(ng/L)×1 L]×10-9/[(载体分子量+插入片段分子量)×660]×(6.02×1023个/mol),其中:6.02×1023是阿佛加德罗常数;660是每个碱基的平均分子量;重组质粒的总长度为3101bp。标准品作10倍梯度稀释,–20℃保存备用。
1.4 实时荧光定量PCR检测方法的建立
1.4.1 引物和Taq Man探针的设计与合成
以1.3中PCR扩增的片段为模板,利用Beacon Designer 5.0软件设计了1对特异引物和Taq Man探针,引物和探针均由大连宝生物有限公司合成,探针的5′端用荧光基团FAM标记,3′端用淬灭基团TAMRA标记。引物及其Taq Man探针序列见表1。扩增长度为116bp。
1.4.2 荧光定量PCR反应体系及条件
反应体系:25 L的总体系,DNA模板5 L,10×Ex Taq buffer 2.5 L,d NTP(2.5 m M)2.5 L,上游引物1 L(10 p M),下游引物1 L(10 p M),探针0.8 L(10 p M),Taq酶(5 U/L)1 L,DEPC处理水补到25 L。置荧光定量PCR仪中,反应条件为94℃3 min;94℃15 s,60℃30 s,72℃1 min,5个循环;94℃10 s,60℃40 s,40个循环,收集荧光信号。用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用量。
1.4.3 标准曲线的制备
将KHV标准品质粒做10倍系列稀释,采用优化好的条件进行实时荧光定量PCR。根据质粒拷贝数和对应的Ct值,利用SDS1.2分析软件得到标准曲线。
1.4.4 FQ-PCR特异性试验
用建立的荧光定量PCR反应体系同时检测鲤春病毒血症病毒(SVCV),传染性造血器官坏死病毒(IHNV)和病毒性出血性败血症病毒(IHNV)阳性质粒,检测KHV引物和探针的特异性。
1.4.5 FQ-PCR重复性试验
对FQ-PCR模板进行10倍系列稀释,并做2组平行样,检测其重复性。
2 结果
2.1 KHV TK基因特异性片段的扩增
目的片段大小为409 bp,经1%琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。
2.2 KHV标准阳性质粒的构建与鉴定
将目的片段与PMD-18T Vector连接,转化到大肠杆菌DH5,经过Amp+的琼脂平板的培养,挑取阳性克隆菌,提取质粒,并测序。经0.8%琼脂糖凝胶电泳,质粒大小为3 101 bp,结果如图2所示。测序结果显示,质粒中含有目的片段。以质粒为模板,进行常规PCR鉴定,扩增出409 bp的目的片段,如图3所示,说明质粒构建成功,取2号管对应的质粒做标准品,用于荧光定量PCR方法的建立。
2.3 重组质粒浓度的测定
提取的质粒经核酸蛋白分析仪测定,其质量浓度为32.85 g/m L,OD260nm/OD280nm比值为1.825,符合纯度要求。根据每个阳性质粒含3101bp,所提质粒DNA溶液浓度可换算为1.6×1010个拷贝/L。
2.4 引物和探针最佳使用浓度的确定
以相同浓度的阳性核酸为模板,选用不同浓度范围的引物和探针,采用矩阵法筛选引物和探针的最佳使用浓度。在模板量相同的情况下,以循环阈值(Ct值)最小,荧光强度增加值(Rn)最大,若两者不一致,优先以Ct值为准,矩阵法优选后,引物和探针的最佳浓度分别为0.4 p M和0.32 p M。
2.5 FQ-PCR标准曲线的建立和回归方程的确定
对标准阳性质粒10倍系列稀释,以优化的条件进行Taq Man FQ-PCR扩增。利用SDS1.2分析软件,以Ct值为纵坐标,质粒DNA拷贝数的对数为横坐标,获得一条标准曲线,如图4所示。可见,在1.6×10~1.6×105拷贝之间,测得的数值基本在一条直线上,与Ct值有良好的相关性,相关系数R2=0.992,说明各个浓度组相关性非常好,可以对病毒进行可靠的定量检测,此阳性质粒可作为FQ-PCR的标准品。质粒在稀释到10-9仍能检测到荧光信号,对应16个拷贝数,该方法检测的灵敏度为16个病毒拷贝数,灵敏度较高。图中,标准曲线的斜率为-3.09,截距为20.96,可以得出拷贝数N与Ct值之间的线性关系表达式即回归方程:Ct=-3.09Ig N+20.96。待测样品的Ct值可直接从仪器中读取,通过回归方程,可确定样品中核酸的含量。
2.6 FQ-PCR重复性试验
将KHV核酸做梯度稀释,做两组重复样,结果如图5所示,重复样Ct值之间相差0.1左右,重复性较好。
2.7 FQ-PCR特异性实验
分别对IHNV、SVCV、IHNV、KHV阳性质粒,用建立好的KHV FQ-PCR的反应体系,进行扩增。如图6所示,只有KHV有扩增曲线,呈现出良好的特异性。
3 讨论
目前对锦鲤疱疹病毒病的诊断方法主要有Soliman等[3]、Gunimaladevi等[4]报道采用LAMP法能高度灵敏、快速、省力的检测出KHV病毒;乌日琴等[5]、刘荭等[6]也初步建立了快速、灵敏和操作简便的KHV病毒的PCR检测方法。这些方法只能作为定性分析的手段。而本文建立的FQ-PCR不仅具有普通PCR的高灵敏性,而且由于荧光探针的使用,可以通过光电传导系统直接探测PCR扩增过程中荧光信号的变化以获得定量结果,所以还具有DNA杂交的高特异性、光谱技术的高精确性和实时监测的特点;FQ-PCR克服了常规PCR的许多缺点,如普通PCR需要琼脂糖凝胶电泳来观察结果,费时费力,并且紫外线和溴化乙锭对人体又有害,这些复杂的过程增加了假阳性的机会,FQ-PCR具有扩增与自动分析一体化,缩短了检测时间。本文建立的FQ-PCR检测方法,具有高灵敏性、高特异性、操作时间短,可做为KHV检测首选的方法。
本文FQ-PCR标准品的构建是荧光定量PCR方法建立的基础,本文选用6个稀释度的标准阳性质粒模板,建立的标准曲线,相关系数为0.992,表明拷贝数与Ct值相关性良好,本试验最低可检出16个病毒拷贝,说明灵敏度较高。因此本研究构建的检测KHV的标准品可用于FQ-PCR检测。
由于FQ-PCR可定量检测病毒数量的特点,可做为判断病毒在体内定植规律、复制水平和用药后病毒是否被清除、新药的药效学等方面研究提供有力的参考,有很好的应用前景和研究价值。
参考文献
[1]Gilad O,Yun S,Andree B.,Initial characteristics of kio herpesvirus and development of a polymerase chain reaction assay to detect the virus in kio,Cyprinus carpio kio.Dis Aqua Org,2002,48(2):101~108.
[2]张立峰,刘晶,苏世敏.一种新发现的鱼类病毒KHV在国外的流行和研究现状[J].中国动物检疫,2003,20(2):41~43.
[3]Soliman H,El-Matbouli M.An inexpensive and rapid diagnostic method of Koi Herpesvirus(KHV)infection by loop-mediated isothermal amplifi cation[J].J Virol,2005,17(2):83.
[4]Gunimaladevi I,Kono T,Venugopal M N,et al.Detection of koi herpesvirus in common carp,Cyprinus carpio L.,by loop-mediated isothermal amplification[J].J Fish Dis,2004,27(10):583~589.
[5]乌日琴,刘中勇,黄宝春.PCR方法快速检测锦鲤疱疹病毒基因[J].检验检疫科学,2005,15(2):6~8.
[6]刘荭,史秀杰,高隆英,等.进口锦鲤暴发病病原的nested-PCR鉴定[J].华中农业大学学报,2002,21(5):414~418.吉
荧光PCR定量检测法 篇2
目的:建立一种快速、定量、特异、灵敏的PCR方法用于对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的`早期诊断和疫情监测.方法:根据GenBank登录的IHHNV毒株序列,使用生物学软件进行序列比对,在IHHNV保守区序列设计特异性引物与Taqman探针.对实时荧光定量PCR反应条件进行优化以缩短检测时间,提高特异性、灵敏度、重复性,并与普通PCR进行盲样测试的比对.结果:本法线性范围5×102～5×107拷贝/ml,检出限5×101拷贝/ml,灵敏度超过普通PCR100倍,特异性高于普通PCR,重复性极好(S=0.035～0.39,CV=0.13%～1.05%),检测时间为普通PCR的1/5,现场盲样IHHNV检出阳性率高于普通PCR 26.00%.结论:本研究建立Taqman实时荧光定量PCR用于对虾IHHNV检测具有特异、灵敏、快速、定量、重复性好等优点.
作 者：王忠发 王建跃 卢亦愚 何伟贤 王学海 Wang Zhong-fa Wang Jian-yue Lu Yi-yu He Wei-xian Wang Xue-hai 作者单位：王忠发,王建跃,何伟贤,Wang Zhong-fa,Wang Jian-yue,He Wei-xian(浙江省舟山市疾病预防控制中心,浙江舟山,316000)
卢亦愚,Lu Yi-yu(浙江省疾病预防控制中心,杭州,310009)
王学海,Wang Xue-hai(浙江大学医学院病原生物研究所,杭州,310031)
荧光PCR定量检测法 篇3
【关键词】荧光定量PCR；单探针法；双探针法；甲型H1N1流感
目前，临床上对流感爆发疫情病原学检测和监测中，一般常用的病毒分离培养法、PCR检测法、胶体金快速检测法等，本研究通过对比分析荧光定量PCR单探针法与双探针法对甲型H1N1流感检测的灵敏度、特异性及准确率，总结其临床应用价值如下：
1资料与方法
1.1一般资料选取我院2009年11月至2011年11月流感样的病例268例，男有131例，女有137例，年龄在6-34岁，中位年龄为16.6±2.3岁，入院时临床表现为发热（体温在38摄氏度或以上）、咽痛/咳嗽，分别留取其鼻咽拭子样本送实验室，分别采取进行荧光定量PCR单探针法与双探针法进行甲型H1N1流感检测，观察对比两种检测方法的检出率、灵敏度、特异性及准确率，进行统计学分析。
1.2方法
1.2.1单探针法
1.2.1.1采集方法将鼻咽拭子样本放进Hanks液中，采集后24h内检测的样本可在4-8摄氏度下进行保存，采集后无法在24h内进行检测的样本将其置入到零下70摄氏度下进行保存。
1.2.1.2试剂盒与检测方法使用的是实时荧光PCR仪（美国应用生物公司生产，型号：7300），甲型H1N1流感病毒的RNA检测试剂盒（北京金豪制药股份公司提供），提取试剂使用的是Qiagen核酸分离的提取试剂盒（QIAampViralRNAMiniKit（50）提供，型号：Cat.No.52904），采取熒光PCR法进行检测；皆按照试剂盒上说明书进行严格操作，共配制出SWFluAl、SwHl、FluA三种反应液，其检测通道皆为FAM，在严格质控下完成操作。
1.2.2双探针法
1.2.2.1采集方法：同上。
1.2.2.2试剂盒与检测方法：使用的是实时荧光PCR仪（美国应用生物公司生产，型号：7300），用H1N1型和甲型流感通用型的病毒核酸双检试剂盒（上海科华生物工程股份有限公司提供），核酸提取的试剂盒采取自行配置，采取荧光PCR法进行检测；皆按照试剂盒上说明书进行严格操作，仅配置一种反应液，其检测通道是VIC（F1uA信号）与FAM（H1N1RNA信号），在严格质控下完成操作。
1.2.3结果判断以阴阳性的对照皆成立作为前提条件，Ct值为无数值或者超过40，认为呈阴性反应；Ct值在36-40时，给予重新检测；Ct值的FluA为阳性或者在36以下，认为呈阳性反应［1］。
1.3统计学方法本组检出率、灵敏度、特异性及准确率的数据采取SPSS13.0软件进行统计学处理，期间的数据比较使用t检验，χ±s作为计量单位；结果时间及检测费用的数据采取卡方软件V1.61版本进行统计学处理，期间的数据比较使用X2检验，%作为计量单位，以P＜0.05为有统计学意义。
2结果
268例样本中，荧光定量PCR单探针法检出阳性率为76.9%（206/268），双探针法检出阳性率为75.7%（203/268），两种方法的检出率对比无明显差异（P＞0.05），无统计学意义；对两种方法的检出阳性的样本病例随访一个月，最终得到临床确诊的有203例，进行荧光定量PCR单探针法检测漏诊3例，灵敏度为98.5%，无误诊案例，特异性为100%，准确率为98.5%；双探针法检测漏诊5例，灵敏度为97.5%，误诊5例，特异性为97.5%，准确率为95.1%，两种方法检测的灵敏度、特异性及准确率相对皆无明显差异（P＞0.05），无统计学意义。两种方法检测的出结果时间及检测费用对比有明显差异（P＜0.05），具有统计学意义，见表1、表2。
3讨论
流感病毒是一种传播速度极快，且容易引发大流行的一种疾病，以甲型流感病毒的传染性及感染能力最强，具有较大的危害性，过去曾数次引发了世界性的流感大流行，因此，对甲型H1N1流感进行实时监测，对于其防控、早诊断和早对症治疗有非常重要的临床意义。本研究中分别采取荧光定量PCR单探针法与双探针法对疑似甲型H1N1流感的268例流感样病例进行检测，荧光定量PCR单探针法检出阳性率为76.9%，灵敏度为98.5%，特异性为100%，准确率为98.5%；双探针法检出阳性率为75.7%，灵敏度为97.5%，特异性为97.5%，准确率为95.1%，两种方法检测的灵敏度、特异性及准确率相对皆无明显差异；显示出两种方法在检出甲型H1N1流感病毒的核酸中皆有较好的效果。另外，本研究中还统计发现，两种方法检测的出结果时间及检测费用对比有明显差异，单探针法检测的出结果时间对比双探针法要长，但检测费用对比双探针法要低，主要是两种方法在核酸的提取、探针的设计和引物的选择上皆有一定差异，单探针法需要配置三对反应液，操作相对复杂，核酸提取试剂采用的是Qiagen法，操作相对费时；而双探针法仅配置一对反应液即可，操作相对简化，且使用H1N1型和甲型流感通用型的病毒核酸双检试剂盒，其提取效率较高，能够完成大量的样品检测［2］。
综上所述，荧光定量PCR单探针法与双探针法对甲型H1N1流感检测的灵敏度、特异性及准确率间无明显差别，皆能有效地检出甲型H1N1流感病毒，但两种方法各自有其优缺点，荧光定量PCR单探针法与双探针法对甲型H1N1流感检测皆有个字的优势与局限性，其中单探针法检测灵敏度、特异性的精确度相对双探针法稍高些，但检测耗时较双探针法长；双探针法检测耗时短，操作简便，能够完成大批量的临床样本筛查并迅速出结果，但检测费用相对较昂贵，临床实践中应根据实际需要，选择性价比高的方法进行检测，具有重要的临床意义。
参考文献
［1］石伟先，黄芳，崔淑娟，等.实时荧光PCR法胶体金快速检测法及病毒分离培养法在甲型流感病毒检测中的临床应用分析［J］.中国卫生检验杂志，2011，21（11）：2690-1692.
荧光PCR定量检测法 篇4
1 材料与方法
1.1 毒株
鹅细小病毒病毒GPVS1株、鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒, 均为华南农业大学禽病实验室保存。
1.2 主要试剂
SYBR Green Realtime PCR Master MixPlus, 购于广州美津生物技术有限公司;PCR试剂、RNA抽提试剂盒, 购于宝生物工程 (大连) 有限公司。
1.3 GPV-VP基因的扩增和克隆
参考GenBank中鹅细小病毒B株VP基因的核苷酸序列, 根据其保守区域的序列设计特异性引物扩增GPV-VP基因。引物序列:上游引物GPV-VP-PCR-F 5′-TGATTCTGCCCTCCCTTCCA-3′;下游引物GPV-VP-PCR-R 5′-TGATGAACACCGAGTCTTCCTTAC-3′。引物由上海基康生物技术有限公司合成。
1.4 PCR反应
取含GPVS1株的番鸭胚尿囊液经100 ℃水浴10 min, 然后冰浴5 min, 15 000 r/min离心10 min;取上清液作模板进行PCR。反应体系:模板DNA 3 μL, dNTP 2 μL, 10×PCR Buffer 2.5 μL, GPV-VP-PCR-F (25 pmol/μL) 0.5 μL, GPV-VP-PCR-R (25 pmol/μL) 0.5 μL, Taq酶 (5 U/μL) 0.5 μL, ddH2O 16 μL, 总体积为25 μL。PCR反应条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性1 min, 54 ℃退火50 s, 72 ℃延伸1 min, 共30个循环;72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳检测。按广州瑞真生物技术有限公司的Gel Extraction Kit说明书纯化目的片段, 将该目的片段连接到pMD18-T载体, 重组质粒pMD18-T-VP经PCR与双酶切鉴定后进行测序。RNA病毒 (尿囊液) 的提取按照产品说明书操作。反转录采用20 μL体系:RNA 9.5 μL, 随机引物1 μL, 10×RT Buffer 2 μL, 10 mmol/L dNTP 2 μL, RNA酶抑制剂0.5 μL, AMV反转录酶1 μL, 加灭菌去离子水至20 μL。混匀, 室温下作用10 min, 接着42 ℃水浴1 h, 即为cDNA。
1.5 实时荧光定量PCR试验
1.5.1 引物及PCR条件
以上述重组质粒为模板, 选择保守序列设计荧光定量PCR 特异性引物, 序列为GPV-VPRT-PCR-F 5′-TTCTCCTACCACTCCCGCTACTT-3′;GPV-VPRT-PCR-R 5′- TGGTCTACATTTCCAGCA2GTTTGT-3′。扩增的目的片段是VP基因序列中3 011～3 144 bp的134 bp片段。pMD18-T-VP稀释10倍测定其在波长280 nm的吸光度值, 计算DNA的浓度和拷贝数。然后以标准质粒10倍梯度稀释溶液为模板, 根据SYBR GreenⅠReal-time PCR试剂盒说明, PCR反应中各组分如下:2×SYBRmixL 10 μL, GPV-VPRT-PCR-F (10 μmol/L) 0.4 μL, GPV-VPRT-PCR-R (10 μmol/L) 0.4 μL, ddH2O 6.2 μL, pMD18-T-VP 3 μL, 总体系为20 μL。荧光定量PCR反应程序:95 ℃预变性1 min;95 ℃变性15 s;60 ℃退火15 s, 72 ℃延伸40 s, 共38个循环。荧光定量PCR反应结束后制作熔解曲线, 反应程序:95 ℃ 15 s, 60 ℃ 1 min, 72 ℃ 40 s, 95 ℃ 15 s。
1.5.2 特异性检测
用引物GPV-VPRT-PCR-F/R对实验室保存的鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒等进行PCR检测。
1.5.3 灵敏度分析
将已知拷贝数的标准质粒做10倍梯度稀释至3.5×102个拷贝/μL, 以各梯度稀释液为模板进行PCR反应。最低起始模板浓度即为该Real-time PCR反应的灵敏度。
2 结果
2.1 pMD18-T-VP重组质粒的构建结果
以病毒DNA为模板进行PCR反应, PCR 产物大小约407 bp。将PCR产物克隆进pMD18-T载体, 经PCR扩增和双酶切鉴定后, 最终测序结果证明重组质粒为阳性。该测序结果与GenBank中公布的GPV核衣壳蛋白基因序列的相似性为98.3% (见图1) 。
2.2 荧光定量PCR 结果
2.2.1 扩增曲线分析
将标准质粒pMD18-T-VP进行10倍梯度稀释后, 选取3.5×104～3.5×107个拷贝/μL的稀释样品作为模板进行PCR反应, 扩增曲线见图2。模板浓度越高, Ct值越小, 即扩增曲线越早进入对数期。阴性对照在36个循环后出现扩增现象, 熔解曲线分析是引物二聚体的形成导致荧光信号值增强。
2.2.2 标准曲线分析
PCR扩增结束后, 根据起始模板浓度和相应的Ct值绘制标准曲线。标准曲线相关系数r2 =0.975, 扩增效率E=86.2% (见图3) 。
2.2.3 熔解曲线分析
目的产物熔解温度为88 ℃, 引物二聚体熔解温度为82 ℃。在3.5×102个拷贝/μL的模板浓度下, 虽然也有相同熔解温度产物的产生, 但是其扩增Ct值已经与空白对照很相近, 结果为阴性 (见图4) 。
2.2.4 灵敏度分析
从扩增曲线可见, 当模板浓度为3.5×103个拷贝/μL时, 荧光定量PCR 可以扩增出特异性产物。当模板浓度为3.5×102个拷贝/μL时, PCR反应虽然能扩增出相同熔解温度的条带, 但是其Ct值已经基本与空白对照重合。因此, 该SYBR GreenⅠReal-time PCR 方法检测灵敏度为3.5×103个拷贝/μL。
2.2.5 重复性试验结果
对于不同浓度的模板, 4个平行样品之间的Ct值差异不显著, 表明该方法具有很好的重复性 (见图5) 。
2.2.6 特异性检测结果
针对实验室保存的与鹅细小病毒共感染的其他病毒鹅源新城疫病毒、鸭瘟病毒、鹅流感病毒进行特异性检测。图6为GPV的扩增曲线, 其余模板均为阴性, 即该引物对GPV具有很好的特异性 (见图6) 。
3 讨论
试验建立的针对鹅细小病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR 方法在病毒3.5×103～3.5×107个拷贝/μL的浓度范围内具有很好的检测效果。荧光定量PCR 技术较其他技术有灵敏度高的显著特点, 因此试验同时要严防污染问题, 即需要实验人员良好的操作技能和实验室的洁净环境。
在临床上, 仅依靠症状和病理变化不能很好地区分鹅细小病毒病和其他鹅病毒病。目前, 用于诊断鹅细小病毒的病毒分离培养和中和试验存在诸多弊端, 例如:达不到快速、准确诊断;依赖操作人员的技术判断误差较大;容易与其他鹅病毒病 (鹅源新城疫、鹅流感) 感染相混淆;更为重要的是不能很好地用于早期临床诊断 (敏感性差) 。而实时荧光定量RT-PCR的敏感性高、特异性强、操作方便, 便于早期临床检测[5], 但也存在技术操作复杂、成本高以及不能很好地现场应用等缺点[6]。本试验建立的鹅细小病毒实时荧光定量PCR检测方法可以结合传统的诊断方法, 为该病的防制提供技术支持, 但该方法与荧光杂交探针实时PCR方法相比, 其检测特异性、灵敏性还有待提高。
参考文献
[1]CALNEK B W.禽病学[M].10版.高福, 苏敬良, 译.北京:中国农业大学出版社, 1999:988-995.
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实时荧光定量PCR技术及其应用 篇5
实时荧光定量PCR技术及其应用
实时荧光定量PCR技术是一种多色荧光检测核酸定量技术,该文简要介绍实时荧光定量PCR技术的原理及其应用.
作 者：欧阳松应 杨冬 欧阳红生 马鹤雯 作者单位：解放军军需大学军事兽医系,长春,130062刊 名：生命的化学 ISTIC PKU英文刊名：CHEMISTRY OF LIFE年，卷(期)：24(1)分类号：Q52关键词：实时荧光定量PCR 基因 荧光探针 SYBR Green
荧光PCR定量检测法 篇6
关键词：实时荧光定量PCR,乙肝DNA,影响因素
乙肝病毒是最为常见的感染性疾病病毒, 是肝硬化、慢性肝炎和原发性肝细胞癌等疾病的主要病毒, 其中乙型病毒性肝炎是一种以肝脏炎性病变为主的多器官损伤综合疾病, 是当前我国传播范围最广, 危害最大的一种传染病[1]。当前, 实时荧光定量PCR检测技术是进行乙肝DNA检测最为有效的方法之一, 应用逐渐加强。本文选取笔者所在医院收治的300例乙肝病毒感染患者进行研究, 对实时荧光定量PCR检测的效果和影响因素进行了分析, 现报道如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料
选取2010年1月-2012年1月笔者所在医院收治的300例乙型肝炎病毒感染患者, 其中男157例, 女143例, 年龄10~65岁, 平均32.5岁。
1.2 检测方法
对本组300例患者进行血标本制作, 在空腹时抽取静脉血, 注入干燥消毒的试管内, 且试管内含有EDTA-K2抗凝管;使用离心机离心5 min;使用实时荧光定量PCR进行乙肝DNA的检测;首先在94℃下进行2 min的预变性, 随后进行40个55℃~95℃循环, 模板DNA经加热至95℃左右一定时间后, 使模板DNA双链DNA解离成为单链后, 温度降至55℃左右, 引物与模板DNA单链配对结合;反应结束后, 制作标本曲线, 计算标本中的DNA模板量;依据试剂盒内的阳性质控标准进行标本的定量阳性质控;进行核酸扩增。本组研究中所采用的药剂和器械均统一, 试剂盒为厦门安普利生物工程有限公司生产, 仪器为9800型PCR扩增仪。以综合临床诊断结果为标准, 对实时荧光定量PCR对乙肝DNA的检测结果准确率进行对比, 并对导致两者差异的因素进行分析总结。
1.3 统计学方法
所得数据采用SPSS 13.0统计学软件进行处理, 计量资料以均数±标准差 (±s) 表示, 采用t检验, 计数资料采用x2检验, P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
本组300例乙肝病毒感染患者, 采用实时荧光定量PCR进行乙肝DNA检测, 与临床综合诊断结果进行对比, 确诊276例 (92.0%) , 漏诊误诊24例 (8.0%) , 实时荧光定量PCR检测与临床诊断比较差异无统计学意义 (P>0.05) 。对影响检测结果的因素进行分析, 主要包括实验室条件、血标本操作和核酸提取操作等影响因素, 详见表1。
3 讨论
3.1 实验室条件影响因素
PCR技术操作对实验室的条件要求较高, 轻微的污染都会导致其产生假阳性的检测结果。实验室硬件要求为:试剂储藏的准备区、标本制备区、扩增反应混合物配置区和扩增分析区;软件要求为:人员专业培训、技术验收和规范化管理等[2,3,4,5]。本组研究中, 有3例漏诊误诊病例是由于实验室条件因素影响所致, 占12.5%, 需要进一步加强实验室硬件建设和软件管理。
3.2 标本因素影响
标本因素影响, 包括标本抗凝血因素、存储因素、溶血和血脂因素等[6,7]。标本抗凝血因素:使用肝素抗凝素时, 会导致标本血液的裂解失效, 使得实时荧光定量PCR不能分别对血浆和血清进行有效检测;标本存储因素:静止时间过长, 超过3 h, 或存储温度高于25℃等, 均会导致标本变性, 对检测结果产生影响;溶血及血脂因素:溶血和血脂会导致标本内血红蛋白变形, 部分酶失去活性从而导致荧光信息强度变化, 对检测结果产生影响[8,9,10]。
3.3 核酸提取方法因素
不同的核酸提取方法会对实时荧光定量PCR检测的结果产生不同的影响, 其中磁珠核酸提取法的准确度较高, 煮沸裂解核酸提取法的准确度较低, 本次试验全部采用磁珠提取法, 但操作差异导致检验结果异常[11,12]。
荧光PCR定量检测法 篇7
血液中的HBV DNA含量变化是临床医生判断乙肝患者抗病毒治疗是否有效的重要检测项目,其检测结果的准确性,对于临床医生的诊断十分重要。目前,享有盛名的荧光定量PCR仪有罗氏公司的LightCycler 480、美国安杰伦公司的MX3000等,我院于2008年3月和2008年8月分别购进1台罗氏LC480和1台MX3000。用这2种荧光定量PCR仪对HBV DNA检测结果进行比较,以观察这2种PCR扩增仪在临床应用中有无差异。
2 材料与方法
2.1 研究对象
标本为门诊患者随机样本共20份,采用无肝素抗凝的血清或者血浆标本,用2台荧光定量PCR扩增仪分别对HBV DNA的含量进行测定。
2.2 仪器和试剂
瑞士罗氏公司的LightCycler 480(以下简称LC480),美国安杰伦公司的MX3000(以下简称MX3000),检测试剂盒由北京巴奥瑞欣生物技术有限公司提供。
2.3 方法
(1)HBV DNA的提取
取3μL的CNR加入到PCR反应孔底部,加入标本血清3μL,吹打混匀,覆盖30μL无菌石蜡油,置核酸提取仪37℃保温5 min,然后在99℃处理6 min和37℃置30 s,直接加入配制好的荧光PCR反应液,封盖后进入实时荧光定量PCR扩增程序。
(2)实时荧光PCR扩增
50℃,2 min;95℃,5 min;3×(94℃,30 s→61℃,60 s)→37×(94℃,10 s→60℃,30 s:采集荧光)。反应体系设为30μL。按仪器说明进行结果判断。
(3)分析应用卫生部临床检验中心提供的室内质控品对2台荧光定量PCR扩增仪进行连续室内质控监测,质控结果满意。用2台荧光定量PCR扩增仪对20份随机标本进行测定,比较HBV DNA的测定结果,HBV DNA的核酸提取及定量检测均严格按照试剂说明书进行。
(4)采用EXCEL软件进行相关分析。
3 结果
(1)2台仪器对20份标本HBV DNA测定结果的比较均为准确性评价,分别做空白对照1份,阳性对照和阴性对照各1份,HBV DNA阳性质控品1份,标准品4份。实验结果均显示,空白对照和阴性对照为阴性结果,阳性对照为阳性结果,阳性质控品为阳性结果,标准品呈线性关系。此结果表明,每台实验仪器均在控制之中,而且每台仪器实验的准确性均有保证,试验结果可信。
(2)其定量数值的误差符合卫生部对荧光定量PCR检测的质控要求。目前国际上并无统一的判断标准,本次试验采用卫生部临检中心室间质评的允许误差为判断标准(0.5对数值)。
(3)2台仪器对20份标本的HBV DNA含量的对数值进行相关性分析,结果表明,二者相关性良好(r=0.96),如图1所示。
4 讨论
(1)LC480和MX3000 2种荧光定量PCR扩增仪,室内质控结果均满意,对标本检测结果也能保持一致性。参加卫生部室间质评结果都满意,两者间HBV DNA结果经过统计学进行比对分析,结果显示2台仪器测定结果的相关性较好(r=0.96),没有明显差异。2种荧光定量PCR扩增仪都能很好地服务于临床。
(2)采用荧光定量PCR仪检测HBV DNA的含量,在反映病毒复制方面是一个较好的指标,有助于判断HBV病毒在体内的复制及传染性,对肝炎患者的临床治疗具有重要的意义。在HBV复制的早期或活动期,HBV DNA含量很高,肝脏功能多存在损伤,也是机体发生免疫应答的重要标记,临床可以进行清除病毒的适时治疗。在HBV复制停止或下降期,血清中的HBV DNA含量处于下降期或呈阴性,可以为小三阳患者抗病毒治疗停药时间的确立提供参考。
(3)2种荧光定量PCR扩增仪都是通过荧光信号采集系统实时监测和记录PCR反应过程中所产生的荧光信号,最后由计算机分析处理系统通过标准曲线对未知模板进行定量分析。MX3000反应过程中光信号的传导与收集是通过光纤进行逐行扫描,LC480是用CCD摄像,一次性采集光源。
(4)核酸扩增定量检测HBV DNA是近年来迅速发展的一项检验方法,乙肝诊断已由原来的定性飞跃到可以利用PCR技术检测病毒载量,与传统的PCR技术相比,实时荧光定量技术具有特异性高、能有效解决PCR产物污染问题、自动化程度较高等特点,现在检验科所用的PCR扩增仪品牌众多,分析原理、试剂环境、操作人员水平等均有差异,因此要严格按照操作程序操作,在职责范围内要有责任、有意识,以保证及时发现仪器设备和试剂盒的异常情况,遇到结果与临床不符,应及时与临床沟通,重新双孔复查,查找原因,以保证检测结果的准确性。
摘要：目的:观察2种荧光定量PCR扩增仪测定乙肝病毒定量(HBV DNA)的结果是否一致。方法:用2台PCR扩增仪同时对20份标本进行检测,观察2台荧光定量PCR定量扩增仪对HBV DNA测定结果的差异。结果:对20份标本HBV DNA含量的对数值进行相关性分析,二者相关性良好(r=0.96)。结论:通过2种荧光定量PCR扩增仪对20份随机样本的检测结果比较,2种仪器检测结果具有较好的一致性,可用于同时检测HBV DNA。
关键词：荧光定量PCR扩增仪,乙肝病毒定量,检测
参考文献
[1]Ho S K,YamW C,Leung E T,et al.Rapid quantification ofhepatitisBvirusDNA by real-time PCR using fluorescenthybridization probes[J].J Med Microbio,2003,52(Pt5):397-402.
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荧光PCR定量检测法 篇8
关键词：荧光定量,PCR检测,性病,淋病奈瑟氏菌,解脲支原体,沙眼衣原体
性传播疾病是指以性行为为主要传播途径的一组传染病, 近年在我国发病率明显上升。性病病原体中, 以淋病奈瑟氏菌、解脲支原体及沙眼衣原体感染较多见, 这三种病原体所引起的泌尿生殖系统感染, 已成为我国各地区主要的性传播疾病[1]。本研究应用荧光定量PCR检测对400例疑似性病患者进行NG、UU、CT三种病原体检测分析, 现报道如下。
1 材料与方法
1.1 一般资料
选取2011年3月至2012年3月我院妇科门诊就诊的疑似性病患者400例, 年龄在17~54岁之间, 平均年龄 (32.3±4.6) 岁。患者自诉有尿频、尿急、尿痛、尿道刺痒及分泌物增多等症状。患者在检测前均未服用抗生素治疗。
1.2 方法
对疑似性病的400例女性患者采用荧光定量PCR同时检测其宫颈分泌物中NG、UU及CT, 比较三种病原体单独感染和混合感染的阳性比例及三种病原体在各个年龄段的分布情况。
1.3 标本采集
将宫颈口过多的分泌物用棉签擦掉, 在无菌条件下, 将棉拭子伸入宫颈内, 旋转数周并停留片刻后取出。标本密封保存于2~8℃备用。
1.4 仪器和试剂
扩增仪为中山大学达安基因股份有限公司的DA 7600自动荧光检测仪, NG、UU、CT检测试剂盒由该公司提供。严格按说明书操作。
1.5 FQ-PCR检测方法
标本经过常规DNA提取液裂解处理后, 作为扩增反应模板。依据试剂盒要求, 从试剂盒中取出NG、UU及CT的PCR扩增反应液, 将处理好的标本适量放入反应管中后, 同时采用外标准定量方法作出标准曲线及设立阴性、阳性对照及空白对照, 将反应管放入荧光PCR检测仪内按照说明书操作程序进行PCR扩增, 扩增条件根据扩增仪的性能与试剂盒的特点由中山大学达安基因股份有限公司提供。程序运行结束后, 电脑自动计算分析出定量结果。
1.6 统计学处理
采用统计学软件SPSS16.0对资料进行统计分析, 计量资料采用t检验, 计数资料采用χ2检验, P<0.05有统计学意义。
2 结果
2.1 400例疑似性病女性患者采用荧光定量PCR检测NG、UU、CT三种病原体, 感染UU的阳性率最高, 感染NG的阳性率最低, 比较三种病原体感染阳性率, 高低为UU>CT>NG, 差异具有统计学意义 (P<0.05) , 见表1。
2.2 400例疑似性病女性患者采用荧光定量PCR检测NG、UU、CT三种病原体, 同时感染UU+CT的阳性率最高, 同时感染NG+UU+CT的阳性率最低, 4种混合感染阳性率比较, 差异无统计学意义 (P>0.05) , 见表2。
2.3 感染NG、UU、CT患者在各年龄段分布状况显示, 20~35岁年龄段为感染3种性病原体的主要人群, 35~50岁年龄段次之, 20~35岁与35~50岁年龄段感染例数明显高于<20岁和>50岁年龄段例数 (P<0.05) , 见表3。
3 讨论
随着社会经济的发展, 社会交往日益频繁, 人们的性意识受各界开放思想的影响而逐渐转变[2], 不洁的性行为导致各种性病的发生。我国上世纪后期以后, 性传播疾病逐渐流行起来, 并以一定的数量逐年递增, 性传播疾病病原体随着时间和环境的变化, 其分布情况也随着改变[3]。淋病奈瑟氏菌 (NG) 、解脲支原体 (UU) 及沙眼衣原体 (CT) 是性传播疾病常见病原体, NG曾经是在8种性病病原体之中感染率最高的, 2000年以后, 感染UU、CT的性病患者数量呈上升趋势, 并且以女性患者居多。有文献报道[4], 由于女性泌尿生殖道的结构特点及引起女性会阴部潮湿、不透气的生活习惯促进病原体在生殖道内繁殖, 导致女性感染性病病原体的概率比男性大。女性患者感染NG、UU、CT, 不仅会引起尿频、尿急、尿痛、尿道刺痒等泌尿生殖道炎症, 而且会导致不孕、流产、死胎、胎儿畸形等严重后果, 给患者身体和精神上带来极大的痛苦[5]。诊断治疗性传播疾病关键因素在于准确检测出是何种病原体, 现临床上采用荧光定量PCR检测技术检测性病病原体, 不仅敏感性高、特异性强, 而且还可以克服常规分泌物涂片检测方法的假阳性问题, 为诊断治疗疾病提供了准确、可靠的依据。本研究采用FQ-PCR技术进行检测, 结果显示:单独感染病原体比例分别为NG阳性率10.75%, CT阳性率24.25%, UU阳性率51.25%, 比较三种病原体感染阳性率, 高低依次为UU>CT>NG, 说明女性患者中UU感染率较大, UU在正常情况下寄生于人体泌尿生殖道黏膜表面, 与其他宿主菌群共存, 当机体免疫力下降或黏膜受损时, UU会大量繁殖而致病。混合感染病原体患者比例分别为NG+UU阳性率3.25%, NG+CT阳性率4.75%, UU+CT阳性率9.25%, NG+UU+CT阳性率2.00%, 同时感染UU+CT的阳性率最高, 同时感染NG+UU+CT的阳性率最低, 说明人体内性病病原体感染经常不是单一的, 当感染一种病原体后, 人体机体抵抗力下降, 容易合并感染其他病原体, 在临床治疗中, 当单独使用一种药物后, 症状无明显改善者, 应考虑多种病原体联合检测, 并根据检测结果改变治疗方案。在各个年龄段的感染情况上, 20~35岁患者属于高发人群, 35~50岁次之, 随着年龄的增长, 性病病原体感染率逐渐下降, 这是因为20~35岁年龄段的女性处于生育繁殖的黄金年龄, 人体内激素水平比较高, 性行为比较活跃, 因此感染性病病原体的机会也较多。综上所述, 应加强对高危人群的性宣传教育, 增强人们对性病的认识, 提倡安全性行为, 积极防治, 减少性传播疾病对人们身心的危害。
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[4]张德, 张树仁, 任更朴.荧光定量PCR对NG、CT和UU三种性病的检测分析[J].中国误诊学杂志, 2008, 8 (30) :7331-7332.[4]张德, 张树仁, 任更朴.荧光定量PCR对NG、CT和UU三种性病的检测分析[J].中国误诊学杂志, 2008, 8 (30) :7331-7332.
荧光PCR定量检测法 篇9
1 材料与方法
1.1 材料
pBR322-HBV质粒 (含3个HBV基因组) 、DH5a菌种, 由生命科学学院微生物实验室提供。
培养基有LB液体培养基、LB固体培养基和SOC培养基, 试剂包括pBS-T连接试剂盒、dNTP、TaqDNA聚合酶、IPTG、xGal、SDS、琼脂糖、二甲基甲酞胺购、RNase。以上及相关溶液均购自购自Biolabs公司。
1.2 方法
1.2.1 引物和探针的设计思路:
使用专业软件根据乙肝病毒DNA前C区、C区和X区的保守序列的特点, 针对性的设计出特征性引物和对应的TaqMan探针和TaqMGB探针。
1.2.2 PCR扩增pBR22-HBv质粒前e区、e区和X区保守序列:
为目的基因的扩增做好准备, 包括流程及所需原料, 在BioRadpTC-200PCR仪上94℃10min、94℃10s、59℃30s, 重复40次。
1.2.3 AT亚克隆:
挑取在LB培养基上生长的DH5a单菌落接种于5ml LB培养基中并在适宜条件培养3h, 取出、离心、弃上清再冰浴30min后制成感受态细胞;电泳待检测的PCR产物:直接使用pBs-T连接试剂盒16h, 然后去5μl连接液至100μl感受态细胞中并混匀, 再冰浴、热激、快速冰浴后加入400ml SOC培养基中, 温浴40min, 然后均匀涂布于90mn LB平板上, 于36℃的恒温条件下培养15h。
1.2.4 HBV-DNA荧光定量PCR定量DNA标准的制备:
最开始的工序是进行目标质粒的提取与纯化, 从扩大培养的阳性亚克隆菌液取lml离心、干燥后置于100μl冰预冷的碱裂解液中, 剧烈振荡后, 再离心、重复多次, 收集沉淀核酸, 以紫外分光光度计为主要工具, 检测含有乙肝病毒DNA的前C区、X区及C区保守序列的pBS-T质粒的浓度大小。根据公式可以得出所提取的每种质粒的拷贝数。然后用TE溶液进行10倍的倍比稀释得到标准品。以上述质粒亚克隆后的载体为模板, 在PCR仪上做温度梯度PCR, 从中找出亚克隆载体的最适退火温度。选择好PCR反应条件和反应体系后, 循环45次, 72℃5min。然后分步电泳, 并分别在各区的最佳退火温度条件下, 用10~1010copies/μl的10种浓度的质粒为模板进行PCR扩增操作。PCR扩增后以琼脂糖凝胶电泳的方法确定灵敏度, 并找出最高灵敏度的区段。
1.2.5 HBV-DNA荧光定量PCR定量检测标准曲线的制备:
在上部操作中确定的最高灵敏度的保守区段为基础, 以荧光定量PCR仪为主要工具, 选用10~1010copies/μl浓度不同的10个质粒标准品, 设置荧光定量PCR, 荧光定量PCR反应采用通用反应条件和反应体系。
1.2.6 HBV-DNA荧光定量PCR检测线性范围、精度和重复性确定:
对质粒标准品测定批内变异系数和批间变异系数, 分别为一个样品同时做出10个循环阈值然后求变异系数或者10个待检测物重复做4次循环阈值然后求变异系数。
2 结果
2.1 前C区、C区和X区目的片段
扩增后得到的保守序列分别为113bp、101bp和57bp。
2.2 HBV-DNA标准品制备
用紫外分光光度计测出的数据统计见表1, 然后将溶液倍比稀释, 每组稀释10个浓度梯度, 直到1010copies/2μl。
2.3 常规PCR检测灵敏度
以带有前C区的pBS-T质粒载体为模板的PCR扩增产物中, 第3~6泳道分别以58.3℃、58.6℃、59.1℃、59.7℃为最佳退火温度, 58.9℃下扩增效果最佳。在此温度下, 分别以上述10种梯度浓度的质粒为模板进行常规PCR扩增。4~10泳道均能扩增出产物, 且随质粒浓度的降低而减少。表明带有前C区质粒最高稀释度为104copies/2μl。其中, 以1010copies/μl浓度质粒为模板的扩增反应中表现出非特异扩增的现象。
同样的, 带有C区的为第4~7泳道, 平均58℃, 最高稀释度为106copies/2μl;带有X区的为第2~4泳道, 平均51℃, 最高稀释度为105copies/2μl。
2.4 HBV-DNA荧光定量PCR检测标准曲线
通过比较前C区、C区和X区保守序列的pBS-T质粒标准品灵敏度, 前C区保守序列最高。选取103~1010ceopies/2μl等不同浓度的质粒标准品在荧光定量PCR上扩增, 其曲线如下所示, 低于5×103copies/μl的质粒浓度未见扩增曲线, 可见5×103copies/μl为其能达到的灵敏度。见图1。
注:1~7分别为5×109、5×108、5×107、5×106、5×105、5×104、5×103copies/μl的扩增曲线
注:横坐标为循环阈值, 纵坐标是起始拷贝数的对数值
由图2可知, 模板浓度越高, 循环阈值 (Ct) 越小, 荧光信号随着循环数的增加逐渐增强, 经过计算浓度降低10倍时, 起始循环数增加4次, 两者呈负相关的趋势。其中相关系数为99.5%, 说明可信度较高。
2.5 HBV-DNA荧光定量PCR精度
将5×106copies/μl的质粒标准品10个同时在同等条件下进行荧光定量PCR, 得出循环阈值分别为:24.069、25.513、23.887、25.233、24.511、24.856、25.489、26.211、25.023、24.711, 均值为24.955, 标准差为0.688, 变异系数为2.800%, 说明荧光定量PCR检测的精确度较高。
2.6 HBV-DNA荧光定量PCR重复性
将5×104copies/μl~5×108copies/μl 5个不同浓度的质粒标准同时在荧光定量PCR仪上重复做4次扩增, 得到不同循环阈值和变异系数, 其变异系数分别为2.079%、2.214%、3.702%、3.442%和2.823%, 结果均<5%, 表明重复性好。
3 讨论
3.1 常规PCR分析
FQ-PCR一般经过设计扩增目的DNA序列所需的引物和探针、选择高效率扩增流程、制备已知浓度的包含目的DNA的相关载体并倍比稀释后制作标准曲线及根据标准曲线确定样品DNA初始量4个步骤[2]。引物是决定PCR特异性的寡核昔酸片段, 本实验选择HBV前C区、C区和X区的保守序列设计引物, 以此为基础, 来达到实验目的。
从原始质粒pBR-322-HBv中扩增前C区、C区、X区保守序列时, 均采用一个扩增条件, 设定好预变性时间使其双链充分解开而结合引物, 同时, 变性后温度快速冷却至40℃~60℃加快其结合, 退火温度与时间、引物长度、碱基组成及其浓度有关[3]。在Tm值允许范围内, 选择较高的复性温度可大大提高PCR反应的特异性, 时间一般为30~60s, 本试验中, 退火温度以60℃为宜。
经目的序列亚克隆至载体后, 应针对性地改善扩增条件。通过对位于HBV 3个保守区段常规PCR灵敏度的检测得出前C区灵敏度最高, 以此作为目的序列用于实时荧光定量PCR检测结果较好。
3.2 HBV-DNAFQ-PCR检测效果评价
毫无疑问, PCR技术己成为病毒等病原性疾病灵敏的检测手段[4]。新世纪以来, 将PCR技术用于血液HIV-1、HCV、HBV的检测越来越广泛, 以荧光定量PCR为代表的检测方法可更加有效的待检测序列进行定量分析。各管内实验中完全封闭而无交叉污染, 在具有常规PCR优势的同时, 兼具计算机完成、DNA扩增的高效性、探针技术的高特异性和光谱技术的高敏感性[5]。还可避免非特异性扩增及扩增产物污染而导致的假阳性的可能, 也解决了常规PCR对工作人员的危害和污染环境等问题, 提高了工作效率, 其在常规PCR基础上添加了荧光双标记探针, 和传统ELISA、常规PCR等方法相比具有一定的优势, 可根据荧光信号的循环阈值变化对比阳性参照标准品即可由电脑得出具体的定量结果, 可以准确地反映出乙肝病毒DNA的复制水平、病程变化和治疗恢复情况等。
FQ-PCR是通过实时检测扩增过程中荧光物质强度变化, 对待测DNA进行定量分析的一种方法[6]。由上图可见, 在一定浓度范围内, 模板浓度与循环闭值之间具有较好的相关性, 在检测1010copies/2μl浓度的模板时, 常规PCR可出现非特异扩增, 而FQ-PCR则没有。当然, 在低于104copies/2μl浓度的待检测液中则没有荧光曲线的生成。同时, 理论上, 10倍稀释后扩增的循环阈值应该相差3.3倍, 本试验结果中可能是由于样本倍比稀释过程中的误差造成。当然, FQ-PCR技术作为近几年发展起来的新技术, 费用较高, 一定程度上限制了其应用, 故需要该项技术的不断成熟和成本的降低。
摘要：目的 用荧光定量PCR对HBV-DNA载量进行实验性研究。方法 扩增含有3个乙肝病毒基因组pBR322质粒中的乙肝病毒目的序列, 并通过AT亚克隆至pBS-T载体中。经过筛选、鉴定及测序验证保证相对更高的拷贝数。对3个保守序列进行了常规PCR退火温度的优化和灵敏度的检测, 建立荧光定量PCR反应体系从而制备标准曲线。结果 曲线相关系数为99.5%, 具有较高的可信度。负相关范围在5×1035×109copies/μl。不论是批内还是批间其变异系数值均小于5%。结论 荧光定量PCR检测乙型肝炎病毒DNA可以灵敏度好, 准确度高, 应加大研究降低成本应用于检验应用。
关键词：HBV,DNA,荧光定量PCR法,扩增曲线,标准曲线
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荧光PCR定量检测法 篇10
1 材料与方法
1.1 标本来源
均来自本院2008年1月—2009年1月临床手术切除标本, 其中正常胃黏膜18例, 胃癌原发灶32例, 胃癌转移灶29例, 同时送病理组织切片, 其中有12例分别取了以上3种组织。所有标本均经病理诊断确认。
1.2 主要试剂和仪器
Trizol购自美国Invitrogen公司。RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit逆转录 (RT) 试剂盒购自立陶宛Fermentas (MBI) 公司。PTC-200 PCR循环仪由美国MJ公司提供。LightCycler® 480高通量实时荧光定量PCR系统购自美国Roche Diagnostics公司。荧光定量PCR酶反应系统TaKaRa Premix Ex TaqTM (Perfect Real Time) Code:DRRO39A由大连TaKaRa公司提供。
1.3 组织总RNA提取和cDNA的合成
Trizol法提取细胞总RNA, 紫外分光光度仪检测RNA的质量和浓度。取总RNA 3 μg进行逆转录反应, 步骤按操作说明书进行, 逆转录的cDNA置-20 ℃保存。
1.4 引物设计及合成
根据已知的Twist基因全序列04688546001和18 s tRNA全序列100008588, 将其递交至 UPL的在线分析设计中心http://WWW.universalprobelibrary.com, 分析得到的特异引物序列如下[4]:Twist基因上游引物为5’-GCGAATGTTTGAGGTGACAG-3’, 下游引物为5’-AGTTGGCCCATTGTTTGGT-3’。18 s tRNA:上游引物5’-GTTCTTAGTTGGTGGAGGGATTT-3’, 下游引物为5’-GGCTGAACGCCACTTGTCC-3’, 长度131bp。 Twist基因和18s tRNA引物均由上海生物公司合成。
1.5 实时定量RT-PCR分析 (水解TaqMan探针)
20 μl反应体系PCR扩增反Twist (10 μl Premix Ex TaqTM, 0.2 μl (20 μm) Left Primer, 0.2 μl (20 μm) Right Primer, 0.2 μl Probe, 8.4 μl H2O, 1 μl cDNA template) [5]:94 ℃预变性1 min, 94 ℃ 20 s, 60 ℃ 40 s, 40个循环。反应结束时检测荧光信号, 冷却, 37 ℃ 1 s。以拷贝数的自然对数为坐标, 循环阈值 (Ct) 为纵坐标制作标准曲线。根据标准品建立标准曲线。为消除标本处理、逆转录和PCR反应差异, 做基因表达的相对定量时, 用18 sRNA在 cDNA样品中的表达量作为衡量cDNA浓度的内参, 样品间同一基因的相对表达量用以下公式计算:表达倍数=2-Δ (Cp) , 其中ΔCp=同一样品目的基因的Cp值-18 sRNA的Cp值, Δ (ΔCp值) =不同样品间ΔCp值的差值[5]。
1.6 统计学分析
采用SPSS 11.5软件分析结果, 采用配对t检验处理结果
2 结果与分析
2.1 提取的组织总RNA质量和纯度
Trizol法提去胃癌组织总RNA, 经紫外分光光度计监测A260/A280为1.871±0.061, 提示总RNA质量较好。
2.2 电泳检测PCR扩增产物
以cDNA为模板, 分别以Twist, 18sRNA上、下游引物进行PCR扩增和20 g/L琼脂糖凝胶电泳、Twist扩增目的片断和预计大小符合。
2.3 方法的稳定性测定
将5个不同稀释度[ (5.0×109) ～ (5.0×105) copies/ml]的标准品分5批次不同时间进行检测, 得到批CV%分别为2.05%、1.52%、1.56%、7.97%、12.38%;将上述标准品同批次各重复5管检测, 得到批内CV%分别为0.63%、0.96%、0.67%、3.17%、8.71%。
2.4 Twist基因在胃癌患组织中的表达
用上述方法, 对收集的标本进行实时荧光定量PCR定量测定。Twist在正常胃黏膜和原癌灶及转移组织中的表达水平差异有统计学意义 (P<0.05) , 提示胃癌组织Twist表达上调;淋巴转移和腹膜转移组织的表上调的患者与病理确诊的胃癌病程有一定关系, 可提示该基因的的高表达可能与胃癌的病程发展有关 (表1) 。
3 讨论
Twist基因是一种在胚胎发育中起到调控作用的转录因子, 在诱导细胞移动及组织塑型中起重要作用[6]。新发现Twist具有癌基因的特征, 能编码凋亡抑制蛋白, Twist表达的显著上调可见于浸润性胃癌、乳腺癌 (小叶癌) 、肝癌等恶性程度高、侵袭性强的肿瘤亚型中, 但在正常组织和恶性程度低的癌细胞中并无表达[7]。一些学者因此推测Twist的激活可能是某些恶性肿瘤发生、发展和转移的重要因素[8]。Twist基因首先在果蝇中被发现, 随后相继在水母、小鼠及人类中被确认, 他们均能编码碱性的螺旋—环—螺旋DNA结合的转录因子, 在不同的种属之间其核苷酸和氨基酸序列高度保守。Twist在胎盘和中胚层来源的组织和细胞中高表达。不同研究表明, Twist蛋白对凋亡起调节作用[9]。
研究证实, Twist能够通过多种途径引起肿瘤的发生, 有抑制分化、阻断P53通路、阻碍N-Myc的促凋亡作用和抑制NF-B/TNF通路等, 从而发挥调亡作用[10], Twist也能诱导上皮细胞—间皮细胞的转变 (EMT) , EMT有助于上皮源性肿瘤细胞的侵袭扩散[11]。一些重要的基因如Twist, snail能够诱导EMT, 它们的共同特征是有能够识别靶基因启动子上的E-box程序的DNA结合序列。E-钙黏合蛋白介导的细胞与细胞黏附作用的丧失是肿瘤细胞侵袭与转移过程形成的原因。在体外, E-钙黏蛋白功能或表达的下调将使无侵袭能力细胞变得具有侵袭能力, 相反, 将E-钙黏蛋白cDNA转染入高侵袭性上皮肿瘤细胞系后, 其侵袭能力下降。
本研究发现, Twist蛋白普遍表达于胃癌中, 当胃癌发生转移时, 则表达明显提高。少数癌旁正常组织虽有弱表达, 而胃癌中表达强度明显高于癌旁正常组织, 二者的表达差异显著。说明Twist在胃癌的发生、发展过程中起到重要作用, 与肿瘤的侵袭转移有一定的关系, 这和其他研究者在乳腺癌和前列腺癌中的研究结果类似[12]。
本实验研究采用的是相对定量的方法, 因为我们更加关注的是胃癌组织及淋巴转移组织中Twist mRNA的表达水平比正常组织中高出多少倍, 而不是在于其具体的拷贝数目是多少, 并且相对定量更加简单、经济, 而且也更为可靠和准确, 因为存在于反应体系中的干扰因素, 如样本不纯、试剂影响等都可以通过内标进行校正而去除。
总之, 利用实时荧光定量PCR检测胃癌Twist基因, 可以作为诊断和检测胃癌术后的疗效观察, 临床应用具有很大的前景。
摘要：目的分析实时荧光定量PCR检测胃癌组织Twist基因的临床意义。方法用实时荧光定量PCR的方法检测正常胃黏膜、胃癌原发灶、胃癌转移灶组织中TwistmRNA的表达含量。并以Twist基因和18 s tRNA含量的比值作为评价Twist表达水平的指标, 组间进行配对t检验。结果Twist/18 s tRNA (log比值) 正常组为0.139±0.003;原发组为0.304±0.046;转移组为0.654±0.015。原发性胃癌组织及转移组织中Twist基因表达水平与正常胃黏膜组织比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) ;转移组与原发组比较, 差异有统计学意义 (P<0.05) 。结论Twist基因在正常胃黏膜组织中表达量较低, 在胃癌及其转移组织中表达水平较高, 而且Twist基因的表达水平与胃癌转移程度存在一定相关性。可以辅助诊断和观察胃癌术后疗效。
关键词：实时荧光定量PCR,Twist基因,胃癌
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